CN103620041B

CN103620041B - 从微藻制备和提取角鲨烯的方法

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Publication number: CN103620041B
Application number: CN201280024524.3A
Authority: CN
Inventors: 伯纳德·波拉; 钱云; 伯纳德·考利尔; 塞吉·科米尼; 菲利皮·卢腾; 劳伦特·塞盖拉
Original assignee: Rogate Brothers
Current assignee: Rogate Brothers
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: CN102787140A; WO2012159979A1; CA2835072A1; KR20140023365A; JP5959628B2; JP2014515929A; CA2835072C; KR102032572B1; EP2710131B1; CN103620041A; US20140088201A1; EP2710131A1; US10087467B2

Abstract

本发明涉及一种以属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，优选以在每100g干生物质2g与12g之间的浓度生产。该方法其特征在于它包括由以下项组成的步骤：在25℃与35℃之间、优选在28℃与32℃之间、并且更优选在大约30℃的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻；并且向所述培养基以每升培养基添加1μg与1000μg之间的维生素B12。

Description

从微藻制备和提取角鲨烯的方法

本发明涉及从破囊壶菌目物种家族的微藻通过发酵而最优化生产角鲨烯的一种方法。

出于本发明的目的，表述“破囊壶菌目物种家族的微藻”旨在指代属于裂殖壶菌属物种（Schizochytriumsp.）、Aurantiochytrium物种（Aurantiochytriumsp.）以及破囊壶菌属物种（Thraustochytriumsp.）的微藻。

角鲨烯是一种三萜烯，一种包含30个碳原子和50个氢原子的类异戊二烯，具有以下化学式：2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。

它是由所有较高级别的有机体，包括人类（在皮脂中发现）天然产生的一种脂质。角鲨烯实际上是胆固醇、类固醇激素和维生素D生物合成中的一种重要的中间产物（胆固醇代谢途径的的一种酶—角鲨烯单加氧酶，通过氧化角鲨烯分子末端之一，将诱导其环化并且产生羊毛甾醇，该羊毛甾醇被转化成胆固醇和其他类固醇）。

在工业上，角鲨烯尤其被用于食品部门、化妆品领域和制药领域。

作为一种食品补充剂，角鲨烯通常被配制成胶囊或者油类。

在化妆品领域中，这个分子可以用作一种抗氧化剂，在保湿霜中用作抗静电剂和润肤剂，快速渗透进皮肤而不留下脂肪痕迹或者感觉，并与其他油类和维生素类很好地混合。

在这个领域，应该注意到，由于角鲨烯非常高的不稳定性（6个不饱和状态），饱和形式的角鲨烷（通过氢化作用得到）是比角鲨烯更好的抗氧化剂，这种角鲨烷在市场上可以找到，一般具有非常高的纯度（99%）。

毒理学研究显示，按照在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角鲨烷都不会展示出任何毒性，并且对人体皮肤没有刺激性或者敏感性。

在制药领域，角鲨烯用作疫苗的佐剂。

这些佐剂是刺激免疫系统并且增加对疫苗的反应的物质。

自从1997年在一种流感疫苗（Fluad，来自Chiron公司，对抗季节性流感）中以每个剂量大约10mg角鲨烯使用角鲨烯以来，角鲨烯已经以添加到接种物质中的乳剂的形式使用以便使得疫苗更易产生免疫性。

如所有含有角鲨烯的疫苗，这些乳剂具有乳白色的外观。

角鲨烯还被用作一种疫苗佐剂，特别是实验疫苗、抗疟疾物质或者靶向新出现的病毒H5N1及2009H1N1的流感疫苗的佐剂，如：

-葛兰素史克公司在对抗2009年流感流行时使用的Pandemrix和Arepanrix疫苗中的AS03佐剂系统的获专利成分，

-诺华公司使用的MF59佐剂系统的获专利成分。

角鲨烯还被添加在流感疫苗中以通过产生记忆CD4细胞来刺激人体的免疫应答。

流感疫苗的第一个水包油佐剂已经与季节性流感病毒抗原联合上市。

角鲨烯的纯度水平在这个应用领域中是至关重要的。

实际上，如果口服使用，角鲨烯被认为是完全安全的；但是，注射途径是争议主题。

实际上，在医学领域，在角鲨烯被杂质污染的情况下，对人接受者的伤害的风险增加，因为通过确定，这种佐剂还可以诱导对抗其自身杂质的强免疫应答。

因此拥有高质量的无杂质（痕量金属，特别是汞，以及痕量的其他毒素类）的角鲨烯至关重要。

在文献中建议了一些生产角鲨烯的路径。

它是常常发现储存在软骨鱼（例如深海鲨）的肝脏中的一种化合物（因此而得名）。

因此这是它们为什么被过度捕渔的原因之一，鲨鱼已经由于其鱼鳍而被猎杀。现在又将鲨鱼的肝脏出售以生产描述为“有益健康”的凝胶胶囊。

然而，虽然上市的角鲨烯因此主要从鲨鱼的肝脏中提取，但是并非没有健康问题。

这是因为鲨鱼能被一些病原体感染，这些病原体可以产生对人体有害的物质。另外，鲨鱼的肝脏，它是有机体消除和纯化的器官，可能包含对人体有害的例如真鲨毒素的毒素类。

这些环境问题（大大降低了鲨鱼的数量）以及健康问题（鱼的肝脏还储存了涉及健康的毒素类）促使了从植物类的提取。

因此有可能将它从橄榄油、和棕榈油中分离，以及从来自谷物类的或者源于苋菜、种子、米糠或小麦胚芽的其他油类中分离。

但是，这种情况中的主要缺点是角鲨烯被提取出的量非常少，按重量计大约为从0.1%至0.7%。

通常从鲨鱼肝脏或从植物类提取的这些方法由于进行大量富集和纯化过程而很昂贵，已经提出了作为这些方法的第一个替代方法，该第一个方法是从以下微生物中产生角鲨烯：天然酵母或重组酵母，特别是酵母菌属（Saccharomyces）类型。

由此，酿酒酵母以其产生角鲨烯的能力而为人了解，但是产生的量非常少：大约0.041mg/g生物量（巴塔查尔吉（Bhattacharjee,P.）等人，2001，《世界微生物生物技术杂志》（WorldJ.Microb.Biotechnol.）17，第811-816页）。

因此已经通过基因重组的方式进行了优化这些生产能力的工作。

产生角鲨烯的重组酵母因此具有以下优势：

-受益于与宿主细胞相同的GRAS（通常认为安全）状态，

-跟宿主细胞一样没有病原体、没有朊病毒或没有毒素类，以及

-已经被用在疫苗领域（例如这些表达了包含乙肝抗原的载体的酵母菌）。

然而，如专利申请WO2010/023551对于医学领域所呈现的（生产纯度高于97%的角鲨烯作为疫苗佐剂），只有使得重组酵母菌超生产角鲨烯（高于菌体干重的15%）变得有可能，这第一个替代方法才可以工业化。

如果可以发生的话，获得这些重组细胞需要：进行大量的、艰苦的、冗长并复杂的代谢工程化步骤，使用分子生物学工具，导致刺激角鲨烯生物合成路径并且抑制角鲨烯的分解代谢途径。

实际上，如所述专利申请WO2010/023551另外介绍的，在角鲨烯生物合成中涉及很多基因：包含甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、HMGR（3-羟基-3-甲戊二酰-辅酶A还原酶）以及角鲨烯合成酶。

对于分解代谢途径，基因编码在角鲨烯转化成麦角固醇中涉及的众多酶，包括角鲨烯环氧酶（ERG1）、羊毛甾醇合成酶、C14-二甲基化酶、d14-还原酶、C4-甲基氧化酶、C4-脱羧酶（ERG26）、3-酮还原酶、C24-甲基转移酶、C8-异构酶、C5-去饱和酶、d22-去饱和酶和d24-还原酶。

另外，还必须考虑到其他分解代谢酶：LEU2（[β]-异丙基苹果酸脱氢酶），环氧角鲨烯环化酶，酵母甾醇-24-甲基转移酶以及麦角甾-5,7,24(28)-三烯醇-22-脱氢酶。

作为从鲨鱼肝脏或从植物类提取方法的第二个替代方法，已经提出了从破囊壶菌目家族（包含破囊壶菌属、Aurantiochytrium属和裂殖壶菌属）、更特别地从Schizochytriummangrovei或Schizochytriumlimacinum的微藻中生产角鲨烯的有希望的方法。

这些微藻在异养条件下（无光；提供葡萄糖作为碳源）产生角鲨烯，并且因此可以由微生物发酵领域的普通技术人员容易地操作。

因此，这些方法通过可控制的发酵条件提供高质量的角鲨烯，这些角鲨烯的纯化可以很容易地进行以满足食品、化妆品和医学需求。

然而在破囊壶菌目家族的这些微藻中，角鲨烯是感兴趣的其他脂质化合物（例如二十二碳六烯酸（或DHA）、ω3族的多元不饱和脂肪酸）的副产品，。

因此似乎角鲨烯被特别描述为商业DHA油类的非皂化部分（连同类胡萝卜素类和甾醇类）的成分之一。

相比较而言，SchizochytriummangroveiFB1菌株产生DHA的比例为菌体干重的6.2%，角鲨烯为0.017%。

结论是，天然产生角鲨烯的这些微生物类其产量是非常低的：

对于ThraustochytridACEM6063，大约为0.1mg/g生物质（参见Lewis等人，《海洋生物技术》（Mar.Biotechnol.），2001,439-447），

对于SchizochytriummangroveiFB1，大约为0.162mg/g生物质（参见Jiang等人，《农业与食品化学杂志》（J.Agric.FoodChem.）,2004，52，第1196-1200页）。

为了增加产量，由此显现出优化这些发酵条件至关重要。

在QianLi等人在《农业与食品化学杂志》（J.Agric.FoodChem.,2009,57,4267-4272）的文章中描述了角鲨烯是甾醇生物合成的一种关键中间体，并且角鲨烯转化成甾醇的第一个步骤是由一种氧依赖性角鲨烯环氧酶进行催化。

因此，反之，如果希望的话，应禁止富含溶解氧的条件从而累积细胞内的角鲨烯。

因此，在一个低的溶解氧水平（0至5%饱和度）下培养ThraustochytridACEM6063，使得有可能累积超过1mg/g的角鲨烯，然而在一个较高的溶解氧水平（40%至60%）下的生长使得有可能获得仅仅0.01mg/g的角鲨烯。

相似地，在15℃的温度下培养使得由ThraustochytridACEM6063生产出1.2mg/g角鲨烯，然而在20℃的温度下培养仅仅产生0.7mg/g（参见Lewis等人，《海洋生物技术》（Mar.Biotechnol.）,2001,3,439-447）。

在G.Chen等人在《新生物技术》（NewBiotechnology,2010,27-4,382-389页）的文章中，回顾了裂殖壶菌主要通过聚酮合酶（首字母缩略词：PKS）途径产生DHA，然而角鲨烯是通过胆固醇生物合成途径合成，这意味着产生这两种化合物时破囊壶菌的营养需求是不同的。

因此他们工作的目标是系统地研究在生产角鲨烯中不同氮源的效果。

G.Chen等人由此发现，在包含由谷氨酸钠、酵母提取物和胰蛋白胨组成的氮源混合物的培养基中，裂殖壶菌可以快速生长并且累积“高”量的角鲨烯。

尽管这样，所谓的“高”的角鲨烯产量完全是相对而言的。

虽然相对于基础培养基的值，这些作者成功地分别以26.3%和10.1%显著增加角鲨烯的含量和产率，但是这些优化的条件实际上产生含量为0.72mg/g和滴度为5.90mgl/l的角鲨烯。

带着优化角鲨烯产量的相同目标，K.W.Fan等人（在《世界微生物生物技术杂志》（WorldJ.Microbiol.Biotechnol.）,2010,26-3,1303-1309页中）使用了角鲨烯单加氧酶（甾醇生物合成中的一种关键酶）的抑制剂：特比萘芬羟基氯化物。

已知角鲨烯含量和产率与微生物培养的年龄相联系。

细胞培养年龄越长，它累积的角鲨烯越少；实际上，它在甾醇生物合成路径中消耗所述角鲨烯越多。

因此特比萘芬通过防止角鲨烯向甾醇路径的这种消耗而起作用，并且因此使得其有可能刺激角鲨烯在细胞内累积至相对于对照品高达36%至40%。

但是，在这个研究中从所使用的AurantiochytriummangroveiFB3菌株获得的最高的角鲨烯产量，即使比对于酿酒酵母（S.cerevisiae）（0.041mg/g生物质）所描述的高很多、或者甚至比对于戴尔有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii）（0.24mg/g生物质）所描述的还高，却仅仅是0.53mg/g生物质。

此外，虽然这些代谢途径的转移允许产生相对更高量的角鲨烯，它的风险是通过相应地限制对产生这些相同细胞的类脂膜至关重要的甾醇类的产生而弱化这些细胞。

在这些最高的角鲨烯产量结果中，使用如在由C-JYue和Y.Jiang在《过程生物化学》（ProcessBiochemistry,2009,44,923-927）的文献文章中所报道的微藻，表明最大角鲨烯含量为1.17±0.6mg/gSchizochytriummangrovei生物质，其中使用茉莉酸甲酯通过直接作用于角鲨烯合成酶（一种所述代谢途径的关键酶）来调节角鲨烯合成的代谢途径。

因此，尽管作了所有的努力，这些值远远低于橄榄油的参考值（大约4.24mg/g），并且远非工业规模所需的值。

考虑到开发比现有技术中描述的那些更有效并且更便宜的一种生产方法，本申请人公司已经发展了自己在破囊壶菌目物种家族的微藻的发酵条件优化上的研究。

因此本发明涉及一种用于获得对于100g的干生物质而言1g角鲨烯规模的方法，也就是，超过这个领域的文献中通常所描述的量高达1000倍。

本发明还涉及一种从得到的发酵培养基提取和纯化角鲨烯的方法。

通过发酵裂殖壶菌来生产角鲨烯

对本申请人公司最主要的荣誉是发现，在控制发酵的所有参数中，其中两个使得它们本身有可能在这些微藻中大量提高角鲨烯的产量水平。

这两个关键参数是培养基的温度、以及维生素类的添加，更准确地说是维生素B1和B6并且尤其是维生素B12的添加。

因此本发明涉及由属于破囊壶菌目物种家族的微藻来生产角鲨烯的一种方法，其特征在于它包含以下步骤：

-在25℃与35℃之间、优选在28℃与32℃之间、更优选大约30℃的温度下，培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻，并且

-向该培养基中以每升培养基添加1μg至1000μg的维生素B12。

优选地，如以下将表明的，本申请人公司推荐添加：

○每升培养基0.1mg至200mg的维生素B1，和/或

○每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。

当然，该方法可以包括回收富含角鲨烯生物质的一个步骤和/或回收或提取角鲨烯的一个步骤。

更具体地，已经测试了以下可商购的菌株：

-裂殖壶菌属物种，参考号ATCC20888，

-Aurantiochytrium物种，参考号ATCCPRA276。

此外，本申请人公司还拥有自己的生产菌株—裂殖壶菌属物种，于2011年4月14日保藏在法国巴斯德研究所的法国国家微生物保藏中心[CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganisms]，保藏号为CNCMI-4469，并且还保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心（中国武汉，430072），保藏号为M209118。

还将Schizochytriummangrovei的一个菌株作为对照进行了测试，以下将举例说明。

具体地，根据本发明的方法使得有可能获得对于100g干生物质而言大于或等于2g、优选对于100g干生物质而言在2g与12g之间的角鲨烯含量。具体地，可以根据实验部分详述的方法对所产生的角鲨烯进行定量。

由此，在根据本发明的方法中，首要的基本特征是选择进行微藻培养和生产角鲨烯的温度。

因此将该温度选择在25℃与35℃之间，优选在28℃与32℃之间，更优选大约在30℃。

因此本申请人公司克服了第一个技术偏见，即要求这些微藻的培养不应超过25℃。

事实上，在以上所引用的破囊壶菌目生产角鲨烯的大部分文献中，基于所研究的微藻的生长温度（即15℃、22℃或25℃）来设置生产温度。

根据本发明的方法，本申请人公司建议，相反地，在28℃和32℃培养这些微藻，因为已经能够注意到：

-虽然由菌体生物质生产的角鲨烯的浓度随着温度高达33℃而增加，超过30℃生物质的量将显著降低，因此限制角鲨烯滴度，

-在25℃的温度下，角鲨烯浓度无法检测到或者非常低。

因此这个温度范围是微藻最佳培养温度和角鲨烯有效生产温度之间的一个折衷。

因此最高25℃的温度与现有技术中通常使用的温度不矛盾，这个温度最佳地促进角鲨烯的生产。

在根据本发明的方法中，第二个基本特征是提供给裂殖壶菌培养基来生产角鲨烯的维生素B12的量，即以每升培养基从1μg至1000μg的维生素B12的比例。

优选地，添加维生素B12时还可以补充：

○每升培养基0.1mg至200mg的维生素B1，和/或

○每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。

在涉及用以上提及的微藻生产角鲨烯的文献中，维生素类的作用没有考虑。维生素类的提供常规地通过添加酵母提取物来进行。

事实上本领域的普通技术人员熟知这些维生素类是按以下比例天然存在于酵母提取物中的：

-50mg/kg至120mg/kg的维生素B1（硫胺素），

-40mg/kg至80mg/kg的维生素B6（吡多辛），

-1μg/kg至5.5μg/kg的维生素B12（氰钴胺），

-仅仅提及这三种维生素B。

但是，对于100ml培养基，仅提供1g至2g引入培养基中的酵母提取物（参见上面列出的科学文章），这对应着极其低的维生素剂量（例如，对于维生素B12，由酵母提取物提供的维生素B12对应为0.07μg/l）。

即使这样，这套文件既没有描述也没有建议为了在微藻中生产角鲨烯而控制维生素B1、B6或B12的含量。

没有受任何理论的约束，本申请人公司已经发现在生产角鲨烯中维生素B12的卓越作用（以下将会示例）表明它是角鲨烯生物合成所涉及的一些关键酶的辅因子。

对于维生素B1，它刺激亮氨酸降解途径，这将增加细胞内角鲨烯前体的量，而维生素B6通过改变细胞色素类的作用而阻止角鲨烯降解。

因此本申请人公司已经发现维生素B12的提供（使温度达到28℃和30℃的情况下）是极大增加角鲨烯产量（在1g/100g干生物质规模上）的关键，并且事实上维生素B1和B6的提供使得尤其有可能增加角鲨烯的生产率，如以下将证明。

根据本发明的方法的另一个特征是添加维生素类可以在整个发酵过程中、或者在一些步骤中、并且不仅仅在生产阶段进行。

但是，必须坚持在整个发酵过程中提供在1μg/l与1000μg/l之间的维生素B12。

常规地，在涉及优化实验室中进行的由微藻生产角鲨烯的条件的工作的文献中，发酵是基于常规微生物接种和生产链进行的，并且通常是最大多数使用的生产条件。

实际上从破囊壶菌生产角鲨烯需要三个连续步骤：在一个琼脂培养皿上从一个分离的菌落开始，预培养以恢复菌株，并且最后实质培养（=生产）。

例如，上面提到的G.Chen的文章描述了包含以下连续步骤的方法：

-从在包含葡萄糖、谷氨酸钠、酵母提取物和各种微量元素（traceelement）的琼脂营养培养基上保存的菌株开始，

-在一个定轨摇床上在锥形烧瓶（Erlenmeyerflask）中，在pH为6、温度为25℃时，制备预培养物，以便获得恢复的生物质，

-向具有与在预培养中所用的培养基相同的培养基的另一系列锥形生产烧瓶接种大约0.5%（v/v）的前述步骤获得的生物质，并且保持在25℃的温度下。

如果发生的话，如可以在所述文章中读到（但是在本领域的其他文章中也证实这是真实的）的，在后面培养步骤的水平上，专家们为了优化发酵条件而采取行动。

换句话说，现有技术优化研究包含改变生产培养基的一种或多种组分以便研究其对角鲨烯生产的影响。

但是正相反，如以下将被开发的，本申请人公司建议从第一步骤就开始控制发酵条件，即使证实在工业规模上实现更加复杂。

在这个规模上，事实上，接种链可以在实际生产步骤之前包含一系列的几个预培养步骤。

根据本发明的方法的一个优选实施例因此可以包含以下连续步骤：

-在锥形烧瓶中，在28℃的温度下，从一个琼脂培养皿上的一个分离的菌落对破囊壶菌目家族的微藻进行第一次预培养，持续24至36小时，

-在锥形烧瓶中，在28℃的温度下，用1%（v/v）的从第一次预培养得到的接种物进行第二次预培养，持续24至36小时，

-在30℃的温度下，在一个设定了条件以便观察到最高45mmol/l/hr氧传递的一个发酵罐内，用0.5%至2%（v/v）的从第二次预培养得到的接种物培养60至150小时。

在这个链条中，如以下将示例的，取决于操作条件，维生素类的添加可以在一个单一的预培养步骤中、在两个预培养步骤中或贯穿整个培养链进行。

如以下将证明的，在一个单一预培养步骤中添加维生素类已经使得有可能获得显著的结果，最佳模式则需要在所执行的所有步骤中进行添加。

微藻生长所需的碳源优选地是葡萄糖。

本申请人公司因此建议控制葡萄糖的添加，从而提供按重量计从15%至22.5%的葡萄糖总量。

尽管如此，如以下将用所选择的裂殖壶菌菌株举例说明的，优选在非零残留葡萄糖含量下、最高等于按重量计8%含量下工作。

关于氮源的性质，本申请人公司已经发现有可能从由以下项组成的组中选择：酵母提取物、尿素、谷氨酸钠和硫酸铵，单独使用一个或它们的组合。

有可能优选酵母提取物，通常用于现有技术的方法中，补充了维生素混合物的尿素，例如Sigma公司销售的BME混合物，使用量为5ml/l。

类似地，有可能完全或部分用谷氨酸钠替代尿素，或者使用谷氨酸钠与硫酸铵的混合物。

本申请人公司尤其建议不使用硝酸形式的氮源。

关于培养基的pH，如以下将示例的，将维持在5.5与6.5之间，优选固定在6的值。

该pH值可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方式进行调整，例如通过添加2N硫酸，然后加入8N氢氧化钠。

最后，可以将溶解氧含量调整至20%与0%之间的一个值，优选在溶解氧成为0%之前的最初的24或48小时期间、优选36小时期间维持在5%，。

关于氧传递，可以用已知的任何方式而且是对于本领域的普通技术人员已知的任何方式调整，以便不超过45mmol/l/hr。

如以下将示例的，在发酵结束时，按照这些操作条件获得的生物质高于50g/l、优选在50g/l与100g/l之间，大约为80g/l。

角鲨烯的含量，就其部分而言，对于100g干生物质而言为高于1g，优选地对于100g干生物质而言为2g与15g之间，甚至更优选地对于100g干生物质而言为5g与10g之间。

从发酵培养基提取和纯化角鲨烯

通过本领域普通技术人员本身已知的任何方法从发酵培养基恢复生物质，例如可以将生物质从发酵罐中移除并且通过微孔过滤或离心法简单地浓缩，或者用一种水性溶液通过连续浓缩-稀释来洗涤。

为了提取脂质含量进行的细胞破裂可以通过各种途径进行，其中有机械的、化学的或酶的途径。

在几步连续提取中用己烷/乙醇从细胞裂解物提取油。

分离己烷部分，并且然后将己烷蒸发掉以便分离原油。

本发明最后涉及用本发明的任何一种方法生产的角鲨烯在制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物中的用途。因此，它涉及一种用于制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物的方法，该方法包括使用本发明的任何一种方法生产角鲨烯，并且进而制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物。

借助下述实例将更清晰地理解本发明，这些实例旨在说明性的而非限制性的。

实例1：添加维生素B1、B6和B12的研究以及温度对角鲨烯生产的影响的研究

预培养和培养基

在此，微藻的发酵在实际培养/生产阶段之前通过两个先前的连续的预培养阶段进行。

对于此实验，在第一次预培养的培养基内添加了维生素类，但是在第二次预培养的培养基中以及在生产中维生素类的添加是可任选的。

因此预培养的培养基具有下表I和II给出的组分：

表I

第一次预培养的培养基	%
		葡萄糖	3
酵母提取物	0.4
		谷氨酸的钠盐	6.42
NaCl	1.25
		MgSO₄	0.4
KCl	0.05
		CaCl₂	0.01
NaHCO₃	0.05
		KH₂PO₄	0.4
维生素混合物	0.14
		微量元素（Trace element）	0.8

表II

第二次预培养的培养基	%
		葡萄糖	8.57
谷氨酸的钠盐	6.42
		酵母提取物	0.64
NaCl	2
		KH₂PO₄	0.64
MgSO₄	2.29
		CaCl₂	0.03
NaHCO₃	0.03
		Na₂SO₄	0.03
添加维生素混合物	0.14
		微量元素	0.2

通常，使用1m/l的ClerolFBA3107止泡剂。

可任选地，使用50mg/l的青霉素G钠盐以便防止污染菌的生长。

将葡萄糖用KH₂PO₄灭菌，并且将其与培养基的其他部分分离，因为这样避免了形成沉淀物（磷酸铵镁）。

在灭菌过滤之后加入维生素混合物和微量元素。

培养基/生产培养基的组分在下表III中给出。

表III

	%
		在T0添加葡萄糖	7.5
尿素	1
		酵母提取物	1.2
NaCl	0.25
		KH₂PO₄	0.96
MgSO₄	1.2
		CaCl₂	0.12
NaHCO₃	0.12
		KCl	0.08
如果添加维生素混合物	0.4
		微量元素	0.56

维生素混合物的组分和微量元素的组分在下表IV和表V中给出：

表IV

维生素混合物	g/l
		B1	45
B6	45
		B12	0.25

表V

微量元素	g/l
		MnCl₂.2H₂O	8.60
CoCl₂.6H₂O	0.2
		NiSO₄.6H₂O	7.50
Na₂MoO₄.2H₂O	0.15
		ZnSO₄.7H₂O	5.70
CuSO₄.5H₂O	6.50
		FeSO₄.7H₂O	32.00
ZnCl₂	1.50

进行发酵

第一次预培养是在500ml的带有挡板的锥形烧瓶中进行，向该烧瓶中添加一滴由CognisGmbHDusseldorf公司销售的ClerolFBA3107止泡剂。

将培养基在其成分完全溶解之后进行过滤，可任选地以0.25mg/l的比例补充青霉素G钠盐。

通过取在一个有盖培养皿内培养的微藻菌落进行接种（比例为一个10μl环）。

孵育持续24至36小时，温度为28℃，伴随100rpm的摇动（在一个定轨摇床上）。

由于生物质沉降（或者粘附在壁上），在摇匀锥形烧瓶之后小心取出3ml至5ml样品。

对于第二次预培养，使用了2l的带挡板的配备管路的锥形烧瓶。

将一滴止泡剂和酵母提取物添加至100ml水中。

在培养基的所有成分溶解在300ml的去离子水之后进行过滤。有可能可任选地添加青霉素G钠盐，并且在其灭菌之前预先向锥形烧瓶中加入一滴止泡剂。

然后用3ml至5ml的第一次预培养物进行接种。

孵育在28℃下再进行24至36小时，伴随100rpm的摇动。

在一个20l的反应器内按以下方式进行实际培养：

-对反应器内的一部分培养基进行灭菌，并且对另一部分分开灭菌以便防止形成沉淀物，

-使用在第二次预培养最后产生的生物质进行接种，比例为0.5%v/v培养基，

-培养维持在30℃，

-氧传递速率固定在35mmol/l/h-40mmol/l/h，

-通气0.2VVM至0.3VVM，

-最初pH>5.5，

-一旦浓度>20%立即补充葡萄糖，以便维持葡萄糖浓度在15g/l与70g/l之间。

下表给出了用本申请人公司的裂殖壶菌属物种获得的结果。

这个表给出了：

-温度对角鲨烯生产的效果（仅仅在两个预培养操作中添加了维生素类：测试“B”和“C”），以及

-与没有添加维生素类的标准（测试“A”）相比，在预培养和生产步骤中添加维生素B1、B6和B12（测试“D”和“E”）的效果。

还进行了在25℃下没有补充添加维生素类的对照测试。

表V

应该注意到在文献的常规条件下，对照测试“A”对于所测试的微藻菌株没能生产出可检测到的量的角鲨烯。

对于测试“B”和“C”：

28℃的预培养温度以及在预培养操作中维生素B1、B6和B12的存在已经使得有可能提供对于100g生物质而言大约1g的角鲨烯产量（测试“B”），也就是比文献中所描述的（例如通过ThraustochytridACEM6063或S.mangroveiFB1生产角鲨烯）高大约1000倍。

对于测试“D”和“E”：

在所有的培养步骤（2个预培养操作以及生产）中温度结合添加维生素类的效果是显著的。当温度保持在25℃时，测试“D”能够生产对于100g生物质而言3.3g的角鲨烯，而当温度达到30℃时，对于测试“E”产量增加至8.2g/l。

在高于25℃的温度下，结合大量添加维生素B1、B6和B12来执行发酵条件，因此使得有可能获得最高的角鲨烯产率和生产率。

对在裂殖壶菌属物种生物质中的角鲨烯进行定量的方法

在生物质的球破裂并且用氯仿/甲醇冷提取之后在25℃通过质子NMR进行分析。通过以下描述的内标法进行定量。

在一个AvanceIII400分光计（BrukerSpectrospin）上，在400MHz下操作，获得光谱。

生物质破裂：准确称量出大约200mg的新鲜生物质。添加大约1cm-1.5cm的玻璃球和0.1ml的甲醇。气密封管并且用一个旋涡混合器搅拌至少5分钟。

冷提取：添加大约2mg的磷酸三苯酯（TPP）、0.9ml的甲醇和2ml的氯仿。气密封管并且用一个旋涡混合器搅拌1分钟，放置进一个冰箱中。通过沉降分离之后（最少1小时），小心恢复澄清的上层相并且将其转移进一个玻璃罐内，在室温下、在氮气流下蒸发至干。将干提取物溶解在0.5ml的CDCl3和0.1ml的CD3OD中，并且转移进一个NMR管中。

光谱记录：在对仪器进行了恰当的设定之后，没有溶剂抑制，没有旋转，弛豫时间至少15s，进行获取。频谱窗必须至少在-1ppm与9ppm之间，其中标记在氯仿峰值上的光谱是在7.25ppm。在傅里叶变换、相校正和手动模式减去基线之后（没有指数乘法运算，LB=GB=0）使用光谱。

利用信号：分配值100至TPP未分辨的峰，该峰在7.05ppm与7.15ppm之间不含有氯仿信号（计数为9个TPP质子）。整合1.55ppm处的角鲨烯信号的面积（单峰计数为6个质子）。计算和表达结果：这些结果按照粗品重量百分比表达。

其中：

As：在1.55ppm处的角鲨烯信号的面积。

PTPP：整合的TPP未分辨的峰的质子数：9

WTPP：称量出的TPP的重量，单位为克

MTPP：TPP的摩尔质量，单位为克每摩尔（MTPP=326g/mol）

Ms：角鲨烯的摩尔质量，单位为克每摩尔（Ms=410g/mol）

PE：新鲜生物质的重量，单位为克

实例2：研究维生素B1、B6和B12的影响

此处进行的实验的目的是考虑维生素类在角鲨烯产率和生产率中的相对重要性。

如在实例1中，预培养的培养基的温度限定在28℃，培养基/生产培养基的温度维持在30℃。

进行了两个实验系列：

-在不同的预培养和生产步骤中添加维生素B1、B2和B6，

-维生素B12单独或与维生素B1和B6组合的作用。大体的培养条件是实例1描述的那些，但是在关于用第二次预培养物的接种上进行了改变，使用了2%v/v的培养物。

下表VI总结了用本申请人公司的裂殖壶菌属物种菌株获得的结果。

在测试“G”、“H”和“I”中：

-对于测试“G”，显示出角鲨烯的产量已经达到对于100g干生物质而言为0.4g，也就是4mg/g生物质，这是C-JYue和Y.Jiang在《过程生物化学》（ProcessBiochemistry，2009，44,923-927）的文章中获得的结果（即在茉莉酸甲酯的存在下最高角鲨烯含量为1.17±0.6mg/gSchizochytriummangrovei生物质）的三倍。

-这个结果在第二次预培养过程中维持提供维生素时达到更加显著的值（对于100g干生物质而言为7.7g），并且当在生产中再次添加维生素时达到对于100g干生物质而言的接近9g的值。

关于测试“J”和“K”，它们尤其证明了维生素B12的添加是必需的并且足以达到对于100g干生物质而言的9g的值。

当在第二次预培养的培养基中添加维生素B6和B1时，对于100g干生物质而言这个值甚至达到10g。

应该注意到测试“I”与“J”之间的差别是角鲨烯滴度的差别：对于100g干生物质所产生的9g角鲨烯，与测试“I”相比，测试“J”中的滴度更低：因此维生素B1和B6显然使得有可能增加体系的生产率（通过增加生物质）。

实例3：对比测试

这个实验目的在于证明实例1和2中测试的操作条件还可以用于本申请人公司拥有的其他类型的微藻：

-裂殖壶菌属物种，参考号为ATCC20888，

-Aurantiochytriumsp.，参考号为ATCCPRA276

操作条件与实例2的测试“I”一致。

作为对照：因其生产角鲨烯的能力而被常规用于文献中的一种菌株：Schizochytriummangrovei。

下表VII给出了获得的结果。

表VII

对于所测试的所有亚族物种的破囊壶菌目的角鲨烯产量都大于2g/100g生物质。S.mangrovei的角鲨烯产量符合文献中所描述的（获得的最佳结果）：2mg的角鲨烯/g干生物质。

实例4：获得由发酵生产的富含角鲨烯原油

在实例1最后获得的生物质（测试“E”）在发酵结束时的浓度为54g/l。

在发酵结束时获得的角鲨烯滴度为4.4g/l。

将生物质从发酵罐移除，并且然后通过离心法浓缩至120g/l。

将生物质继续在一个50l罐内在150rpm下搅拌并且加热至60℃。

然后用45%的氢氧化钾将pH调整至10。

维持这些条件持续6h，以便实现完全的碱性溶菌（alkalinelysis）。

在一个光学显微镜下并且通过样品离心（2分钟，10000g）监测溶菌的质量。

在溶菌最后，在罐中加入10升的乙醇（1体积乙醇/体积溶菌产物）维持在45℃并且搅拌10分钟。

然后向罐内加入10升的己烷，保持搅拌30分钟。

然后将混合物离心以便分离轻部分（己烷+油），将该轻部分存放在1m³的罐内。

重（水）相再次与10升己烷放在一起以便按照先前相同的方案进行第二次提取，从而提高提取产率。

这两种有机部分进行合并以便在一个旋转蒸发器内蒸发己烷。

将提取的油的己烷残留物通过在一个刮板式薄膜蒸发器（wipedfilmevaporator）内蒸发除去（80℃，1mbar）。

因此原油回收产率为70%。

Claims

1.一种由属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，其特征在于它包含由以下项组成的步骤：

-在25℃与35℃之间的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻，所述微藻选自下组，该组由以下各项组成：裂殖壶菌属物种(Schizochytriumsp.)、Aurantiochytrium物种以及破囊壶菌属物种(Thraustochytriumsp.)，并且

-向预培养基或培养基以每升培养基添加1μg至1000μg的维生素B12，每升培养基0.1mg至200mg的维生素B1，和每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在28℃与32℃之间的温度下培养微藻。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于在30℃的温度下培养微藻。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于这种破囊壶菌目家族的微藻选自下组，该组由以下各项组成：裂殖壶菌属物种ATCC20888，Aurantiochytrium物种ATCCPRA276，以及保藏在巴斯德研究所(InstitutPasteur)的法国国家微生物保藏中心、编号为No.CNCMI-4469的裂殖壶菌属物种菌株。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所获得的角鲨烯含量对于100g的干生物质而言为大于或等于2g。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所获得的角鲨烯含量对于100g的干生物质而言在2g与12g之间。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于这种属于破囊壶菌目物种家族的微藻的该培养通过以下连续步骤进行：

-在锥形烧瓶内，在28℃温度下，从在一个琼脂培养皿上的一个分离的菌落进行第一次预培养，持续24至36小时，

-在锥形烧瓶内，在28℃温度下，用1％(v/v)的从该第一次预培养得到的接种物进行第二次预培养，持续24至36小时，

-在30℃，在一个设定了条件以便观察到最高45mmol/l/hr的氧传递的发酵罐内，用0.5％至2％(v/v)的从该第二次预培养得到的接种物培养60至150小时。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于在这两次预培养步骤中进行维生素B12的添加，从而使得维生素的总含量在1μg/l与10μg/l培养基之间。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于还在这两次预培养步骤中添加维生素B1和B6，从而使得维生素的总含量在100μg/l与200μg/l培养基之间。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于维生素B12的添加是如下进行：

-在这两次预培养步骤中，使得维生素的总含量在1μg/l与10μg/l培养基之间，

-在生产步骤中，使得维生素的总含量为1000μg/l培养基。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于还如下添加了维生素B1和B6：

-在这两次预培养步骤中，使得维生素的总含量在100μg/l与200μg/l培养基之间，

-在生产步骤中，使得维生素的总含量在150mg/l与200mg/l培养基之间。