ES2940086T3 - Santaleno sintasa - Google Patents

Abstract

La invención está dirigida a una santalene sintasa, a un ácido nucleico que codifica dicha santalene sintasa, a un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, a una célula huésped que comprende dicho vector de expresión, a un método para preparar santalene, a un método para preparar santalol y a un método para preparar una santalene sintasa. La invención se refiere además a un anticuerpo específico para la santalane sintasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Santaleno sintasa

La invención se dirige a una santaleno sintasa, a un ácido nucleico que codifica dicha santaleno sintasa, a un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, a una célula huésped que comprende dicho vector de expresión, a un método de preparación de santaleno, a un método de preparación de santalol y a un método de preparación de una santaleno sintasa.

Muchos organismos tienen la capacidad de producir una amplia gama de terpenos y terpenoides. Los terpenos se construyen real o conceptualmente a partir de residuos de 2-metilbutano, usualmente denominados unidades de isopreno, que tiene la fórmula molecular C5H8. Se puede considerar la unidad isopreno como uno de los bloques de construcción comunes de la naturaleza. Las fórmulas moleculares básicas de los terpenos son múltiplos de esa fórmula: (C5H8)n, siendo n el número de unidades de isopreno enlazadas. Esto se denomina la regla del isopreno, por lo que los terpenos también se denominan isoprenoides. Las unidades de isopreno pueden estar unidas "cabeza con cola" para formar cadenas lineales o pueden estar dispuestas para formar anillos. En su biosíntesis, los terpenos se forman a partir de los precursores universales de 5 carbonos isopentenil difosfato (IPP) y su isómero, dimetilalil difosfato (DMAPP). En consecuencia, un esqueleto de carbono de terpeno generalmente comprende un múltiplo de 5 átomos de carbono. Los más comunes son los terpenos de 5-, 10-, 15-, 20-, 30- y 40- carbonos, denominados hemi-, mono-, sesqui-, di-, tri- y tetraterpenos, respectivamente. Además de las conexiones "cabeza-cola", los tri- y tetraterpenos también contienen una conexión "cola-a-cola" en su centro. Los terpenos pueden comprender otros grupos funcionales, como alcoholes y sus glucósidos, éteres, aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos y ésteres. Estos terpenos funcionalizados se denominan en lo sucesivo terpenoides. Al igual que los terpenos, los terpenoides suelen tener un esqueleto de carbono que tiene un múltiplo de 5 átomos de carbono. Cabe señalar que el número total de carbonos en un terpenoide no necesita ser múltiplo de 5, por ejemplo, el grupo funcional puede ser un grupo éster que comprenda un radical alquilo con cualquier número de átomos de carbono.

Aparte de las definiciones anteriores, es importante señalar que los términos "terpeno", "terpenoide" e "isoprenoide" se utilizan con frecuencia indistintamente en la literatura abierta y en la de patentes.

El documento WO2016064347 divulga el aislamiento de ácidos nucleicos que codifican terpeno sintasas de Cananga odorata.

El santaleno es un sesquiterpeno natural que se produce en determinadas plantas, tal como el sándalo. El santaleno, y especialmente el p-santaleno, es útil como material de partida para la síntesis química o la biosíntesis del santalol y, en particular, para el p -santalol, que es uno de los principales componentes del aceite de sándalo. El aceite de sándalo es un importante ingrediente de perfumería que se obtiene por destilación al vapor del duramen de diversas especies del árbol de sándalo (Santalum), por ejemplo, Santalum album y Santalum spicatum. El aceite de sándalo se utiliza en perfumería, cosmética y aromatización. El aceite de sándalo contiene más de 90% de alcoholes sesquiterpénicos, de los cuales 40-60% corresponde al a-santalol, mientras que el p-santalol comprende 15-25%. Aunque otros componentes tales como a-santalol, epi-p-santalol y bergamotol también pueden contribuir al perfil sensorial típico del aceite de sándalo, p-santalol se considera la molécula más importante que define el olor del aceite de sándalo. La composición exacta del aceite depende de la especie de Santalum, de las condiciones de recolección y del proceso de destilación empleado.

Los árboles de sándalo se han sobreexplotado para producir sándalo y aceite de sándalo durante un largo periodo, lo que ha llevado al estado de amenaza de varias especies de sándalo (Teixeira da Silva et al., 2016). En consecuencia, el suministro de aceite de sándalo ha disminuido considerablemente en los últimos años. Por lo tanto, es deseable proporcionar una fuente alternativa de terpenos del aceite de sándalo, y especialmente de los a- y p-santaloles, que son las moléculas clave para definir el olor dulce, cálido y amaderado del aceite de sándalo (Baldovini et al., 2011) (Díaz-Chávez et al., 2013).

Se ha propuesto preparar santaleno (o santalol) microbiológicamente, utilizando microorganismos modificados genéticamente mediante la incorporación de un gen que codifica una proteína con actividad santaleno sintasa. Una santaleno sintasa puede utilizarse para la preparación de santaleno a partir de FPP, una conversión que podría ejecutarse como una reacción aislada(in vitro) o como parte de una vía metabólica más larga que conduzca eventualmente a la producción de santaleno a partir de azúcar(in vivo).

El documento WO/2010/067309 describe un método para producir p-santaleno utilizando una santaleno sintasa de Santalum (Schalk, 2014). Patente de los Estados Unidos 8993284, WO201100026 y Jones et al. (2011) describen terpeno sintasas de tres especies diferentes de Santalum(Santalum album, S. austrocaledonicum y S. spicatum) que producen a-santaleno, a-trans-bergamoteno, epi-p-santaleno y p-santaleno simultáneamente (Zulak et al., 2016). El documento WO2015153501 describe enzimas santaleno sintasa modificadas derivadas de la santaleno sintasa de S. album con mayor actividad terpeno sintasa en comparación con la santaleno sintasa nativa de S. album . El documento WO2012/110375 describe una ruta de síntesis para un intermediario que puede utilizarse para la síntesis química de beta-santalol.

Las únicas terpeno sintasas conocidas que forman a-santaleno, p-santaleno, epi-p-santaleno y bergamoteno se han identificado hasta ahora en el género Santalum. Sin embargo, se han descrito otras plantas que producen algunos sesquiterpenoides del tipo del santalol: El documentoWO2006/134523 describe una terpeno sintasa capaz de sintetizar sesquiterpenos con un esqueleto de santaleno, como epi-p-santaleno y trans-a-bergamoteno, pero no se describe la producción de p-santaleno y a-santaleno (SCHALK, 2006). El epi-p-santaleno no puede utilizarse para la síntesis del p-santalol deseado. El documento WO2009/109597 describe otra terpeno sintasa capaz de producir terpenos del tipo santaleno (Schalk, 2016). Sin embargo, la sintasa descrita produce a-santaleno a partir de E,E-farnesil pirofosfato, pero no p-santaleno. El documento WO 2008/142318 describe una a-santaleno sintasa de Solanum habrochaites. Esta enzima utiliza el Z,Z-farnesil pirofosfato como sustrato para producir a-santaleno. De nuevo, la sintasa descrita sólo produce a-santaleno y no p-santaleno. Se ha descrito que los aceites esenciales derivados de la hidrodestilación de las hojas, el tallo y la corteza del alcanforero, Cinnamomum camphora, contienen terpenos de tipo santaleno, concretamente a-santaleno, cis-a-bergamoteno, epi-beta-santaleno y beta-santaleno (Pelissier & Bessiere, 1995), pero no se ha identificado ningún terpeno sintasa correspondiente.

Las santaleno sintasas conocidas actualmente presentan una serie de inconvenientes que son especialmente indeseables cuando se aplican en un proceso industrial de producción de santaleno en el que el santaleno (o santalol y, en particular, el p-santalol) se prepara a partir de FPP, ya sea en una reacción aislada(in vitro), por ejemplo, utilizando una santaleno sintasa aislada o células enteras (permeabilizadas), o de otro modo, por ejemplo, en un proceso fermentativo que forma parte de una ruta metabólica más larga que conduce eventualmente a la producción de p-santalol a partir de azúcar(in vivo).

Así pues, existe la necesidad de una santaleno sintasa alternativa que pueda utilizarse en la preparación de santaleno, en particular p-santaleno y/o p-santalol. En particular, se necesita una santaleno sintasa alternativa que muestre una expresión mejorada, al menos en células huésped seleccionadas; una santaleno sintasa alternativa que tenga una actividad enzimática elevada al menos en condiciones específicas, tal como a un pH neutro o alcalino y/o intracelularmente en la célula en la que se ha producido; y/o una santaleno sintasa alternativa que sea altamente específica, en particular que tenga una especificidad mejorada en comparación con la santaleno sintasa de Santalum album, con respecto a catalizar la conversión de FPP en p-santaleno, al menos en condiciones específicas, tal como a un pH aproximadamente neutro o alcalino y/o intracelularmente en la célula en la que se ha producido.

Se ha descubierto que un polipéptido específico hasta ahora desconocido tiene actividad santaleno sintasa y que este polipéptido puede utilizarse como catalizador que puede servir como alternativa a las santaleno sintasas conocidas.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una santaleno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3, o un homólogo funcional del mismo, siendo dicho homólogo funcional una santaleno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % con SEQ ID NO: 3 y que tenga una especificidad hacia la catálisis de la formación de santaleno, expresada como la relación molar santaleno/bergamoteno de al menos 1,5:1. Dicho homólogo puede ser, en particular, una santaleno sintasa que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % con SEQ ID NO: 3.

Además, la divulgación se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión a una santaleno sintasa de acuerdo con la invención.

El anticuerpo, que puede ser monoclonal o policlonal, puede producirse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Hudson et al., Practical Immunology, Tercera Edición (1989), Blackwell Scientific Publications.

La invención se refiere además a un ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa de acuerdo con la invención, o que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a dicha secuencia codificante, en la que el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y otras secuencias de ácido nucleico que codifican una santaleno sintasa de acuerdo con la invención, dichas otras secuencias que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, en la que la identidad de secuencia se compara en toda la longitud de la secuencia, o respectivamente de los ácidos nucleicos complementarios de la misma. Dicha otra secuencia de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa de acuerdo con la invención puede denominarse en lo sucesivo un análogo funcional.

Una santaleno sintasa o un ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser un compuesto natural o un fragmento de un compuesto aislado de su fuente natural (por ejemplo, Cinnamomum camphora), ser un compuesto sintetizado química o enzimáticamente o un fragmento de un compuesto o un compuesto o fragmento de un compuesto producido en una célula recombinante, en cuya célula recombinante puede estar presente o a partir de cuya célula puede haberse aislado.

La invención se refiere además a un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La invención se refiere además a una célula huésped, que puede ser un organismo no humano per se o parte de un organismo multicelular, que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico, preferentemente un ácido nucleico heterólogo a dicha célula huésped, de acuerdo con la invención. La célula huésped se selecciona preferentemente del grupo de las células bacterianas, las células fúngicas (incluyendo las levaduras) y las células vegetales.

La invención se refiere además a un método para preparar santaleno, que comprende convertir FPP en santaleno en presencia de una santaleno sintasa de acuerdo con la invención. Pueden existir cuatro isómeros geométricos diferentes de FPP, es decir, 2E,6E-FPP, 2Z,6E-FPP, 2E,6Z-FPP y 2Z,6Z-FPP. Se han obtenido buenos resultados con 2E,6E-FPP, aunque en principio cualquier otro isómero de FPP puede ser un sustrato adecuado para una enzima de acuerdo con la invención.

La invención se dirige además a un método para producir una santaleno sintasa de acuerdo con la invención, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la invención en condiciones propicias para la producción de la santaleno sintasa y, opcionalmente, recuperar la santaleno sintasa de la célula huésped.

Se ha descubierto que una santaleno sintasa de acuerdo con la invención es más específica hacia la síntesis de santaleno y en particular de p-santaleno que una santaleno sintasa de S. album, en particular a pH neutro o en torno al pH en un ensayo in vitro o en un método en el que el santaleno, y en particular el p-santaleno, se sintetiza intracelularmente en una célula huésped modificada genéticamente para producir una santaleno sintasa de acuerdo con la invención y una santaleno sintasa de S. album, respectivamente. Los resultados iniciales muestran que, en condiciones idénticas, la cantidad de producto secundario principal (bergamoteno) formado con la enzima novedosa de la invención es significativamente menor, es decir, una relación molar

a-santaleno/bergamoteno= 2:1 (0,5:1 para S. album)

p-santaleno/bergamoteno= 0,9:1 (0,3:1 para S. album)

a+p-santaleno/ bergamoteno= 2,9:1 (0,8:1 para S. album)

De acuerdo con la invención se ha encontrado posible llevar la santaleno sintasa a expresión con buen rendimiento en organismos distintos. Por ejemplo, se ha descubierto que la santaleno sintasa se expresa bien en E. coli, Rhodobacter sphaeroides y en plantas de Nicotiana benthamiana .

Así, en una realización ventajosa, la presente invención proporciona una santaleno sintasa con especificidad mejorada hacia la catálisis de la síntesis de santaleno y una tasa de producción mejorada para p-santaleno, cuando se usa en un método para preparar santaleno, en particular en comparación con la santaleno sintasa de S. album u otra santaleno sintasa de acuerdo con la técnica anterior, citada en el presente documento.

En una realización preferida, se proporciona un método para preparar santaleno de acuerdo con la invención, en el que el santaleno se prepara en una célula huésped, una planta o cultivo de plantas, o un hongo o cultivo de hongos, de acuerdo con la invención, que expresa dicha santaleno sintasa. Preferentemente, el método para preparar santaleno de acuerdo con la invención comprende además aislar el santaleno de dicha célula huésped, planta o cultivo vegetal, u hongo o cultivo de hongo. preferentemente, el método para preparar santaleno de acuerdo con la invención da como resultado una relación de a-santaleno a a-bergamoteno que es superior a 1:1, más preferentemente superior a 1,5:1, más preferentemente superior a 1,7:1, más preferentemente superior a 1,9:1, lo más preferentemente aproximadamente 2:1. Preferentemente, el método para preparar santaleno de acuerdo con la invención da como resultado una relación p -santaleno/a-bergamoteno superior a 0,5 : 1, más preferentemente superior a 0,6:1, más preferentemente superior a 0,7:1, más preferentemente superior a 0,8:1, más preferentemente alrededor de 0,9:1. Preferentemente, el método para preparar santaleno de acuerdo con la invención da como resultado una relación de santalenos (a- y p -santaleno) a a-bergamoteno superior a 2:1, más preferentemente superior a 2,3:1, más preferentemente superior a 2,5:1, más preferentemente superior a 2,7:1, más preferentemente superior a 2,8:1, lo más preferentemente alrededor de 2,9:1.

Sin estar limitado por la teoría, se cree que una alta especificidad hacia la catálisis de la síntesis de santaleno a pH neutro o ligeramente alcalino se considera en particular deseable para métodos en los que el santaleno se prepara intracelularmente, porque se cree que diversas células huésped tienen un pH intracelular neutro o ligeramente alcalino, tal como un pH de 7,0-8,5 (para valores de pH intracelular de bacterias, véase por ejemplo: Booth, Microbiological Reviews (1985) 49: 359-378). Cuando, por ejemplo, se expusieron células de E. coli a valores de pH que varían de 5,5 a 8,0, el pH intracelular se situó entre 7,1 y 7,9 (Olsen et al., Appl. Environ. Microbiol. (2002) 68: 4145-4147). Esto puede explicar una especificidad mejorada hacia la síntesis de santaleno de una santaleno sintasa de acuerdo con la invención, también intracelularmente.

El término "o" utilizado en el presente documento se define como "y/o" a menos que se especifique lo contrario. Los términos "un" o "una" utilizados en el presente documento se definen como "al menos uno", a menos que se especifique lo contrario.

Cuando se hace referencia a un sustantivo (porejemplo, un compuesto, un aditivo, etc.) en singular, se entiende que se incluye el plural.

Los términos farnesil difosfato y farnesil pirofosfato (ambos abreviados como FPP) utilizados indistintamente en el presente documento se refieren al compuesto 3,7,11 -trimetil-2,6,10-dodecatrien-1 -il pirofosfato e incluyen todos los isómeros conocidos de este compuesto.

El término "recombinante" en relación con una célula recombinante, vector, ácido nucleico o similar, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula, vector, ácido nucleico o similar, que contiene ácido nucleico que no se encuentra de forma natural en esa célula, vector, ácido nucleico o similar y/o que no se encuentra de forma natural en ese mismo lugar. Generalmente, dicho ácido nucleico se ha introducido en dicha cepa (célula) mediante técnicas de ADN recombinante.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se produce de forma natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en el que está presente, o que se encuentra en una célula o ubicación o ubicaciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que difieren de aquellas en las que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos a la célula en la que se introducen, sino que se han obtenido de otra célula o se han producido sintética o recombinantemente. Generalmente, aunque no necesariamente, dichos ácidos nucleicos codifican proteínas que normalmente no son producidas por la célula en la que se expresa el ADN.

Un gen que es endógeno a una célula huésped particular pero que ha sido modificado de su forma natural, a través, por ejemplo, del uso de mezcla de ADN, también se denomina heterólogo. El término "heterólogo" también incluye copias múltiples no naturales de una secuencia de ADN natural. Así, el término "heterólogo" puede referirse a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula, pero en una posición y/o un número dentro del ácido nucleico de la célula huésped en el que el segmento no se encuentra normalmente. Los segmentos de ADN exógenos se expresan para producir polipéptidos exógenos. Una secuencia de ADN "homóloga" es una secuencia de ADN asociada de forma natural con una célula huésped en la que se introduce.

Cualquier ácido nucleico o proteína que un experto en la técnica reconocería como heterólogo o extraño a la célula en la que se expresa se engloba en el término ácido nucleico o proteína heterólogos.

El término "mutado" o "mutación" utilizado en el presente documento en relación con proteínas o polipéptidos significa que al menos un aminoácido de la secuencia de proteína o polipéptido de tipo silvestre o natural ha sido sustituido por un aminoácido diferente, o eliminado, o insertado en la secuencia mediante mutagénesis de ácidos nucleicos que codifican estos aminoácidos. La mutagénesis es un método bien conocido en la técnica, e incluye, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio mediante PCR o mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos, como se describe en Sambrook, J., y Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.3ra ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001). El término "mutado" o "mutación", tal como se utiliza en el presente documento en relación con los genes, significa que al menos un nucleótido de la secuencia de nucleótidos de ese gen o de una secuencia reguladora del mismo, ha sido sustituido por un nucleótido diferente, o se ha eliminado o insertado en la secuencia mediante mutagénesis.

Los términos "marco de lectura abierto" y "ORF" se refieren a la secuencia de aminoácidos codificada entre los codones de iniciación y terminación de la traducción de una secuencia codificante. Los términos "codón de iniciación" y "codón de terminación" se refieren a una unidad de tres nucleótidos adyacentes ('codón') en una secuencia codificante que especifica la iniciación y la terminación en cadena, respectivamente, de la síntesis de proteínas (traducción del ARNm).

El término "gen" se utiliza en sentido amplio para referirse a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con una función biológica. Así, los genes incluyen secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Por ejemplo, gen se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras. Los genes también incluyen segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes pueden obtenerse de diversas fuentes, incluyendo la clonación a partir de una fuente de interés o la síntesis a partir de información de secuencias conocidas o predichas, y pueden incluir secuencias diseñadas para tener los parámetros deseados.

El término "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que contenga 1) secuencias de ADN, incluyendo secuencias reguladoras y codificadoras, que no se encuentran juntas en la naturaleza, o 2) secuencias que codifican partes de proteínas que no están unidas de forma natural, o 3) partes de promotores que no están unidos de forma natural. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de fuentes diferentes, o comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza.

El término "transgénico" para una célula u organismo transgénico, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un organismo o célula (que puede ser un organismo per se o una célula de un organismo pluricelular del que se ha aislado) que contiene un ácido nucleico que no se encuentra de forma natural en ese organismo o célula y cuyo ácido nucleico se ha introducido en ese organismo o célula (es decir, se ha introducido en el propio organismo o célula o en un ancestro del organismo o en un organismo ancestral de un organismo del que se ha aislado la célula) utilizando técnicas de ADN recombinante.

Un "transgén" se refiere a un gen que se ha introducido en el genoma por transformación y que preferentemente se mantiene de forma estable. Los transgenes pueden incluir, por ejemplo, genes heterólogos u homólogos a los genes de una planta concreta que se vaya a transformar. Además, los transgenes pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. El término "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped pero que se introduce por transferencia genética.

"Transformación" y "que transforma", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a la introducción de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, conjugación, f-apareamiento o electroporación. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma de la célula huésped.

"Secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ADN o ARN que codifica una secuencia específica de aminoácidos y excluye las secuencias no codificantes. Puede constituir una "secuencia codificante ininterrumpida", es decir, carente de intrón, tal como en un ADNc, o puede incluir uno o más intrones unidos por uniones de empalme apropiadas. Un "intrón" es una secuencia de ARN que está contenida en el transcrito primario pero que se elimina mediante la escisión y nueva ligadura del ARN dentro de la célula para crear el ARNm maduro que puede traducirse en una proteína.

"Secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras incluyen potenciadores, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias señal de poliadenilación. Incluyen secuencias naturales y sintéticas, así como secuencias que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Como se ha señalado anteriormente, el término "secuencias reguladoras adecuadas" no se limita a los promotores.

Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores (tales como promotores transcripcionales, promotores constitutivos, promotores inducibles), operadores o potenciadores, sitios de unión ribosomal de ARNm y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Las secuencias de ácido nucleico están "enlazadas operablemente" cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADNc de la invención.

Cada una de las secuencias reguladoras puede seleccionarse independientemente de secuencias reguladoras heterólogas y homólogas.

"Promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos, normalmente corriente arriba (5') de su secuencia codificante, que controla la expresión de dicha secuencia codificante proporcionando el reconocimiento para la ARN polimerasa y otros factores necesarios para una transcripción adecuada. "Promotor" incluye un promotor mínimo que es una secuencia corta de ADN compuesta por una caja TATA y otras secuencias que sirven para especificar el lugar de inicio de la transcripción, al que se añaden elementos reguladores para controlar la expresión. "Promotor" también se refiere a una secuencia de nucleótidos que incluye un promotor mínimo más elementos reguladores que es capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora consiste en elementos proximales y más distales corriente arriba, estos últimos a menudo denominados potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad tisular de un promotor. Es capaz de funcionar en ambas orientaciones (normal o invertida), y es capaz de funcionar incluso cuando se desplaza tanto corriente arriba como corriente abajo del promotor. Tanto los potenciadores como otros elementos promotores anteriores se unen a proteínas de unión al ADN específicas de la secuencia que median sus efectos. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso estar compuestos de segmentos de ADN sintético. Un promotor también puede contener secuencias de ADN implicadas en la unión de factores proteicos que controlan la eficacia del inicio de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo.

El término "ácido nucleico", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, es decir, un polinucleótido, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, abarca los análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en el sentido de que se hibridan a los ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a los nucleótidos naturales (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A menos que se indique lo contrario, el término incluye una referencia a la secuencia especificada, así como a su secuencia complementaria. Por lo tanto, los ADN o ARN con esqueletos modificados para lograr estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" en el sentido que se da a este término en el presente documento. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tal como bases tritiladas, por citar sólo dos ejemplos, son "polinucleótidos" en el sentido en que se utiliza este término en el presente documento. Se apreciará que se ha hecho una gran variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término "polinucleótido", tal y como se emplea en el presente documento, abarca dichas formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y las células, incluyendo, entre otras, las células simples y complejas.

Cada secuencia de ácido nucleico presente en el presente documento que codifica un polipéptido también, por referencia al código genético, describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. El término "variantes modificadas de forma conservadora" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias particulares de ácidos nucleicos, el término "variantes conservadoramente modificadas" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o conservadoramente modificadas de las secuencias de aminoácidos debido a la degeneración del código genético. El término "degeneración del código genético" se refiere al hecho de que un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición donde una alanina está especificada por un codón, éste puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada de forma conservadora. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan en el presente documento indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales. La naturaleza esencial de tales análogos de aminoácidos naturales es que, cuando se incorporan a una proteína, dicha proteína es específicamente reactiva frente a los anticuerpos provocados por la misma proteína, pero compuesta en su totalidad por aminoácidos naturales. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también incluyen modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, la glucosilación, la unión a lípidos, la sulfatación, la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ADP-ribosilación.

En el contexto de la presente solicitud, los oligómeros (tal como oligonucleótidos, oligopéptidos) se consideran una especie del grupo de los polímeros. Los oligómeros tienen un número relativamente bajo de unidades monoméricas, en general 2-100, en particular 6-100. Por "casete de expresión", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula huésped apropiada, que comprende un promotor unido de forma operable a la secuencia de nucleótidos de interés que está unida de forma operable a señales de terminación. También suele incluir secuencias necesarias para la traducción correcta de la secuencia de nucleótidos. La región codificante suele codificar una proteína de interés, pero también puede codificar un ARN funcional de interés, por ejemplo, un ARN antisentido o un ARN no traducido, en sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser uno que exista de forma natural pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción sólo cuando la célula huésped está expuesta a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo pluricelular, el promotor también puede ser específico de un tejido u órgano concreto o de una fase de desarrollo.

El término "vector", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una construcción compuesta de material genético diseñado para dirigir la transformación de una célula objetivo. Un vector contiene múltiples elementos genéticos orientados posicional y secuencialmente, es decir, vinculados operativamente con otros elementos necesarios, de forma que el ácido nucleico de un casete de ácido nucleico pueda transcribirse y, cuando sea necesario, traducirse en las células transformadas. En particular, el vector puede seleccionarse del grupo de vectores virales, (bacterio)fagos, cósmidos o plásmidos. El vector también puede ser un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial bacteriano (BAC) o un vector binario de Agrobacterium . El vector puede tener una forma lineal o circular de cadena doble o simple que puede ser o no autotransmisible o movilizable, y que puede transformar el huésped procariota o eucariota bien por integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (por ejemplo, plásmido replicante autónomo con un origen de replicación). Se incluyen específicamente los vectores lanzadera, es decir, un vehículo de ADN capaz, naturalmente o por diseño, de replicarse en dos organismos huéspedes diferentes, que pueden seleccionarse de actinomicetos y especies afines, bacterias y eucariotas (por ejemplo, células de plantas superiores, mamíferos, levaduras u hongos). Preferentemente, el ácido nucleico del vector está bajo el control de un promotor adecuado u otros elementos reguladores para la transcripción en una célula huésped, tal como una célula microbiana, por ejemplo, bacteriana, o vegetal, y está unido de forma operable a ellos. El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que funcione en múltiples huéspedes. En el caso del ADN genómico, éste puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y, en el caso del ADNc, puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para su expresión en la célula huésped.

Los vectores que contienen un ácido polinucleico de acuerdo con la invención pueden prepararse con base en una metodología conocida en la técnica per se. Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia de ADNc que codifique el polipéptido de acuerdo con la invención unido de forma operable a elementos reguladores adecuados, tal como secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales o translacionales.

El término "vector", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la referencia a un vector para el trabajo de clonación estándar ("vector de clonación"), así como a vectores de tipo más especializado, como un vector de expresión (autosómico) y un vector de clonación utilizado para la integración en el cromosoma de la célula huésped ("vector de integración").

Los "vectores de clonación" contienen típicamente uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los que pueden insertarse secuencias de ADN extrañas de forma determinable sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación.

El término "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, unido operablemente a) segmentos de ácido nucleico adicionales que permiten su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión suelen derivar de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. En particular, un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que comprende en la dirección 5' a 3' y operativamente enlazados: (a) una región de iniciación de la transcripción y de la traducción que son reconocidas por el organismo huésped, (b) una secuencia codificante para un polipéptido de interés, y (c) una región de terminación de la transcripción y de la traducción que son reconocidas por el organismo huésped. "Plásmido" se refiere al ADN extracromosómico de replicación autónoma que no está integrado en el genoma de un microorganismo y suele ser de naturaleza circular.

Un "vector de integración" se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que puede incorporarse al genoma de un microorganismo y proporciona una herencia estable de un gen que codifica un polipéptido de interés. El vector de integración comprende generalmente uno o más segmentos que comprenden una secuencia génica que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, unido operablemente a) segmentos adicionales de ácido nucleico que permiten su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y uno o más segmentos que impulsen la incorporación del gen de interés en el genoma de la célula objetivo, normalmente mediante el proceso de recombinación homóloga. Normalmente, el vector de integración será uno que pueda transferirse a la célula objetivo, pero que tenga un replicón que no sea funcional en ese organismo. La integración del segmento que comprende el gen de interés puede seleccionarse si se incluye un marcador apropiado dentro de ese segmento.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "enlazado operablemente" o "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "operativamente ligada" a otra secuencia de control y/o a una secuencia codificante se liga de tal manera que la transcripción y/o expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con la secuencia de control. Generalmente, enlazadas de forma operable significa que las secuencias de ácido nucleico enlazadas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura.

El término "santaleno sintasa" se utiliza en el presente documento para polipéptidos que tienen actividad catalítica en la formación de santaleno y terpenos similares al santaleno tal como a-santaleno, p-santaleno, trans-a-bergamoteno y epi-p-santaleno a partir de farnesil difosfato, y para otras fracciones que comprenden dicho polipéptido. Ejemplos de estas otras fracciones incluyen complejos de dicho polipéptido con uno o más polipéptidos, proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de santaleno sintasa fusionado a una secuencia peptídica o proteica, otros complejos de dichos polipéptidos (por ejemplo, complejos metaloproteicos), compuestos macromoleculares que comprenden dicho polipéptido y otra molécula orgánica, dicho polipéptido unido a un material de soporte, etc. La santaleno sintasa puede suministrarse en su medio natural, es decir, dentro de una célula en la que se ha producido, o en el medio al que ha sido excretada por la célula que la produce. También puede suministrarse separado de la fuente que ha producido el polipéptido y puede manipularse uniéndolo a un portador, etiquetándolo con una fracción de etiquetado, etc. El término "homólogo funcional" de una secuencia, o abreviado "homólogo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende dicha secuencia específica con la condición de que uno o más aminoácidos se sustituyan, supriman, añadan y/o inserten, y cuyo polipéptido tiene (cualitativamente) la misma funcionalidad enzimática para la conversión de sustratos en caso de que el término "homólogo funcional" se utilice para una enzima, es decir, un homólogo de la secuencia con SEQ ID NO: 3 con actividad catalítica en la formación de santaleno a partir de farnesil difosfato. En los ejemplos se describe una prueba adecuada para verificar si un polipéptido o una fracción que comprende un polipéptido es una santaleno sintasa ("Prueba de actividad santaleno sintasa"). Además, el experto reconoce que las secuencias nucleotídicas equivalentes abarcadas por esta invención también pueden definirse por su capacidad de hibridación, bajo condiciones bajas, moderadas y/o estrictas, con las secuencias nucleotídicas que están dentro del alcance literal de las presentes reivindicaciones.

Un homólogo de SEQ ID NO: 3 de acuerdo con la invención tiene una especificidad hacia la catálisis de la formación de santaleno, expresada como la relación molar de santaleno a bergamoteno (un producto secundario conocido, formado en reacciones catalizadas por santaleno sintasa conocidas) de al menos 1.5:1, más en particular de al menos 2:1, más en particular de al menos 2,4:1, más en particular de al menos 2,8:1, cuando se determina a pH 7, utilizando el ensayo de actividad santaleno sintasa descrito en el presente documento más adelante en los Ejemplos (utilizando un polipéptido purificado). Dicha relación puede ser infinita (1:0; es decir, no se forma ninguna cantidad detectable de bergamoteno), o hasta 100:1, o hasta 10:1 o hasta 5:1.

La identidad o similitud de secuencias se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias de ácidos nucleicos, determinada mediante la comparación de dichas secuencias. Normalmente, las identidades o similitudes de secuencias se comparan en toda la longitud de las secuencias, pero también pueden compararse sólo para una parte de las secuencias que se alinean entre sí. En la técnica, por "identidad" o "similitud" también se entiende el grado de parentesco de secuencia entre secuencias polipeptídicas o secuencias de ácido nucleico, según el caso, determinado por la correspondencia entre dichas secuencias. La identidad de secuencia utilizada en el presente documento es el valor determinado por el algoritmo de alineación por pares "Needle" de EMBOSS, por ejemplo, en el servidor del European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/). Para la alineación de secuencias de aminoácidos los parámetros por defecto son: Matriz = Blosum62; Penalización por brecha abierta = 10,0; Penalización por extensión de brecha = 0,5. Para la alineación de secuencias de ácidos nucleicos los parámetros por defecto son: Matriz = DNAfull; Penalización por brecha abierta = 10,0; Penalización por extensión de brecha = 0,5.

Discrepancias entre una santaleno sintasa de acuerdo con SEQ ID NO: 3 o un ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 disponible y un homólogo funcional de dicha santaleno sintasa puede ser, en particular, el resultado de modificaciones realizadas, por ejemplo, para mejorar una propiedad de la santaleno sintasa o del ácido polinucleico (por ejemplo, una expresión mejorada) mediante una técnica biológica conocida por el experto en la técnica, tal como, por ejemplo, la evolución molecular o el diseño racional o mediante el uso de una técnica de mutagénesis conocida en la técnica (mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida al sitio, evolución dirigida, recombinación génica, etc.). La secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante de la santaleno sintasa puede estar alterada en comparación con las secuencias de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, respectivamente, como resultado de una o más variaciones naturales. Ejemplos de estas modificaciones/variaciones naturales son las diferencias en la glicosilación (definidas más ampliamente como "modificaciones postraduccionales"), las diferencias debidas al empalme alternativo y los polimorfismos de ácido nucleico único (SNP). El ácido nucleico puede modificarse de forma que codifique un polipéptido que difiera en al menos un aminoácido del polipéptido de SEQ ID NO: 3, de modo que codifica un polipéptido que comprende una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 3, cuyo polipéptido sigue teniendo actividad santaleno sintasa. Además, puede hacerse uso de la optimización de codones u optimización de pares de codones, por ejemplo, con base en un método como el descrito en el documento WO 2008/000632 o como el que ofrecen empresas comerciales de síntesis de ADN como DNA2.0, Geneart y GenScript. Ejemplos de una secuencia de codón optimizado es SEQ ID NO: 2. Pueden incorporarse a los vectores (de expresión) una o más secuencias que codifiquen péptidos señal apropiados que no estén naturalmente asociados con los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, una secuencia de ADN para un péptido señal líder se puede fusionar en el marco a una secuencia de ácido nucleico de la invención para que el polipéptido de la invención se traduzca inicialmente como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Dependiendo de la naturaleza del péptido señal, el polipéptido expresado se dirigirá de forma diferente. Un péptido señal secretor que sea funcional en las células huésped previstas, por ejemplo, aumenta la secreción extracelular del polipéptido expresado. Otros péptidos señal dirigen los polipéptidos expresados a determinados orgánulos, como los cloroplastos, las mitocondrias y los peroxisomas. El péptido señal puede escindirse del polipéptido durante el transporte al orgánulo previsto o desde la célula. Es posible proporcionar una fusión de una secuencia peptídica adicional en el extremo amino o carboxilo terminal de un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3 u homólogo del mismo.

Como se ha mencionado anteriormente, la invención se refiere además a una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la invención. Por "célula huésped" se entiende una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector.

El ácido nucleico de la invención es heterólogo a la célula huésped de la invención. La célula huésped puede ser una célula procariota, una célula eucariota o una célula de un miembro de las Archaea. La célula huésped puede proceder de cualquier organismo no humano. En particular, la célula huésped puede seleccionarse de células bacterianas, células fúngicas, arqueas, protistas, células vegetales (incluyendo las algas), células procedentes de un animal (en particular aisladas de dicho animal). La célula huésped puede formar parte de un organismo pluricelular, distinto del humano o del organismo del que procede naturalmente la enzima (tal como Cinnamomum camphora en el caso de la santaleno sintasa de SEQ ID NO: 3). En una realización específica, las células huésped de la invención se encuentran en un cultivo de células procedentes de un organismo multicelular, pero aisladas del mismo.

En general, la célula huésped es una célula aislada que comprende genes para expresar las enzimas para catalizar los pasos de reacción de la vía del mevalonato u otra vía metabólica (tal como la vía de la deoxilulosa-5-fosfato (DXP)) que permite la producción de los difosfatos de prenilo C5 isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP), que son los bloques de construcción isoprenoides universales. Hasta donde se sabe, a menos que se hayan eliminado genes específicos, todos los organismos conocidos comprenden una vía de este tipo. En general, los eucariotas son naturalmente capaces de preparar PPI a través de la vía del mevalonato. A continuación, este IPP se isomeriza en DMAPP por la acción de la enzima isopentenil difosfato isomerasa (Idi). La vía DXP, que proporciona IPP y DMAPP en una relación de 5:1, es común a los procariotas, aunque varios procariotas son capaces de preparar IPP de forma natural a través de la vía del mevalonato. Estas vías son conocidas en la técnica y han sido descritas, por ejemplo, por Withers & Keasling en Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 73: 980-990. Cada uno de los genes de estas vías puede ser homólogo o heterólogo de la célula.

Las células huésped comprenderán, además, ya sea endógenamente o a partir de fuentes heterólogas, uno o más genes para expresar enzimas con actividad prenil transferasa que catalizan la condensación cabeza-cola de los prenil difosfatos C5 produciendo prenil difosfatos más largos. El precursor sesquiterpénico universal farnesil difosfato (FPP), por ejemplo, se forma por la acción de estas enzimas mediante la adición sucesiva cabeza-cola de 2 moléculas de IPP a 1 molécula de DMAPP.

En una realización, la célula huésped es una bacteria. La bacteria puede ser grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas pueden seleccionarse de los géneros Bacillus y Lactobacillus, en particular de las especies Bacillus subtilis y Lactobacillus casei.

En una realización preferida, la bacteria se selecciona del grupo de bacterias Gram negativas, en particular del grupo de Rhodobacter, Paracoccus y Escherichia, más en particular del grupo de Rhodobacter capsulatus,

Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus zeaxanthinifaciens y Escherichia coli. Rhodobacter sphaeroides es un ejemplo de organismo que contiene de forma natural todos los genes necesarios para expresar las enzimas que catalizan los distintos pasos de reacción de la vía DXP, permitiendo la producción intracelular de IPP y DMAPP. En una realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica, en particular una célula fúngica seleccionada del grupo de Aspergillus, Blakeslea, Penicillium, Phaffia (Xanthophyllomyces), Pichia, Saccharomyces y Yarrowia, más en particular del grupo de Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Blakeslea trispora, Penicillium chrysogenum, Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous), Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica.

También es posible expresar los ácidos nucleicos de la invención en células derivadas de organismos eucariotas superiores, tal como células vegetales y células animales, tal como células de insecto, o células de ratón, rata o humanas. Dichas células pueden mantenerse en un cultivo celular o tisular y utilizarse para la producción in vitro de santaleno sintasa.

Un organismo multicelular que comprende células huésped de acuerdo con la invención se selecciona del grupo de plantas multicelulares y hongos(Basidiomycetes).

Así, en una realización específica, la invención se refiere a una planta transgénica o a un cultivo de células o tejidos vegetales que comprende células vegetales transgénicas, dicha planta o cultivo que comprende células huésped vegetales de acuerdo con la invención. La planta transgénica o el cultivo de células vegetales transgénicas podrá seleccionarse, en particular, de Nicotiana spp., Solanum spp., Cichorum intybus, Lactuca sativa, Mentha spp., Artemisia annua, plantas formadoras de tubérculos, tales como Helianthus tuberosus, mandioca y Beta vulgaris, cultivos oleaginosos, tales como Brassica spp, Elaeis spp. (palmera de aceite), Helianthus annuus, Glycine m axy Arachis hypogaea, plantas de cultivo líquido, tal como la lenteja de agua Lemna spp., células BY2 de tabaco y Physcomitrella patens, árboles, tales como el pino y el álamo, respectivamente un cultivo celular o un cultivo de tejidos de cualquiera de dichas plantas. En una realización específica, el cultivo de tejidos es un cultivo de raíces pilosas.

En otra realización específica, la invención se refiere a un hongo transgénico o a un cultivo que comprende células de hongo transgénico. El hongo transgénico o el cultivo que comprende las células huésped transgénicas puede seleccionarse en particular del grupo de Schizophyllum, Agaricus y Pleurotus, más en particular de Schizophyllum commune, el hongo común(Agaricus bisporus), el hongo ostra(Pleurotus ostreotus y Pleurotus sapidus), respectivamente un cultivo que comprenda células de cualquiera de dichos hongos.

Una célula huésped de acuerdo con la invención puede producirse basándose en técnicas genéticas y de biología molecular estándar generalmente conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., y Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3ra ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001); y F.M. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, Inc., Nueva York (1987), y suplementos posteriores.

Los métodos para transformar Basidiomycetes son conocidos por, por ejemplo, Alves et al. (Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 6379-6384), Godio et al. (Curr. Genet. (2004) 46: 287-294), Schuurs et al. (Genética (1997) 147: 589-596), y el documento WO 06/096050. Para lograr la expresión de un gen de santaleno sintasa adecuado en basidiomicetos, su marco de lectura abierto completo se clona normalmente en un vector de expresión adecuado para la transformación de basidiomicetos. Preferentemente, el vector de expresión también comprende secuencias de ácido nucleico que regulan el inicio y la terminación de la transcripción. También se prefiere incorporar al menos un gen marcador seleccionable para permitir la selección de los transformantes. La expresión de una santaleno sintasa puede lograrse utilizando un promotor de basidiomicetos, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible. Un ejemplo de promotor constitutivo fuerte es el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpdA). Se prefiere este promotor para la expresión constitutiva cuando el material de ADN recombinante se expresa en un hospedador basidiomiceto. Otros ejemplos son el promotor de la fosfoglicerato cinasa (pgk), el promotor de la piruvato cinasa (pki), TPI, el promotor de la triosa fosfato isomerasa (tpi), el promotor de la APC sintetasa subunidad g (oliC), el promotor sc3 y el promotor de la acetamidasa (amdS) de un basidiomiceto (documento WO 96/41882).

Si es necesario, la secuencia primaria de nucleótidos del gen de la santaleno sintasa puede adaptarse al uso de codones del huesped basidiomiceto.

Además, la expresión puede dirigirse especialmente al micelio (monocariota) o a los cuerpos fructíferos (dicariotas). En este último caso, el promotor Fbh1 de Pleurotis es especialmente útil (Penas, M.M. et al., Mycologia (2004) 96: 75­ 82).

Las metodologías para la construcción de construcciones de transformación de plantas se describen en la técnica. La sobreexpresión puede lograrse mediante la inserción de una o más copias adicionales del gen seleccionado. No es desconocido que las plantas o su progenie, originalmente transformadas con una o más de una copia extra de una secuencia de nucleótidos muestren sobreexpresión.

La obtención de niveles suficientes de expresión transgénica en los tejidos vegetales apropiados es un aspecto importante en la producción de cultivos modificados genéticamente. La expresión de secuencias de ADN heterólogas en una planta huésped depende de la presencia de un promotor operable que sea funcional en la planta huésped. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde se expresa la secuencia de ADN heteróloga dentro del organismo. Aunque se ha demostrado que muchos promotores de dicotiledóneas son operativos en monocotiledóneas y viceversa, lo ideal es seleccionar promotores de dicotiledóneas para la expresión en dicotiledóneas y promotores de monocotiledóneas para la expresión en monocotiledóneas. Sin embargo, no existe ninguna restricción en cuanto a la procedencia de los promotores seleccionados; basta con que sean operativos para impulsar la expresión de las secuencias de nucleótidos en la célula o tejido deseados. En algunos casos, es deseable la expresión en múltiples tejidos, y a este respecto pueden utilizarse promotores constitutivos como la serie de promotores 35S. Sin embargo, en algunas de las realizaciones de la presente invención se prefiere que la expresión en las plantas transgénicas sea específica de la hoja, más preferentemente, la expresión del gen se produce en los plástidos de la hoja. El promotor del gen de la isopreno sintasa de Populus alba (PaIspS) (Sasaki et al., FEBS Letters (2005) 579: 2514-2518) parece ser el motor de la expresión plástido-específica. Por lo tanto, este promotor es un promotor muy adecuado para su uso en un vector de expresión de la presente invención.

Otros promotores específicos de hoja adecuados son el promotor rbcS (Rubisco)(por ejemplo, de café, véase el documento WO 02/092822); de Brassica, véase el documento US 7,115,733; de la soja, véase Dhanker, O., et al., Nature Biotechnol. (2002) 20: 1140-1145), el promotor de cy-FBPase (véase el documento US 6,229,067), la secuencia promotora de la proteína de unión a clorofila a/b recolectora de luz de la palma de aceite (véase US 2006/0288409), el promotor STP3 de Arabidopsis thaliana (véase, Büttner, M. et al., Plant cell & Environ. (2001) 23: 175-184), el promotor del gen PAL2 de la judía (véase Sablowski, R.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1995) 92: 6901-6905), secuencias potenciadoras del promotor ST-LS1 de la patata (véase Stockhaus, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1985) 84: 7943-7947), el promotor CAB1 del trigo (véase Gotor, C. et al., Plant J. (1993) 3: 509­ 518), el promotor específico de estomas del gen de la ADP-glucosa-fosforilasa de patata (véase el documentoUS 5,538,879), el elemento LPSE1 del gen P(D540) del arroz (véase el documento CN 2007/10051443), y el promotor específico de estomas, pGC1(At1g22690) de Arabidopsis thaliana (véase Yang, Y. et al., Plant Methods (2008) 4: 6).

Las especies vegetales pueden, por ejemplo, transformarse mediante la transformación mediada por ADN de protoplastos de células vegetales y la posterior regeneración de la planta a partir de los protoplastos transformados de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Otros ejemplos de métodos de transformación de células vegetales incluyen la microinyección (Crossway et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 179-185), electroporación (Riggs, C.D. y Bates, G.W., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1986), 83: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium(Hinchee et al., Bio/Technol. (1988) 6: 915-922), transferencia directa de genes (Paszkowski, J. et al., EMBO J. (1984) 3: 2717-2722), y aceleración balística de partículas utilizando dispositivos disponibles en Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y BioRad, Hercules, California (véase, por ejemplo, Sanford et al., U. S. Pat. No.

4,945050 y Solicitud de patente europea EP 0332581).

También es posible emplear el método de transformación de protoplastos para maíz (Solicitud de Patente Europea EP 0292435, Patente de EE. UU. No. 5,350,689).

Es particularmente preferible utilizar los vectores de tipo binario de los plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium spp. Los vectores derivados de Ti transforman una amplia variedad de plantas superiores, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como la soja, el algodón, la colza, el tabaco y el arroz (Pacciotti et al., Bio/technol. (1985) 3: 241; Byrne M.C. et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture (1987) 8: 3-15; Sukhapinda, K. et al., Plant Mol. Biol. (1987) 8: 209-217; Hiei, Y. et al., The Plant J. (1994) 6: 271-282). El uso de ADN-T para transformar células vegetales ha sido objeto de amplios estudios y está ampliamente descrito (por ejemplo, el documento. EP-A 120 516). Para su introducción en plantas, los genes quiméricos de la invención pueden insertarse en vectores binarios como se describe en los ejemplos.

Los expertos en la técnica disponen de otros métodos de transformación, tal como la captación directa de construcciones de ADN extrañas (véase EP-A 295 959), técnicas de electroporación (Fromm, M.E. et al., Nature (1986), 319: 791-793) o bombardeo balístico de alta velocidad con partículas metálicas recubiertas con los constructos de ácido nucleico (por ejemplo, el documento US 4,945,050). Una vez transformadas, las células pueden ser regeneradas por los expertos en la técnica. De especial relevancia son los métodos para transformar genes extraños en cultivos de importancia comercial, tal como la colza (De Block, M. et al., Plant Physiol. (1989) 91: 694-701), girasol (Everett, N.P. et al., Bio/Technology (1987) 5: 1201-1204), soja (EP-A 301 749), arroz (Hiei, Y. et al., The Plant J. (1994) 6: 271-282), y el maíz (Fromm et al., 1990, Bio/Technology 8: 833-839).

Los expertos en la técnica apreciarán que la elección del método puede depender del tipo de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea.

En otra realización, el vector descrito en el presente documento puede transformarse directamente en el genoma plastidial. La tecnología de transformación de plástidos se describe ampliamente en, por ejemplo, los documentos US 5,451,513, US 5,545,817, US 5,545,818 y w O 95/16783. La técnica básica para la transformación de cloroplastos consiste en introducir regiones de ADN plastidial clonado que flanquean un marcador seleccionable junto con el gen de interés en un tejido objetivo adecuado, por ejemplo, mediante biolística o transformación de protoplastos (por ejemplo, transformación mediada por cloruro cálcico o PEG).

Las células de Agrobacterium tumefaciens que contienen un vector de acuerdo con la presente invención, en el que el vector comprende un plásmido Ti, son útiles en métodos de fabricación de plantas transformadas. Las células vegetales se infectan con un Agrobacterium tumefaciens como se ha descrito anteriormente para producir una célula vegetal transformada y, a continuación, se regenera una planta a partir de la célula vegetal transformada. Se conocen numerosos sistemas de vectores de Agrobacterium útiles para llevar a cabo la presente invención. Suelen llevar al menos una secuencia límite de ADN-T e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12: 8711-8720).

Los métodos que utilizan una forma de transferencia génica directa o una transferencia mediada por Agrobacterium suelen realizarse, aunque no necesariamente, con un marcador seleccionable que puede proporcionar resistencia a un antibiótico (por ejemplo, kanamicina, higromicina o metotrexato) o a un herbicida (por ejemplo, fosfinotricina). Sin embargo, la elección del marcador seleccionable para la transformación de plantas no es crítica para la invención.

Métodos generales de cultivo de tejidos vegetales son proporcionados por ejemplo por Maki, K.Y. et al., Plant Physiol. (1993) 15: 473-497y por Phillips, R.I. et al. En: Sprague GF, Dudley JW, eds. Corn and corn improvement. 3a edn. Madison (1988) 345-387.

Después de la transformación, las células de la planta transgénica se colocan en un medio selectivo apropiado para la selección de células transgénicas que luego se cultivan a callo. Los brotes se cultivan a partir de callos y plántulas generados a partir del brote mediante cultivo en medio de enraizamiento. El marcador concreto utilizado permitirá seleccionar las células transformadas frente a las que carecen del ADN que se ha introducido.

Para confirmar la presencia de los transgenes en las células y plantas transgénicas, pueden realizarse diversos ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como transferencia Southern y Northern, hibridación in situ y métodos de amplificación con base en ácidos nucleicos tales como PCR o RT-PCR y ensayos "bioquímicos", tales como la detección de la presencia de un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunológicos (transferencias ELISAs y Western) o por función enzimática. La presencia de santaleno sintasa enzimáticamente activa puede establecerse mediante el análisis químico de los productos volátiles (santaleno) de la planta.

Una santaleno sintasa de acuerdo con la invención puede utilizarse para la producción industrial de santaleno, cuyo santaleno puede utilizarse per se como sabor o aroma, por ejemplo, en un producto alimenticio, o como fragancia, por ejemplo, en un producto doméstico, o como intermediario para la producción de otro isoprenoide, por ejemplo, santalol.

Un método para producir santaleno de acuerdo con la invención comprende preparar santaleno en presencia de santaleno sintasa. En principio, dicho método puede basarse en cualquier técnica para emplear una enzima en la preparación de un compuesto de interés.

El método puede ser un método en el que el FPP o cualquiera de sus precursores (tal como farnesol, IPP, isopentenil fosfato, 3-metilbut-3-en-1-ol e incluso mevalonato) se alimenta como sustrato a células que comprenden la santaleno sintasa. Alternativamente, el método también puede ser un método en el que se utilice un organismo vivo que comprenda un sistema enzimático capaz de formar FPP a partir de una fuente de carbono adecuada, estableciendo así una ruta fermentativa completa hacia el santaleno. Cabe señalar que el término "fermentativo" se utiliza en el presente documento en un sentido amplio para los procesos en los que se hace uso de un cultivo de un organismo para sintetizar un compuesto a partir de una materia prima adecuada (por ejemplo, un hidrato de carbono, una fuente de aminoácidos, una fuente de ácidos grasos). Por lo tanto, los procesos fermentativos tal y como se entienden en el presente documento no se limitan a condiciones anaeróbicas, y se extienden a procesos en condiciones aeróbicas. Por lo general, se conocen las materias primas adecuadas para determinadas especies de (micro)organismos.

Asimismo, puede utilizarse la santaleno sintasa aislada de la célula en la que se ha producido, por ejemplo, en un sistema de reacción en el que el sustrato (FPP) y la santaleno sintasa se ponen en contacto en condiciones adecuadas (pH, disolvente, temperatura), condiciones que pueden basarse en la técnica anterior a la que se hace referencia en el presente documento y en la presente divulgación, opcionalmente en combinación con algunas pruebas rutinarias. La santaleno sintasa puede, por ejemplo, solubilizarse en un medio acuoso en el que también esté presente el FPP o la santaleno sintasa puede inmovilizarse en un material de soporte de una manera conocida en la técnica y ponerse en contacto a continuación con un líquido que comprenda el f Pp . Dado que la enzima tiene una elevada actividad y/o selectividad hacia la catálisis de FPP a santaleno, la presente invención también es ventajosa para dicho método in vitro, no sólo en condiciones ácidas, sino también en caso de que el pH sea aproximadamente neutro o alcalino. Las condiciones adecuadas pueden basarse en la metodología conocida para santaleno sintasas conocidas, por ejemplo, a las que se hace referencia en la bibliografía citada en el presente documento, en la información divulgada en el presente documento, en el conocimiento general común y, opcionalmente, en alguna experimentación rutinaria.

En un método particularmente ventajoso de la invención, el santaleno se prepara fermentativamente, es decir, cultivando células que expresan santaleno sintasa en un medio de cultivo. La reacción real catalizada por la santaleno sintasa puede tener lugar intracelularmente o -si la santaleno sintasa se excreta en el medio de cultivoextracelularmente en el medio de cultivo.

Las células utilizadas en un método para preparar santaleno de acuerdo con la invención pueden ser en particular células huésped de acuerdo con la invención. Si se desea, estas células huésped pueden modificarse para suministrar el FPP a la santaleno sintasa en cantidades mayores. Esto puede hacerse, por ejemplo, aumentando el flujo de carbono hacia la FPP, lo que en sí mismo puede realizarse de diferentes maneras. En células huésped con una vía endógena de DXP (como E. coli y R. sphaeroides) la desregulación de la expresión de las enzimas de esta vía puede tener un claro efecto positivo en la formación de isoprenoides. La sobreexpresión de dxs que codifican la 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXP-sintetasas), la primera enzima de la vía DXP y, por tanto, uno de los principales objetivos de la ingeniería metabólica, ha dado lugar a un aumento de la biosíntesis de varios isoprenoides (por ejemplo, Matthews y Wurtzel, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2000) 53: 396-400; Huang et al., Bioorg. Med. Química. (2001) 9: 2237-2242; Harker y Bramley, FEBS Lett (1999) 448: 115-119; Jones et al. Metab. Eng. (2000) 2: 328-338yYuan et al. Metab. Eng. (2006) 8: 79-90). También la sobreexpresión de dxr, que codifica la DXP isomeroreductasa (también conocida como 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa), la enzima que cataliza el segundo paso comprometido en la ruta de la DXP, puede conducir a un aumento de la producción de isoprenoides (Albrecht et al., Biotechnol. Lett. (1999) 21: 791-795), efecto que puede incrementarse aún más mediante la coexpresión simultánea de dxs (Kim & Keasling, Biotechnol Bioeng (2001) 72: 408-415). Además, se obtuvo un efecto positivo en la biosíntesis de isoprenoides mediante la sobreexpresión de isopentenil difosfato isomerasa (IPP isomerasa, Idi), la enzima que cataliza la interconversión de IPP en dimetilalil difosfato, DMAPP(por ejemplo,Kajiwara et al. Biochem. J. (1997) 324: 421-426); Misawa y Shimada, J. Biotech. (1998) 59: 169-181y Yuan et al. Metab. Eng. (2006) 8: 79-90) y las enzimas MEP citidililtransferasa (también conocida como4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritolsintasa, IspD) y 2C-metil-D-eritritol2,4-ciclodifosfato sintasa (IspF), que se transcriben como un operón ispDF en E. coli (Yuan et al. Metab. Eng. (2006) 8: 79-90).

Un enfoque alternativo y más eficiente para diseñar cepas con una vía endógena de DXP para la producción de isoprenoides de alto nivel es la introducción de una vía heteróloga de mevalonato. La coexpresión en E. coli de la vía del mevalonato de Saccharomyces cerevisiae con un gen sintético de la amorfa-4,11-dieno sintasa dio lugar a la formación del sesquiterpeno amorfadieno en títulos de más de 110 mg/L cuando la cepa recombinante de E. coli se cultivó en un medio LB+ glicerol (Martin et al. Nat. Biotechnol. (2003) 21: 796-802). Esta cepa de E. coli se mejoró posteriormente mediante la introducción de copias adicionales del gen tHMGI que codifica el dominio catalítico C-terminal de la enzima de levadura 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa. Al aumentar la formación y, por tanto, la actividad de esta enzima, se redujo el nivel intracelular del intermediario tóxico de la vía del mevalonato HMG-CoA, superando así la inhibición del crecimiento y dando lugar a una mayor producción de mevalonato (Pitera et al. Metab. Eng. (2007) 9: 193-207). Se mejoró aún más el flujo a través de la vía heteróloga del mevalonato mediante la optimización del codón de los tres primeros genes de esta vía en combinación con la sustitución del promotor lac de tipo silvestre por el promotor lacUV5, dos veces más potente (Anthony et al. Met. Eng. (2009) 11: 13-19). La producción de amorfadieno podría incrementarse aún más sustituyendo los genes de la levadura para la HMG-CoA sintasa y la HMG-CoA reductasa por los genes equivalentes de la bacteria grampositiva Staphylococcus aureus. En combinación con un protocolo de fermentación optimizado, el cultivo de esta nueva cepa modificada de E. coli produjo un título de amorfadieno de 27,4 g/L (Tsuruta et al. PloS ONE (2009) 4(2): e4489. doi:10.1371/journal.pone.0004489). Del mismo modo, una cepa de E. coli modificada por ingeniería con la vía del mevalonato de Streptococcus pneumoniae en combinación con el gen de la decaprenil difosfato sintasa(ddsA) de Agrobacterium tumefaciens produjo coenzima Q10 (CoQ-iü) en más de 2400 pg/g de peso seco celular (Zahiri et al. Met. Eng. (2006) 8: 406-416. También se obtuvo una mayor producción deCoQ10 mediante ingeniería de una cepa de Rhodobacter sphaeroides con la vía del mevalonato de Paracoccus zeaxanthinifaciens en su forma nativa (documento WO 2005/005650) y una forma mutada (documento WO 2006/018211).

También las células huésped con una vía MEV endógena (tal como S. cerevisiae) han sido objeto de múltiples estudios de ingeniería para obtener cepas hiperproductoras de isoprenoides. La introducción en S. cerevisiae de la vía DXP heteróloga derivada de E. coli en combinación con el gen que codifica la santaleno sintasa de Citrus dio lugar a una cepa que acumulaba aproximadamente 10 veces más santaleno en comparación con la cepa que expresaba únicamente la santaleno sintasa (documento WO 2007/093962). Sin embargo, la mayoría de las mejoras en las levaduras de importancia industrial Candida utilis y S. cerevisiae se han centrado en la ingeniería de la vía homóloga MEV. Especialmente la sobreexpresión de la enzima HMG-CoA reductasa, que se cree que es la principal enzima reguladora de la vía DXP, en su versión completa o truncada, ha parecido ser un método eficaz para aumentar la producción de isoprenoides. Este efecto estimulante de la sobreexpresión de la HMG-CoA reductasa truncada N-terminal se ha observado, por ejemplo, en el caso de la producción de licopeno en C. utilis (Shimada et al. Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 2676-2680) y la producción de epi-cedrol en S. cerevisiae (Jackson et al. Org. Lett. (2003) 5: 1629-1632). En este último caso, la producción de este sesquiterpeno podría mejorarse aún más mediante la introducción de upc2-1, un alelo que provoca un aumento del flujo metabólico hacia la biosíntesis de esteroles. Otro método para aumentar el flujo a través de la vía MEV es el empleo de una variante de mevalonato quinasa que sea menos sensible a la inhibición por retroalimentación por FPP y otros precursores isoprenoides. Los documentos WO 2006/063752wO 2006/0752, por ejemplo, muestra que Paracoccus zeaxanthinifaciens R 114, una bacteria con una vía MEV endógena, tras la introducción del mutante de mevalonato quinasa N66K/I152M de S. cerevisiae y el gen ddsA de P. zeaxanthinifaciens ATCC 21588 produce significativamente más coenzima Q10 que la cepa correspondiente de P. zeaxanthinifaciens que expresa el tipo silvestre de mevalonato quinasa de S. cerevisiae. También se han obtenido resultados positivos similares en la producción de CoQ-i0 con P. zeaxanthinifaciens R114 con la variante resistente a la retroalimentación K93E de la mevalonato quinasa de P. zeaxanthinifaciens (el documento WO 2004/111214).

Un segundo enfoque para aumentar las cantidades de FPP se basa en la reducción o eliminación de las actividades enzimáticas secundarias sobre el FPP. En la levadura, el gen ERG9 codifica la enzima farnesil difosfato farnesil transferasa (escualeno sintasa), que cataliza la condensación de dos moléculas de farnesil difosfato para formar escualeno. Dado que es el primer paso después de la FPP en la biosíntesis de esteroles y, por tanto, regula el flujo de unidades de isopreno en la vía de los esteroles, ERG9 es un objetivo frecuente en la ingeniería metabólica de levaduras para aumentar la producción de sesquiterpenos y carotenoides. La alteración de ERG9 en combinación con la sobreexpresión de la tHMG-CoA reductasa en la levadura C. utilis condujo a una mayor producción de licopeno (Shimada et al. Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 2676-2680). Una combinación similar de sobreexpresión de tHMG-CoA reductasa y regulación a la baja de ERG9 utilizando un promotor reprimible por metionina aumentó la producción del sesquiterpeno amorfadieno en levadura en aproximadamente 10 veces en comparación con la cepa de levadura que sólo expresaba el gen de la amorfadieno sintasa (Ro et al. Nature (2006) 440: 940-943; Lenihan et al. Biotechnol. Prog. (2008) 24: 1026-1032). Dado que el ergosterol es vital para el crecimiento de la levadura y que las células de levadura no pueden asimilar ergosterol alimentado externamente durante el crecimiento aeróbico, la regulación a la baja/el bloqueo de ERG9 se combina frecuentemente con mutaciones que dotan a la cepa de levadura de una absorción aeróbica eficiente de ergosterol del medio de cultivo. Algunos ejemplos son el alelo sue (Takahishi et al. Biotechnol. Bioeng. (2007) 97: 170-181) y el alelo upc2-1 (Jackson et al. Org. Lett. (2003) 5: 1629-1632). Takahashi et al (Biotechnol. Bioeng. (2007) 97: 170-181) también investigaron el efecto de limitar la actividad de la fosfatasa endógena eliminando el gen de la fosfatasa dpp1 en la levadura. Aunque esta inactivación limitaba claramente la desfosforilación de FPP, lo que se reflejaba en una acumulación mucho menor de farnesol, no mejoraba la producción de sesquiterpenos por encima de la de las mutaciones combinadas erg9/sue en las condiciones de crecimiento aplicadas.

Las condiciones de reacción para la preparación fermentativa de santaleno pueden elegirse en función de las condiciones conocidas para la especie de célula huésped utilizada (por ejemplo, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus zeaxanthinifaciens, Escherichia coli, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Phaffia rhodozyma y Pichia pastoris), la información divulgada en el presente documento, el conocimiento general y, opcionalmente, alguna experimentación rutinaria.

En principio, el pH del medio de reacción (medio de cultivo) utilizado en un método de acuerdo con la invención puede elegirse dentro de límites amplios, siempre que la santaleno sintasa (en la célula huésped) esté activa y muestre una especificidad deseada en las condiciones de pH. En caso de que el método incluya el uso de células, para expresar la santaleno sintasa, el pH se selecciona de forma que las células sean capaces de realizar su función o funciones previstas. En particular, el pH puede elegirse dentro del intervalo de cuatro unidades de pH por debajo del pH neutro y dos unidades de pH por encima del pH neutro, es decir, entre pH 3 y pH 9 en el caso de un sistema esencialmente acuoso a 25 °C. Se han obtenido buenos resultados, por ejemplo, en un medio de reacción acuoso con un pH comprendido entre 6,8 y 7,5.

Un sistema se considera acuoso si el agua es el único disolvente o el disolvente predominante (> 50 % en peso, en particular > 90 % en peso, con base en el total de líquidos), en el que, por ejemplo, puede disolverse una cantidad menor de alcohol u otro disolvente (< 50 % en peso, en particular < 10 % en peso, con base en el total de líquidos) (por ejemplo, como fuente de carbono, en caso de un enfoque fermentativo completo) en una concentración tal que los microorganismos presentes permanezcan activos.

En particular, en caso de que se utilice una levadura y/o un hongo, pueden preferirse condiciones ácidas, en particular el pH puede estar en el intervalo de pH 3 a pH 8, con base en un sistema esencialmente acuoso a 25 °C. Si se desea, el pH puede ajustarse utilizando un ácido y/o una base o tamponarse con una combinación adecuada de un ácido y una base. Las condiciones anaeróbicas se definen en el presente documento como condiciones sin oxígeno o en las que las células cultivadas, en particular un microorganismo, prácticamente no consumen oxígeno, y normalmente corresponden a un consumo de oxígeno inferior a 5 mmol/l.h, preferentemente a un consumo de oxígeno inferior a 2,5 mmol/l.h, o más preferentemente inferior a 1 mmol/l.h. Las condiciones aeróbicas son aquellas en las que se disuelve en el medio un nivel suficiente de oxígeno para un crecimiento sin restricciones, capaz de soportar una tasa de consumo de oxígeno de al menos 10 mmol/l.h, más preferentemente mayor a 20 mmol/l.h, incluso más preferentemente mayor a 50 mmol/l.h, y más preferentemente mayor a 100 mmol/l.h. Las condiciones de oxígeno limitado se definen como aquellas en las que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El límite inferior para las condiciones de oxígeno limitado viene determinado por el límite superior para las condiciones anaeróbicas, es decir, normalmente al menos 1 mmol/l.h, y en particular al menos 2,5 mmol/l.h, o al menos 5 mmol/l.h. El límite superior para las condiciones de oxígeno limitado viene determinado por el límite inferior para las condiciones aeróbicas, es decir, inferior a 100 mmol/l.h, inferior a 50 mmol/l.h, inferior a 20 mmol/l.h, o inferior a 10 mmol/l.h.

Que las condiciones sean aeróbicas, anaeróbicas o limitadas en oxígeno depende de las condiciones en las que se lleve a cabo el método, en particular de la cantidad y composición del flujo de gas entrante, las propiedades reales de mezcla/transferencia de masa del equipo utilizado, el tipo de microorganismo utilizado y la densidad de microorganismos.

En principio, la temperatura utilizada no es crítica, siempre que la santaleno sintasa (en las células), muestre una actividad sustancial. Generalmente, la temperatura puede ser de al menos 0 °C, en particular de al menos 15 °C, más en particular de al menos 20 °C. La temperatura máxima deseada depende de la santaleno sintasa y de las células, en el caso de un método en el que se utilicen células para expresar la santaleno sintasa. La temperatura es igual o inferior a 70 °, preferentemente igual o inferior a 50 °C, más preferentemente igual o inferior a 40 °C, en particular igual o inferior a 35 °C.

En el caso de un proceso fermentativo, las condiciones de incubación pueden elegirse dentro de amplios límites siempre que las células muestren suficiente actividad y/o crecimiento. Esto incluye condiciones aeróbicas, de oxígeno limitado y anaeróbicas.

En particular, si la reacción catalítica por la que se forma el santaleno se lleva a cabo fuera de una célula huésped, puede utilizarse un medio de reacción que comprenda un disolvente orgánico en una concentración elevada (por ejemplo, más del 50 %, o más del 90 % en peso, con base en el total de líquidos), en caso de que la santaleno sintasa utilizada conserve suficiente actividad y especificidad en dicho medio.

Si se desea, el santaleno producido en un método de acuerdo con la invención, o un compuesto adicional en el que se ha convertido el santaleno después de su preparación (tal como el santalol), se recupera del medio de reacción en el que se ha producido. Un método adecuado es la extracción líquido-líquido con un líquido extractor que no sea miscible con el medio de reacción.

En particular, es adecuada (para la extracción a partir de un medio de reacción acuoso) la extracción con un disolvente orgánico líquido, tal como un hidrocarburo líquido. De los primeros resultados se desprende que este método también es adecuado para extraer el santaleno (u otro producto) de un medio de reacción que contenga células de acuerdo con la invención utilizadas para su producción, sin necesidad de generar lisis para las células para recuperar el santaleno (u otro producto). En particular, el disolvente orgánico puede seleccionarse entre alcanos líquidos, alcoholes líquidos de cadena larga (alcoholes que tengan al menos 12 átomos de carbono) y ésteres líquidos de ácidos grasos de cadena larga (ácidos que tengan al menos 12 átomos de carbono). Los alcanos líquidos adecuados incluyen, en particular, los alcanos C6-C16, tales como el hexano, el octano, el decano, el dodecano, el isododecano y el hexadecano. Entre los alcoholes alifáticos de cadena larga adecuados se incluyen los alcoholes alifáticos C12-C18, como el alcohol oleílico y el alcohol palmitoleílico. Los ésteres adecuados de ácidos grasos de cadena larga incluyen, en particular, ésteres de alcoholes C1-C4 de ácidos grasos C12-C18, como el miristato de isopropilo y el oleato de etilo.

En una realización ventajosa, el santaleno (o un producto adicional) se produce en un reactor que comprende una primera fase líquida (la fase de reacción), dicha primera fase líquida que contiene células de acuerdo con la invención en las que se produce el santaleno (o un producto adicional), y una segunda fase líquida (fase orgánica que permanece esencialmente separada de la primera fase cuando se pone en contacto), siendo dicha segunda fase líquida la fase de extracción, por la que el producto formado tiene una mayor afinidad. Este método es ventajoso porque permite recuperar el producto in s itu . Además, contribuye a prevenir o, al menos, reducir los posibles efectos tóxicos del santaleno (o de otro producto) para las células, ya que, debido a la presencia de la segunda fase, la concentración de santaleno (o de otro producto) en la fase de reacción puede mantenerse relativamente baja durante todo el proceso. Por último, hay indicios claros de que la fase de extracción contribuye a extraer el santaleno (o cualquier otro producto) de la fase de reacción.

En un método preferido de la invención, la fase extractara forma una capa sobre la fase de reacción o se mezcla con la fase de reacción para formar una dispersión de la fase de reacción en la fase extractora o una dispersión de la fase extractora en la fase de reacción. Así, la fase de extracción no sólo extrae el producto de la fase de reacción, sino que también ayuda a reducir o evitar completamente las pérdidas del producto formado del reactor a través de los gases de escape, que pueden producirse si el santaleno se produce en la fase de reacción (acuosa) o se excreta en la fase de reacción (acuosa). El santaleno es poco soluble en agua y, por tanto, se volatiliza fácilmente del agua. Se contempla que el santaleno disuelto en la fase orgánica (como una capa o dispersión) está al menos sustancialmente impedido de volatilización.

Los líquidos adecuados para su uso como fase de extracción combinan una densidad inferior a la de la fase de reacción con una buena biocompatibilidad (sin interferencia con la viabilidad de las células vivas), una baja volatilidad y una inmiscibilidad casi absoluta con la fase de reacción acuosa. Ejemplos de líquidos adecuados para esta aplicación son alcanos líquidos como el decano, el dodecano, el isododecano, el tetradecano y el hexadecano o alcoholes alifáticos de cadena larga como el alcohol oleílico y el alcohol palmitoleílico, o ésteres de ácidos grasos de cadena larga como el miristato de isopropilo y el oleato de etilo (véase, por ejemplo, Asadollahi et al. (Biotechnol. Bioeng. (2008) 99: 666­ 677), Newman et al. (Biotechnol. Bioeng. (2006) 95: 684-691) y el documento WO 2009/042070).

El santaleno producido de acuerdo con la invención puede utilizarse como tal, por ejemplo, para su uso como aroma o fragancia, o como repelente de insectos, o puede utilizarse como material de partida para otro compuesto, en particular otro aroma o fragancia. En particular, el santaleno puede convertirse en santalol. La conversión del santaleno en santalol puede llevarse a cabo de forma intracelular o extracelular. Si esta preparación se lleva a cabo dentro de una célula, el santalol suele aislarse de la célula huésped tras su producción. La invención se refiere además a un método para preparar santalol, preferentemente p-santalol, que comprende convertir FPP en santaleno, preferentemente p-santaleno, en presencia de una santaleno sintasa de acuerdo con la invención, comprendiendo además convertir el santaleno en santalol, preferentemente p-santalol. Preferentemente, el santaleno se prepara en una célula huésped, una planta o cultivo de plantas, o un hongo o cultivo de hongos, que exprese dicha santaleno sintasa, de acuerdo con la invención. En una realización preferida, se proporciona un método para preparar santalol, preferentemente p-santalol, de acuerdo con la invención, que comprende además aislar el santalol.

En general, los métodos adecuados para preparar santalol a partir de santaleno pueden dividirse en: i) métodos puramente químicos como los descritos en Willis et al. (1985) en el ejemplo 11, ii) métodos biocatalíticos (por ejemplo, los que utilizan monooxigenasas P450) como los ejemplificados por Daviet et al. (2015), que también podría realizarse como una bioconversión (es decir, métodos que aplican células vivas enteras), y iv. fermentación completa y iii) oxidación autocatalítica del santaleno, como ejemplifican Ngo y Brown (2000). En una realización específica, la conversión comprende una hidroxilación regiospecífica del santaleno para formar santalol.

Se contempla que uno o más genes que codifican una enzima o pluralidad de enzimas para catalizar la conversión de santaleno en santalol pueden incorporarse en una célula huésped de acuerdo con la invención. Dichas enzimas pueden seleccionarse, por ejemplo, de las enzimas de Chlorella o Botryosphaeria, o la Premnaspirodiene oxidasa de Hyoscyamus muticus, o los mutantes P450cam o P450BM-3 mencionados anteriormente. Como se ha indicado anteriormente, la divulgación se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión a una santaleno sintasa de acuerdo con la invención. El término "anticuerpo" incluye la referencia a las formas de unión a antígeno de los anticuerpos (por ejemplo, Fab, F (ab) 2). El término "anticuerpo" se refiere frecuentemente a un polipéptido codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos que se unen y reconocen específicamente un analito (antígeno). Sin embargo, aunque varios fragmentos de anticuerpo pueden definirse en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, tal como se utiliza en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpos tales como Fv de cadena simple, anticuerpos quiméricos (es decir, que comprenden regiones constantes y variables de diferentes especies), anticuerpos humanizados (es decir, que comprenden una región determinante de la complementariedad (CDR) de una fuente no humana) y anticuerpos heteroconjugados(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos).

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o, preferentemente, por técnicas de expresión recombinante.

Los anticuerpos policlonales contra la santaleno sintasa pueden producirse por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede administrarse una santaleno sintasa heteróloga a diversos animales huéspedes, incluyendo, pero no limitado a, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales específicos para la santaleno sintasa. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, e incluyen, pero no se limitan a, los de Freund (completos e incompletos), geles minerales tales como el hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como la lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de visualización de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de la hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al método por el que se produce.

Los métodos para producir y cribar anticuerpos específicos utilizando la tecnología de la hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Brevemente, los ratones pueden ser inmunizados con santaleno sintasa y una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el santaleno sintasa en el suero del ratón, se cosecha el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible en el ATCC. Las hibridomas se seleccionan y clonan por dilución limitada. A continuación, los clones de hibridoma se analizan mediante métodos conocidos en la técnica para detectar células que segreguen anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención. El líquido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.

Se divulga un método de generación de anticuerpos monoclonales que comprende el cultivo de una célula de hibridoma que segrega un anticuerpo en el que, preferentemente, la hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con santaleno sintasa con células de mieloma y, a continuación, cribando las hibridomas resultantes de la fusión para clones de hibridoma que segregan un anticuerpo capaz de unirse a la santaleno sintasa. Un anticuerpo puede utilizarse, por ejemplo, en un método para aislar una santaleno sintasa producida como se divulga en el presente documento, por ejemplo, utilizando el anticuerpo inmovilizado en un material de soporte cromatográfico.

Además, la presente divulgación se dirige a un método para preparar santaleno o santalol, comprendiendo el método convertir un sustrato poliprenil difosfato en santaleno o santalol en presencia de una enzima, comprendiendo la enzima un primer segmento que comprende un péptido marcado y un segundo segmento que comprende una santaleno sintasa de acuerdo con la invención. Una enzima que comprende dicho primer y segundo segmento puede denominarse en el presente documento "enzima marcada".

Para la preparación de santaleno, en particular, se puede utilizar un método, una secuencia de aminoácidos, una secuencia de ácidos nucleicos o una célula huésped como se describe en el presente documento. El santalol puede, por ejemplo, prepararse por oxigenación/oxidación del santaleno de una manera conocida per se. El péptido-etiqueta se selecciona preferentemente del grupo de las proteínas de utilización del nitrógeno (NusA; s Eq ID NO: 26), tiorredoxinas (Trx; SEQ ID NO: 27), proteínas de unión a maltosa (MBP; SEQ ID NO: 28), una etiqueta denominada SET-tag, SEQ ID NO: 29) y sus homólogos funcionales. Tal como se utiliza en el presente documento, un homólogo funcional de un péptido marcado es un péptido marcado que tiene al menos aproximadamente el mismo efecto sobre la solubilidad de la enzima marcada, en comparación con la enzima no marcada. Típicamente, el homólogo difiere en que uno o más aminoácidos se han insertado, sustituidos, suprimidos o ampliados en el péptido del que es homólogo. El homólogo puede comprender, en particular, una o más sustituciones de un aminoácido hidrófilo por otro aminoácido hidrófilo o de un aminoácido hidrófobo por otro. El homólogo puede tener en particular una identidad de secuencia de al menos 40 %, más en particular de al menos 50 %, preferentemente de al menos 55 %, más preferentemente de al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % con la secuencia de una NusA, Trx, MBP o SET.

Particularmente adecuada es la proteína de unión a maltosa de Escherichia coli, o un homólogo funcional de la misma.

El uso de una enzima marcada de acuerdo con la invención es particularmente ventajoso en la medida en que puede contribuir a un aumento de la producción, especialmente a un aumento de la producción celular de un terpenoide o de un terpeno, como el a-santaleno y el p-santaleno.

Para mejorar la solubilidad de la enzima marcada (en comparación con la enzima sin la etiqueta), el primer segmento de la enzima se une preferentemente en su C-terminal al N-terminal del segundo segmento. Alternativamente, el primer segmento de la enzima marcada se une en su N-terminal al C-terminal del segundo segmento.

Además, la presente divulgación se dirige a un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido un primer segmento que comprende un péptido-etiqueta, preferentemente un MBP, un NusA, un Trx, una etiqueta SET) o un homólogo funcional de cualquiera de ellos, y un segundo segmento que comprende una santaleno sintasa o una amorfadieno sintasa. El segundo segmento puede comprender, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 3.

Además, la presente divulgación se dirige a una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico que codifica dicha santaleno sintasa marcada. Los ácidos nucleicos específicos de acuerdo con la invención que codifican una enzima marcada se muestran en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31. La célula huésped puede, en particular, comprender un gen que comprenda cualquiera de estas secuencias o un análogo funcional de las mismas.

Además, la presente divulgación se dirige a una enzima, que comprende un primer segmento que comprende un péptido-etiqueta y un segundo segmento que comprende un polipéptido que tiene actividad enzimática para convertir un poliprenil difosfato en un terpeno, en particular una santaleno sintasa, siendo el péptido-etiqueta seleccionado preferentemente del grupo de MBP, NusA, Trx o SET). Las enzimas específicas que comprenden una enzima marcada de acuerdo con la invención se muestran en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos.

LEYENDAS DE FIGURAS

Figura 1 Mapa del plásmido p-m-LPppa-CiCaSSy-mpmii alt.

Figura 2 Mapa del plásmido p-m-SPppa-MBP-CiCaSSy-mpmii alt.

Figura 3 Mapa del plásmido p-m-PcrtE-TRX-CiCaSSy-mpmii alt.

Figura 4 Mapa del plásmido p-m-PcrtE-TRX-SaSSy-mpmii alt.

Figura 5 Cromatograma GC de las especies terpénicas producidas por CiCaSSy en R. sphaeroides. Los compuestos identificados por GC-MS son: a-santaleno (Tiempo de retención: 5,3 min), trans-a-bergamoteno (Rt: 5,45 min), epi-p-santaleno (Rt: 5,75 min) y p-santaleno (Rt: 5,95 min).

Figura 6 Producción de terpenos totales (A), a-santaleno (B), p-santaleno (C) y trans-a-bergamoteno (D) durante la fermentación por lotes alimentados de cepas Rhodobacter sphaeroides Rs265-9c que albergan plásmidos con el gen que codifica la SaSSy (ejemplo comparativo) o la CiCaSSy santaleno sintasa. Las relaciones de producto para los terpenos individuales (B, C y D) se representan como la cantidad (área) relativa al área total de los componentes, tal y como se indica en el cromatograma GC de la figura 5.

Figura 7 Alineamiento de CiCaSSY con proteínas relevantes

La secuencia de la proteína CiCaSSY (TS23-3) (SEQ ID NO: 3) se alineó con las secuencias proteicas de sus variantes más próximas TS23-1 (SEQ ID NO: 10) y TS23-2 (SEQ ID NO: 11) que se encuentran en C. camphora. Se destacan los 21 de los 553 residuos que eran diferentes entre la proteína de TS23-1 y CiCaSSY.

Figura 8 Análisis GC-MS de la producción de terpenos en E. coli (ejemplo 5), muestra de control del vector: E. coli transformada con pACYCDUET.

Figura 9 Análisis GC-MS de la producción de terpenos en E. coli (ejemplo 5), muestra clon TS23-1: E. coli transformada con pACYCDuet_TS23-1

Figura 10 Análisis GC-MS de la producción de terpenos en E. coli (ejemplo 5), muestra clon TS23-3: E. coli transformada con pACYCDuet_TS23-3 (CicaSSy)

Figura 11 Análisis GC-MS de la producción de terpenos en E. coli (ejemplo 5), muestra clon SaSSy: E. coli transformada con pACYCDuet_SaSSy)

EJEMPLOS:

Ejemplo 1:

Análisis GC-MS de Cinnamomum camphora

Se adquirió una planta de Cinnamomum camphora de aproximadamente 30 cm de altura en Planfor (Pépiniéres PLANFOR, RD 651 40090 UCHACQ - FRANCIA). Se conocen varios quimiotipos de Cinnamomum camphora. En particular, el tipo cineol parece contener santaleno (Stubbs et al., 2004, Pelissier et al., 1995), mientras que otros quimiotipos (alcanfor, linalol) no parecen contener santaleno (por ejemplo, Frizzo 2000; Pino 1998). La planta se diseccionó en material de hoja, tallo y raíz. Se pesaron 0,5 g de material vegetal en un tubo de vidrio previamente enfriado y se añadieron 2 ml de diclorometano. La suspensión se agitó en vórtex durante 1 minuto, se sonicó durante 5 minutos en un baño de ultrasonidos y se centrifugó durante 5 minutos a 1500 g a temperatura ambiente. Se recogió el sobrenadante y se filtró sobre una columna de 1 g de sulfato sódico. Se analizaron aproximadamente 2 pl por CG/EM utilizando un cromatógrafo de gases como se describe detalladamente en Cankar et al. (2015). Los santalenos se identificaron comparando los tiempos de retención y los espectros de masas con los del aceite de sándalo (Sigma-Aldrich).

Resultados:

Las raíces, las hojas y el tallo de C. camphora parecían contener compuestos que corresponden a a-santaleno (Rt 13,17 min), a-bergamoteno (Rt 13,34 min), epi-p-santaleno (Rt 13,54 min) y p-santaleno (Rt 13,69 min). La concentración de santalenos fue mayor en las raíces. Otros compuestos encontrados en las raíces de la planta Cinnamomum se identificaron como guaiol, guaiadieno, intermedeol, eremoligenol, germacreno D, isolepidozeno, saffrol, limoneno, pineno, canfeno, mirceno, sabineno, 1,8-cineol y alcanfor. Por lo tanto, este tejido se tomó posteriormente para la extracción de ARN.

Ejemplo 2:

Extracción y análisis del ARN

El ARN del material de la raíz de C. camphora se aisló de la siguiente manera: Se calentaron a 65 °C aproximadamente 15 ml de tampón de extracción (bromuro de hexadecil-trimetilamonio al 2 %, polivinilpirrolidinona K 30 al 2 %, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), EDTA 25 mM, NaCl 2,0 M, espermidina 0,5 g/L y p-mercaptoetanol al 2%), tras lo cual se añadieron y mezclaron 3 g de tejido triturado. La mezcla se extrajo dos veces con un volumen igual de cloroformo:isoamilalcohol (1 : 24), y se añadió un cuarto de volumen de LiCl 10 M al sobrenadante y se mezcló. El ARN se precipitó durante la noche a 4 °C y se recogió por centrifugación a 10.000 g durante 20 minutos. El precipitado se disolvió en 500 pl de SSTE [1,0 M NaCl, 0,5% SDS, 10 mM Tris-HC1 (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] y se extrajo una vez con un volumen igual de cloroformo: isoamilalcohol. Se añadieron dos volúmenes de etanol al sobrenadante, se incubó durante al menos 2 h a -20 °C, se centrifugó a 13.000 g y se eliminó el sobrenadante. El precipitado se secó al aire y se resuspendió en agua. El ARN total (60 pg) se envió a Vertis Biotechnology AG (Freising, Alemania). Se aisló ARN poliA+, se sintetizó ADNc cebado aleatoriamente utilizando un cebador adaptador N6 aleatorizado y transcriptasa inversa M-MLV H. El ADNc se cortó y fraccionó, y se usaron fragmentos de un tamaño de 500 pb para análisis posteriores.

Los ADNc llevan unidas a sus extremos 5' y 3' las secuencias adaptadoras A y B especificadas por Illumina. Posteriormente, el material se analizó en un dispositivo de secuenciación Illumina MiSeq. En total, MiSeq leyó 27.919.287 secuencias, con una longitud total de 10.592.407.803 pares de bases. Se utilizó Trimmomatic-0.32 para recortar las secuencias de los adaptadores de secuenciación de Illumina, Seqprep para solapar las secuencias de extremos emparejados y bowtie2 (versión 2.2.1) para eliminar la contaminación phiX (el ADN phiX se utiliza como control de picos, normalmente presente en <1 %). Las lecturas de extremos emparejados y las lecturas únicas se utilizaron en un ensamblaje Trinity (trinityrnaseq-2.0.2). Trinity ensambló un total de 160871 contigs.

Para identificar las sintasas de sesquiterpeno, se utilizaron los contigs de C. camphora para crear una base de datos de secuencias de ADNc. En esta base de datos, se utilizó el programa TBLASTN para identificar secuencias de ADNc que codifican proteínas que muestran identidad con secuencias proteicas de sintasas de sesquiterpenos, incluyendo las sintasas de santaleno de Santalum album (accesión E3W202 del GenBank), Clausena lansium (ADR71055) y Solanum habrochaites (ACJ38409), valenceno sintasa de Callitropsis nootkatensis (CDM55287) y trans-abergamoteno sintasa de Phyla dulcis (AFR23371). En total, se identificaron 95 contigs en la base de datos de ADNc de C. camphora que presentan una homología significativa con las sintasas de sesquiterpenos. Los contigs se agruparon en 28 grupos en función de su solapamiento en la secuencia. Estos 28 contigs se caracterizaron adicionalmente analizándolos mediante el programa BLASTX para alinearlos con secuencias proteicas presentes en la base de datos UniProt (descargada el 28 de agosto de 2015), y 14 de ellos se identificaron como secuencias putativas de sesquiterpeno sintasas y otros 14 como sintasas putativas de monoterpeno, de acuerdo con su homología con secuencias de terpeno sintasas presentes en UniProt.

Se examinaron los estigmas en busca de marcos de lectura abiertos que codificaran las proteínas terpeno sintasa de longitud completa, basándose en las alineaciones proporcionadas por el análisis BLASTX. Se utilizó el siguiente criterio para identificar una proteína de longitud completa: tanto las sintasas de sesquiterpenos como las sintasas de monoterpenos llevan un motivo RRxxxxxxxxW (RRX8W) cerca de su inicio N-terminal. Para identificarse como codón de inicio, un codón ATG dentro del marco debe situarse entre 20 y 70 codones aguas arriba de la región que codifica el motivo RRX8W o de su posición ortóloga.

Ejemplo 3: Clonación de la Cinnamomum camphora Santaleno Sintasa (CiCaSSy)

Se amplificaron marcos de lectura abiertos de longitud completa a partir del ADNc de C. camphora. Se diseñaron cebadores directos e inversos, como se muestra en la Tabla 1, y se utilizaron para amplificar marcos de lectura abiertos totales de forma que el marco de lectura se fusionara con el C-terminal de una etiqueta His-6 en el plásmido pCDF-DUET-1 (corporación Novagen). Se clonaron un total de 37 ORF de terpeno sintasa diferentes. Utilizando los cebadores TS23fw y TS23re (Tabla 1), se obtuvieron tres ADNc diferentes estrechamente relacionados, que codificaban proteínas con SEQ ID NO:10 (TS23-1), SEQ ID NO:11 (TS23-2) y SEQ ID NO:3 (TS23-3).

Tabla 1

Las variantes clonadas se analizaron secuenciando el inserto TS. Las distintas variantes se introdujeron en E. coli BL21-RIL (Stratagene) químicamente competente, mediante transformación por choque térmico, y se seleccionaron en LB-agar con glucosa al 1 %, espectinomicina 50 ug/ml y cloranfenicol 50 ul/ml . Las transformantes se transfirieron a 5 ml de medio líquido LB con glucosa al 1 %, espectinomicina 50 ug/ml y cloranfenicol 50 ug/ml y se cultivaron durante la noche a 37 °C y 250 rpm.

De transfirieron 200 pl de esos cultivos a 20 ml de medio LB con el antibiótico apropiado en un matraz Erlenmeyer de 100 ml, y se incubaron a 37 °C, 250 rpm hasta que el A600 fue de 0,4 a 0,6. Posteriormente, se añadió IPTG 1 mM y los cultivos se incubaron durante toda la noche a 18 °C y 250 rpm. Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación (10 min 8000xg), se eliminó el medio y se resuspendieron en tampón de resuspensió 1 ml n (Tris-HCl 50 mM pH = 7,5, 1,4 mM p-mercaptoetanol; 4 °C). Las células se disgregaron agitándolas 2 veces durante 10 segundos con arena de circonio 0,2 g en una máquina Fastprep a velocidad 6,5. Las partículas insolubles se eliminaron posteriormente por centrifugación (10 min 13.000xg, 4 °C). La proteína soluble se utilizó inmediatamente para ensayos enzimáticos.

Ejemplo 4: ensayo enzimático in vitro

Para los ensayos enzimáticos, en un tubo de vidrio se hizo una mezcla de 800 pl de tampón MOPSO (MOPSO 15 mM (ácido 3-[N-morfolino]-2-hidroxipropano sulfónico) pH = 7,0, glicerol al 12,5 %, MgCl2 1 mM, tween 20 al 0,1 %, ácido ascórbico 1 mM, ditiotreitol 1 mM), 100 pl de solución enzimática purificada y 5 pl de difosfato de farnesilo o difosfato de geranilo (10 mM, Sigma FPP evaporado en seco y disuelto en etanol al 50%) y 20 pl de Na-ortovanadato 250 mM. Esta mezcla se incubó a 30 °C con agitación suave durante 2 horas. Posteriormente, la fase acuosa se extrajo con 2 ml de etilacetato. Se recogió la fase de etilacetato, se centrifugó a 1200xg, se secó sobre una columna de sulfato sódico y se analizó por GC-MS.

El análisis GC-MS se realizó en un sistema de Agilent Technologies, compuesto por un sistema GC 7980A, un detector MSD inerte 597C (70 eV), un automuestreador e inyector 7683 y una columna Phenomenex Zebron ZB-5ms de 30 m de longitud x 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 pm de fase estacionaria, con una precolumna Guardian (5 m). En este sistema se inyectó 1 pl de la muestra. La cámara de inyección se situó a 250 °C, la inyección se realizó sin fraccionamiento y la columna ZB5 se mantuvo a 45 °C durante 2 minutos, tras lo cual se inició un gradiente de 10 °C por minuto, hasta 300 °C. Se detectaron picos en los cromatogramas del recuento total de iones. Los compuestos se identificaron por su índice de retención y por su espectro de masas en combinación con la comparación del espectro de masas con bibliotecas (NIST8 y propias).

Clon TS23-3 (SEQ ID NO: 3) producía santalenos en este ensayo in vitro y, por tanto, codificaba una santaleno sintasa, por lo que se denominó CiCaSSY. Los clones TS23-1 (SEQ ID NO: 10) y TS23-2 (SEQ ID NO: 11) no produjeron santalenos ni otros sesquiterpenos en el ensayo in vitro.

Ejemplo 5:

Expresión de la santaleno sintasa en E. coli

Para la producción de sesquiterpenos en E. coli, la terpeno sintasa debe recibir el sustrato FPP. Por tanto, Cicassy se coexpresó con un plásmido que contenía todos los genes necesarios para la síntesis de FPP (pBbA5c-MevT-MBIS-NPtII). Este plásmido es una variante del plásmido pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, IspA) (Peralta-Yalta et al., 2011), en el que se ha intercambiado el marcador de resistencia al cloranfenicol por un marcador de resistencia a la kanamicina (NptII). A partir de este plásmido, se amplificó un fragmento de 728 pares de bases que va desde el sitio Apal hasta el inicio de la cloranfenicol aciltransferasa (CAT) utilizando la polimerasa Phusion y los cebadores P7 GCTGTTAGCGGGCCCATTAAG (SEQ ID NO: 12) y P2 GATATTCTCATTTTAGCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG (SEQ ID NO: 13), y el gen de la neomicina fosfotransferasa II (NptII) de pBINPlus (van Engelen 1995) utilizando los cebadores P5 CAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGCTAAAATGAGAATATC (SEQ ID NO: 14) y P6 CCAAGCGAGCTCGATATCAAACTAAAACAATTCATCCAG (SEQ ID NO: 15). Los fragmentos se aislaron del gel y se utilizaron como molde para una PCR de fusión, utilizando los cebadores P6 y P7 y amplificaron un fragmento de fusión de 1524 pb. Tanto este fragmento como pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, IspA) se digirieron con las enzimas de restricción ApaI y SacI, y el fragmento vectorial de pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO) y el fragmento de PCR de fusión digerido se ligaron y transformaron en E. coli DH5alpha por electroporación, y las colonias recombinantes se seleccionaron en LB+kanamicina. La presencia de los elementos genéticos que incluyen el operón de la vía MEV y el gen NptII se confirmó aislando ADN plasmídico miniprep y analizando este ADN mediante digestión con ApaI y SacI, obteniéndose bandas de aproximadamente 12000 pb y 1500 pb. El plásmido resultante se denominó pBbA5Sc-MevT-MBIS-NptII.

Además, el fragmento BamHI NotI de 1670 pb del vector pCDF-DUET-1 en el que se había clonado CiCaSSY se transfirió a pACYC-DUET-1 (Novagen corporation), para una comparación justa con SaSSY, que también se había introducido en pACYC-DUET-1 de esta manera.

El primer plásmido pBbA5c-MevT-MBIS-NPtII se transformó por choque térmico en células BL21DE3 competentes disponibles comercialmente (New England Biolabs cat C2527). Las transformantes se seleccionaron en placas LB con kanamicina 50 ug/ml y glucosa al 1 %.

Se cultivó una transformante pBbA5c-MevT-MBIS-NPtII y se hicieron células competentes con el método C aC h. Brevemente, se cultivaron 10 ml de esta transformante en LB glucosa al 1 % 50 ug/ml de Kanamicina hasta que A600 = 0,5. Posteriormente, las células se centrifugaron a 8000xg durante 5 min, se resuspendieron en 1 ml de CaCh100 mM enfriado con hielo, se centrifugaron de nuevo durante 5 minutos a 8000xg, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de CaCh 100 mM enfriado con hielo y se utilizaron 50 ul de estas células para la transformación. Las células se transformaron por choque térmico con 50 ng de los plásmidos pACYCDuet, pACYCDuet_TS23-1, pACYCDuet_CicaSSy y pACYCDuet_Sassy. Las transformantes se seleccionaron en placas LB con kanamicina 50 ug/ml, cloroanfenicol 50 ug/ml y glucosa al 1%.

Se inoculó un tubo con 5 ml de medio LB con kanamicina 50 ug/ml, cloroanfenicol 50 ug/ml y glucosa al 1 % con una colonia que contenía ambos plásmidos y se cultivó durante la noche a 37 °C. El cultivo de toda la noche se utilizó para inocular 20 ml de LB más antibióticos (pero sin glucosa) hasta una DO de 0,1. El cultivo creció hasta una DO de 0,45­ 0,55 y luego se indujo con 20 ul de IPTG 1M. El cultivo se cubrió con 2 ml de dodecano para evitar la evaporación de los sesquiterpenos del matraz y se cultivó durante toda la noche a 28 °C y 250 rpm.

Para el análisis GC-MS, el dodecano se separó del cultivo por centrifugación y se diluyó 200 veces con acetato de etilo. Se analizaron 2 pl por CG/EM utilizando un cromatógrafo de gases como se describe detalladamente en Cankar et al. (2015).

Ts23-1 no produjo una cantidad detectable de ningún terpeno en este sistema (Figura 9). El principal producto de SaSSY en este sistema resultó ser a-bergamoteno trans (Figura 11); el principal producto de CiCaSSY resultó ser asantaleno (Figura 10).

Ejemplo 6:

RS102 medio

Se disolvieron 20 g/l de extracto de levadura (Gistex, DSM) y 0,5 g/l de NaCl en agua destilada, se llevó el pH a 7,4 con NaOH, se añadió agua destilada hasta un volumen de 930 ml y se esteriliza el medio con vapor.

Un ml de MgSO4-7H2O estéril 0,5 g/ml, 2 ml de microelementos filtrados estériles (80 g/L (NH4)2Fe(SO4)2-6H2O; 6 g/L ZnSO4-7H2O; 2 g/L MnSO4-H2O; (0.2 g/L NiSO4-6H2O, opcionalmente); 2 g/L Vitamina C), y 2 ml de solución de CaFe esterilizada en autoclave (75 g/L CaCh-2H2O; 5 g/L FeCla-6H2O; 3,75 ml HCl (37%)) y 66 ml de solución de glucosa se añaden al medio esterilizado.

Ejemplo 7:

Bacterias y condiciones de cultivo

La cepa Rs265-9c de Rhodobacter sphaeroides se obtuvo a partir de la cepa ATCC 35053 de Rhodobacter sphaeroides [adquirida en la American Type Culture Collection (ATCC - Manassas, VA, EE. UU.- www.atcc.org); número 35053; Rhodobacter sphaeroides (van Niel) Imhoff et al., aislada de una balsa de decantación de aguas residuales en Indiana y depositada como Rhodopseudomonas sphaeroides van Niel] tras dos rondas de mutagénesis y se utilizó como huésped base para la construcción de cepas recombinantes con producción mejorada de santaleno. Todas las cepas de R. sphaeroides se cultivaron a 30 °C en el medio RS102, a menos que se indique lo contrario.

Las cepas de E. coli se cultivaron a 37 °C en medio LB (Becton Dickinson, Sparks, MD, EE. UU.). Para el mantenimiento de plásmidos en cepas recombinantes de E. coli y R. sphaeroides, se añadieron ampicilina (100 mg/L), cloranfenicol (30 mg/L) y/o neomicina (25-50 mg/L, dependiendo del plásmido) al medio de cultivo. Los cultivos líquidos se cultivaron rutinariamente de forma aeróbica en un agitador rotatorio. Cuando se necesitaron medios sólidos, se añadió agar (1,5 % de concentración final).

Ejemplo 8: Clonación de la santaleno sintasa (CiCaSSy) y construcción del plásmido p-m-LPppa-CiCaSSympmii alt

Para la expresión de la Cinnamomum camphora santaleno sintasa en R. sphaeroides, Genscript USA Inc. (Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.) sintetizó y optimizó el ORF completo en términos de uso de codones para R. sphaeroides . Además, se añadió la secuencia del promotor LPppa en el 5' del gen (SEQ ID NO:2). El constructo se entregó clonado en el plásmido pUC57. El constructo completo se extrajo del plásmido utilizando las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (en los extremos 5' y 3', respectivamente). El fragmento que contiene el promotor y el gen (1758 pb) se ligó al vector p-m-mpmii alt previamente digerido con las mismas dos enzimas de restricción. La mezcla de ligación se transformó en células E. coli S17-1. La transferencia de p-m-LPppa-CiCaSSy-mpmii alt (Figura 1) de S17-1 a R. sphaeroides Rs265-9c mediante conjugación se realizó utilizando procedimientos estándar (Patente US 9260709B2). La secuencia de nucleótidos del constructo LPppa-CiCaSSy se indica en SEQ ID NO:2; la secuencia de la proteína se representa en SEQ ID NO:3.

Ejemplo 9:

Construcción del plásmido p-m-SPppa-MBP-CiCaSSy-mpmii alt

Para la expresión del gen CiCaSSy en combinación con la etiqueta MBP bajo la regulación del promotor SPppa, la construcción SPppa-MBP fue sintetizada por Genscript USA Inc. (Piscataway, New Jersey, EE. UU.). El gen que codifica la MBP fue codón optimizado para la expresión en R. sphaeroides. A continuación, el constructo SPppa-MBP se fusionó con la secuencia CiCaSSy y se clonó en el vector p-m-mpmii alt previamente digerido con EcoRI y BamHI. Brevemente, el constructo SPppa-MBP se amplificó utilizando los cebadores 5'-CTGTCCATGATCTTGTCGTCGTC-3' (SEQ ID NO: 16) y 5'-ACTGGCCTCAGAATTCAAATTTATTTGCTTTGAGCGGATAAC-3' (SEQ ID NO: 17), y CiCaSSy se amplificó con los cebadores 5'-CAAGATCATGGACAGCATGGAAGTC-3' (SEQ ID NO: 18) y 5'-TTTATGATTTGGGATCCTCAGCCCAGGTT-3' (SEQ ID NO: 19). A continuación, los amplicones y los vectores digeridos se ensamblaron utilizando la mezcla de enzimas InFusion®de Clontech. La mezcla de reacción se transformó en células E. coli S17-1.

La transferencia de p-m-SPppa-MBP-CiCaSSy-mpmii alt (Figura 2) de S17-1 a R. sphaeroides Rs265-9c por conjugación se realizó utilizando procedimientos estándar (Patente US 9260709B2). La secuencia de nucleótidos del constructo SPppa-MBP-CiCaSSy se indica en SEQ ID NO:4; la secuencia de la proteína se representa en SEQ ID NO:5.

Ejemplo 10:

Construcción del plásmido p-m-PcrtE-TRX-CiCaSSy-mpmii alt

Para la expresión del gen CiCaSSy en combinación con la etiqueta TRX bajo la regulación del promotor PcrtE, lel constructo PcrtE-TRX fue sintetizado por Genscript USA Inc. (Piscataway, New Jersey, EE. UU.). El gen que codifica TRX de E. coli se optimizó en codones para su expresión en R. sphaeroides. A continuación, el constructo PcrtE-TRX se fusionó con la secuencia CiCaSSy y se clonó en el vector p-m-mpmii alt previamente digerido con EcoRI y BamHI. Brevemente, el constructo PcrtE-TRX se amplificó utilizando los cebadores 5'-CTGTCCATAATCTTGTCGTCGTCAT -3' (SEQ ID NO: 20) y 5'- ACTGGCCTCAGAATTCCGCTGCTGAACG -3' (SEQ ID NO: 21), y CiCaSSy se amplificó con los cebadores 5'- CAAGATTATGGACAGCATGGAAGTCC -3' (SEQ ID NO: 22) y 5'- TTTATGATTTGGGATCCTCAGCCCAGGTT-3' (SEQ ID NO: 23). A continuación, los amplicones y los vectores digeridos se ensamblaron utilizando la mezcla de enzimas InFusion® de Clontech. La mezcla de reacción se transformó en células E. coli S17-1.

La transferencia de p-m-PcrtE-TRX-CiCaSSy-mpmii alt (Figura 3) de S17-1 a R. sphaeroides Rs265-9c mediante conjugación se realizó utilizando procedimientos estándar (Patente US 9260709B2).

La secuencia de nucleótidos del constructo PcrtE-TRX-CiCaSSy se indica en SEQ ID NO:6; la secuencia de proteínas se representa en SEQ ID NO:7

Ejemplo 11 Comparativo:

Construcción del plásmido p-m-PcrtE-TRX-SaSSy-mpmii alt

Para la expresión de Santalum album santaleno sintasa (SaSSy) en R. sphaeroides en combinación con la etiqueta TRX bajo la regulación del promotor PcrtE, se sintetizó el ORF de longitud completa junto con la TRX de E. coli fa medida y optimizado en términos de uso de codones para R. sphaeroides por Genscript USA Inc. (Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.). Además, se añadió la secuencia del promotor PcrtE en el 5' del gen (SEQ ID NO: 24). El constructo se entregó clonado en el plásmido pUC57. El constructo completo se extrajo del plásmido utilizando las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (en los extremos 5' y 3', respectivamente). El fragmento que contiene el promotor y los genes (2335 pb) se ligó al vector p-m-mpmii alt previamente digerido con las mismas dos enzimas de restricción. La mezcla de ligación se transformó en células E. coli S17-1.

La transferencia de p-m-PcrtE-TRX-SaSSy-mpmii alt (Figura 4) de S17-1 a R. sphaeroides Rs265-9c mediante conjugación se realizó utilizando procedimientos estándar (Patente US 9260709B2).

La secuencia de nucleótidos del constructo PcrtE-TRX-SaSSy se indica en SEQ ID NO: 24; la secuencia de la proteína está representada en SEQ ID NO: 25.

Ejemplo 12:

Condiciones de crecimiento matraces de agitación. Los cultivos de semillas se realizaron en matraces de agitación de 100 ml sin deflectores con 20 ml de medio RS102 con 100 mg/L de neomicina y un bucle de licor madre de glicerol. Los matraces de cultivo de semillas se cultivaron durante 72 horas a 30 °C en una incubadora de agitación con una órbita de 50 mm a 110 rpm.

Al final de las 72 horas, se evaluó la DO600 del cultivo para calcular el volumen exacto de cultivo que se transferiría a los matraces más grandes.

Los experimentos en matraces de agitación se realizaron en matraces de agitación de 300 ml con 2 deflectores de fondo. Se añadieron al matraz 20 ml de medio RS102 y neomicina a una concentración final de 100 mg/L, junto con 2 ml de n-dodecano estéril. El volumen del inóculo se ajustó para obtener un valor final de OD600 de 0,05 en 20 ml de medio.

Los matraces se mantuvieron durante 72 horas a 30 °C en una incubadora de agitación con una órbita de 50 mm a 110 rpm. Los experimentos en matraz agitado se realizaron por duplicado.

Ejemplo 13:

Preparación de muestras para el análisis del contenido de isoprenoides en fase orgánica

Los cultivos se recogieron 72 horas después de la inoculación en tubos PP de 50 ml previamente pesados que se centrifugaron a 4500xg durante 20 minutos. La capa de n-dodecano se transfirió a un tubo de microcentrífuga para su posterior análisis por GC.

Se pesaron 10 microlitros de laureato de etilo en un vial de vidrio de 10 ml al que se añadieron y pesaron 800 |j 1 de la solución de dodecano aislada. Posteriormente, se añadieron 8 ml de acetona al vial para diluir la concentración de dodecano y poder realizar un análisis GC más preciso. Se transfirieron aproximadamente 1,5 ml de la solución de dodecano en acetona que contenía terpeno a un vial de cromatografía.

Ejemplo 14:

Cromatografía de gases

La cromatografía de gases se realizó en un Shimadzu GC2010 Plus equipado con una columna capilar Restek RTX-5Sil MS (30 m x 0,25 mm, 0,5 pm). Las temperaturas del inyector y del detector FID se fijaron en 280 ° C y 300 ° C, respectivamente. El flujo de gas a través de la columna se fijó en 40 ml/min. La temperatura inicial del horno fue de 160 °C, se aumentó a 180 °C a una tasa de 2 °C/min, se aumentó a 300 °C a una tasa de 50 °C/min y se mantuvo a esa temperatura durante 3 minutos. El volumen de muestra inyectado fue de 1 |jl con una relación de división de 1:50, y el flujo de nitrógeno fue de 30 ml/min.

Ejemplo 15:

Análisis de terpenos producidos por CiCaSSy en R. sphaeroides

La Figura 5 muestra el cromatografía obtenido analizando la fase orgánica aislada de todos los cultivos de R. sphaeroides que expresan el gen CiCaSSy (cepas de los ejemplos 9, 10 y 11). Se identificaron cuatro compuestos principales: a-santaleno (A), trans-a-bergamoteno (B), epi-p-santaleno (C) y p-santaleno (D). El terpeno más abundante fue el a-santaleno, seguido del trans-a-bergamoteno y el p-santaleno. Dado que no se dispone de santalenos purificados para utilizarlos como patrones, el título de terpeno se calculó a partir del factor de respuesta GC obtenido con el terpeno valenceno. La producción total de terpenos (área acumulada bajo la curva para los 4 terpenos) obtenida en las cepas de los ejemplos 9, 10 y 11 es de 5,3 ± 0,12 g/kg de dodecano, 5,8 ± 0,29 g/kg de dodecano y 3,4 ± 0,09 g/kg de dodecano, respectivamente. La relación de las cuatro especies de terpenos se conservó en todas las cepas.

Ejemplo 16

Medio de siembra para el cultivo en lotes alimentados

Los siguientes componentes se disolvieron en 1 L de agua: extracto de levadura 20,8 g, MgSO4'7H2O 10,3 g, ZnSO4-7H2O 86 mg, MnSO4 H2O 30 mg, CaCh 2H2O 1,1 g, FeSO4'7H2O 0,96 g, KH2PO41,44 g, y K2HPO41,44 g . El pH se ajustó a 7,4 con NaOH 10 M. Tras la esterilización (121°C, 20 min), se añaden 50 ml de glucosa al 50% (p/p) y 1 ml de sulfato de neomicina 0,1 mg/ml por litro de medio.

Ejemplo 17

Medio para el cultivo en lotes alimentados

Los siguientes componentes se disolvieron en 1 L de agua: extracto de levadura 25 g, MgSO4 7H2O 1,7 g, ZnSO4 -7H2O 0,10 g, MnSO4 H2O 35 mg, CaCh 2H2O 1,3 g, FeCh 6H2O 0,17 g, K2HPO4V g, KH2PO4V, (NH4)2Fe(SO4)2 -6H2O 1,1 g, (NH4)2SO42,8 g, (NH4)H2PO41,1 g, MgCh 6H2O 1,9 g, y antiespuma 1 ml.

Tras la esterilización (121°C, 20 min), se ajusta el pH a 7,0 con una solución de hidróxido de amonio al 25%. Por litro de medio estéril, se añadieron 60 ml de glucosa al 50% (p/p), 1 ml de sulfato de neomicina 0,1 mg/ml, 4 mg de niacina, 8 mg de tiamina HCl, 4 mg de nicotinamida, 0,2 mg de biotina y 150 ml de n-dodecano.

Ejemplo 18

Condiciones de cultivo para fermentación por lotes alimentados

Los cultivos de semillas para los cultivos por lotes alimentados se prepararon inoculando 500 ml de medio de siembra estéril (ejemplo 16) añadiendo 1 ml de licor madre de glicerol de la cepa de Rhodobacter sphaeroides apropiada, e incubando durante 48 horas a 30°C.

En un recipiente fermentador de 1 L, se esterilizaron 350 ml de medio de alimentación y se suplementaron con glucosa esterilizada (filtrada), Neomicina, vitaminas y n-dodecano como se indica (ejemplo 17). Mediante la adición de 50 ml de cultivo de semillas, se inoculó el medio y se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C, agitación de 600 rpm, flujo de aire de 0,3 vvm y un pH de 7 (ajustado mediante la adición automatizada de una solución de hidróxido de amonio al 12,5%). Transcurridas 24 horas, se aumentó la agitación a 1.200 rpm y se introdujeron en el fermentador 450-500 g de glucosa al 50 (p/p)% en 100 horas.

Ejemplo 19

Preparación de muestras GC Fermentación por lotes

Se recogieron muestras de caldo de aproximadamente 20 ml durante un cultivo por lotes alimentado. Se pesaron 10 microlitros de laureato de etilo en un vial de vidrio de 10 ml al que se añadieron 0,8 ml de muestra de caldo y se pesaron. A continuación, se añadieron 8 ml de acetona al vial y la mezcla de acetona y caldo se incubó a temperatura ambiente durante 25 minutos mientras se agitaba a 400 rpm. Se transfirieron aproximadamente 1,5 ml de la mezcla de acetón y caldo que contenía terpeno a un vial de cromatografía y se utilizaron para el análisis de acuerdo con el ejemplo 14.

Ejemplo 20

Comparación de la producción de terpenos por cepas de Rhodobacter spaeroides que albergan CiCassy y SaSSy

Las cepas de Rhodobacter spaeroides que albergan CiCaSSy (p-m-SPppa-MBP-CiCaSSy-mpmii alt, ejemplo 10) o SaSSy(p-m-PcrtE-TRX-CiCaSSy-mpmii alt, ejemplo 11, ejemplo comparativo) se cultivaron en modo alimentado por lotes de acuerdo con el ejemplo 18. Se tomaron muestras del caldo de fermentación en distintos momentos y se analizaron para determinar la producción de terpenos de acuerdo con los ejemplos 19 y 14. La concentración de terpenos totales producidos (áreas acumuladas de los picos A-D de la figura 5) fue casi igual para ambas cepas durante todo el cultivo (Figura 6A), y se obtuvo una concentración final de terpenos de aproximadamente 5,5 g/kg de caldo. A lo largo de 120 horas de cultivo por lotes alimentados, los terpenos producidos por la cepa CiCaSSy consistieron aproximadamente en 49 % de a-santaleno (Figura 6B), 21 % de p-santaleno (Figura 6C) y 25% de transa-bergamoteno (Figura 6D), mientras que la cepa SaSSy produjo aproximadamente 28 % de a-santaleno (Figura 6B), 14 % de p-santaleno (Figura 6C) y 52 % de trans-a-bergamoteno (Figura 6D). Los porcentajes de a-santaleno y psantaleno producidos por la cepa CiCaSSy fueron respectivamente 1,8 veces y 1,5 veces superiores a los de la cepa SaSSy. En cambio, la fracción trans-a-bergamoteno producida por la cepa CiCaSSy fue 2 veces inferior a la de la cepa SaSSy.

REFERENCIAS

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Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Santaleno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3 o un homólogo funcional del mismo, donde dicho homólogo

- es una santaleno sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % con SEQ ID NO: 3; y

- que tiene una especificidad hacia la catálisis de la formación de santaleno, expresada como la relación molar santaleno/bergamoteno de al menos 1,5: 1.

2. Santaleno sintasa de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.

3. Ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una santaleno sintasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o una secuencia complementaria de la misma, en la que el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 65 % con una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia complementaria de cualquiera de estas secuencias, en la que la identidad de secuencia se compara en toda la longitud de la secuencia.

4. Vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una célula huésped no humana que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga de acuerdo con la reivindicación 3.

6. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula huésped es una célula bacteriana seleccionada del grupo de bacterias Gram negativas, en particular del grupo de Rhodobacter, Paracoccus y Escherichia.

7. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula huésped es una célula fúngica seleccionada del grupo de Aspergillus, Blakeslea, Penicillium, Phaffia (Xanthophyllomyces), Pichia, Saccharomycesy Yarrowia.

8. Planta o cultivo transgénico que comprende células vegetales transgénicas, dicha planta o cultivo que comprende células huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la célula huésped es de una planta transgénica seleccionada de Nicotiana spp, Solanum spp, Cichorum intybus, Lactuca sativa, Mentha spp, Artemisia annua, plantas formadoras de tubérculos, cultivos oleaginosos, plantas de cultivo líquido, células BY2 de tabaco, Physcomitrella patens y árboles.

9. Seta transgénica o cultivo que comprende células de seta transgénica, comprendiendo dicha seta o cultivo células huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la célula huésped se selecciona de Schizophyllum, Agaricus y Pleurotis.

10. Método para preparar santaleno, que comprende convertir un farnesil difosfato (FPP) en santaleno en presencia de una santaleno sintasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

11. Método para preparar santaleno de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el santaleno se prepara en una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, 6 o 7, una planta o cultivo de plantas de acuerdo co la reivindicación 8, o un hongo o cultivo de hongos de acuerdo con la reivindicación 9, que exprese dicha santaleno sintasa.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que comprende además aislar el santaleno.

13. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la relación molar de santaleno a bergamoteno es al menos 1,5: 1 y la relación a-santaleno/a-bergamoteno es superior a 1 y/o la relación p-santaleno/abergamoteno es superior a 0,5: 1.

14. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la relación de santalenos (a- y p-santaleno) y a-bergamoteno es superior a 2: 1.

15. Método para preparar santalol, que comprende convertir FPP en santaleno en presencia de una santaleno sintasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además convertir el santaleno en santalol.

16. Método para preparar santalol de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el santaleno se prepara en una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, 6 o 7, una planta o cultivo de plantas de acuerdo con la reivindicación 8, o un hongo o cultivo de hongos de acuerdo con la reivindicación 9, que exprese dicha santaleno sintasa.

17. Método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, que comprende además aislar el santalol.