KR20140023365A

KR20140023365A - 미세조류로부터의 스쿠알렌의 생산 및 추출 방법

Info

Publication number: KR20140023365A
Application number: KR1020137030411A
Authority: KR
Inventors: 베르나르 포라; 윈 쳰; 베르나르 콜리에; 세르주 코미니; 필리프 루탕; 로랑 세귈라
Original assignee: 로께뜨프레르
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2014-02-26
Also published as: CN102787140A; WO2012159979A1; CA2835072A1; JP5959628B2; JP2014515929A; CN103620041B; CA2835072C; KR102032572B1; EP2710131B1; CN103620041A; US20140088201A1; EP2710131A1; US10087467B2

Abstract

본 발명은 트라우스토키트리알레스 종(Thraustochytriales sp.)의 과(family)에 속하는 미세조류로부터, 바람직하게는 건조 바이오매스 100g당 2 내지 12g의 농도로 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 25 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃, 그리고 더 바람직하게는 약 30℃의 온도에서 트라우스토키트리알레스 종의 과에 속하는 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지에 배양 배지 1리터당 1 내지 1000㎍의 비타민 B12를 첨가하는 단계로 이루어진 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

미세조류로부터의 스쿠알렌의 생산 및 추출 방법{METHOD FOR THE PREPARATION AND EXTRACTION OF SQUALENE FROM MICROALGAE}

본 발명은 트라우스토키트리알레스 종(Thraustochytriales sp.) 과(family)의 미세조류로부터의 발효에 의한 스쿠알렌의 최적화된 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위하여, "트라우스토키트리알레스 종 과"라는 표현은 스키조키트리움 종(Schizochytrium sp .), 아우란티오키트리움 종(Aurantiochytrium sp .) 및 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp .)의 종(species)에 속하는 미세조류를 의미하고자 한다.

스쿠알렌은 30개의 탄소 원자 및 50개의 수소 원자를 포함하는 이소프레노이드인 트리테르펜이며, 하기의 화학식을 갖는다: 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥센.

이는 인간(피지에서 발견)을 포함한 모든 고등 생물에 의해 천연적으로 생산되는 지질이다. 스쿠알렌은 실제로 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬 및 비타민 D의 생합성에서의 필수 중간생산물이다(콜레스테롤 대사 경로의 효소인 스쿠알렌 모노옥시게나제는 스쿠알렌 분자의 말단들 중 하나를 산화시킴으로써 이의 환화를 유도하고, 그 결과 라노스테롤을 생산할 것이며, 이는 콜레스테롤 및 다른 스테로이드로 전환될 것이다).

산업적으로, 스쿠알렌은 특히 식품 부문, 화장품 분야 및 제약 분야에서 사용된다.

식품 보충제로서, 스쿠알렌은 캡슐로서 또는 오일로서 통상 제형화된다.

화장품 분야에서, 이 분자는 보습 크림에서 연화제, 정전기 방지제 및 산화방지제로서 사용되어, 지방 자국(fatty trace) 또는 사용감(sensation)을 남기지 않고서 피부에 신속히 침투되고, 다른 오일 및 비타민과 완전히 혼합된다.

이 분야에서는, 스쿠알렌의 매우 높은 불안정성(6개의 불포화체)을 고려하면, 이는 포화 형태의 스쿠알란(수소화에 의해 수득됨)이라는 것을 유의해야 하는데, 스쿠알란은 스쿠알렌보다 더 우수한 산화방지제이며, 일반적으로 매우 높은 수준의 순도(99%)로 출시되고 있다.

독성학적 연구에 의하면, 화장품에 사용되는 농도에서, 스쿠알렌 및 스쿠알란은 어떠한 독성도 나타내지 않으며, 인간 피부에 자극적이거나 민감하지 않은 것으로 밝혀졌다.

제약 분야에서, 스쿠알렌은 백신용 애쥬번트로 사용된다.

이들 애쥬번트는 면역 시스템을 자극시키고 백신에 대한 반응을 증가시키는 물질이다.

스쿠알렌은 1997년 이래로 인플루엔자 백신(Fluad, Chiron사로부터 입수 가능, 계절성 인플루엔자 예방)에 용량당 대략 10mg의 스쿠알렌으로, 백신을 더 면역원성이 되게 하기 위하여 백신접종 물질에 첨가된 에멀젼의 형태로 사용되어 왔다.

스쿠알렌을 함유하는 모든 백신과 마찬가지로, 이들 에멀젼은 유백색 외관을 갖는다.

스쿠알렌은 또한, 특히 실험용 백신, 항말라리아 물질 또는 출현 바이러스 H5N1에 이어 2009년의 H1N1을 표적으로 하는 인플루엔자 백신의 백신 애쥬번트로서 다음으로 사용된다:

- 2009 인플루엔자 대유행(2009 influenza pandemic)을 예방하기 위한 판뎀릭스(Pandemrix) 및 아레판릭스(Arepanrix) 백신에서 Glaxosmithkline사가 사용하는 AS03 애쥬번트 시스템의 특허된 구성성분,

- Novartis사가 사용하는 MF59 애쥬번트 시스템의 특허된 구성성분.

스쿠알렌은 또한, 기억 CD4 세포의 생성을 통한 인체의 면역 반응을 자극시키기 위하여 인플루엔자 백신에 첨가되어 왔다.

이는 인플루엔자 백신을 위한 최초의 수중유 애쥬번트이며, 계절성 인플루엔자 바이러스 항원과 병용되어 시판되어 왔다.

스쿠알렌의 순도 수준은 이 응용 분야에서 필수적이다.

실제로, 구강으로 섭취되는 경우, 스쿠알렌은 완전히 안전하다고 여겨지지만; 그러나, 주사 가능 경로는 논쟁의 대상이다.

실제로, 의학 분야에서, 스쿠알렌이 불순물로 오염된 상황에서 인간 수용자에 대한 유해 위험이 증가될 수 있는데, 그 이유는, 정의에 의하면, 이 애쥬번트는 자체의 불순물에 대해서도 강한 면역 반응을 유도할 수 있기 때문이다.

따라서, 불순물(미량의 금속(특히, 수은), 및 미량의 다른 독소)이 없는 고품질 스쿠알렌을 갖는 것이 필수적이다.

스쿠알렌을 생산하기 위한 일정수의 경로가 문헌에 제안되어 있다.

이는 심해 상어(따라서, 이의 이름)와 같은 연골 어류의 간에 저장된 상태로 흔히 발견되는 화합물이다.

따라서, 이는 이들이 남획되는 이유들 중 하나이며, 상어는 벌써 이의 지느러미 때문에 사냥되었다. 지금 상어 간은 "건강에 좋음"으로 표기된 겔 캡슐을 제조하기 위하여 판매된다.

그러나, 시판되는 스쿠알렌은 이렇게 주로 상어 간으로부터 추출되지만, 이는 건강상의 문제를 안고 있다.

그 이유는 상어는 인간에게 유해한 물질을 생성할 수 있는 병원체로 감염될 수 있기 때문이다. 게다가, 상어 간(이는 유기체의 제거 및 정화 기관임)은 인간에게 유해한 카르카톡신(carchatoxin)과 같은 독소를 함유할 수 있다.

이들 환경상 우려(상어수의 큰 감소) 및 건강상 우려(어류 간은 또한 건강에 관해 우려가 되는 독소를 저장함)로 인해 식물로부터의 스쿠알렌의 추출이 시도되어 왔다.

따라서, 스쿠알렌을 올리브유 및 팜유로부터 분리하거나, 아마란스, 종자, 쌀겨 또는 소맥 배아로부터 기원하거나 곡물로부터 유래하는 다른 오일 중에서 분리하는 것이 가능하다.

그러나, 이러한 경우에 있어서의 중대한 결점은 스쿠알렌은 약 0.1중량% 내지 0.7중량%로 매우 소량으로 추출된다는 것이다.

흔히 실질적인 부화(enrichment) 및 정제 공정의 구현에 의해 고비용이 되게 하는, 상어 간 또는 식물로부터의 이러한 추출 방법에 대한 최초의 대안으로서, 미생물(천연 효모 또는 재조합 효모, 특히 사카로마이세스(Saccharomyces) 유형)로부터 스쿠알렌을 생산하기 위한 최초의 방법이 제안되었다.

따라서, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 이의 스쿠알렌 생산 능력에 대해 알려져 있는데, 그러나 이는 약 0.041mg/g 바이오매스로 매우 소량으로 생산된다(문헌[Bhattacharjee, P. et al., 2001, in World J. Microb . Biotechnol ., 17, pp. 811-816]).

따라서, 유전자 조합에 의해 이들 생산 능력의 최적화에 대한 연구가 수행되어 왔다.

따라서, 스쿠알렌을 생산하는 재조합 효모는 하기의 장점을 갖는다:

- 숙주 세포와 동일한 GRAS(Generally Regarded As Safe, 일반적으로 안전한 것으로 간주됨) 상태로부터 이익을 얻음,

- 숙주 세포와 마찬가지로 프리온 또는 독소의 병원체가 없음, 및

- 백신 분야에서 이미 사용되어 왔음(예컨대, B형 간염 항원을 함유하는 벡터를 발현하는 이들 효모).

그러나, 의학 분야를 위한 특허 출원 WO　2010/023551호(백신 애쥬번트로서 97% 초과의 순도를 갖는 스쿠알렌의 생산)에 의해 제시된 바와 같이, 이러한 최초의 대안은 스쿠알렌을 (15중량% 초과의 건조 세포로) 과다생산하는 재조합 효모를 갖는 것이 가능한 경우에만 산업화 가능하다.

공교롭게도, 이들 재조합 세포의 획득은 분자 생물학 툴을 사용하여 수고스럽고 시간이 많이 걸리며 복잡한 다수의 대사 공학적 단계들의 구현을 필요로 하는데, 이때 이들 단계는 스쿠알렌 생합성 경로의 자극 및 스쿠알렌 이화 경로의 억제를 가져오는 것이다.

실제로, 더욱이 상기 특허 출원 WO　2010/023551호에 상기되어 있는 바와 같이, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 피로포스포메발로네이트 데카르복실라제, 이소펜테닐 피로포스페이트 이성화효소, HMGR (3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소) 및 스쿠알렌 합성효소를 포함한 스쿠알렌 생합성에 관여하는 많은 유전자가 있다.

이화 경로를 위하여, 유전자는 스쿠알렌의 에르고스테롤로의 전환에 관여하는 다수의 효소를 암호화하는데, 이러한 효소에는 스쿠알렌 에폭시다제(ERG1), 라노스테롤 합성효소, C14-디메틸라제, d14-환원효소, C4-메틸산화효소, C4-데카르복실라제(ERG26), 3-케토환원효소, C24-메틸트랜스퍼라제, C8-이성화효소, C5-불포화화효소, d22-불포화화효소 및 d24-환원효소가 포함된다.

더욱이, 다른 이화 효소, 즉 LEU2([베타]-이소프로필 말레이트 데하이드로게나제), 옥시도스쿠알렌 사이클라제, 지모스테롤-24-메틸트랜스퍼라제 및 에르고스타-5,7,24(28)-트리엔올-22-데하이드로게나제가 또한 고려되어야 한다.

상어 간 또는 식물로부터의 추출 방법에 대한 제2 대안으로서, 트라우스토키트리알레스 과(트라우스토키트리움, 아우란티오키트리움 및 스키조키트리움 속(genus) 포함), 더 특히 스키조키트리움 만그로베이(Schizochytrium mangrovei) 또는 스키조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum)의 미세조류로부터 스쿠알렌을 생산하기 위한 유망한 방법이 제안되어 왔다.

이들 미세조류는 종속영양 조건(광의 부재; 탄소 공급원으로서 글루코스의 제공) 하에서 스쿠알렌을 생산하며, 따라서 미생물 발효 분야의 당업자에 의해 용이하게 조작될 수 있다.

따라서, 이들 방법은 제어된 발효 조건에 의해, 식품, 화장품 및 의학적 필요성을 충족시키도록 정제가 용이하게 수행될 수 있는 스쿠알렌의 품질을 제공한다.

그러나, 트라우스토키트리알레스 과의 이들 미세조류에서, 스쿠알렌은 관심 대상인 다른 지질 화합물, 예컨대 도코사헥사엔산 (또는 DHA), ω3 패밀리의 다가불포화 지방산의 부산물(coproduct)이다.

따라서, 스쿠알렌은 (카로테노이드 및 스테롤과 함께) 시판 DHA 오일의 비누화 불가능 분획의 성분들 중 하나로서 구체적으로 표기되는 것으로 보인다.

비교로서, 스키조키트리움 만그로베이 FB1 주(strain)는 0.017%의 스쿠알렌에 대해 6.2건조중량%의 세포의 비율로 DHA를 생산한다.

그 결과, 스쿠알렌을 천연적으로 생산하는 이들 미생물은 하기와 같이 소량으로 그렇게 한다:

- 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) ACEM 6063의 경우 약 0.1mg/g 바이오매스(참조: 문헌[Lewis et al., in Mar . Biotechnol ., 2001, 439-447]),

- 스키조키트리움 만그로베이 FB1의 경우 약 0.162mg/g 바이오매스(참조: 문헌[Jiang et al., in J. Agric . Food Chem ., 2004, 52, pp. 1196-1200]).

따라서, 이러한 생산을 증가시키기 위해, 발효 조건을 최적화하는 것이 필수적인 것으로 여겨진다.

문헌[J. Agric . Food Chem ., 2009, 57, 4267-4272]의 Qian Li et al.의 논문에는, 스쿠알렌이 스테롤 생합성의 핵심 중간생산물이며, 스쿠알렌의 스테롤로의 전환의 제1 단계는 산소-의존성 스쿠알렌 에폭시다제에 의해 촉매되는 것으로 명시되어 있다.

따라서, 대조적으로 세포내 스쿠알렌을 축적하는 것이 요구되는 경우, 용존 산소가 풍부한 조건은 금지되어야 한다.

따라서, 낮은 용존 산소 수준(0 내지 5% 포화)에서의 트라우스토키트리드 ACEM 6063의 배양은 1mg/g 초과의 스쿠알렌을 축적할 수 있게 하며, 반면 더 높은 용존 산소 수준(40% 내지 60%)에서의 성장은 단지 0.01mg/g의 스쿠알렌을 달성할 수 있게 한다.

마찬가지로, 15℃ 온도에서의 배양은 트라우스토키트리드 ACEM 6063에 의한 스쿠알렌의 생산이 1.2mg/g이 되게 하며, 반면 20℃에서는 단지 0.7mg/g이다(참조: 문헌[Lewis et al., in Mar . Biotechnol ., 2001, 3, 439-447]).

문헌[New Biotechnology, 2010, 27-4, pp. 382-389]의 G. Chen et al.의 논문에는, 스키조키트리움은 폴리케티드 합성효소(polyketide synthase; 두문자어: PKS) 경로에 의해 DHA를 주로 생산하며, 반면 스쿠알렌은 대신에 콜레스테롤 생합성 경로에 의해 합성되는 것으로 상기되어 있는데, 이는 이들 2개의 화합물에 대한 트라우스토키트리드의 영양상의 필요가 구별된다는 것을 의미한다.

따라서, 이들의 연구의 목적은 스쿠알렌의 생산에 있어서의 다양한 질소 공급원의 영향을 체계적으로 조사하는 것이었다.

따라서, G. Chen et al.은 스키조키트리움이 효모 추출물 및 트립토판의 글루탐산일나트륨으로 이루어진 질소성 공급원들의 혼합물을 함유하는 배양 배지에서 급속히 성장하고 "높은" 양의 스쿠알렌을 축적할 수 있다는 것을 알아내었다.

그럼에도 불구하고, 스쿠알렌의 이러한 "높은" 생산은 전적으로 상대적이다.

이들 저자들은 스쿠알렌 함량 및 수율을 기초 배지의 값에 비하여 각각 26.3% 및 10.1%로 유의하게 증가시키는 데 성공하지만, 실제로 이들 최적화된 조건은 0.72mg/g의 스쿠알렌 함량 및 5.90mgℓ/ℓ의 역가(titer)를 생성한다.

스쿠알렌 생산의 최적화라는 동일한 목적을 갖고서, 문헌[World J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 26-3, pp. 1303-1309]에서 K. W. Fan et al.은 스쿠알렌 모노옥시게나제(스테롤 생합성의 핵심 효소)의 억제제, 즉 테르비나핀 하이드록시클로라이드를 사용하였다.

스쿠알렌 함량 및 수율은 미생물 배양의 연령에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.

세포 배양 연령이 더 높을수록, 스쿠알렌의 축적은 더 적게 일어나며; 실제로 상기 스쿠알렌을 스테롤 생합성 경로에 더 많이 소비한다.

따라서, 테르비나핀의 작용은 스테롤 경로에 대한 스쿠알렌의 이 소비를 방지하고, 따라서 스쿠알렌의 세포내 축적을 대조군에 비하여 최대 36% 내지 40%까지 자극할 수 있게 함으로써 행해진다.

그러나, 이 연구에서 사용된 아우란티오키트리움 만그로베이(Aurantiochytrium mangrovei) FB3 주에 의해 최고의 스쿠알렌 생산이 달성되었는데, 그럴지라도 이는 S. 세레비시아(0.041mg/g 바이오매스)에 대해 기재된 것보다, 또는 심지어는 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii)(0.24mg/g 바이오매스)에 대해 기재된 것보다 훨씬 더 높다.

더욱이, 대사 경로의 이러한 전환은 상대적으로 더 많은 양의 스쿠알렌을 가능하게 하지만, 그에 맞추어 이는 세포의 지질막의 생산에 필수적인 스테롤의 생산을 제한함으로써 동일 세포를 약화시킬 위험이 있다.

미세조류를 사용한 것 중 문헌에 보고된 최고의 스쿠알렌 생산 결과 중에서, 문헌[논문: C-J Yue and Y. Jiang, Process Biochemistry, 2009, 44, 923-927]은 스키조키트리움 만그로베이의 1.17 ± 0.6mg/g 바이오매스의 최대 스쿠알렌 함량을 나타내는데, 이는 상기 대사 경로의 핵심 효소인 스쿠알렌 합성효소에 직접 작용함으로써 스쿠알렌 합성의 대사 경로를 조절하기 위하여 메틸 자스모네이트를 사용한다.

따라서, 행해진 모든 노력에도 불구하고, 이들 값은 올리브유에 대한 기준값(약 4.24mg/g)보다 훨씬 더 낮으며, 산업적 규모에 요구되는 값과는 동떨어져 있다.

종래 기술에 기재된 것보다 훨씬 더 효과적이고 훨씬 비용이 덜 드는 생산 방법의 개발과 관련하여, 본 출원인 회사는 트라우스토키트리알레스 종 과의 미세조류에 대한 발효 조건의 최적화에 대한 자체 연구를 개발하였다.

따라서, 본 발명은 건조 바이오매스 100g당 1g의 규모로, 즉 이 분야의 문헌에 통상 기재된 것보다 최대 1000배를 초과하여 스쿠알렌을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 생성된 발효 배지로부터의 스쿠알렌의 추출 및 정제 방법에 관한 것이다.

스키조키트리움의 발효에 의한 스쿠알렌의 생산

무엇보다도 본 출원인 회사는 자랑스럽게도, 발효를 제어하기 위한 모든 파라미터들 중에서, 이들 중 2개가 이들 단독으로 이들 미세조류에서 스쿠알렌 생산 수준을 상당히 증가시키는 것을 가능하게 한다는 것을 알아내었다.

이들 2개의 핵심 파라미터는 배양 배지의 온도와, 비타민, 더 정확하게는 비타민 B1 및 B6, 그리고 특히 비타민 B12의 첨가이다.

따라서, 본 발명은 트라우스토키트리알레스 종 과에 속하는 미세조류에 의한 스쿠알렌의 생산 방법에 관한 것이며, 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:

- 25 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃, 더 우선적으로는 약 30℃의 온도에서 트라우스토키트리알레스 종 과에 속하는 미세조류를 배양하는 단계, 및

- 배양 배지에 배양 배지 1리터당 1 내지 1000㎍의 비타민 B12를 첨가하는 단계.

우선적으로는, 이하에 나타내는 바와 같이, 본 출원인 회사는 하기를 첨가할 것을 권장한다:

○ 배양 배지 1리터당 0.1mg 내지 200mg의 비타민 B1, 및/또는

○ 배양 배지 1리터당 0.1mg 내지 200mg의 비타민 B6.

물론, 이 방법은 스쿠알렌-풍부 바이오매스를 회수하는 단계 및/또는 스쿠알렌을 회수 또는 추출하는 단계를 포함할 수 있다.

더 특히, 하기의 구매가능한 주가 시험되었다:

- ATCC 20888로 참조되는 스키조키트리움 종,

- ATCC PRA 276으로 참조되는 아우란티오키트리움 종.

더욱이, 본 출원인 회사는 또한 자체 소유의 생산주(production strain)를 보유하는데, 이는 프랑스에서 2011년 4월 14일에 인스티튜트 파스퇴르(Institut Pasteur)의 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)[국립 미생물 배양 수집소]에 CNCM I-4469호로 기탁되고, 또한 중국에서 중국 우한 우한 대학교(우: 430072)의 중국 국립균배양 수집소(CCTCC,CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)에 M 209118호로 기탁된 스키조키트리움 종이다.

스키조키트리움 만그로베이의 주가 또한, 이하에 예시되는 바와 같이 대조군으로서 시험되었다.

특히, 본 발명에 따른 방법은 건조 바이오매스 100g당 2g 이상, 바람직하게는 건조 바이오매스 100g당 2 내지 12g의 스쿠알렌 함량을 수득하는 것을 가능하게 한다. 특히, 생산된 스쿠알렌의 정량화는 실험 섹션에서 상세히 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법에서, 제1 본질적인 특징은 미세조류의 배양 및 이의 스쿠알렌 생산 둘 모두가 수행될 온도의 선택이다.

따라서, 이 온도는 25 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃, 더 우선적으로는 약 30℃로 선택된다.

따라서, 본 출원인 회사는 이들 미세조류의 배양이 25℃를 초과하지 않아야 할 것을 필요로 한다는 제1 기술적 선행개념을 극복하였다.

실제로, 트라우스토키트리알레스에서의 스쿠알렌의 생산에 대한 상기에 인용된 대부분의 논문에서, 생산 온도는 연구된 미세조류의 성장 온도, 즉 15℃, 22℃ 또는 25℃를 기초로 설정하였다.

대조적으로, 본 발명의 방법에 따르면, 본 출원인 회사는 이들 미세조류를 28 및 32℃에서 배양할 것을 권장하는데, 이는 하기를 알아차릴 수 있었기 때문이다:

- 세포 바이오매스에 의해 생성되는 스쿠알렌 농도는 최대 33℃까지는 온도와 함께 증가하지만, 30℃를 넘어서면 바이오매스의 양은 유의하게 감소되고, 이에 따라 스쿠알렌 역가를 한정한다는 것,

- 25℃의 온도에서, 스쿠알렌 농도는 검출 불가능하거나 매우 낮다는 것.

따라서, 이 온도 범위는 미세조류의 최적 배양을 위한 온도와 스쿠알렌의 효과적인 생산을 위한 온도 사이의 절충이다.

따라서, 많아야 25℃라는 온도는, 종래 기술에서 흔히 사용되는 것과는 대조적으로, 스쿠알렌 생산을 최상으로 촉진시키는 온도가 아니다.

본 발명에 따른 방법에서, 제2 본질적 특징은 스쿠알렌의 생산을 위해, 즉 배양 배지 1리터당 1 내지 1000㎍의 비타민 B12의 비율로 스키조키트리움 배양 배지에 제공되는 비타민 B12의 양이다.

우선적으로는, 비타민 B12의 이러한 첨가는 하기로 보충될 수 있다:

○ 배양 배지 1리터당 0.1mg 내지 200mg의 비타민 B1, 및/또는

○ 배양 배지 1리터당 0.1mg 내지 200mg의 비타민 B6.

상기에 언급된 미세조류에 의한 스쿠알렌의 생산에 관한 문헌에서, 비타민의 역할은 고려되어 있지 않다. 비타민의 제공은 통상적으로 효모 추출물의 첨가에 의해 수행된다.

실제로, 이들 비타민은 단지 이들 3개의 비타민 B만 언급한다면, 하기의 비율로 효모 추출물 내에 천연적으로 존재한다는 것이 당업자에게 잘 알려져 있다:

- 50 내지 120mg/kg의 비타민 B1 (티아민),

- 40 내지 80mg/kg의 비타민 B6 (피리독신),

- 1 내지 5.5㎍/kg의 비타민 B12 (시아노코발라민).

그러나, 배양 배지 내로 도입되는 효모 추출물의 제공은 배양 배지 100㎖당 단지 1 내지 2g이며(참조: 상기에 열거된 과학 논문들), 이는 극히 낮은 비타민 용량에 상응한다(예를 들어, 비타민 B12의 경우, 효모 추출물에 의한 비타민 B12의 이러한 제공은 0.07㎍/ℓ에 상응함).

그렇다고는 하더라도, 이러한 일련의 문헌들은 미세조류에서의 스쿠알렌의 생산을 위한 비타민 B1, B6 또는 B12의 함량의 제어를 기술하지도 제시하지도 않는다.

어떠한 이론에 의해서도 구애됨 없이, 본 출원인 회사는 (이하에 예시되는 바와 같이) 스쿠알렌의 생산에서의 비타민 B12의 주요 역할이 스쿠알렌 생합성에 관여하는 핵심 효소들 중 몇몇의 보조인자(cofactor)로서의 이의 참여를 제시할 것임을 알아내었다.

비타민 B1에 관해서는, 이는 류신 분해 경로를 자극시켜 스쿠알렌 전구체의 세포내 양을 증가시킬 것이며, 비타민 B6는 시토크롬의 작용을 변형시킴으로써 스쿠알렌 분해를 방지할 것이다.

따라서, 본 출원인 회사는 비타민 B12의 제공이 28 및 30℃로 되게 한 온도와 함께, (1g/100g 건조 바이오매스의 규모로) 스쿠알렌의 생산을 상당히 증가시키는 데 핵심이며, 실제로 비타민 B1 및 B6의 제공은 이하에 예증되어 있는 바와 같이, 특히 스쿠알렌 생산성의 증가를 가능하게 한다는 것을 알아내었다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 특징은 이들 비타민의 첨가가, 발효 공정 전체를 통해 또는 이의 단계들 중 몇몇 단계 동안 수행될 수 있으며, 단지 생산 단계에서만 수행되지는 않는다는 것이다.

그러나, 발효 공정 전체에 걸쳐 1 내지 1000㎍/ℓ의 비타민 B12의 제공은 고수되어야만 한다.

통상적으로, 미세조류에 의한 스쿠알렌 생산에 대한 조건을 최적화하기 위한 연구에 관한 문헌에서, 발효는 통상적인 미생물 접종 및 생산 사슬에 기초하여 수행되며, 이는 일반적으로 대부분에 작용되는 생산 조건이다.

실제로, 트라우스토키트리움으로부터의 스쿠알렌의 생산은 3개의 연속적 단계들을 필요로 한다: 한천 디쉬 상에 있는 분리된 콜로니로부터 출발하는 단계, 전배양하여 주를 회복시키는 단계, 및 마지막으로, 그 자체로 배양(=생산)하는 단계.

예를 들어, 상기에 언급된 G. Chen의 논문에는 하기의 연속적 단계들을 포함하는 방법이 기술되어 있다:

- 글루코스, 글루탐산일나트륨, 효모 추출물 및 다양한 미량 성분을 포함하는 한천 영양 배지 상에 유지된 주로부터 출발하는 단계,

- 회복된 바이오매스를 수득하기 위하여 25℃의 온도에서 pH 6에서, 회전 진탕기(orbital shaker) 상의 삼각 플라스크 내에서 전배양액을 제조하는 단계,

- 이전 단계에서 수득된 약 0.5% (v/v)의 바이오매스를 사용하여, 또 다른 일련의 생산용 삼각 플라스크에 전배양액에 사용된 것과 동일한 배양 배지를 접종시키고, 온도를 25℃로 유지하는 단계.

공교롭게도, 상기 논문에서 읽을 수 있는 바와 같이(그러나 이는 이 분야에서의 다른 논문들에 대해서도 해당되는 것으로 입증됨), 발효 조건을 최적화하기 위하여 전문가들이 후자의 배양 단계의 수준에서 활동한다.

다시 말하면, 종래 기술의 최적화 연구는 스쿠알렌의 생산에 미치는 성분들의 영향을 연구하기 위하여 생산 배지의 하나 이상의 성분들을 변동시키는 것으로 이루어진다.

그러나, 대조적으로, 이하에 전개되는 바와 같이, 본 출원인 회사는 발효 조건이 산업적 규모로 구현하는 데 더 복잡한 것으로 입증된다 하더라도, 제1 단계부터 바로 발효 조건을 제어할 것을 권장한다.

이 규모상에서는, 실제로, 접종 사슬이 실제의 생산 단계 전에 일련의 수 개의 전배양 단계들로 구성될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 일 바람직한 구현예는 연속된 하기의 단계들로 이루어질 수 있다:

- 한천 디쉬 상에 있는 분리된 콜로니로부터 28℃의 온도에서 삼각 플라스크 내에서 24 내지 36시간 동안 트라우스토키트리알레스 과의 미세조류의 제1 전배양시키는 단계,

- 제1 전배양으로부터 생성된 1% (v/v)의 접종물을 사용하여, 28℃의 온도에서 삼각 플라스크 내에서 24 내지 36시간 동안 제2 전배양시키는 단계,

- 제2 전배양으로부터 생성된 0.5% 내지 2% (v/v)의 접종물을 사용하여, 많아야 45mmol/ℓ/hr의 산소 전달을 관찰하도록 컨디셔닝된 발효조 내에서 30℃에서 60 내지 150시간 동안 배양하는 단계.

이러한 연쇄(chaining)에서, 이하에 예시되는 바와 같이, 조작 조건에 따라, 비타민의 첨가는 단일의 전배양 단계에서, 2개의 전배양 단계에서 또는 배양 사슬 전체를 통해 수행될 수 있다.

이하에 예증되는 바와 같이, 단일의 전배양 단계에서의 비타민의 첨가는 이미 현저한 결과를 얻는 것을 가능하게 하며, 최적화된 모드는 구현되는 모든 단계에서의 첨가를 필요로 한다.

미세조류의 성장에 필요한 탄소 공급원은 우선적으로는 글루코스이다.

따라서, 본 출원인 회사는 15중량% 내지 22.5중량%의 글루코스의 총량을 제공하도록 글루코스의 첨가를 제어할 것을 권장한다.

그렇다고는 하더라도, 이하에 예시되는 바와 같이, 선택된 스키조키트리움 주의 경우, 많아야 8중량%의 비-제로 잔류 글루코스 함량에서 작업하는 것이 바람직하다.

질소 공급원의 성질에 관하여, 본 출원인 회사는 효모 추출물, 우레아, 글루탐산나트륨 및 황산암모늄으로 이루어진 군으로부터 단독으로 또는 조합하여 이를 선택하는 것이 가능하다는 것을 알아내었다.

종래 기술의 방법에서 통상적으로 사용되는 효모 추출물보다 비타민 칵테일, 예컨대 Sigma사에 의해 판매되며, 5㎖/ℓ로 사용되는 BME 칵테일로 보충된 우레아를 선호할 수 있다.

마찬가지로, 우레아를 글루탐산나트륨으로 전체적으로 또는 부분적으로 대체하거나, 또는 글루탐산나트륨 및 황산암모늄의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다.

본 출원인 회사는 질산 형태(nitric form)의 질소의 공급원을 사용하지 않을 것을 특히 권장한다.

배양 배지의 pH에 관하여, 이하에 예시되는 바와 같이, 이는 5.5 내지 6.5로 유지되며, 우선적으로는 6의 값으로 고정될 것이다.

pH는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어 2N 황산을 첨가하고, 이어서 8N 수산화나트륨을 사용함으로써 조절될 수 있다.

마지막으로, 용존 산소 함량은 24 또는 48시간, 바람직하게는 36시간의 초기 기간 동안 20% 내지 0%의 값으로 조절될 수 있으며, 바람직하게는 5%로 유지될 수 있으며, 이후에는 0%로 남겨진다.

산소 전달에 관하여, 이는 45mmol/ℓ/hr을 초과하지 않도록 더욱이 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 조절될 것이다.

이하에 예시되는 바와 같이, 발효의 종료시에 이들 조작 조건 하에서 수득된 바이오매스는 50g/ℓ 초과, 바람직하게는 50 내지 100g/ℓ, 약 80g/ℓ이다.

스쿠알렌 함량은 이의 부분을 위해 건조 바이오매스 100g당 1g 초과, 바람직하게는 건조 바이오매스 100g당 2 내지 15g, 더욱 더 우선적으로는 건조 바이오매스 100g당 5 내지 10g이다.

발효 배지로부터의 스쿠알렌의 추출 및 정제

바이오매스는 당업자에게 그 자체로 공지된 임의의 방법에 의해 발효 배지로부터 회수되는데, 예를 들어 바이오매스는 발효조로부터 회수되고 미세여과 또는 원심분리에 의해 단순 농축되거나, 또는 수용액에 의한 연속된 농축-희석을 통해 세척될 수 있다.

지질 함량을 추출하기 위한 세포의 파열은 다양한 경로를 통해 수행될 수 있으며, 이러한 경로 중에는 기계적, 화학적 또는 효소적 경로가 있다.

오일은 수 회의 연속된 추출로 헥산/에탄올을 사용하여 세포 용해물(lysate)로부터 추출된다.

헥산 분획이 분리되고, 이어서 조(crude) 오일을 분리하도록 헥산이 증발 제거된다.

마지막으로, 본 발명은 의학 분야, 화장품 분야 및 식품 부문을 위한 것으로 의도된 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 방법들 중 어느 한 방법에 의해 생산된 스쿠알렌의 용도에 관한 것이다. 따라서, 이는 의학 분야, 화장품 분야 및 식품 부문을 위한 것으로 의도된 조성물의 제조 방법에 관한 것이며, 본 방법은 본 발명의 방법들 중 어느 한 방법에 의한 스쿠알렌의 생산, 및 이어서 의학 분야, 화장품 분야 및 식품 부문을 위한 것으로 의도된 조성물의 제조를 포함한다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 더 명확히 이해될 것이며, 이때 이들 실시예는 예시적이며 비제한적인 것이고자 한다.

실시예 1: 비타민 B1, B6 및 B12의 첨가 및 스쿠알렌 생산에 대한 온도의 영향에 관한 연구

전배양 배지 및 배양 배지

여기서는 실제의 배양/생산 단계 전에 2개의 선행하는 연속적 전배양 단계로 미세조류의 발효를 수행하였다.

이 실험을 위하여, 비타민을 제1 전배양 배지에 첨가하였지만, 제2 전배양 배지에 대한 첨가 및 생산에서의 이의 첨가는 선택적이었다.

따라서, 전배양 배지는 하기의 표 I 및 표 II에 주어진 조성을 가졌다:

표 I

표 II

일반적으로, Clerol FBA3107 소포제(antifoam)를 1㎖/ℓ로 사용하였다.

선택적으로, 오염 세균의 성장을 방지하기 위하여 50mg/ℓ의 페니실린 G 나트륨 염을 사용하였다.

글루코스를 KH₂PO₄로 멸균시키고 배지의 나머지로부터 분리하였는데, 그 이유는 침전물(인산마그네슘암모늄)의 형성을 이로써 피할 수 있었기 때문이다.

비타민 혼합물 및 미량 성분은 멸균 여과 후에 첨가하였다.

배양/생산 배지의 조성은 하기의 표 III에 제공되어 있다.

표 III

비타민 혼합물 및 미량 성분의 조성은 하기의 표 IV 및 표 V에 제공되어 있다:

표 IV

표 V

발효의 수행

제1 전배양을 500㎖ 배플 삼각 플라스크 내에서 수행하였는데, 이 플라스크에는 Cognis GmbH Duesseldorf에 의해 판매되는 Clerol FBA　3107 소포제 한 방울을 첨가하였다.

이 배양 배지를 이의 구성성분들을 완전히 용해시킨 후 여과하였으며, 선택적으로 0.25mg/ℓ의 비율로 페니실린 G 나트륨 염으로 보충하였다.

페트리 디쉬 내에서 배양된 미세조류의 콜로니를 (한 개의 10㎕ 루프의 비율로) 채취함으로써 접종을 수행하였다.

(회전 진탕기 상에서) 100rpm으로 진탕하면서 28℃의 온도에서 24 내지 36시간 인큐베이션을 지속하였다.

바이오매스가 침강하기(또는 벽에 부착하기) 때문에, 삼각 플라스크를 충분히 진탕한 후에 주의를 기울여 3 내지 5㎖를 샘플링하였다.

제2 전배양을 위하여, 튜빙이 장착된 2ℓ 배플 삼각 플라스크를 사용하였다.

한 방울의 소포제 및 효모 추출물을 100㎖의 물에 첨가하였다.

300㎖의 탈염수 중에 용해시킨 후에, 이 배지의 모든 구성성분들을 여과하였다. 선택적으로 페니실린 G 나트륨 염을 첨가하고, 사전에 삼각 플라스크에, 이의 멸균화 전에 한 방울의 소포제를 첨가하는 것이 가능하였다.

이어서, 3 내지 5㎖의 제1 전배양액을 사용하여 접종을 수행하였다.

100rpm으로 진탕하면서 추가 24 내지 36시간 동안 28℃에서 인큐베이션을 수행하였다.

실제의 배양은 20ℓ 반응기 내에서 하기의 방법으로 수행하였다:

- 반응기 내에서 배지의 일부분의 멸균화, 및 침전물의 형성을 방지하도록 별개로 나머지 다른 부분의 멸균화,

- 배양 배지의 0.5% v/v의 비율로 제2 전배양의 종료시에 생산된 바이오매스를 사용하여 접종을 수행함,

- 30℃에서 배양을 유지함,

- 산소 전달 속도를 35 내지 40mmol/ℓ/h로 고정시킴,

- 0.2 내지 0.3VVM의 폭기(0.2 내지 0.3VVM),

- 초기 pH > 5.5,

- 15 내지 70g/ℓ의 글루코스 농도를 유지하도록, 농도가 > 20%이 되자 마자 글루코스를 공급함.

하기의 표는 본 출원인 회사의 스키조키트리움 종에 의해 얻어진 결과를 제공한다.

이 표는 하기를 제공한다:

- 스쿠알렌의 생산에 대한 온도의 영향(2개의 전배양 조작에서만 비타민 첨가: 시험 "B" 및 "C"), 및

- 비타민의 첨가를 행하지 않은 표준(시험 "A")과 비교하여, 전배양 단계 및 생산 단계에서의 비타민 B1, B6 및 B12의 첨가의 영향(시험 "D" 및 "E").

25℃에서 비타민의 보충 첨가를 행하지 않은 대조군을 또한 수행하였다.

표 V

문헌의 통상적인 조건 하에서 대조군 "A"는 시험된 미세조류 주에 대해 검출 가능한 양의 스쿠알렌의 생산이 불가능하였다는 것을 유의해야 한다.

시험 "B" 및 "C"의 경우:

28℃의 전배양 온도 및 전배양 조작에서의 비타민 B1, B6 및 B12의 존재는 이미 바이오매스 100g당 약 1g의 스쿠알렌 생산을 제공할 수 있게 하였는데(시험 "B"), 즉 문헌에 기재된 것(예를 들어, 트라우스토키트리드 ACEM　6063 또는 S. 만그로베이 FB1에 의한 스쿠알렌의 생산의 경우)보다 대략 1000배 더 많은 양이다.

시험 "D" 및 "E"의 경우:

모든 배양 단계(2개의 전배양 조작 및 생산)에서의 비타민의 첨가와 결합된 온도의 영향은 현저하다. 시험 "D"는, 온도를 25℃로 그대로 두었을 때 바이오매스 100g당 3.3g의 스쿠알렌의 생산을 가능하게 하였으며, 이는 시험 "E"의 경우, 온도를 30℃가 되게 하였을 때 8.2g/ℓ로 증가하였다.

따라서, 비타민 B1, B6 및 B12의 상당한 첨가와 결합되어 25℃ 초과의 온도에서의 발효 조건의 수행은 최고의 스쿠알렌 수율 및 생산성을 얻을 수 있게 한다.

스키조키트리움 종 바이오매스 내의 스쿠알렌의 정량화 방법

이 분석은 바이오 매스의 비드(bead) 파괴 및 클로로포름/메탄올에 의한 저온 추출 후에 25℃에서의 양성자 NMR에 의해 수행하였다. 정량화는 하기에 기재된 바와 같이 내부 표준물에 의해 수행하였다.

400MHz에서 작동하는 Avance III　400 분광계(Bruker Spectrospin)에서 스펙트럼을 얻었다.

바이오매스 파괴: 대략 200mg의 새로운 바이오매스를 정확히 칭량해서 덜어낸다. 대략 1 내지 1.5　cm의 유리 비드 및 0.1㎖의 메탄올을 첨가한다. 튜브를 기밀식으로 밀봉하고 적어도 5분 동안 보텍스 믹서로 교반한다.

저온 추출: 대략 2mg의 트리페닐 포스페이트 (TPP), 0.9㎖의 메탄올 및 2㎖의 클로로포름을 첨가한다. 튜브를 기밀식으로 밀봉하고 1분 동안 보텍스 믹서에 의해 교반한다. 냉장고에 넣는다. (최소 1시간 동안) 침강시킴으로써 분리를 행한 후에, 투명한 위쪽 상(phase)을 조심스럽게 회수하고, 질소 스트림 하에서 주위 온도에서, 증발 건조를 위해 유리병(glass jar) 내로 이를 옮긴다. 건조 추출물을 0.5㎖의 CDCl₃ 및 0.1㎖의 CD₃OD 중에 용해시키고, NMR 튜브 내로 옮긴다.

스펙트럼 기록: 기기에 적절한 세팅을 적용한 후에, 적어도 15초의 이완 시간을 갖고서 회전하지 않고서 용매 억제 없이 획득을 수행한다. 스펙트럼 창(spectral window)은 7.25ppm에서의 클로로포름 피크에 대해 교정된 스펙트럼에 대해 적어도 -1 내지 9ppm이어야 한다. (지수함수적 증식 없이, LB　=　GB　=　0) 수동 모드에서 푸리에 변환, 위상 보정 및 기준선의 감산을 행한 후에 스펙트럼을 사용한다.

신호의 사용: 7.05 내지 7.15ppm에서 클로로포름 신호를 함유하지 않는 TPP 비분해 피크에 대해 값 100을 할당한다(9개의 TPP 양성자로서 카운팅). 1.55ppm에서의 스쿠알렌 신호의 면적을 적분한다(6개의 양성자로서 단일항 카운팅). 이들 결과의 계산 및 표현: 이들 결과를 대강의 중량 백분율로 표현하였다.

이 식에서,

A_s: 1.55ppm에서의 스쿠알렌 신호의 면적.

P_TPP: 적분된 TPP 비분해 피크의 양성자의 개수: 9

W_TPP: 칭량해서 덜어낸 TPP의 중량(단위: g)

M_TPP: TPP의 몰질량(단위: g/mol) (M_TPP　=　326g/mol)

M_S: 스쿠알렌의 몰질량(단위: g/mol) (M_S　=　410g/mol)

PE: 새로운 바이오매스의 중량(단위: g)

실시예 2: 비타민 B1, B6 및 B12의 영향에 대한 연구

여기서 수행된 실험의 목적은 스쿠알렌 수율 및 생산성에서의 이들 비타민의 상대적 중요성을 고려하는 것이었다.

전배양 배지의 온도를 실시예 1에서와 같이 28℃로 규정하고, 배양/생산 배지의 온도를 30℃로 유지하였다.

2개의 실험 시리즈를 수행하였다:

- 다양한 전배양 단계 및 생산 단계에서 비타민 B1, B2 및 B6의 첨가

- 단독으로의 또는 비타민 B1 및 B6와 조합된 상태에서의 비타민 B12의 역할. 일반적인 배양 조건은 실시예 1에 기재된 것들이었지만, 제2 전배양액에 의한 접종에 관하여 배양액의 2% v/v가 되게 변형하였다.

하기의 표 VI에는 본 출원인 회사의 스키조키트리움 sp 주를 사용하여 얻어진 결과들이 종합되어 있다.

표 VI

시험 "G", "H" 및 "I"에서:

- 시험 "G"의 경우, 스쿠알렌의 생산은 이미 건조 바이오매스 100g당 0.4g, 즉 4mg/g 바이오매스에 도달한 것으로 나타나 있는데, 이는 C-J Yue and Y. Jiang의 논문(문헌[Process Biochemistry, 2009, 44, 923-927])에서 얻어진 결과(즉, 메틸 자스모네이트의 존재하에 스키조키트리움 만그로베이 바이오매스의 최대 스쿠알렌 함량이 1.17　± 0.6mg/g임)의 3배이다.

- 이 결과는 제2 전배양 동안 비타민의 제공을 유지했을 때 더욱 더 현저한 값에 도달하였으며(건조 바이오매스 100g당 7.7g), 비타민의 이러한 첨가를 생산 단계에서 다시 수행했을 때 건조 바이오매스 100g당 9g에 근접한 값에 도달하였다.

시험 "J" 및 "K"에 관하여, 이들은 특히, 비타민 B12의 첨가가 바이오매스 100g당 9g의 값에 도달하는 데 필요하고 충분하다는 것을 입증한다.

심지어는, 이 값은 비타민 B6 및 B1을 제2 전배양 배지에 첨가했을 때 건조 바이오매스 100g당 10g에 도달하였다.

시험 "I"와 시험 "J" 사이의 차이가 스쿠알렌 역가의 관점에 있다는 것을 유의해야 한다: 건조 바이오매스 100g당 생산된 스쿠알렌이 9g인 경우, 역가는 시험 "I"와 비교하여 시험 "J"에서 더 낮았다: 따라서, 비타민 B1 및 B6는 명확히 (바이오매스를 증가시킴으로써) 시스템의 생산성을 증가시킬 수 있게 하였다.

실시예 3: 비교 시험

이 실험은 실시예 1 및 실시예 2에 시험된 조작 조건이 또한 본 출원인 회사에 의해 보유된 유형의 다른 미세조류에 적용될 수 있음을 입증하는 것을 목적으로 하였다:

- ATCC 20888로 참조되는 스키조키트리움 종,

- ATCC PRA 276으로 참조되는 아우란티오키트리움 종.

조작 조건은 실시예 2의 시험 "I"와 동일하였다.

대조군으로서: 스쿠알렌 생산 능력으로 인해 문헌에서 통상적으로 사용된 주: 스키조키트리움 만그로베이.

하기의 표 VII에는 얻어진 결과가 제공되어 있다.

표 VII

스쿠알렌 생산은 시험된 아과 종의 모든 트라우스토키트리알레스에 대해 바이오매스 100g당 2g을 초과하였다. S. 만그로베이의 것은 (얻어진 최상의 결과에 대해) 문헌에 기재된 것에 부합된다: 2mg 스쿠알렌/g 건조 바이오매스.

실시예 4: 발효에 의해 생산된 스쿠알렌이 풍부한 조 오일의 수득

실시예 1(시험 "E")의 종료시에 수득된 바이오매스는 발효의 종료시에 54g/ℓ의 농도였다.

발효의 종료시에 얻어진 스쿠알렌 역가는 4.4g/ℓ였다.

바이오매스를 발효조로부터 회수하고, 이어서 원심분리에 의해 120g/ℓ로 농축시켰다.

바이오매스를 50ℓ 탱크 내에서 150rpm으로 교반하면서 유지하고, 60℃로 가열하였다.

이어서, 45% 수산화칼륨을 사용하여 pH를 10으로 조정하였다.

완전한 알칼리 용해(alkaline lysis)를 달성하기 위하여 이들 조건을 6시간 동안 유지하였다.

용해의 품질을 광학 현미경 하에서 그리고 단순 원심분리(2분, 10,000g)에 의해 모니터링하였다.

용해의 종료시에, 10리터의 에탄올(1부피의 에탄올/용해물의 부피)을 45℃로 유지된 탱크에 첨가하고 10분 동안 교반하였다.

이어서, 10리터의 헥산을 탱크에 첨가하고 30분 동안 교반하면서 유지하였다.

이어서, 혼합물을 원심분리하여 경질 분획(헥산 + 오일)을 분리하였으며, 이를 1m³ 탱크 내에 보관하였다.

추출 수율을 증가시키기 위해 중질(수성) 상을 10리터의 헥산과 다시 합쳐서 앞서와 동일한 설계에 따라 제2 추출을 수행하도록 하였다.

2개의 유기 분획을 합하여 회전 증발기 내에서 헥산의 증발을 수행하였다.

추출된 오일의 헥산 잔류물을 와이프드 필름(wiped film) 증발기(80℃; 1mbar) 내에서 증발시켜 제거하였다.

이렇게 해서 조 오일을 70%의 수율로 회수하였다.

국립 미생물 배양 수집소

CNCMI-4469

20110414

중국 국립균배양 수집소

CCTCCM209118

20090610

Claims

트라우스토키트리알레스 종(Thraustochytriales sp.) 과(family)에 속하는 미세조류에 의한 스쿠알렌의 생산 방법으로서,
- 25 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃, 더 우선적으로는 약 30℃의 온도에서 트라우스토키트리알레스 종 과에 속하는 미세조류를 배양하는 단계, 및
- 전배양 배지 또는 배양 배지에 배양 배지 1리터당 1 내지 1000㎍의 비타민 B12를 첨가하는 단계로 이루어진 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
하기가 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법:
○ 배양 배지 1리터당 0.1mg 내지 200mg의 비타민 B1, 및/또는
○ 배양 배지 1리터당 0.1mg 내지 200mg의 비타민 B6.
제1항 또는 제2항에 있어서,
트라우스토키트리알레스 과의 미세조류가 스키조키트리움 종(Schizochytrium sp .), 아우란티오키트리움 종(Aurantiochytrium sp .) 및 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
트라우스토키트리알레스 과의 미세조류가 스키조키트리움 종 ATCC　20888, 아우란티오키트리움 종 ATCC　PRA 276 및 인스티튜트 파스퇴르(Institut Pasteur)의 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)[국립 미생물 배양 수집소]에 CNCM I-4469호로 기탁된 스키조키트리움 종 주(strain)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
수득된 스쿠알렌 함량이 건조 바이오매스 100g당 2g 이상, 바람직하게는 건조 바이오매스 100g당 2g 내지 12g인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
트라우스토키트리알레스 종 과에 속하는 미세조류의 배양 단계가 연속된 하기의 단계들로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 한천 디쉬 상에 있는 분리된 콜로니로부터 28℃의 온도에서 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask) 내에서 24 내지 36시간 동안 제1 전배양시키는 단계,
- 제1 전배양으로부터 생성된 1% (v/v)의 접종물을 사용하여, 28℃의 온도에서 삼각 플라스크 내에서 24 내지 36시간 동안 제2 전배양시키는 단계,
- 제2 전배양으로부터 생성된 0.5% 내지 2% (v/v)의 접종물을 사용하여, 많아야 45　mmol/ℓ/hr의 산소 전달을 관찰하도록 컨디셔닝된 발효조 내에서 30℃에서 60 내지 150시간 동안 배양하는 단계.
제6항에 있어서,
비타민 B12의 첨가가, 비타민의 총 함량이 배양 배지의 1 내지 10㎍/ℓ가 되도록 2개의 전배양 단계에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
비타민 B1 및 B6이 또한, 비타민의 총 함량이 배양 배지의 100 내지 200㎍/ℓ가 되도록 2개의 전배양 단계에서 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
비타민 B12의 첨가가,
- 비타민의 총 함량이 배양 배지의 1 내지 10㎍/ℓ가 되도록 2개의 전배양 단계에서 수행되고,
- 비타민의 총 함량이 배양 배지의 약 1000㎍/ℓ가 되도록 생산 단계에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
비타민 B1 및 B6이 또한,
- 비타민의 총 함량이 배양 배지의 100 내지 200㎍/ℓ가 되도록 2개의 전배양 단계에서 첨가되고,
- 비타민의 총 함량이 배양 배지의 150 내지 200㎍/ℓ가 되도록 생산 단계에서 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
의학 분야, 화장품 분야 및 식품 부문을 위한 것으로 의도된 조성물의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제10항의 방법 중 어느 한 방법에 의해 생산된 스쿠알렌의 용도.