JP2014532418A - シトクロムp450及びテルペンの酵素的酸化のためのそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
テルペンは、ほとんどの生物(微生物、動物及び植物)において見出される。これらの化合物は、5個の炭素単位、いわゆるイソプレン単位から製造され、それらの構造に存在するこれらの単位の数によって分類される。従って、モノテルペン、セスキテルペン及びジテルペンは、それぞれ炭素原子10個、15個及び20個を含むテルペンである。ジテルペンは、例えば、植物界に広く見出され、2500種を超えるジテルペン構造が記載されている(Connolly and Hill, Dictionary of terpenoids, 1991, Chapman & Hall, London)。テルペン分子及びそれらの酸化された誘導体は、それらのフレーバー特性及びフレグランス特性並びにそれらの化粧品効果、医薬品効果及び抗菌効果のため、長年の間関心がある。種々の方法、例えば蒸気蒸留又は溶媒抽出によって得られた植物抽出物は、テルペン分子の酸化させた誘導体の源として使用される。代わりに、植物抽出によって見出された又は生合成プロセスによって得られたテルペン分子は、化学的プロセス及び酵素的プロセスを使用して酸化される。
本発明は、経済的な、信頼性のある、再現のある方法で、テルペンを酵素的に酸化するための方法を提供する。
a)シトクロムP450レダクターゼ(CPR)の存在で、該テルペン化合物と本発明の少なくとも1つのポリペプチドとを接触する工程、
b)場合により、工程a)において製造された酸化させたテルペンを単離する工程
を含む。
a)本発明による少なくとも1つの核酸を含み、かつ本発明の少なくとも1つのポリペプチドを発現又は過剰発現するために形質転換させたヒトでない宿主生物又は宿主細胞を培養すること、
b)工程a)において培養したヒトでない宿主生物又は宿主細胞から本発明のポリペプチドを単離すること
を含む、本発明のポリペプチドを製造するための方法を提供する。
(a)前記実施態様のいずれかに従って核酸を選択する工程、
(b)選択した核酸を改質して、少なくとも1つの突然変異体核酸を得る工程、
(c)宿主細胞又は単細胞生物を突然変異体核酸で形質転換して、突然変異体核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現する工程、
(d)少なくとも1つの改質されたシトクロムP450活性についてポリペプチドをスクリーニングする工程、
(e)場合により、ポリペプチドが所望の変異体シトクロムP450活性を有さない場合に、プロセス工程(a)〜(d)を、所望の変異体シトクロムP450活性を有するポリペプチドが得られるまで繰り返す工程、
(f)場合により、所望の変異体シトクロムP450活性を有するポリペプチドが、工程(d)において同定された場合に、工程(c)において得られた対応する突然変異体核酸を単離する工程
を含む。
本発明を、次の実施例の方法によってさらに詳細に記載する。
RNA抽出及びcDNAライブラリー構築
ベチバー(Vetiveria zizanioides (L.) Nash)植物を、苗床(The Austral Plants Company, Les Avirons, The Reunion Island, France)から得た。植物を、温室(Lullier Agronomy research Station, Geneva, Switzerland)においてポットで栽培し、そして6ヶ月から1年の茂みを分けることによって栄養繁殖した。根の収穫のために、植物を、ポットから取り出し、そして水道水で洗った。
P450特異性オリゴヌクレオチドの設計
テルペンヒドロキシラーゼ活性を有する植物P450についてオリゴヌクレオチドの設計特異性を設計するために、P450をヒドロキシル化する公知のテルペンからのアミノ酸配列を選択した:スペアミントからのリモネン6−ヒドロキシラーゼ(GenBank受託番号AAD44150)、ペパーミントからの2つのリモネン3−ヒドロキシラーゼ(GenBank受託番号AAD44152及びAAD44151)、タバコからのエピ−アリストロチェンヒドロキシラーゼ(Genbank受託番号AAK62343)、ヒヨシアムス・ムチクス(Hyoscyamus muticus)からのプレムナスピロジエノキシゲナーゼ(GenBank受託番号ABS00393)、スコッチスペアミントからの2つのリモネンヒドロキシラーゼ(Genbank受託番号AAQ18707及びAAQ18708)、タバコからのジテルペンヒドロキシラーゼ(Genbank受託番号AAD47832)並びにCYP71D科からの2つの種類、ジャガイモからのCyp71D4(Genbank受託番号CAC24711)及びチャコポテト(chaco potato)からのCYP71D6(Genbank受託番号P93530)。その配列を、ClustalWプログラム(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994); CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice; Nucleic Acids Res. 22, 4673−4680)で整列させた。アライメントを図2において示す。
ベチバーP450 cDNAのPCR増幅
実施例2において記載されたプライマーを、ベチバーcDNAライブラリーから、P450 cDNAフラグメントのPCRによる増幅のために使用した。PCRを、Advantage(登録商標)2 Polymerase Mix(Clontech、Takara Bio Europe)を使用して実施した。それぞれのPCR混合物は、50μLの合計容量で、5μLのAdvantage(登録商標)2 PCR Buffer、200μMのdNTP、200nMのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー、5μLの200倍希釈cDNA、1μLのAdvantage(登録商標)2 Polymerase Mixを含んだ。次の条件を、増幅のために使用した:
− 94℃で3分の変性
− 以下
・94℃で1分の変性
・最初のサイクルについて65℃で、及びそれぞれ次のサイクルで64℃で1分のアニーリング
・72℃で2分の伸長
を15サイクル
− 以下
・94℃で1分の変性
・58℃で1分のアニーリング
・72℃で2分の伸長
を20サイクル
− 最終的に72℃で10分の伸長。
細菌におけるベチバーP450の非相同発現
真核生物P450モノオキシゲナーゼにおいて、タンパク質のN末端配列は、これらの酵素の膜局在化のために必須な膜アンカーを構成する。プロリンが豊富な領域(521−11(配列番号:23)及び521−16(配列番号:24)におけるPPGP)によって範囲を設定されたタンパク質のこの部分は、酵素活性の特異性の調整に必須ではない。従って、この領域は、触媒活性に対して効果を有さない、欠失、挿入又は突然変異によって改質されてよい。しかしながら、植物P450を含む、真核生物P450のN末端領域の特異的改質は、微生物において発現させる場合に、検出された組換えタンパク質のレベルに対してポジティブな効果を有することが示されている(Halkier et al (1995) Arch. Biochem. Biophys. 322, 369−377; Haudenschield et al (2000) Arch. Biochem. Biophys. 379, 127−136)。従って、これらの以前の観察に基づいて、P450の膜アンカー領域VzP521−11及びVzP521−16を、再設計して、図3において示した改質を導入した。
細菌における植物P450レダクターゼの非相同発現
植物P450の活性を再構築するために、第二の膜タンパク質の存在が必須である。このタンパク質、P450レダクターゼ(CPR)は、NADPH(ニコチンアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形)からの電子のP450活性部位への輸送中に含まれる。ある植物からのCPRは、他の植物からのP450酵素の活性を補うことができることが示されている(Jensen and Moller (2010) Phytochemsitry 71, 132−141)。
2つのプラスミドを使用するP450及びP450レダクターゼの同時発現
植物P450を使用する細胞全体の生体内変化のために、単一の宿主細胞におけるP450及びCPRタンパク質の同時発現を要求する。この同時発現を、2つのプラスミドを使用して得ることができる。例えばBL21 StarTM(DE3) E.coli細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA)を、プラスミドpACYC−tcATR1−opt及びプラスミドpCW−218−521−11又はpCW−218−521−16で同時形質転換させた。形質転換させた細胞を、カルベニシリン(50μg/ml)及びクロラムフェニコール(34μg/ml)LBアガロースプレート上で選択した。単コロニーを使用して、同一の抗生物質で補った5mLの液体LB培地をインキュベートした。その培養物を37℃で一昼夜インキュベートした。翌日、同一の抗生物質で補った2〜250mLのTB培地及び1mMチアミンHCLを一昼夜培養物の0.2mLに植えた。37℃での培養の6時間後に、その培養物を28℃まで冷却させ、そして1mMのIPTG及び75mg/Lのδ−アミノレブリン酸を添加した。その培養を24〜36時間維持した。タンパク質分画を、実施例4において記載したように製造し、組換えP450及びCPRの発現を、それぞれ実施例4及び5において記載した手法を使用して評価した。
1つのプラスミドを使用するP450及びP450レダクターゼの同時発現
ベチバーP450についてエンコードするcDNA及びCPRについてコードするcDNAを含む2シストロン性構成物を有する発現プラスミドを製造した。その構成物を、2つのコード領域間に、リボソーム結合部位(RBS)を含むスペーサー配列を挿入するために設計した。
ベチバーP450及びCPRを発現するE.coliの全細胞を使用するジザエンからクシモルへの生物変換
(+)−ジザエンの酸化を、ベチバーP450及びCPRを発現するE.coliの全細胞を使用して実施できる(生物変換)。ジザエンを、特許WO 2010/134004号において記載された方法に従って遺伝子操作したE.coli細胞を使用して、及び配列受託番号HI931369を有するセスキテルペン合成酵素を使用して製造した。
ベチバーP450及びCPRを発現するE.coliの全細胞を使用する他のモノテルペン及びセスキテルペン分子の生物変換
ベチバーP450及びCPRを発現するE.coli細胞を製造し、育て、そして生物変換を、実施例8において記載したリン酸カリウム緩衝液中で得た細胞を使用して実施した。
ベチバーP450を使用する化合物のin vitro酸化
ベチバーからのP450を使用するセスキテルペンの酸化を、細胞溶解物又は部分的に生成したタンパク質を使用してin vitroでも実施できる。
遺伝子操作した細胞におけるクシモルのin vivo製造
(+)−ジザエンの酸化生成物を、遺伝子操作したE.coli細胞中でも実施して、炭素源、例えばグルコース又はグリセロールからセスキテルペンを製造できる。プラスミドを、P450、P450レダクターゼ及びテルペン合成酵素から構成されるオペロンを含むpCWori(Barnes H.J (1996) Method Enzymol. 272, 3−14)プラスミドから製造した。そして、2つのプラスミドを、pCW−2391−521−11又はpCW−2392−521−16におけるCPR配列の終止コドンの後に、RBS配列及び(+)−ジザエン合成酵素(VzZS)についてコードする最適化配列を挿入することによって製造した。
Claims (37)
- 配列番号:1又は2に対して少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含み、かつシトクロムP450活性を有するポリペプチド。
- 配列番号:1又は2に対して少なくとも85%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号:1又は2を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- さらに膜アンカー配列を含む、請求項1から3までのいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 場合により膜アンカー配列と共に、配列番号:1又は2からなる、請求項1から3までのいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、単環式又は多環式のモノテルペン及びセスキテルペンから選択される少なくとも1つのテルペン化合物を酸化することができることを特徴とする、請求項1から5までのいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記単環式又は多環式のモノテルペン又はセスキテルペンが、環状部分上で置換基として少なくとも1つのメチル基を含むことを特徴とする、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記単環式又は多環式のモノテルペン又はセスキテルペンが、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−ロンギピネン、アルファ−フネブレン、ツジョセン、バレンセン、ベータ−カミグレン、アロアルマデンドレン、アルファ−ネオクロベン、イソサチベン、レデン、S−リモネン、アルファ−フムレン、アルファ−グルユネン、アルファ−ピネン、ベータ−フネブレン、R−リモネン及びベータ−ピネンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記単環式又は多環式のモノテルペン又はセスキテルペンが、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−フネブレン、バレンセン及びツジョセンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載のポリペプチド。
- 請求項1から9までのいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 配列番号:3、4又はそれらの補体に対して少なくとも70%同一のヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の核酸。
- 配列番号:3、4又はそれらの補体に対して少なくとも90%同一のヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の核酸。
- 配列番号:3、4又はそれらの補体を含む、請求項12に記載の核酸。
- 場合により膜アンカー配列をコードするヌクレオチド配列と共に、配列番号:3、4又はそれらの補体からなる、請求項10に記載の核酸。
- 請求項10から14までのいずれか1項に記載の核酸を含む発現ベクター。
- ウィルスベクター、バクテリオファージ、又はプラスミドの形での、請求項15に記載の発現ベクター。
- 転写、翻訳開始又は終止を調節する少なくとも1つの調節配列、例えば転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、又はmRNAリボソーム結合部位に操作可能に連結され、及び場合により少なくとも1つの選択マーカーを含む本発明の核酸を含む、請求項15又は16に記載の発現ベクター。
- 請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸を有するために形質転換される、ヒトでない宿主生物又は宿主細胞。
- 前記ヒトでない宿主生物が、植物、原核生物又は真菌である、請求項18に記載のヒトでない宿主生物。
- 前記ヒトでない宿主生物が、微生物である、請求項18に記載のヒトでない宿主生物。
- 前記微生物が、細菌又は酵母である、請求項20に記載のヒトでない宿主生物。
- 前記細菌がE.coliであり、かつ前記酵母がサッカロミセス・セレビジエである、請求項21に記載のヒトでない宿主生物。
- 植物細胞である、請求項18に記載のヒトでない宿主細胞。
- 少なくとも1つのテルペン化合物を酸化するための方法において、
a)P450レダクターゼ(CPR)の存在で、該テルペン化合物と請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドとを接触すること、
b)場合により、工程a)において製造された酸化させたテルペンを単離すること
を含む、前記方法。 - 前記テルペン化合物が、単環式又は多環式のモノテルペン及びセスキテルペンから選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記テルペン化合物が、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−ロンギピネン、アルファ−フネブレン、ツジョセン、バレンセン、ベータ−カミグレン、アロアルマデンドレン、アルファ−ネオクロベン、イソサチベン、レデン、S−リモネン、アルファ−フムレン、アルファ−グルユネン、アルファ−ピネン、ベータ−フネブレン、R−リモネン及びベータ−ピネンからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記テルペン化合物が、ジザエン、アルファ−セドレン、アルファ−フネブレン、バレンセン及びツジョセンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項26に記載のポリペプチド。
- 前記工程a)を、テルペン化合物の酸化を促す条件下で酸化させたテルペン化合物の存在で、請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを発現するために形質転換させたヒトでない宿主生物又は宿主細胞を培養することにより実施し、該生物又は細胞は、さらにCPRを発現する、請求項24から27までのいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記工程a)の前に、請求項10から14までのいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸でヒトでない宿主生物又は宿主細胞を形質転換し、該生物又は細胞が、請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを発現することを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記ヒトでない宿主生物が、植物、原核生物又は真菌である、請求項28又は29に記載の方法。
- 前記ヒトでない宿主生物が、微生物である、請求項28又は29に記載の方法。
- 前記微生物が、細菌又は酵母である、請求項31に記載の方法。
- 前記細菌がE.coliであり、かつ前記酵母がサッカロミセス・セレビジエである、請求項32に記載の方法。
- 前記ヒトでない宿主細胞が、植物細胞である、請求項29又は30に記載の方法。
- 以下、
a)請求項10から14までのいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸を有するために形質転換させたヒトでない宿主生物又は宿主細胞を培養し、請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを発現又は過剰発現すること、
b)工程a)において培養したヒトでない宿主生物又は宿主細胞からポリペプチドを単離すること
を含む、請求項1から9までのいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを製造するための方法。 - さらに、工程a)の前に、請求項10から14までのいずれか1項に記載の少なくとも1つの核酸でヒトでない宿主生物又は宿主細胞を形質転換して、請求項1から9までのいずれか1項に記載のポリペプチドを発現又は過剰発現する工程を含む、請求項35に記載の方法。
- テルペン化合物を酸化できる変異体ポリペプチドを製造するための方法であって、
(a)請求項10から14までのいずれか1項に記載の核酸を選択する工程、
(b)選択した核酸を改質して、少なくとも1つの突然変異体核酸を得る工程、
(c)宿主細胞又は単細胞生物を突然変異体核酸配列で形質転換して、突然変異体核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現する工程、
(d)テルペン化合物を酸化する少なくとも1つの変異体活性についてポリペプチドをスクリーニングする工程、
(e)場合により、ポリペプチドが所望の変異体活性を有さない場合に、プロセス工程(a)〜(d)を、所望の変異体を有するポリペプチドが得られるまで繰り返す工程、
(f)場合により、所望の変異体活性を有するポリペプチドが、工程(d)において同定された場合に、工程(c)において得られた対応する突然変異体核酸を単離する工程
を含む、前記方法。
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