KR100967592B1 - 감소된 게놈을 갖는 박테리아 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그것의 본래 부모 균주의 게놈보다 2 내지 약 20% 이상 더 적도록 유전적으로 조작된 게놈을 갖는 박테리아를 제공한다. 더 적은 게놈을 갖는 박테리아는 더 효율적으로 상업상 제품을 생성해 낼 수 있다. 본 발명은 또한 박테리아 게놈으로부터 유전자 및 다른 DNA 서열을 결실시키는 방법을 제공한다. 그 방법은 정밀한 결실을 제공하며 결실 부위 주변의 유전자 DNA 서열에 돌연변이를 거의 도입시키지 않는다. 따라서, 게놈 내에서 목적하지 않는 상동성 재조합의 가능성을 증가시키지 않으면서 박테리아에 일련의 결실을 제조하는데 본 방법이 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명에 의해 제공된 몇가지 방법은 목적하는 DNA 서열을 갖는 박테리아 게놈의 영역을 치환하는데 또한 사용될 수 있다.

Description

감소된 게놈을 갖는 박테리아{BACTERIA WITH REDUCED GENOME}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 계류중인 미국특허출원 제10/057,582호(2002년 1월 23일 공개) 및 미국 가출원 제60/409,080호(2002년 9월 6일 공개)의 부분계속출원이며, 이들 두 출원은 전체로 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있다.

연방 후원된 연구 또는 개발에 관한 보고

본 발명은 NIH GM35682 사무국에 의해 재정된 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국은 본 발명에 대하여 특정 권리를 가진다.

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광범위한 상업적 상품을 제조하는데 박테리아가 사용되어 왔다. 예컨대, 다수의 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주 및 바실러스(Bacillus) 균주가 항생제를 제조하는데 사용되어 왔으며; 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans) 및 다수의 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 균주가 비타민 B12를 제조하는데 사용되어 왔으며; 어떤 다른 박테리아는 비타민 리보플라빈을 제조하는데 사용되어 왔으며; 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이 각각 식품 첨가제인 라이신 및 글루탐산을 제조하는데 사용되어 왔으며; 다른 박테리아가 식품 첨가제로 사용되는 다른 아미노산을 제조하는데 사용되어 왔으며; 알칼리제네스 유트로파스(Alcaligenes eutrophas)가 생물 분해될 수 있는 미생물성 플라스틱을 제조하는데 사용되어 왔으며; 그리고 다수의 아세토박터(Acetobacter) 및 글루코노박터(Gluconobacter) 균주가 식초를 제조하는데 사용되어 왔다. 더 최근에는, 에스체리키아 콜리(Escherichia coli, E. coli)와 같은 박테리아가, 실험실에서 뿐 아니라 산업적 세팅에서 유전적으로 조작되었고, 단백질 및 핵산과 같은 생물학적 시약의 제조에 사용되기 위한 숙주 세포로 사용되어 왔다는 것은 통상적이다. 발효기에서 배양된 대장균 배양물에서 제조된 인간 단백질과 같은 성공적인 제품의 몇 가지 예를 제약 산업이 입증한다.

조작된 박테리아로부터 목적하는 단백질 생성물의 제조 또는 정제에 대해 정상적인 박테리아 단백질이 반대로 작용하는 것은 보기드문 사건이 아니다. 예컨대, 플라스미드에 의해 숙주 세포로 도입되는 유전자에 의해 코딩된 목적하는 생성물의 다량을 제조하기 위해 숙주 세포로서 이콜라이 박테리아가 사용될 때, 임의의 정상 이콜라이 유전자 생성물이 플라스미드 DNA의 도입 및 보존을 간섭할 수 있다. 더 중요하게는, 박테리아에서 단백질을 제조하는데 있어서 박테리아 배양의 경제성 때문에, 흔히 재조합 단백질의 정제 비용이 생산 비용보다 더 들 수 있고, 박테리아 숙주에 의해 제조된 몇 가지 천연 단백질은 정제 문제에 민감하다. 또한, 다수의 박테리아 균주는 제조되는 타겟 단백질로부터 반드시 정제되어야 하는 독소를 발생시키며 그리고 어떤 균주는, 우연히, 타겟 단백질의 크기와 유사한 천연 단백질을 제조할 수 있으며, 따라서 정제 과정에서 크기에 따른 분리가 불가능하게 된다.

또한, 그렇지만, 재조합 단백질을 제조하기 위해 발효기에 사용된 박테리아의 유전자는 많은 불필요한 유전자를 포함한다. 자연 환경에서 박테리아 생물은 온도, 스트레스 또는 음식 공급원 부족의 어려운 환경 조건에서 생존하기 위한 메카니즘을 제공하기 위한 많은 조건 반응적 유전자를 갖는다. 발효 탱크 내의 박테리아 생물은 이런 문제점을 갖지 않으며 따라서 이들 조건 반응적 유전자가 불필요하다. 박테리아 숙주는 이들 유전자를 복제하는 각 증식 주기에 대사 에너지를 소비한다. 따라서 재조합 단백질의 제조에 사용되는 박테리아 숙주에 의해 생성된 불필요한 유전자 및 원하지 않는 단백질은, 결과적으로 시스템에서 효율의 손실이며 개선되어야 할 것이다.

미생물체의 게놈에서 결실을 만드는 것은 심각하게 어려운 일이 아니다. 결실된 유전자에 의해 그 생명체에 결핍된 형질이 무엇인지 연구하기 위해 게놈의 영역을 간단한 결실시킴으로써 생명체에서 불규칙 결실 연구를 수행할 수 있다. 그렇지만, 게놈 DNA의 특정 영역의 목적하는 결실을 만드는 것은 더 어려우며 만약 방법의 하나의 목적이 결실 이후 그 생명체 내에, 본원에서 "스카(scar)"라는 용어로서, 삽입된 DNA를 남기지 않는 것이라면 그것은 훨씬 더 어렵다. 만약 삽입된 DNA의 영역, 즉 스카가, 게놈 결실 과정 이후 내부에 남는다면, 그런 영역은 게놈 재배열을 목적하거나 또는 발생시키는 게놈 영역으로부터 잘려나갈 수 있는 원하지 않는 재조합 이벤트에 대한 위치일 수 있다. 일련의 다중 결실을 구축하는 경우, 이전 단계에서 남은 스카가 연속하는 결실 단계에 대한 인공인 타겟이 될 수 있다. 이는 게놈으로부터 일련의 결실을 생성하기 위해 반복적으로 그 방법이 사용될 때 특히 그러하다. 다시 말하면, 만약 삽입된 DNA가 내부에 남는다면 결실 과정에 의해 생명체는 유전적으로 불안정하게 된다.

본 발명은 바람직하게는 게놈에 스카를 남기지 않고 생명체의 게놈을 감소시키는 방법을 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 그것의 본래의 부모 균주의 게놈보다 적어도 2 퍼센트(2%) 내지 20 퍼센트(20%) 더 적어지도록 유전적으로 조작된 게놈을 갖는 박테리아를 제공한다. 바람직하게는, 게놈은 본래 부모의 게놈보다 적어도 7 퍼센트(7%) 더 적다. 더 바람직하게는, 유전자는 그것의 본래의 부모 균주의 게놈보다 8 퍼센트(8%) 내지 14 퍼센트(14%) 내지 20 퍼센트(20%) 더 적다. 생성물을 제조하기 위해 사용될 때, 더 적은 게놈을 갖는 박테리아는 1 이상의 하기의 장점을 가질 수 있다. (1) 자원 소비의 측면 또는 제조 속도의 측면에서, 궁극적으로 수율 퍼센트 또는 세가지 모두에서 그 제조 공정이 더 효율적일 수 있다. (2) 생성물 정제 공정이 간소화될 수 있거나 또는 더 순수한 생성물이 얻어질 수 있다. (3) 천연 단백질의 간섭에 의해 이전에 제조될 수 없었던 생성물이 제조될 수 있다. (4) 목적하는 생성물의 세포당 수율이 증가될 수 있다.

본 발명은 또한, "깨끗한 게놈"을 갖도록 조작된 생명체, 바람직하게는 박테리아에 관한 것으로서, 예컨대, 박테리아의 성장 및 대사에 불필요한 임의의 유전자와 같은 유전자적 물질, 삽입 서열(운반가능한 성분, transposable element), 슈도유전자(pseudogenes), 프로파지(prophage), 내인성 제한 변형(restriction modification) 유전자, 병원성 유전자, 독소 유전자, 핌브리아(fimbrial) 유전자, 주변세포질(periplasmic) 단백질 유전자, 인바신(invasin) 유전자, 알려지지 않은 기능의 서열 및 박테리아의 동일한 본래의 부모 종의 두 균주 사이에서 통상 발견되지 않는 서열이 결핍된 것이다. 배양시 세포 생존 및 임의의 단백질의 생성에 불필요한 다른 DNA 서열은 결실될 수 있다. 본 발명의 감소된 게놈 박테리아는, 유용한 생성물을 발현하기 위한 무수한 게놈 성분뿐 아니라 미세한 튜닝에 대한 전례없는 기회를 제공하거나 또는 목적하는 생성물의 발현을 최적화하는 유전자적 제어 성분에 첨가될 수 있는 기본적인 유전자 골격으로 보여질 수 있다.

본 발명은, 조작으로부터 어떤 잔류 DNA를 남기지 않고 (스카없는 결실) 박테리아 게놈으로부터 유전자 또는 다른 DNA 서열의 목적하는 결실에 대한 재료 및 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 방법이 결실 부위 주변의 게놈 DNA 서열상에 돌연변이를 거의 도입시키기 않거나 또는 잔류 DNA를 남기지 않기 때문에, 게놈 내에서 원하지 않는 상동성 재조합의 가능성의 증가 없이 박테리아에서 일련의 결실을 생성하는 데 본 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법의 몇가지는, 예컨대, 박테리오파지, 본래의 플라스미드 등 게다가, 포유 동물 및 식물과 같은 고등 생명체에서 유사한 결실을 얻는데 또한 유용하다.

첫번째 결실 방법은 선형 DNA에 기초한다. 본 공정을 수행하려면, 먼저, 박테리아에서 선형 DNA 구조물이 제공되며 그리고 상동성 재조합의 빈도를 증가시킬 수 있는 것인 박테리아에 거주하는 시스템에 의해 보강된 상동성 재조합을 통해 박 테리아 게놈의 영역이 선형 DNA 구조물에 의해 치환된다. 다음, 박테리아 내로 먼저 도입된 분리 유전자가 선형 DNA 구조물 상에 위치한 단독 인식 부위에서 박테리아 게놈을 절단하도록 서열 특이적 뉴클레아제를 발현한다. 이후, 선형 DNA 구조물의 하나의 말단의 게놈 DNA에서 타겟에 대한 DNA 상동체를 포함하도록 조작된 DNA 서열이 선형 DNA 구조물의 다른 말단에 인접하여 위치한 유사 게놈 DNA 서열을 이용하여 상동성 재조합을 수행한다. 최종 결과는 게놈의 하나의 영역의 정밀한 결실이다.

두번째 방법 또한 선형 DNA에 기초한다. 두 DNA 서열, 그 중 하나는 결실되는 박테리아 게놈 영역의 하나의 말단의 측면 위치 서열과 동일하며 그 중 나머지는 결실되는 박테리아 게놈의 다른 말단의 측면 위치 서열과 동일한 것이, 두 서열이 서로 옆에 위치하는 벡터 내로 조작된다. 1 이상의 서열-특이적 뉴클레아제 인식 부위가 두 서열의 한쪽에서 벡터 내로 또한 조작된다. 벡터가 박테리아 내로 도입되며, 서열-특이적 뉴클레아제 인식 부위를 인식하고 거기의 벡터를 절단하는 뉴클레아제를 박테리아 내에서 발현시킴으로써 선형 DNA가 박테리아 내에 생성된다. 선형 DNA는, 상동성 재조합의 빈도를 증가시키도록 박테리아에 거주하는 시스템에 의해 보강된 박테리아 게놈을 이용하여 상동성 재조합을 수행한다. 따라서 그것의 게놈에 잔류하는 가공물이 없는 목적하는 결실을 갖는 박테리아가 생성된다.

전술한 두번째 방법은 목적하는 DNA 서열로 박테리아 게놈의 선택된 영역을 치환하는데 또한 사용될 수 있다. 이 경우, 상동성 재조합을 수행하고 따라서 선택된 영영으로 치환되는 목적하는 DNA 서열이 벡터내로 도입된다. 목적하는 영역을 결실시키기 위한 다른 모든 양태는 동일하다.

세번째 방법은 자살 플라스미드(suicide plasmid)에 기초한다. 본 방법에 사용되는 특정 플라스미드는, 항생제 내성 유전자와 같이 프로모터 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 복제 개시점을 포함한다. 박테리아 게놈의 목적하는 영역을 결실시키기 위해, 서로 바로 옆에 위치한 두 DNA 서열을 포함하는 DNA 삽입물, 그 중 하나는 결실되는 박테리아 게놈 영역의 하나의 말단의 측면 위치 서열과 동일하며 그 중 나머지는 결실되는 박테리아 게놈의 다른 말단의 측면 위치 서열과 동일한 것이 플라스미드 내로 삽입된다. 이후 플라스미드가 박테리아 내로 도입되며 박테리아 게놈자 내로 일체화된다. 다음, 재조합 이벤트가 선택되기 위하여 이소성(ectopic) 개시점으로부터 박테리아 게놈 내로 도입되는 복제를 유도하도록 프로모터가 활성화된다. 다수의 박테리아에서, 재조합 이벤트는 박테리아 게놈의 목적하는 영역의 정밀한 결실을 초래하며 이들 박테리아는 확인될 수 있다. 재조합 이벤트에 대해 선택하는 다른 방식은 서열-특이적 뉴클레아제의 인식 부위를 조작하고 특정 플라스미드 내로 서열-특이적 뉴클레아제를 이용하여 박테리아 게놈을 절단하는 것이며 그 후에 플라스미드가 박테리아 게놈 내로 일체화된다.

전술한 자살 플라스미드에 기초하는 방법은 목적하는 DNA 서열로 박테리아 게놈의 선택된 영역을 치환하는데 또한 사용될 수 있다. 이 경우, 상동성 재조합을 수행할 수 있으며 따라서 그 선택된 영역을 치환하는 목적하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 삽입물이 플라스미드 내로 삽입된다. 목적하는 영역을 결실시키기 위한 다른 모든 양태는 동일하다.

본 발명의 방법은 그 중에서도 특히 재조합 유전자 생성물의 제조를 위한 감소된 게놈 박테리아를 조작하는데 유용하다. 그런 조작된 박테리아는, 불필요한 박테리아 유전자 생성물의 제거 덕택으로, 제조 효율 및 목적하는 유전자 생성물의 수율을 증가시킴으로써 게다가 생성물에 더 효율적인 정제를 허용함으로써 그런 단백질의 개선된 제조를 허용한다. 본 발명의 바람직한 감소된 게놈 박테리아는 주변세포질 단백질 및/또는 막 단백질을 코딩하는 1 이상의 본래 유전자가 결실된 박테리아이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 DNA 및 벡터, DNA를 제조하는 방법 및 바이알을 포함하는 키트에 관련되며, 그 바이알은 본 발명의 1 이상의 DNA 또는 벡터 및 필요에 따라 적절한 버퍼, 프라이머, 엔도뉴클레아제, 뉴클레오티드, 및 폴리머라제를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 감소된 게놈 박테리아를 포함하거나 또는 항원 결정자의 발현을 허용하는 발현 제어 서열과 작동적으로 관련된 병원성 생명체의 항원 결정자를 코딩하는 DNA가 도입된 본 발명의 감소된 게놈 박테리아를 포함하는 생백신에 관한 것이다. 또한 본 발명의 범위는, 병원성 생명체로부터 유도되며 필요에 따라 복제 개시점을 갖는 DNA가 도입된 본 발명의 감소된 게놈 박테리아를 포함하는 생백신이며, 상기 생백신은 병원성 생명체에 대응하여 숙주에서 증가된 면역 반응을 유도하는 것이 가능하다. 상기 DNA는 바람직하게는 메틸화 부위에서 메틸화된다. 본 발명은 또한 다른 항원 결정자를 보유하지만 병원성에 대응하는 유전자를 그 생명체의 게놈으로부터 결실시킴으로써 병원성 생명체로부터 생성된 생백신에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 이하의 상세한 설명을 참고로 명백해질 것이다.

몇가지 도면의 간단한 설명

도 1은 이콜라이 K-12 박테리아 게놈 상에서 유전자 및 다른 DNA 서열의 위치를 보여주며, 최외곽의 고리상에 블랙 및 밝게 음영화된 박스가 결실 후보지이다.

도 2는 본 발명의 선형 DNA에 기초한 스카없는 유전자 변이 방법의 특정 실시예를 예시한다.

도 3은 본 발명의 다른 선형 DNA에 기초한 방법의 특정 실시예를 예시한다.

도 4는 도 3에 예시된 선형 DNA에 기초한 방법에 사용될 수 있는 돌연변이 유도 플라스미드를 보여준다.

도 5A-C는 본 발명의 자살 플라스미드에 기초한 방법의 특정 실시예를 예시한다.

도 6은 도 5A-C에 예시된 자살 플라스미드에 기초한 방법에 사용될 수 있는 3개의 플라스미드를 보여준다.

발명의 상세한 설명

박테리아는 그것의 자연 환경에서 표준 산업상 또는 실험실 성장에서 정상적으로 경험할 수 없는 많은 조건에 노출되며, 따라서 다수의 조건-의존적, 스트레스-유도 유전자 또는 그렇지 않으면 생명체의 산업상 또는 실험실 사용에서 필요하지 않을 수 있는 불필요한 게놈을 운반한다. 산업상 또는 실험실의 중요한 공정에서 박테리아 배양의 사용에 대한 유해한 영향 없이 결실 될 수 있는 박테리아 균주의 게놈 내에 포함된 많은 유전자적 정보를 실현하는 데에서 본 발명은 출발한다. 많은 산업상 및 실험실 응용에서 감소된 게놈을 갖는 박테리아가 본래의 균주에 비해 유리할 수 있는 것으로 인식되었다. 예컨대, 감소된 게놈을 갖는 박테리아는 적어도 대사 요구량이 어느 정도 적으며 따라서 목적하는 생성물을 더 효율적으로 제조해낼 수 있다. 게다가, 감소된 게놈은, 남아 있는 박테리아 단백질로부터 목적하는 단백질의 더 용이한 정제를 허용하면서, 더 적은 본래의 생성물 및 더 낮은 수준의 본래의 단백질로 유도할 수 있다. 또한, 몇몇 박테리아 유전자 서열은 표준 산업상 또는 실험실 시험을 간섭할 수 있는 불안정성과 관련되며, 비용이 들고 부담이 되는 품질 제어 공정을 수반할 수 있다.

본 발명은 또한 어떤 삽입된 DNA 내부(스카없는 결실)를 남기지 않고 게놈으로부터 유전자 DNA를 결실시키는 몇가지 방법을 포함한다. 만약 누군가 박테리아 게놈을 구성하는 단일 DNA 분자로부터 몇가지 서열 결실을 얻는다면, 어떤 삽입된 DNA 서열 내부를 남기지 않는 것이 중요하다. 그런 삽입된 서열은, 만약 그들이 내부에 남는다면, 박테리아로부터 남아있는 게놈에서 특징지어지지 않고 그리고 아마도 중요한 부분을 결실시키거나 또는 부적당한 효과로 다른 예기치 않은 게놈 재배열을 일으키는, 원하지 않는 재조합 이벤트에 대한 후보 부위가 될 것이다. 게놈 감소 노력의 목적의 하나가 박테리아의 유전자적 안정성을 증가시키는 것이기 때문에, 어떤 삽입된 DNA 내부를 남기는 것은 그 목적에 반할 수 있으며, 피해야 한다. 따라서 유전자로부터 DNA를 결실시키는 데 사용된 방법은 중요하고 복잡해 진다.

하나의 양태에서, 본 발명은, 그것의 본래의 부모 균주의 게놈보다 더 적어지도록 유전적으로 조작된 게놈을 갖는 박테리아와 관련된다. 예시적 목적상, 본원에 기재된 작업은 통상 실험실 및 산업상 대장균 박테리아에 촛점을 둔다. 본원에 기재된 게놈 감소 작업은, 본원에 기재된 작업에 우선하여, 4,639,221 뉴클레오티드 또는 염기쌍의 게놈, 실험실 이콜라이 균주 K-12로 출발한다. 본 발명의 박테리아는, 그것의 본래의 부모 균주의 게놈보다 적어도 2 퍼센트 (2%), 바람직하게는 5 퍼센트 (5%), 더 바람직하게는 7 퍼센트 (7%) 내지 8 퍼센트(8%) 내지 14 퍼센트 (14%) 내지 18 퍼센트 (18%) 내지 20 퍼센트 (20%), 내지 40 퍼센트 (40%) 내지 60 퍼센트 (60%) 더 적은 게놈을 갖는다. 용어 "본래의 부모 균주"은, 과학적 군집에 의해 통상 이해되며 그리고 그것의 게놈이 더 적은 유전자를 갖는 박테리아 균주를 제조하도록 일련의 결실이 이루어질 수 있는 것으로서, 자연적으로 또는 자연 환경에서 발견되는 박테리아 균주 (또는 다른 생명체)을 의미한다. 일련의 결실 이후에 더 적어진 게놈의 퍼센트는 "모든 결실 이전에 게놈 상에 염기쌍의 총 수"에 대해 "모든 결실 이후에 결실된 염기 쌍의 총 수"를 나눔으로써 그리고 그후 100을 곱함으로써 계산된다.

본 발명의 다른 양태는 그것의 단백질 코딩 유전자 약 5% 내지 약 10%가 결실된 감소된 게놈 박테리아를 포함한다. 바람직하게는 단백질 코딩 유전자 약 10% 내지 20%가 결실된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 단백질 코딩 유전자 약 30% 내지 약 40% 내지 약 60%가 결실된다.

일반적으로 말하면, 결실될 수 있는 유전자의 유형, 및 다른 DNA 서열은, 특정 성장 조건 하에서 박테리아의 생존율 및 증식율에 반대의 영향을 미치지 않는 그런 결실이다. 수용할 수 있는 반대 효과의 수준 여부는 특정 적용예에 따라 좌우된다. 예컨대, 하나의 적용예에서 증식율의 30% 감소가 수용될 수 있지만 다른 것에 대해서는 그러하지 아니하다. 게다가, 유전자로부터 DNA 서열의 결실의 반대 효과는 배양 조건을 변화시키는 것과 같은 측정에 의해 감소될 수 있다. 그런 측정은 수용할 수 있는 것에 대해 수용할 수 없는 반대 효과로 바뀔 수 있다. 바람직하게는, 증식율은 대략 부모 균주과 동일하다. 그렇지만, 부모 균주보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 내지 약 50% 범위의 더 낮은 증식율은 본 발명의 범위 내이다. 더 구체적으로, 본 발명의 박테리아의 바람직한 배가 시간 (doubling time)은 약 30분 내지 3시간의 범위일 수 있다.

본 발명의 박테리아는, 목적하는 생성물을 제조하기 위해 유용할 수 있는 자원 (즉, 영양분)에 대한 그들의 사용을 최적화하도록 본 발명의 방법에 의해 아마도 조작된다. 그런 생성물은, 재조합 단백질, 한정되지 않는 예시로서, 인슐린, 인터루킨, 싸이토킨, 성장 호르몬, 성장 인자, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자, 인터페론, 항제, 항체 단편, 또는 어떤 다른 유용한 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 생성물은 치료용 제품, 백신 성분, 진단 제품, 또는 연구용 시약일 수 있다. 박테리아는 또한, 바닐린, 시킴산, 아미노산, 비타민, 유기산 등과 같은 상업상 유용한 대사 중간체 및 최종 생성물, 및 박테리아에서 자연적으로 생성된 것이 아닌 대사 경로 조작 또는 다른 유전자적 조작의 결과로서 생성된 화학적 화합물과 같은 산업상 유용한 생성물을 발현하는데 바탕으로서 사용될 수 있다 - (예컨대, 미국 특허 6,472,16 및 6,372,476 참조, 둘 다 본원에서 참고 문헌으로 인용됨).

이하에서, 이콜라이는, 더 효율적으로 목적하는 생성물을 제조해낼 수 있는 박테리아를 제조하기 위한 결실에 대한 후보인 유전자 및 다른 DNA 서열을 예시하는 예로써 사용된다. 유전자 및 다른 DNA 서열의 예시된 일반 원칙 및 유형이 다른 박테리아 종 또는 균주에 적용할 수 있는 결실에 대한 후보로 확인되었다. 결실 후보로 이하에 확인된 유전자 및 다른 DNA 서열은 단지 예시인 것으로 이해된다. 수용될 수 없는 수준으로 세포 생존 및 증식에 미치는 영향 없이 확인되지 않은 많은 다른 이콜라이 유전자 및 다른 DNA 서열이 결실될 수 있다.

후술하는 분석 및 방법은 타겟 박테리아 균주 박테리오파지 유전자 또는 본래의 플라스미드의 DNA 서열의 적어도 일부에 적용할 수 있는 것으로 가정한다. 바람직하게는, 전체 서열에 적용할 수 있다. 그런 완전 또는 부분 서열은 GenBank데이타베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다. 이콜라이의 몇가지 균주의 전체 게놈 서열이, 몇가지 다른 통상 사용되는 실험실 박테리아의 서열로서 현재 공개되었다 (예컨대, Blattner et al, Science, 277: 1453-74, 1997 K-12 균주 MG1655; 또한 GenBank 접수 번호 U00096 참조; Perna et al, Nature, 409, 529-533, 2001; Hayashi et al, DNA Res., 8, 11-22, 2001, 및 Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2002) 99 (26) 17020-17024 및 GenBank 접수 번호 AE014075, 이 모두가 본원에서 그 전문이 참고문헌으로 인용됨). 결실 공정을 시작하려면, 박테리아의 게놈은, 결실에 대한 좋은 후보를 나타내는 그것의 서열을 찾기 위해 분석된다. 물론, 이들 기술은 서열 일자가 유용하거나 또는 결정될 수 있는 유전자 영역에서 부분적으로 서열화된 유전자에 또한 적용될 수 있다.

이콜라이, 및 게다가 다른 박테리아 뿐 아니라 고등 생명체에서, 결실될 수 있는 DNA 서열의 유형은 일반적으로 그 생명체 또는 그 생명체의 유전자 생성물의 안정성에 반대로 영향을 미치는 것을 포함한다. 불안정성을 증가시키는 그런 서열은 유전자 불안정성에 역할을 수행할 수 있는 운반가능한 성분, 삽입 서열, 및 다른 "자가 DNA" 성분을 포함한다. 예컨대, 삽입 서열 (IS) 성분 및 그들의 관련된 운반물(transposes)은 박테리아 게놈에서 흔히 발견되며, 따라서 결실에 대한 타겟이다. IS 서열은 이콜라이에서 일반적이며, 그들 모두는 결실될 수 있다. 본 명세서의 목적을 명백히 하기 위해, 본 발명자들은 용어 IS 성분 및 운반가능한 성분을 일반적으로, 완전하건 또는 결점이 있건 간에, 게놈의 한 지점으로부터 다른 곳으로 이동할 수 있는 DNA 성분을 언급하는데 사용한다. 과학 및 기술에서 IS 성분의 유해한 효과의 예는 시퀀싱(sequencing)에서 증폭 동안 숙주 이콜라이의 게놈으로부터 BAC 플라스미드 내로 그들이 도약할 수 있다는 사실이다. GenBank 데이타베이스로부터 인간 유전자 및 다른 서열에서 많은 예가 발견되었다. 모든 IS 성분의 숙주 세포로부터 결실에 의해 이 가공물이 예방될 수 있다. 특정 적용예에서, 유전자의 불안정성과 관련된 다른 특정 유전자도 또한 결실될 수 있다.

도 1에 보인 것은, K-12 균주에서 자연적으로 4,639,221 염기쌍을 포함하는 이콜라이 게놈의 예시이다. 도 1은, 안쪽 고리 상에서, 결실 없이 스케일된 이콜라이 K-12 게놈 (균주 MG1655)의 염기쌍 위치의 스케일을 보여 준다 (또한 Blattner et al., supra 참조). 순서대로 바깥쪽의 다음 고리는, 관련된 균주 0157:H7에서 결실되거나 또는 상당히 변형된 K-12 게놈의 영역을 보여주며, 따라서 그것은 K-12 게놈으로부터 잠재적으로 검출가능하다. 바깥쪽 다음 고리는 본래의 게놈에서 완전하거나 또는 부분적인 IS 성분의 위치를 보여준다. 바깥쪽으로 이동하는 다음 고리는 본원에서 특히 결실을 타겟으로 한 rhs 요소 A 내지 E 및 플라젤라(flagellar) 및 제한 영역(restriction regions)의 위치를 보여준다. 최외곽의 고리는 이하의 표 1 및 2에서 나열한 바와 같이, 게놈에서 실제로 형성된 결실의 위치를 보여준다. 이들 결실은 본래 K-12 MG1655 게놈에서 약 14 퍼센트의 염기쌍으로 구성된다. 본 발명의 방법을 사용하여 18% 내지 20% 내지 약 40%의 유전자가 본원에 기재된 디자인 패러다임을 이용하여 결실될 것이다.

결실될 수 있는 이콜라이 유전자의 다른 패밀리는, 그것의 생성물이 외인성 DNA를 파괴하는 것인 제한 변형(modification) 시스템 유전자 및 다른 내인성 뉴클레아제이다. 이들 유전자는 배양 환경에서 박테리아의 생존 및 성장에 중요하지 않다. 이들 유전자는 또한 박테리아 내로 도입된 플라스미드를 파괴함으로써 유전자 조작을 간섭할 수 있다. 이콜라이 게놈 지도상에서 제한 변형 시스템 유전자의 위치는 도 1 및 표 1에 보인다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 특정 용도, 예컨대, 진핵생물성 메틸라제 유전자에 대한 균주를 최적화하기 위해, 결실된 이콜라이 균주의 뒤로 다른 DNA 메틸라제 유전자가 추가될 수 있다.

결실될 수 있는 이콜라이 유전자의 다른 패밀리는 플라젤라 유전자 패밀리이다. 플라젤라는 박테리아에서 운동성을 담당한다. 자연 환경에서, 박테리아는 영양분을 찾아 헤엄친다. 배양되는 환경에서, 박테리아 운동성은 세포 생존 및 성장에 중요하지 않으며, 세포 에너지의 1%를 소비하는 수영 동작은 대사적으로 매우 소비적이며 이익이 없다. 따라서, 플라젤라 유전자는 더 적은 게놈을 갖는 박테리아를 생성시키면서 결실될 것이다. 이콜라이 게놈 지도 상에서 플라젤라 유전자의 위치는 도 1 및 표 1에 보인다.

이미 언급된, 결실될 수 있는 이콜라이 DNA 성분의 하나의 유형은, IS 성분 (또는 운반가능한 성분)이다. IS 성분은 배양되는 환경에서 세포 생존 및 성장에 중요하지 않으며, 유전자 안정성을 간섭하는 것으로 알려져 있다. 따라서, IS 성분은 더 적은 게놈을 갖는 박테리아를 생성시키면서 결실될 수 있다. 이콜라이 게놈 지도 상에서 IS 성분의 위치는 도 1 및 표 1에 보인다.

결실될 수 있는 이콜라이 DNA 성분의 다른 유형은 rhs 요소이다. 모든 rhs 요소는 3.7 Kb Rhs 코아(core)를 공유하며, 그것은 상동성 재조합을 경유하는 게놈 재배열에 대한 수단을 제공하는 대형 상동성 반복 영역 (이콜라이 K-12에는 5개의 복사본이 있음)이다. rhs 요소는, 종으로서 이콜라이의 분화 이후 몇몇 다른 바탕으로 널리 진화되며 수평적 교환에 의해 이콜라이에까지 퍼진 보조 성분이다. 이콜라이 게놈 지도 상에서 rhs 요소의 위치는 도 1 및 표 1에 보인다.

결실될 수 있는 이콜라이 DNA 성분의 다른 유형은 전사되지 않는 영역인데, 그것은 세포 생존 및 증식에 덜 중요하기 때문이다. 이콜라이 게놈에서 결실될 수 있는 다른 유형은 hsd 영역이다. hsd 영역은 전술한 주된 제한 변형 유전자 패밀리를 코딩한다. 이콜라이 게놈 지도 상에서 전사되지 않는 영역 및 hsd 영역의 위치는 도 1 및 표 1에 보인다.

프로파지, 슈도 유전자, 독소 유전자, 병원성 유전자, 주변세포질 단백질 유전자, 막단백질 유전자가 또한, 본원에 기재된 유전자 선택 패러다임에 기초한 결실될 수 있는 유전자이다. 이콜라이 K-12의 서열 (Blattner, et al., supra 참조)을, 그것의 상대적으로 인접한 0157:H7의 서열 (Perna et al., supra 참조)에 비교한 이후, 상대적으로 연속적인 백본(backbone) 내로 불규칙적으로 삽입된 1 내지 약 85 kb의 균주 특정 아일랜드 상에 단백질 코딩 유전자 22% (K-12) 및 46% (0157:H7)가 위치한다는 것이 논의되었다.

결실될 수 있는 다른 유전자는, 예컨대, 용균 파지 T1에 대한 수용체를 코딩하는 ton A (FhuA) 및/또는 그것의 완전 오페론을 포함하는 박테리오파지 수용체를 코딩하는 유전자이다.

결실 후보로서 추가의 유전자 및 DNA 서열을 확인하는 하나의 일반적 방법은 하나의 박테리아 균주의 게놈을 1 이상의 다른 균주과 비교하는 것이다. 두개 또는 세개의 균주에 존재하지 않는 어떤 DNA 서열은 기능적으로 덜 필수적이며 따라서 결실 후보를 확인하는 데 사용될 수 있다. 후술하는 실시예에서, 두 이콜라이 균주, 0157: H7 EDL933 및 K-12 MG1655의 전체 게놈 서열이 비교되었다. 두 균주에서 발견되지 않은 DNA 서열이 결실 타겟을 확인하는데 사용되었다. 이콜라이 균주 MG1655로부터 확인된 그런 타겟 12개가 결실되었으며, 결과적으로 약 8% 더 적은 게놈을 갖는 박테리아 균주가 되었다. 감소된 게놈을 갖는 박테리아는 본래의 부모 MG1655 균주과 실질적으로 동일한 속도로 성장한다.

요로 병원성 이콜라이 균주 CFT073 H7의 DNA 서열이 (Welch et al., supra 참조) 최근에 결정되었으며 그것의 서열이 K-12 (MG1655) 및 0157:H7에 비교되었다. 결과는, 전체 게놈 중에 어느 하나의 게놈에서 발견되는 모든 코딩 유전자의 단지 약 40%가 존재하며 그리고 CFT073, K-12 및 0157:H7가 67%, 43% 및 68% 균주 특정 아일랜드 유전자로 구성된다는 것을 보인다. 이 정보를 기초로, 단백질 코딩 서열의 약 60% 이하가 이콜라이로부터 결실될 수 있다. 바람직하게는 5% 이상 또는 약 90% 또는 약 15% 또는 약 21%의 단백질 코딩 유전자가 결실된다. 더 바람직하게는, 약 30%의 단백질 코딩 유전자가 결실된다. 하나의 균주에서 성장에 필수적일 수 있는 유전자가 다른 균주에서는 성장에 필요하지 않다는 것을 기억하여야 한다. 그런 경우, 성장에 필수적인 유전자 균주는 그 균주으로부터 결실되지 않으며, 또는 원한다면 그 균주의 성장을 허용하는 보완적 기능의 다른 유전자로 치환된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 미니말 배지에서 배양될 때 균주의 적당한 성장을 허용하게 되는 것인 약 100개의 "아일랜드" 및 주변 DNA를 제거하도록, 73 결실을 포함하는 약 3.7 메가베이스(K-12보다 약 20% 더 적음)의 게놈을 생성하기 위하여 이콜라이 게놈으로부터 추가의 유전자를 선택하는데 (본 방법의 발명을 사용하여) 서열 정보가 사용된다. 게놈으로부터 어떤 남아있는 운반가능한 성분 (IS 서열)을 완전 제거하는 데 그 디자인이 또한 필요하다.

주변세포질 클렌징 및 단백질 발현

본원에 기재된 것을 이유로, 박테리아의 주변세포질 공간 내로 분비되어야 하는 재조합 단백질의 제조 분야에서 필요성이 있으며 그리고 주변세포질 발현을 최적화하기 위해 박테리아를 조작하는데 본 발명의 방법이 제공된다.

이콜라이와 같은 그램-음성 박테리아는, 안쪽 세포막 및 바깥쪽 세포막의 두 세포막을 갖는다. 두 막은 주변세포질 공간(periplasmic space, PS)에 의해 분리되어 있다. 적절한 시그날 서열을 갖는 박테리아 단백질이, Sec-시스템 및 Tat-시스템의 2 이상의 상이한 시스템에 의해 안쪽 세포막을 통해 PS 내로 분비된다. (Danese et al., Annu. Rev. Genet. (1998) 32: 59-94; Fekes et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., (1999) 63: 161- 193; 및 Pugsley, Microbiol. Rev. (1993) 57: 50-108 [sic]. Hynds et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 34868-34874; Santini et al. (1998) EMBO J. 17: 101-112; Sargent et al., EMBO J. 17: 101-112 [TAT] 모두 본원에서 참고문헌으로 인용되었다.)

Sec-시스템은 세포질 ATP 및 기전력을 이용하여, 적절한 시그날 펩티드를 인식하며 주변세포질 내로 폴딩(folding)되지 않은 상태로 단백질을 수송한다. 시그날 단백질의 절단 이후, 새로운 단백질이 이황화 결합의 형성을 촉매하는 샤페론(chaperones), 펩티딜-프롤일 이소머라제, 및 티오레독신 연결 시스템의 도움으로 폴딩된다. 예컨대, 모두 본원에서 참고문헌으로 인용된 Hynds et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 34868-34874; Santini et al. (1998) EMBO J. 17: 101-112; Sargent et al., EMBO J. 17: 101-112 [TAT] 참조.

Sec-시스템과는 대조적으로, Tat-시스템은 완전히 폴딩된 형태로 큰 단백질을 수송하며 적절한 시그날 서열의 인식에 더 특이적이다. 본 발명자들은, (1) 이 종성 재조합 단백질을 발현하기 위한 바람직한 부위이며, (2) 제어된 조건에서 산업상 사용하기에, 많은 불필요한 단백질을 가지며, 그리고 (3) 많은 불필요한 적응 및 제어 시스템에서 역할을 하기 때문에, 그 중 몇몇은 유해한 것으로 드러났지만, 주변세포질을 선택하였다. 주변세포질로부터 본래의 단백질을 제거함으로써, 단백질 생성에 대한 공정을 크게 개선시키는 것이 가능하다는 것을 본 발명자들은 예상하였다. 주변세포질에서 단백질의 발현 및 분비는 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 1983, 166(4): p.557-80; Hockney, R. C., Trends Biotechnol., 1994, 12(11): p.456-632.; 및 Hararaig G., et al., Trends Biotechnol., 1998, 16(2): p.54-60.에서 연구되었으며 모두 본원에서 참고문헌으로 인용되어 있다.

주변세포질이 단백질 생성에 바람직한 부위라는 것에 대한 몇가지 이유가 있다; (1) 천연 단백질과 동일한 아미노 말단을 갖는 재조합 단백질을 제조하는 것이 가능한 반면, 세포질에서는 단백질이 항상 아미노산 메티오닌으로 시작한다; (2) 많은 단백질이 주변세포질 공간에서 정확하게 폴딩될 수 있다; (3) 세포질의 산화성 환경에서 정확한 이황화 결합이 형성될 수 있다; (4) 주변세포질 공간은 세포질보다 단백질을 훨씬 더 적게 함유한다, 정제가 간소화됨; (5) 세포질보다 프로테아제가 거의 없다, 단백질 소화 및 손실이 감소됨; (6) 발현된 단백질은 특이적으로, 더 풍부한 세포질 단백질이 실질적으로 자유로운 바깥쪽막을 분열시킴으로써 다른 주변세포질 단백질로 용이하게 방출된다. 주변세포질 공간은, 아마도 이곳이 가장 안쪽 및 최외곽 막단백질이 가공되는 기관이기 때문에, 안쪽막을 통해, 이들 가공 임무를 수행하기 위해, 세포성 세포질 대사에 연결된 천연 효소 시스템을 갖는다. 대조적으로, 세포질의 환원되는 환경에서 발현된 재조합 단백질 사슬의 적절한 폴딩을 얻는 것은 매우 어려운 것으로 밝혀졌다. 단백질은 흔히 불용성의 "포합체 (inclusion bodies)" 내로 응집된다. 초기 포합체 정제가 간단한 반면, 단백질은 다시 용해되고 다시 폴딩되어야 하며, 몇가지 단백질에 있어서는 예측할 수 없고 제어하기 어려운 공정이며, 따라서 산업적 규모에서는 작동할 수 없는 것으로서 비효율적이다.

재조합 단백질은 그들이 시그날 펩티드에 결합되어 주변세포질 공간 내로 분비를 유발하는 융합 단백질을 발현시킴으로써 주변세포질에서 일반적으로 생성된다. 거기에서 시그날 펩티드는 특정 시그날 펩티다제에 의해 매우 정밀하게 절단된다. Genentech (뉴트로핀, Full Prescriber Information.) 및 Pharmacia에 의해 이 방법으로 제2세대 재조합 인간 성장 호르몬이 제조되었다. 모든 단백질이 이 경로에 의해 성공적으로 생성될 수 있는 것은 아니며 분비 및 후-분비 가공 시스템이 제한된 능력을 갖는다는 증거이다. 또한, 여전히 처리되어야 할 단백질 불순물이 있다. 특히, 하나의 그런 공인된 생성물에도, 그것이 어떤 환자에서 항체의 생성을 유발하는 이콜라이 주변세포질 단백질의 트레이스를 포함한다는 경고가 있다 (고노트로핀: Full Prescriber Information). 이것이 임상에서 문제되지 않는 것으로 주장되었지만, 이는 불필요한 것으로 인식되어져야 한다. 본 발명의 물질 및 방법이 이 문제의 감소 또는 제거를 허용할 것이다.

본 기술 분야에서 PS 내로 분비되어야 하는 재조합 단백질의 생성이 요구된다. Sec- 또는 Tat-시스템을 실행시킴으로써 또는 각각의 박테리아에 유용한 어떤 다른 병원체를 분비시킴으로써 이런 분비가 수행될 수 있다. 두 경우에, 적절한 시그말 펩티드가 재조합 단백질에 추가될 것이다. 만약 Sec-시스템이 사용된다면, 이하의 추가 실시예가 필요하다. 고효율 발현 구조물에 의해 Sec-시스템이 포화될 수 있다는 연구가 있기 때문에, 실시예의 첫번째 세트는, PS에서 적절하게 수송되며 폴딩될 수 있는 재조합 단백질의 최적의 발현 수준으로 시스템을 진행시킬 것이다.

본 발명의 감소된 게놈 박테리아에서 주변세포질 발현에 유용한 재조합 DNA 구조물은 목적하는 이종성 단백질을 코딩하는 1 이상의 두번째 DNA 서열에 효과적으로 연결된 주변세포질 공간에 대해 단백질의 수송을 매개할 수 있는 시그날 펩티드를 코딩하는 첫번째 DNA 서열을 포함한다. 시그날 서열은 발현될 단백질에 대해 선천적일 수 있다. 바람직하게는, 주변세포질 공간 내로 수송되는 단백질은 생물학적으로 활성이 있다. 재조합 DNA 구조물의 발현은 숙주 박테리아에서 유도성(inducible) 프로모터 또는 구조적으로 발현되는 프로모터로 제어될 수 있다. 유도성 프로모터의 사용은 포화될 수 있는 것으로 알려진 Sec 시스템을 사용하는 때에 특히 유리하다. 예컨대, 대사될 수 없는 갈락토스 유도체 유도성의, lac에 기초하는 프로모터/리프레서, IPTG가 사용될 수 있다. 그런 프로모터는 Sec 시스템을 통해 발현 및 분비의 미세한 튜닝을 허용하며 따라서 주변세포질 발현이 최적화된다.

재조합 단백질은 재조합 단백질의 적절한 폴딩을 보장하는 샤페론/이황화 결합 형성 효소로 또한 공발현될 수 있다. 재조합 단백질의 주변세포질 발현에 유용한 DNA 서열은 미국 특허 5,747,662; 5,578,464; 6,335,178; 및 6,022,952에 게재된 것을 포함하지만 그것만으로 한정되지 않는다. Thomas et al., Mol-Micro, (2001) 39(1) 47-53; Weiner et al., Cell, (1998) 93, 93-101; 및 Current Protocols in Molecular Biology (1994) 16.6.1-16.6.14 (John Wiley et al. and Sons에 의해 2000년 출판) 모두 본원에서 참고문헌으로 그 전문이 인용되었다.

본 발명의 하나의 구체예에서, MDS40을 구축하는데, 미니말 배지 상에서 성장하는 생명체의 능력을 손상시키지 않는, 9개의 공지된 그리고 3개의 추정되는 주변세포질 단백질 유전자가 성공적으로 결실되었다. (표 4 및 이하의 데이타 참조). 이들 돌연변이는 아미노산 섭취, 무기물 대사, 세포막 보수, 당 대사 및 흡착을 포함하는 기능의 범위에 영향을 미친다.

그들의 시그날-펩티드 서열에 의해 확인된, 공지된 또는 추정되는 막단백질을 코딩하는 대략 85 유전자가 결실되었다. 이 중에서 33개가 플라젤라 구조 또는 생합성에 관계되며; 9개가 핌브리아 구조 또는 생합성에 관계되며; 그리고 13개가 일반적 분비 경로에 관계된다. 나머지는 세포막에서 공지되거나 또는 추정되는 다양한 기능을 갖는다. 이들 단백질의 다수가 주변세포질 공간에서 가공되는 것으로 여겨진다. 그들은 미니말 배지 상에서 성장하는 생명체의 능력에 명백하게 영향을 주지 않고, MDS40을 구축하는데에서 결실되었다.

첨부된 MG1655 데이타베이스 및 이들과 교차 관련된 문헌에서 시그날 펩티드-유사 서열을 검색함으로써, 본 발명자들은 대다수가 주변세포질 단백질에 거주하는 것으로 여겨지는 181 단백질을 확인하였다. 흡착 및 운동성; 영양분 및 염의 섭취, 트레이스 성분 섭취; 환경에 대한 센싱(sensing); 방어 및 보호; 그리고 주변세포질 단백질 분비 및 가공을 제외하고, 기능에 따라 이들 단백질의 다수가 몇가 지 군으로 분류되었다. 생물 약학적 제조에 대해 정의된 미니말 배지에 필요한 것과는 달리, 결실되었거나 결실될 유전자 또는 완전 오페론 중에 당 또는 아미노산 수송 단백질을 코딩하는 것이 있다.

PS 내로의 재조합 단백질 수송의 효율을 모니터링 하기 위해, 상업적으로 구입할 수 있는 3개의 태그(tag), E.coli 알칼리 포스파타제, Aequoria 그린 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP) 또는 인간 성장 호르몬 단백질이 전술한 방법에 따라 사용될 수 있다. 최종 설명 목적상 인간 성장 호르몬 단백질이 현재 가장 바람직하며 그리고 ELISA 및 PS에서 재조합 단백질 배치에 대한 유전자 칩에 기초한 측정에 사용될 수 있다.

누구든 게놈으로부터 1 또는 수개의 유전자 또는 다른 DNA 서열을 결실시키는 것의 중요성을 시험할 수 있다. 예컨대, 게놈의 1 또는 수개의 유전자 또는 다른 DNA 서열이 결실된 이후, 남아 있는 박테리아의 생존 및 증식율을 측정할 수 있다. 비록 상기에 확인된 유전자 또는 다른 DNA 서열 대부분이, 원하는 생성물을 제조하기 위한 목적에 대해 유해한 영향 없이 결실될 수 있지만, 특정 유전자 또는 다른 DNA 서열의 결실이 세포 사멸 또는 증식율의 납득할 수 없는 수준의 감소와 같은 납득할 수 없는 중요성을 가질 수 있다는 것이 가능하다. 생물학적 경로 사이에 유전자 기능 및 상호작용에서 반복성이 있기 때문에 이 가능성이 존재한다. 추가의 결실 없이 균주 상에서 발생할 수 있는 몇가지 결실이 다른 결실과 단지 조합하여 유해해 질 수 있다. 임의의 방법이 결실 후보를 확인하는데 사용되기 때문에 이 가능성이 또한 존재한다. 예컨대, 결실 후보를 확인하는데 사용되는 하나의 방법은 두 이콜라이 균주를 비교하는 것 및 두 균주 상에 존재하지 않는 유전자 또는 다른 DNA 서열을 선택하는 것이다. 이들 유전자 및 다른 DNA 서열의 대다수가 기능적으로 필수적이지는 않지만, 그들 중 몇몇은 고유한 균주에 대해 중요할 수 있다. 결실 후보를 확인하는데 사용되는 다른 방법은 전사되지 않는 영역 및 유전자의 안정성에 중요할 수 있는 임의의 전사되지 않는 영역에 존재하는 가능성을 확인하는 것이다.

1 또는 수개의 유전자 또는 다른 DNA 서열을 결실의 결과가 적용예의 목적에 좌우되어 시험되어야 한다. 예컨대, 많은 적용예에서 사실인 것인 높은 제조 효율이 주된 관심일 때, 증식율 및 배지 소비율에 대한 효과가 시험되는 결과일 수 있다. 이 경우에, 중요하게 시험되는 것은 또한 특정 생성물의 생성 속도량 및 세포당 수율에 더 특이적일 수 있다. 천연 단백질 불순물을 제거하는 것이 주된 관심일 때, 더 적은 천연 단백질 및 더 낮은 천연 단백질 수준, 또는 특정 천연 단백질의 부재가 시험되는 결과일 수 있다.

유전자 또는 그 DNA 서열에 대해 거의 알려진 것이 없을 때 유전자 또는 다른 DNA 서열을 결실시키는 것의 결과를 시험하는 것이 중요하다. 비록 수고스럽지만, 이것이, 감소된 게놈을 갖는 박테리아를 만드는데 결실 후보를 확인하는 다른 가능한 방법이다. 다른 방법에 의해 확인된 후보가 결실되었거나 그리고 추가의 후보를 찾아야 하는 때에 이 방법이 특히 유용하다.

조건의 하나의 세트하에서 유전자 또는 다른 DNA 서열을 결실의 결과가 박테리아의 생존 가능성에 대해 영향이 있을 때, 특정 유전자 또는 다른 DNA 서열을 결 실시키지 않기 위한 하나의 대안은 유해한 영향이 경감될 수 있는 방안이 있는지 결정하는 것이다. 예컨대, 만약, 리포폴리사카라이드 (LPS) 유전자를 결실시키는 것이 세포막으로부터 LPS 단백질의 막통과 도메인의 부재에 의해 유발된 더 다공성인 세포막으로 인하여 낮은 생존을 유발하게 된다면, LPS 유전자가 결여된 박테리아는 LPS 유전자를 운반하는 박테리아만큼 생존할 수 있도록 더 다공성의 세포막에 적응하여 배양 조건이 변화될 수 있다.

본 기술 분야에서 당업자에게 공지된 박테리아 게놈으로부터 DNA 서열의 결실 방법이 감소된 게놈을 갖는 박테리아를 제조하는데 사용될 수 있다. 이들 방법의 예는 Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997), Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27: 1555-1557 (1999), Datsenko, K. A. et al., Proc. Natal. Acad. Sci. 97: 6640-6649 (2000) 및 Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)에 기재된 것을 포함하지만 이것만으로 한정되지 않으며, 모두 그 전문이 본원에서 참고문헌으로 인용되었다. 기본적으로, 결실 방법은 선형 DNA에 기초한 것 및 자살 플라스미드에 기초한 것으로 분류될 수 있다. Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27: 1555-1557 (1999) 및 Datsenko, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6640-6649 (2000)에 개시된 방법은 선형 DNA에 기초한 방법이며, Posfai, G. et al., J Bacteriol. 179: 4426- 4428 (1997) 및 Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)에 개시된 방법은 자살 플라스미드에 기초한 방법이다.

박테리아 게놈으로부터 DNA 서열을 결실시키는 몇가지 공지된 방법은, 어떤 방법이라도 박테리아에서 1회 이상 사용된다면, 결실 과정 동안 외인성 DNA 서열을 유전자 내로 도입시키며 따라서 목적하지 않는 이종성 재조합의 잠재적 문제점을 발생시킨다. 이 문제를 피하기 위해, 스카없는 결실 방법이 바람직하다. 스카없는 결실에 의해, 결실에서 어떤 돌연변이 없이 그리고 그 생명체의 게놈에서 어떤 삽입된 DNA를 남기지 않고 게놈으로부터 DNA 서열이 정밀하게 결실되는 것을 의미한다. 그렇지만, PCR 증폭 및 DNA 보수 과정에서 만들어진 것과 같은 실수에 의해, 스카없는 결실에 1 또는 2개의 뉴클레오티드 변화가 때때로 도입될 수 있다. 후술하는 것은 선형 DNA에 기초한 또는 자살 플라스미드에 기초한 신규한 스카없는 결실 방법이다. 이들 신규한 방법이 후술하는 실시예에서 이콜라이 균주에 적용되었다. 실시예에서 이콜라이 균주에 사용된 특정 벡터 및 조건이 다른 박테리아에 사용하기 위하여 본 기술 분야에서 당업자에게 받아들여질 수 있다. 고등 생명체에서 유사한 효과에 대해 유사한 방법 및 플라스미드가 사용될 수 있다. 어떤 경우에서는 최소화된 게놈 이콜라이 균주에 대한 운반 제조 보다는 기존 제조 균주를 변형하는 것이 더 적당할 수 있다.

본 발명의 방법은 박테리아의 게놈을 감소시키는데 사용하는 것으로 제한되지 않으며, 예컨대, P1, P2, 람다(lambda)와 같은 박테리오파지 및 다른 박테리오파지로부터 DNA를 결실시키는데 본 방법이 사용될 수 있다. 다양한 목적상 그들의 유용한 성질을 개선시키기 위해 및/또는 그런 박테리오파지의 사용을 손상시키는 임의의 성질을 감소시키거나 또는 제거하기 위해, 그런 방법은 박테리오파지 게놈의 조작을 허용한다. 유사하게, 해로운 성분(예컨대, 독성 유전자)을 플라스미드로 부터 제거하기 위해 박테리아에 거주하는 플라스미드를 변형시키는데 및 플라스미드의 다른 유용한 성질을 개선시키는데 본 발명의 방법이 유용하다.

수용체 이콜라이 내로 DNA의 조각을 형질도입하는 것에 대해 잘 알려진 일반화된 형질도입 박테리오파지 P1이 전술되었다. 그렇지만, 형질도입을 위한 P1의 임의의 유전자 특성, 게놈 DNA를 들어올리고 포장하는 능력이 궁극적으로 제한된다. 특히, P1의 포장 영역 (pac)은, P1의 dam 메틸라제에 의해 메틸화될 때 파지 코우트(coat) 내의 유전자 DNA의 양을 제한하는 GATC 풍부 영역이다. 그렇지만 포장 영역의 dam 관련 메틸화가 부재하는 경우, DNA의 포장은 "엉성하게(sloppy)" 되고, 즉, 포장 영역이 메틸화되는 경우보다 게놈 DNA의 분율을 더 용이하게 포장한다. 따라서, 본 발명의 결실 방법을 사용하여 dam 유전자를 제거하도록 P1 게놈을 조작하는 것이 유리할 것이며 그럼에 의해 게놈 물질을 들어올리고 포장하는 능력이 향상된다.

P1 형질도입의 사용과 관련된 다른 단점은 파지가 두 삽입 서열을 운반한다는 것이다. 삽입 서열상에서, P1 유전자의 ssb와 prt 장소 사이에서 IS1이 발견되었다. 다른, res 유전자에서 IS5가 발견되었다. 결과적으로, 형질도입에서 P1이 사용될 때, 1 이상의 삽입 서열이 그 생명체의 게놈 장소 내로 점프할 수 있다는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 IS 서열을 제거하는데 P1 게놈을 조작하는 것이 유리할 것이며 그럼에 의해 P1이 형질도입물로 사용되는 경우보다 게놈 오염이 방지된다 .

상기 설명에서, 특정 실시예와 관련하여 본 발명이 기재되었다. 이들 실시예 로 본 발명이 제한되는 것이 아니고, 첨부된 청구항에 의해 정의된 취지 및 범위에 의해 확장되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 구체예는 감소된 게놈을 갖는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)이다. 최근, 쉬겔라 플렉스네리 2a 균주 2457T의 전체 게놈 서열이 결정되었다. (서열화된 균주는 American Type Culture Collection에, 접수 번호 ATCC 700930로 재기탁되었다.) 쉬겔라 플렉스네리의 게놈은 G＋C 함량 50.9%의 4,599,354 염기쌍 (bp)의 단일-고리형 염색체로 구성된다. 박테리아가 광범위한 상동성(homology)을 보이기 때문에 염색체의 1 염기쌍이 이콜라이 K-12의 염기쌍 하나와 대응하는 것으로 할당된다. 유전자는 평균 크기 873 염기쌍을 갖는 약 4082 추측된 유전자로 보여진다. 쉬겔라 플렉스네리 게놈은 수평적으로 운반되는 DNA가 훨씬 더 적고 그리고 E.coli에 존재하는 357 유전자가 결여됨에도 불구하고 이콜라이 병원체의 백본 및 아일랜드 모자이크 구조를 나타낸다. (Perna et al., (2001) Nature, 409: 529-533 참조). 생명체는 그것의 거대한 삽입 서열의 보체, 몇몇 유전자 재배열, 12 은닉 프로파지, 372 슈도 유전자, 및 195 Shigella 특이 유전자가 특징적이다. 본원에서 참고문헌으로 인용된 첨부된 S. flexneri의 완전 서열이 GenBank에 접수 번호 AE014073으로 기탁되었다. (또한 "Complete Genome Sequence and Comparative Genomics of Shigella flexneri Serotype 2A 균주 2457T", Wei et al., (출판중) 참조.) 그것의 DNA 서열에 기초하여, Shigella가 계통발생학적으로 이콜라이로부터 구별할 수 없다는 것은 놀라운 일이다.

쉬겔라 플렉스네리 서열을 갖는 것으로 본 개시로부터 용이하게 드러난 바와 같이, 그것의 게놈은 본원에 기재된 방법 및 유전자 선택 패러다임을 사용하여 용이하게 감소될 수 있다. 감소된 게놈 이콜라이 (생백신)에 관해서 본원에 기재된 것을 이유로 감소된 게놈 쉬겔라는 이질체 (재조합) 단백질 또는 다른 유용한 영양분의 발현에 유용할 수 있다. 본 발명의 결실 방법에 민감한 감소된 게놈 쉬겔라 또는 어떤 병원성 박테리아 물질에 대한 다른 용도는 숙주로부터 면역 반응을 유도하는 목적에 대한 항원의 표시 또는 표현을 위한 비이클(vehicle)이다. 그런 조작된 쉬겔라는, 숙주에서 면역 반응 및 바람직하게는 숙주의 장관벽에서 점막성 면역 반응을 유도하기에 충분한 항원 결정자를 코딩하는 것과 같은 다른 유전자를 유지하는 반면, 예컨대, 생명체로부터 결실된 독소에 대응하는 유전자를 가질 수 있다.

쉬겔라 플렉스네리는, 그것의 뉴클레오티드 서열이 결정되었으며 본원에서 참고문헌으로 인용된 것으로서 접수 번호 AF348706로 GenBank에 기탁된 210-kb "대형 독소 (또는 침입) 플라스미드"로 그것의 독소 결정자가 특징지워지며 한정되는 것에 대한 이 전략에 잠재적으로 잘 부응한다. (또한 Venkatesan et al. Infection of lmmunity (May 2001) 3271-3285 참조). 침입 플라스미드로부터 결실될 후보 중에서 라이신 탈탄산효소(decarboxylase)를 코딩하는 cadA 유전자가 있다.

결실된 쉬겔라 침입 플라스미드는 감소된 게놈 이콜라이 내로 도입될 수 있으며, 그럼에 의해 이콜라이로 접종된 숙주에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 쉬겔라 침입 플라스미드 유전자의 충분한 발현을 허용하게 된다. 침입 플라스미드는 또한 플라스미드로부터 액포 파열에 대응하는 유전자와 같은 해로운 유전자를 결실시키도록 조작될 수 있다. 침입 플라스미드로부터 제거될 바람직한 후보 유전자는 ipaA, ipaB, ipaC, ipaD 및 virB로 구성되는 군으로부터 선택된 1 이상의 유전자를 포함한다. 본 발명은 또한, 그 안에 도입되고, 변형된 침입성 플라스미드로부터 침입 플라스미드가 유전자의 발현을 최적화하기 위해 도입된, 감소된 게놈 이콜라이에 대해 다른 유전자의 첨가를 허용한다.

본 발명은 또한, 예컨대, 감소된 게놈 이콜라이, 또는, 예컨대, 백신으로 접종되었던 숙주에 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 유전자를 내부에 포함하는 감소된 게놈 이콜라이를 포함하는 생백신에 관한 것이다. 감소된 게놈 백신은 숙주에서 목적하는 생리학적 반응 (즉, 면역 반응)을 유도할 수 있는 것으로 알려진 DNA를 포함하는, DNA를 주성분으로 한 백신일 수 있다.

본 발명에 따른 감소된 게놈 생명체의 중요한 장점 중 하나는, 목적하는 분자의 발현을 허용하는 것 뿐 아니라, 또한 목적하는 생성물의 발현을 최적화할 수 있는 분자의 공급원을 제공하기 위해 흠이 없는 바탕 내로 추가 DNA를 도입하기 위한 기회를 제공하도록 DNA가 도입될 수 있는 흠이 없는, 최소한의 유전자적 바탕을 제공하는 것이다.

결실 방법

선형 타겟 DNA의 구축

선형 타겟 DNA의 구축에 대한 실시예는 다음과 같다: 프라이머 a＋b (도 1)를 제조하기 위해, 20pmol의 프라이머 a를 20pmol의 프라이머 b와 혼합하고 그리고 총부피 50㎕에서 PCR을 수행하였다. 사이클 파라미터는 다음과 같다: 15 ×(94℃ 40초/57℃ 또는 그 이하 [프라이머 a와 b 사이의 중복량에 좌우됨] 40초/72℃ 15초). 다음 이 PCT 생성물 1㎕를 각각 20 pmol의 프라이머 a 및 c (도 1), 및 50ng의 pSG76-CS 주형과 혼합하며, 부피 2 ×50㎕에서 PCT 제2라운드가 수행되었다. 사이클 파라미터는 다음과 같다: 28 ×(94℃ 40초/57℃ 40초/72℃ 80초). 결과적으로, PCR-제조된 선형 DNA-단편을 Promega Wizard PCT 정제 키트로 정제하였으며, 20㎕ 물에 현탁시켰다. 주형 플라스미드의 제거 (예컨대, DpnI 소화에 의한)는 불필요하다. PCT에 의한 선형 타겟 단편을 제조하는데 pSG76-CS가 주형 플라스미드로 작용하였다. 그것은 클로람페니콜 내성(Cm^R) 유전자 및 두 I-Sce I 부위를 포함하며, 두번째 I-Sce I 부위의 PCT-매개 삽입에 의해 얻어지며, 그리고 NotI 영역 하부의 pSG76-C 내로 두번째 I-Sce I 인식 부위의 PCT-매개 삽입에 의해 얻어진다. 두 I-Sce I 부위는 반대 방향이다.

선형 DNA에 기초한 스카없는 신규한 결실 방법 I

본 발명의 신규한 DNA에 기초한 스카없는 결실 방법은 도 2의 관점에서 다음의 설명이 읽혀질 때 최선으로 이해될 수 있다. 일반적으로 말하면, 그 방법은, 결실될 것으로 마킹된 유전자의 조각을 인공 DNA 서열로 치환하는 것을 포함한다. 인공 서열은 I-Sce I와 같은 서열-특이적 뉴클레아제에 대한 1 이상의 인식 부위를 포함하며, 그것은 E.coli K-12 게놈에 본래 어느 곳에서도 발생하지 않는 서열을 절단한다. 유전자 내로 선형 DNA 분자의 정밀한 삽입은 상동성 재조합의 빈도를 증가시킬 수 있는 시스템에 의한 도움으로 상동성 재조합에 의해 달성된다. 서열-특이적 뉴클레아제가 박테리아 내로 도입될 때, 그것은 단독 인식 부위 또는 부위들에서 게놈 DNA를 절단하며, 상동성 재조합 이벤트가 발생하는 단지 그런 박테리아만이 생존할 것이다.

도 2에 대해서 구체적으로 언급하면, 인공 DNA 삽입물에 대한 주형으로서 플라스미드 pSG76-CS가 사용되었다. 인공 삽입 서열은 도 2에서 A, B 및 C로 표시되는 서열 사이로 확장된다. C^R은 항생제 내성에 대한 유전자를 의미한다. 삽입물 DNA는 플라스미드로부터 PCR 증폭되며 이콜라이 숙주 내로 전기천공된다(electroporated). 서열 A와 B가 계획된 결실이 걸려 있는 숙주의 유전자에서 서열이 일치되도록 삽입물이 구축된다. 삽입물 서열 C는 숙주 유전자의 서열 B 내에서 숙주 유전자의 서열과 정확히 일치된다. 이후, 박테리아 게놈 내로 인공 DNA가 삽입되는 상동성 재조합 이벤트가 발생하는 그런 박테리아에 의해서만 생존되게 되는 선택으로, 항생제 내성에 대해 박테리아가 선택된다. 이 재조합 이벤트는 서열 A와 C의 쌍 사이에서 발생한다. 삽입된 DNA 서열은 또한 이제 삽입물의 하나의 말단에 위치한 서열 B를 포함하며, 도 2에 도시된 바와 같이, 그것은 삽입물의 다른 말단의 바로 바깥쪽 게놈에서 서열에 대해 상동성이 되도록 디자인된다. 이후, 박테리아의 성장 후, 박테리아는 I-SceI 서열-특이적 뉴클레아제를 발현하는 플라스미드, pSTKST로 형질전환된다. I-SceI 효소가 박테리아의 유전자를 절단하며, 재조합 이벤트가 발생하는 단지 그런 개체만이 생존할 것이다. 생존자의 10-100%가 B 내지 B 재조합 생존자이며, 그것은 스크리닝(screening) 단계에 의해 확인될 수 있다. B 내지 B 재조합 이벤트는, 결실 주변에 본래 서열 외에는 아무것도 남기지 않으면서, 게놈으로부터 전체 삽입된 DNA를 결실시킨다.

반복하면, 본 방법의 첫번째 단계는 박테리아에 선형 DNA 분자를 제공하는 것을 포함한다. 선형 DNA 분자는 다음과 같은 특징을 갖는 인공 선형 DNA 서열을 포함한다: 선형 DNA 서열의 하나의 말단이 결실되는 게놈 영역의 왼쪽 측면(flank) 상에 게놈 서열과 동일한 서열이며, 결실되는 게놈 영역의 오른쪽 측면 상에 게놈 서열과 동일한 서열이 뒤따른다; 선형 DNA 분자의 나머지 말단은 결실되는 게놈 영역 내의 게놈 서열과 동일한 서열이다; 선형 DNA의 두 말단 사이에는, 박테리아 균주의 게놈 및 항생제 선택 유전자에서 존재하지 않는 인식 부위가 있다. 인공 DNA 서열은 폴리머라제 체인 반응 (PCR) 또는 직접 DNA 합성을 이용하여 제조될 수 있다. 이 목적을 위한 PCR 주형은 단독 인식 부위를 포함하며 그리고 인공 선형 DNA 서열의 두 말단 상의 게놈 DNA 서열은 PCR 반응에 사용되는 프라이머의 일부이다. PCR 주형은 플라스미드에 의해 제공될 수 있다. 주형으로 사용될 수 있는 플라스미드의 예는 pSG76-C (GenBank 접수 번호 Y09893)이며, Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)에 기재되었다. pSG76-C로부터 유도된 pSG76-CS (GenBank 접수 번호 AF402780)도 또한 사용될 수 있다. pSG76-CS은 클로람페니콜 내성 (Cm^R) 유전자 및 두 I-SceI 부위를 포함하며, 그리고 두번째 I-SceI 인식 부위를 NotI 부위의 하부인 pSG76-C 내로 PCR-매개 삽입함으로써 얻어진다. 두 I-SceI 부위는 반대 방향이다.

직접 선형 DNA 분자를 박테리아 내로 도입하는 전기천공과 같은 본 기술분야에서 당업자에게 공지된 어떤 방법을 사용하여 인공 또는 구축된 DNA 서열이 박테리아 내로 제공될 수 있다. 이 경우에, 삽입된 DNA 서열을 뒤에 포함하는 콜로니를 선택하기 위한 목적상 항생제 내성 유전자와 같은 선택 마커가 인공 DNA 서열 내로 조작된다. 대안적으로, 인공 선형 DNA 서열을 운반하는 벡터로 박테리아를 형질전환시킴으로써 및 제한 효소 절단을 통해 박테리아 내에서 선형 DNA 분자를 제조함으로써 선형 DNA 분자가 박테리아에 제공될 수 있다. 사용되는 제한 효소는 단지 벡터 상에서만 절단하지만 박테리아 게놈은 그러하지 아니하다. 이 경우에, 삽입된 선형 DNA를 갖는 박테리아가 후에 직접 PCR에 의해 스크리닝될 수 있기 위한 벡터의 더 높은 형질전환 효율 때문에, 인공 선형 DNA 서열은 선택 마커를 운반하지 않는다.

스카없는 결실의 제2단계는 인공 DNA 분자의 삽입에 의한 게놈 영역의 치환을 포함한다. 상동성 재조합의 빈도를 증가시키는 시스템을 포함하도록 박테리아 세포가 조작된다. 그런 시스템의 예는 Red 재조합효소(recombinase) 시스템이다. 그 시스템은 벡터에 의해 박테리아 세포 내로 도입될 수 있다. 그 시스템은 결실 타겟을 포함하는 게놈 영역을 치환하도록 선형 DNA 분자를 돕는다. 이하의 실시예에 기재한 바와 같이, 이콜라이에 사용될 수 있는 동일성 재조합 시스템을 운반하는 벡터가 pBADαβγ이며, 이는 Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27: 1555-1557 (1999)에 기재되었다. Datsenko, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6640-6649 (2000)에 기재된 다른 플라스미드 pKD46도 또한 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 플라스미드는 pGPXX 및 pJGXX를 포함한다. pGPXX는 pBADαβγ에서 복제 개시점을 pSC101 복제 개시점으로 치환함으로써 pBADαβγ로부터 유도된다. pJGXX는, tet 프로모터 제어하에서 파지 933W로부터 Red 기능을 코딩하는 pSC101 플라스미드이다

스카없는 결실 방법의 제3단계는 삽입된 DNA 서열의 제거를 포함한다. 삽입된 DNA 서열 상에서 단독 인식 부위를 인식하는 I-SceI와 같은 서열-특이적 뉴클레아제에 대한 발현 벡터가 박테리아 내로 도입된다. 서열-특이적 뉴클레아제가 이후 발현되며 박테리아 게놈이 절단된다. 절단 이후, 삽입된 선형 DNA 분자의 결실의 결과로서 상동성 재조합이 발생하는 단지 그런 세포만이 생존할 수 있다. 따라서, 게놈으로부터 결실된 타겟 DNA 서열을 갖는 박테리아가 얻어진다. 이콜라이에 사용될 수 있는 서열-특이적 뉴클레아제 발현 벡터의 예는 pKSUC1, pKSUC5, pSTKST, pSTAST, pKTSHa, pKTSHc, pBADSce1 및 pBADSce2를 포함한다. 이들 벡터에 의해 운반되는 서열-특이적 뉴클레아제는 I-SceI이다. pKSUC1 ,pKSUC5, pSTKST 및 pSTAST가 이하의 실시예에 기재되어 있다.

전술된 방법은 박테리아에서 일련의 결실을 얻기 위해 반복적으로 사용될 수 있다. pBADαβγ 및 pKSUC1에 대한 경우에서와 같이, 상동성 재조합 시스템에 대한 발현 벡터 및 단독 서열-특이적 뉴클레아제에 대한 발현 벡터가 서로 양립할 수 없는 때, 두 벡터의 형질전환은 각각의 결실 사이클에서 수행되어야 한다. 두 벡터의 형질전환은, 양립할 수 있는 두 플라스미드, 예컨대 pBADαβγ 및 pSTKST, 또는 pKD46 및 pKSUC5가 사용될 때, 추가적 결실 사이클을 피할 수 있다. 서로 양립 할 수 있는 이들 두 벡터의 사용의 예는 이하의 실시예에 기재되었다.

상기 스카없는 결실 방법은 박테리아 게놈 상에 일련의 결실을 더 효율적으로 만들기 위해 변형될 수 있다 (이것의 예는 이하의 실시예에서 방법 4이다). 변형된 방법의 제1단계는 박테리아 세포, 바람직하게는 야생형 박테리아 세포에서, 각각 하나의 삽입을 운반하는, 제조된 한 세트의 균주과 나란한 경향으로, 개별적으로 선형 DNA 분자의 삽입물을 제조하는 것을 포함한다. 이 단계는 후술하는 바와 같이 수행될 수 있다. 변형된 방법의 제2단계는 그것의 유전자가 감소되어야 하는 타겟 세포 내로 개별 삽입물을 순차적으로 전달시키는 것을 포함한다. PI 형질전이는 삽입물을 전달하는데 사용될 수 있는 방법의 예이다. 변형된 방법의 제3단계는 삽입된 서열의 재조합적인 제거를 포함하며, 후술하는 바와 같이 수행될 수 있다.

선형 DNA에 기초한 스카없는 신규한 결실 방법 II

이 신규한 선형 DNA에 기초한 방법에서, 하나는 결실되는 박테리아 게놈 영역의 하나의 말단의 측면 위치 서열과 동일하고 그리고 나머지 하나는 박테리아 게놈 영역의 나머지 말단의 측면 위치 서열과 동일하며 그리고 동일한 방향성인, 두 DNA 서열이 플라스미드 벡터 내로 조작된다. 본원에서 용어 벡터는 타겟 벡터이다. 두 DNA 서열은 타겟 벡터 상에 서로 옆에 위치한다. 단지 타겟 벡터만을 절단하지만 박테리아 게놈은 그렇지 않은 효소에 대한 1 이상의 인식 부위가 또한 타겟 벡터 내로 두 DNA 서열의 바깥쪽 위치에서 조작된다. 인식 부위는 I-SceI와 같은 서열-특이적 뉴클레아제에 대한 부위일 수 있다. 인식 부위는 또한 메틸화되지 않은 서열만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 효소에 대한 부위일 수 있다. 만약 가능하다면, 박테리아 게놈 상에 인식 부위가 메틸화되었기 때문에, 제한 효소는 단지 타겟 벡터만을 절단할 수 있다. 박테리아 및 선형 DNA 분자 내로 형질전환되는 타겟 벡터는 타겟 벡터 상에서 인식 부위를 인식하고 절단하는 효소를 박테리아에서 발현함으로써 박테리아 내에서 제조된다. 다음, 결실될 영역의 측면 위치 박테리아 게놈와 선형 DNA 사이의 상동성 서열로 상동성 재조합을 유도하도록 상동성 재조합을 증가시킬 수 있는 시스템이 박테리아 내에서 활성화된다. 상기 상동성 재조합의 결과로서 결실되는 타겟 게놈 영역을 갖는 박테리아가 얻어질 수 있다.

이 신규한 선형 DNA에 기초한 방법은 또한 목적하는 DNA 서열을 갖는 박테리아 게놈 영역을 치환하는데 사용될 수 있다. 이 경우에, 게놈 상에서 영역을 치환하도록 박테리아 게놈으로 상동성 재조합을 수행할 수 있는 목적하는 DNA 서열이 타겟 벡터 내로 조작된다. 다른 모든 양태는 전술한 박테리아 게놈의 영역을 결실시키는 것과 동일하다.

박테리아 게놈에서 타겟 영역을 결실시키거나 치환하는데 비록 본 방법이 사용되지만, 박테리아 게놈 내로 타겟 벡터 상에서 운반되는 DNA의 도입을 선택하기 위한 마커 유전자는 높은 도입 효율에 있어서 불필요하다. 간단히 PCR에 의한 30-100 콜로니의 스크리닝은 박테리아 게놈에서 목적하는 변형을 갖는 클론의 확인을 일반적으로 허용한다.

특정 실시예로서, 도 3 및 4는 유전자의 중앙에서 Amber 스탑 코돈 도입에 대해 이 방법을 사용한 것을 예시한다. 제1단계로서, 유전자 또는 염색체 영역의 중앙 근처에 위치한 목적하는 변형을 갖는 DNA 단편이 제조된다. 서열-특이적 뉴클레아제 I-SceI 인식 부위가 DNA 단편의 한쪽 면으로 도입된다. DNA 단편을 증폭시키는데 사용되는 PCR 프라이머의 5' 말단에 그 서열을 포함시킴으로써 이는 용이하게 수행될 수 있다. 더 긴 DNA 단편 (500-5,000 뉴클레오티드)이 일반적으로 최선으로 작동한다.

DNA 단편이 pUC19 (GenBank 접수 번호 M77789)와 같은 멀티-카피 타겟 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 이 타겟 벡터가 후술하는 바와 같이 돌연변이 유도 벡터를 따라 사용되기 때문에, pl5A 개시점 플라스미드 (pACYC 184-유도 (GenBank 접수 번호 X06403)와 양립가능하도록 그리고 클로람페니콜이 아닌 약물 내성을 갖도록 타겟 벡터가 조작된다. 다른 돌연변이 플라스미드를 사용함으로써 이들 제한은 용이하게 피할 수 있다.

도 4에 예시된 바와 같이, 본 실시예에 사용된 돌연변이 유도 플라스미드는 P-BAD 프로모터의 제어하에서 서열-특이적 뉴클레아제 I-SceI 및 람다(lambda) red 유전자 exo, beta 및 gam을 포함한다. 플라스미드는 또한 pl5Aori 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함한다.

타겟 및 돌연변이 유도 플라스미드가 recA 파지티브 이콜라이 내로 형질전환된다. 클로람페니콜에 대한 내성을 갖도록 박테리아가 선택되며 그리고 그 내성은 타겟 플라스미드 상에서 전달된다. 이후 단일 콜로니가 선택되고 0.2% 아라비노즈 및 클로람페니콜을 포함하는 1 ml의 영양분이 정의된 배지에서 37℃에서 약 7.0시간 동안 배양되었다 (Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119: 736-47, 본원에서 그것의 전문이 참고문헌으로 인용됨). 이후 배양물의 일련의 희석물 (예컨대, 1:1,000, 1:10,000 등등)이 LB와 같은 비선택적 배지상에 플레이팅되었다. 다음, 목적하는 돌연변이에 대해 콜로니를 스크리닝하였다. 만약 성장 표현형이 공지되었다면, 스크리닝은 적절한 배지 상에서 패칭(patching)시킴으로써 수행될 수 있다. 반면, 콜로니 PCR로 스크리닝이 수행되며, 제한 소화 및 전기영동 또는 시퀀싱이 이어진다.

자살 플라스미드에 기초한 방법

여기 기재된 자살 플라스미드에 기초한 방법은 스카없는 결실 및 유전자 치환 모두에 사용될 수 있다. 이 방법의 기본 성분은 프로모터의 제어하에서 항생제 내성 유전자 및 복제 개시점을 포함하는 Interlock 플라스미드로 명명된 플라스미드 벡터를 포함한다. Interlock 플라스미드는 또한 삽입될 수 있는 DNA 삽입물에 1 이상의 영역을 포함한다. 본 방법이 스카없는 결실에 사용될 때, DNA 삽입물은 유사한 방향으로, 서로 다음 오른쪽에 위치하는 두 DNA 서열을 포함하며, 그 중 하나는 결실되는 박테리아 게놈의 하나의 말단의 측면 위치 서열과 동일하며 그리고 나머지 하나는 박테리아 게놈 영역의 나머지 말단의 측면 위치 서열과 동일하다. 이 방법이 유전자 치환에 사용될 때, DNA 삽입물은 박테리아 게놈의 조각을 치환하게 되는 서열을 포함한다. 복제 개시점을 조절하는 프로모터가 작동되지 않을때, 플라스미드의 복제가 정지되며 그리고 측면 영역의 부위에서 염색체 삽입을 위해 선택하는데 항생제 작용이 사용될 수 있다. 측면 영역의 부위에서 염색체의 삽입 이후, 플라스미드로부터 복제 개시점을 제어하는 프로모터가 작동할 수 있으며 그리고 상기 복제 개시점, 그것의 프로모터 또는 둘을 제거하도록 재조합 이벤트가 발생하는 그런 박테리아만이 생존할 수 있다. DNA 삽입이 스카없는 결실을 제조하기 위한 경우, 어떤 삽입 이전에 목적하는 스카없는 결실 또는 동일한 게놈을 갖는 박테리아에서 일체화된 삽입물과 게놈에서 대응하는 영역 사이의 재조합이 일어날 것이다. DNA 삽입이 유전자 치환을 위한 경우, 어떤 삽입 이전에 목적하는 치환 또는 동일한 게놈을 갖는 박테리아에서 재조합이 일어날 것이다. 유전자에서 목적하는 변형이 된 그런 박테리아를 동정하기 위한 스크리닝 단계가 이후 수행될 수 있다.

상기 방법의 변형예는 박테리아 게놈에서 서열-특이적 뉴클레아제 인식 영역이 결핍된 것을 또한 포함하는 플라스미드를 제외하고는 동일한 Interlock 플라스미드를 포함한다. 염색체 삽입 이후, 복제 개시점의 활성화로 재조합 이벤트를 선택하기 위한 프로모터를 제어하는 대신, 박테리아 게놈을 절단하고 재조합 이벤트를 선택하는 서열-특이적 뉴클레아제를 발현하도록 박테리아가 조작된다.

자살 플라스미드에 기초한 방법은 또한 박테리아 게놈 상에서 일련의 결실을 제조하기 위한 선형 DNA에 기초한 신규한 방법에서와 유사한 경향으로 반복적으로 사용될 수 있다.

도 6은 자살 플라스미드에 기초한 방법에 사용될 수 있는 플라스미드 구체예를 보여준다. pIL1은 Interlock 플라스미드이고 pBAD-Sce-1은 서열-특이적 뉴클레아제 I-SceI을 발현하기 위한 플라스미드이다. pIL4는 둘의 조합이다. pIL1 및 pIL4에 사용된 tet 프로모터는 엄격하게 조절되며 따라서 더 연약한 온도 민감성 성분과 같은 다른 제어 메카니즘에 비해 유리하다. 본 발명의 자살 플라스미드에 기초한 방법을 예시하기 위해 유전자 치환에 대해 pIL4를 사용하는 실시예를 도 5A-C에 보였다. 도 5A는 pIL4 내로의 DNA 삽입물의 삽입 및 박테리아 게놈 내로의 pIL4의 삽입을 보여준다. 열 활성화 클로로테트라사이클린 (CTC), tet 리프레서는 불활성이며, O 및 P 프로모터가 작용하며, 그리고 플라스미드가 복제된다. CTC를 제거한 이후, tet 리프레서가 O 프로모터에 결합되며 그리고 P 프로모터 및 복제가 차단된다. 클로람페니콜 내성이 삽입물(integrant)을 선택하는데 사용될 수 있다. 도 5B는 상동성 재조합 및 상동성 재조합의 두 가능한 성과를 선택하는데 있어 이소성 개시점의 도입을 사용한 것을 보여준다. 도 5C는 상동성 재조합 및 재조합의 두 가능한 성과에 대해 선택하는 대안의 방식을 보여준다. 이 대안의 방식은 이중-스트랜드 브레이크(double-strand break)를 제조하기 위해 I-SceI 발현을 유도하는 것을 포함한다.

자살 플라스미드에 기초한 방법의 두 특정 구체예가 이하에 프로토콜 1과 2로서 기재되었다. pIL1 또는 pIL4가 프로토콜 1에 사용될 수 있으며, pBAD-Sce-1과 조합된 pIL1이 프로토콜 2에 사용될 수 있다. 본 기술분야에서 당업자는 pIL4 를 단독으로 사용하여 프로토콜 2를 또한 적용할 수 있다.

프로토콜 1 (람다 개시점을 이용한 카운터 선택(Counterselection)):

1. 선형 DNA 단편으로서 목적하는 게놈 변이를 제조한다. Amber 돌연변이체를 제조하는 경우, 메가프라이머 PCR에 의해 변이가 이루어질 수 있다. 게놈에서 결실을 제조하기 위해, 결실의 목적하는 종말점의 융합이 사용되어야 한다. DNA 단 편의 말단은 클로닝을 위해 인산화되어야 한다.

2. 제한 효소 Srfl으로 pIL4 벡터를 소화시킴으로써 블런트 클로닝 영역을 제조한다 (도 5A 및 6) . 벡터를 탈인산화한다.

3. 목적하는 변이 및 pIL4 벡터의 블런트 결찰(ligation)을 수행한다.

4. (노트: 본 단계는 대규모 실행에서는 잠재적으로 없어도 됨.) 이콜라이 (예컨대 JS5)의 클로닝 균주 내로 결찰된 것을 형질전환시킨다. LB ＋ 1 ㎍/ml cTc에서 1시간 동안 형질전환을 진행시킨다. (LB 배지에서 깨끗하게 오토클레이브된 cTc-클로르테트라사이클린. 스탁 100 ㎍/ml를 20분 동안 오토클레이브시키며 이후 4℃의 어두운 곳에서 보관한다. 5일 이내에 사용될 수 있다. 대안적으로, 2 ng/ml의 무수 테트라사이클린의 용액이 치환될 수 있다). 이후 LB + 클로람페니콜 (Cam 25 ㎍/ml) + cTc (1 ㎍/ml) 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 진행시킨다. 균등 배지에서 콜로니를 성장시키고 플라스미드 미니프렙 DNA를 제조한다. 젤 전기영동에 의해 분석하고 삽입물이 있는 클론을 선택한다.

5. 이콜라이의 recA 양성 균주 (예컨대 MG1655) 내로 확인된 플라스미드를 형질전환시킨다. 1시간 동안 LB + 1 ㎍/ml cTc에서 진행시킨다. Cam 및 1 ㎍/ml cTc를 포함하는 플레이트 상에 진행된 일부를 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 성장시킨다.

6. 콜로니를 1 ml LB 내로 들어올리고 Cam 플레이트 상에 10㎕를 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 성장시킨다.

7. 모든 세포가 일체화된 플라스미드를 함유하는 것을 확인하기 위해 Cam 플 레이트 상에 콜로니를 스트리킹한다. 37℃에서 밤새 성장시킨다.

8. 콜로니를 1 ml LB 내로 들어올리고 그리고 5 ㎍/ml cTc를 함유하는 플레이트 상에서 1:100 희석물 100 ㎕을 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 성장시킨다.

9. (돌연변이체에 대한 스크리닝) 카운터 선택된 콜로니의 단지 한 분율만이 목적하는 변이를 포함할 것이며 나머지는 wt로 복귀될 것이다. 돌연변이체의 복귀돌연변이체(revertant)에 대한 비율은 클로닝된 단편에서 변이의 위치에 좌우될 것이다. 목적하는 돌연변이체를 확인하기 위해 스크리닝의 몇몇 종류가 수행되어야 한다. Amber 돌연변이체의 제조를 위해, 문제가 되는 유전자는 PCR에 의해 증폭될 수 있으며 BfaI 제한 효소로 소화될 수 있다 (BfaI가 'C'로 표기된 Amber 코돈을 절단한다).

프로토콜 2 (I.Scel로 대규모의 카운터 선택):

1-4. 프로토콜 1과 동일.

5. 이콜라이의 recA 양성 균주 (예컨대 MG 1655) 내로 삽입물을 운반하는 Interlock 플라스미드 및 pBAD-Scel을 공-형질전환시킨다. LB ＋ 1 ㎍/ml cTc에서 1시간 동안 형질전환을 진행시킨다. (대안적으로, 삽입물을 운반하는 Interlock 플라스미드가 이미 pBAD-Scel을 운반하는 그 자신의 컴피턴트 세포 내로 형질전환될 수 있다).

6. 클로람페니콜 25 ㎍/ml 및 카나마이신 50 ㎍/ml 첨가. 37℃에서 1-2 시간 동안 진동시키면서 성장시킨다.

7. 마이크로 원심분리기에서 30초 동안 세포를 펠렛팅한다.

8. (일체화 단계) 1 ml LB + 클로람페니콜 (25 ㎍/ml) + 카나마이신 (50㎍/ml) + 글루코스 (0.2%)에서 세포를 재현탁시키고 37℃에서 밤새 진동시키면서 성장시킨다.

9. 동일한 배지에서 오버나이트 배양물을 1:10,000으로 희석하고 37℃에서 추가 16-24시간 성장시킨다.

10. (카운터 선택 단계) 배양물 10㎕를 1 ml lxM9 미니말 염 (성장 속도를 최소화하기 위해)으로 희석시킨다. 이것을 각각 0.5 ml의 두 튜브로 나눈다. 하나에 아리비노스 0.2%를 추가하고 나머지에 글루코스 0.2%를 추가한다 (음성 대조군으로서 작용함). 37℃에서 1-2시간 진동시키면서 성장시킨다.

11. LB + 카나마이신 (50 ㎍/ml) + 아라비노스 (0.2%) 상에 10 ㎕의 아라비노스 튜브를 플레이팅하고 그리고 LB + 클로람페니콜(25, ug/ml) + 카나마이신 (50yg/ml) + 글루코스 (0.2%) 상에 10 ㎕의 글루코스 튜브를 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 성장시킨다.

12. (돌연변이체에 대한 스크리닝) 제1차 프로토콜의 단계9를 수행한다.

플라스미드

인공 삽입된 DNA 서열의 PCR 구축에 사용된 플라스미드가 pSG76-CS (GenBank 접수 번호 AF402780)로 표기되었으며, 이는 pSG76-C로부터 두번째 I-SceI 부위를 삽입함으로써 유도되었다 (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)). 두번째 I-SceI 부위는 NotI 부위의 하부인 pSG76-C 내로 두번째 I-SceI 인식 부위를 PCR-매개 삽입함으로써 얻었다. 두 I-SceI 부위는 반대 방향이다.

게놈 내로 선형 DNA-단편의 재조합을 강화하기 위해 pBADαβγ 플라스미드가 사용되었다. 이 플라스미드는 Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27: 1555-1557 (1999)에 기재되어 있다.

I-SceI를 발현하기 위한 PKSUC1 플라스미드 (GenBank 접수 번호 AF402779)가 pSG76-K (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) 및 pUC19RP12 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999))로부터 유도되었다. pSG76-K의 XbaI-NotI 단편 (Kan 유전자를 운반하며; NotI 말단은 클레나우(Klenow) 폴리머라제에 의해 블런팅됨)이 pUC19RP12의 XbaI-DraI 단편 (I-SceI 유전자 및 pUC ori를 운반함)으로 결찰되었다.

I-SceI의 테트라사이클린 조절 발현을 위해 pKSUC5 플라스미드가 pFT-K (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) 및 pKSUC1로부터 유도되었다. pKSUC1의 대형 XbaI-NcoI 단편이 tet 리프레서를 운반하는 pFT-K의 XbaI-NcoI 단편으로 결찰되었다.

게놈 내로 선형 DNA-단편의 재조합을 강화하기 위한 PKD46 플라스미드가 Datsenko, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6640-6649 (2000)에 기재되었다.

플라스미드 pSTKST (GenBank 접수 번호 AF406953)는, pFT-K (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) 및 pUC19RP12 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999))로부터 유도된, I-SceI의 클로르테트라사이클린-조절 발현을 위한 낮은 카피 넘버 Kan^R 플라스미드이다. pUC19RP12로부터 I-SceI 유전자를 운반하는 XbaI-PstI 단편이 pFT-K의 대형 XbaI-PstI 단편으로 결찰되었다. 클로르테트라사이클린에 의해 도입될 때 이 플라스미드가 I-SceI을 발현시킨다. 플라스미드의 복제는 온도 민감성이다 (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)).

I-SceI의 클로르테트라사이클린 조절 발현을 위한 낮은 카피 넘버 Ap^R 플라스미드, 플라스미드 pSTAST가 pFT-A (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) 및 pUC19RP12 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999))로부터 유도되었다. pUC19RP12로부터 I-SceI 유전자를 운반하는 XbaI-PstI 단편이 pFT-A의 대형 XbaI-PstI 단편으로 결찰되었다. 클로르테트라사이클린에 의해 도입될 때 이 플라스미드가 I-SceI을 발현시킨다. 플라스미드의 복제는 온도 민감성이다 (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)).

결실 방법 1

여기에서는 이콜라이 K-12의 게놈으로부터 반복적으로 결실을 얻기 위하여 본 방법이 사용되는 것을 기재하고 있다. 이 방법은 스카없는 결실 방법이다. 이 방법은 PCR에 의한 선형 타겟 단편을 구축하는 것으로부터 출발한다. 20 pmol의 프라이머 A를 20 pmol 프라이머 B와 혼합함으로써, 그리고 총부피 50㎕에서 PCR을 수행함으로써 수행되었다. 사용된 사이클 파라미터는 15 ×(94℃ 40초/57℃ 또는 그 이하 (A와 B의 중복에 좌우됨) 40초/72℃ 15초)이다. 상기 PCR 혼합물 1 ㎕를 취하여, 각각 20 pmol의 프라이머 A 및 C, 50 ng의 pSG76-CS를 추가하고 그리고 2 ×50 ㎕(50-㎕ 튜브 사용, 더 많은 DNA를 갖도록 두 튜브를 조합하였다)의 부피에서 PCR을 수행한다. 사용된 사이클 파라미터는 28 ×(94℃ 40초/57℃ 40초/72℃ 80초)이다. 상기 단계로부터 PCR 혼합물을 정제하기 위하여, Promega Wizard PCR 정제 키트가 사용되었다. 제조된 DNA 단편을 20㎕ 물에 현탁시켰다.

다음은 인공 DNA-단편의 삽입에 의한 게놈 영역의 치환이다. 이는, pBADαβγ를 운반하는 타겟 세포를 얻음으로써 그리고, 세포를 수확하기 0.25-1시간 이전 배양물에 0.1% 아라비노스가 첨가된 것을 제외하고 기재된 바와 같이 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)) 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포를 제조함으로써 수행되었다. 4㎕의 DNA 단편 (100-200 ng)이 40㎕의 일렉트로컴피턴트 세포 내로 전기천공되었다. 세포가 Cam 플레이트 (25 g cam/ml) 상에 플레이팅되었으며 37℃에서 배양되었다. 밤샘 배양 이후 일반적인 결과는 총 10 내지 수백 콜로니를 얻는 것이다. 프라이머 D 및 E를 사용하여 PCR에 의하여 단편의 정확한 부위 삽입에 대하여 몇개의 콜로니를 체크하였다.

다음은 삽입된 서열의 결실이다. 상기 CaCl₂ 방법에 의해 선택된 콜로니로부터 유도된 컴피턴트 세포를 제조함으로써 수행되었다 (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). 플라스미드 pKSUC1(~100 ng)가 표준 방법 (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989))에 의하여 세포 내로 형질전환되었다. 세포가 Kan 플레이트 상에 플레이팅되었으며 37℃에서 배양되었다 (pKSUC1 및 pBADαβγ는 양립할 수 없으며, 따라서 Kan 상에서의 선택은 세포로부터 pBADαβγ를 제거한다). 프라이머 D 및 E를 사용하여 PCR에 의하여 단편의 정확한 결실에 대하여 콜로니를 체크하였다. 정확한 결실을 운반하는 콜로니를 선택하였다. 이 경우, 세포는 pKSUC1을 운반한다. 다음 단계는 이 플라스미드를 결실시키는 것이다.

pBADαβγ로 pKSUC1의 치환을 통해 결실이 수행되었다. 이전 단계로부터 콜로니가 선택되었으며, 깨끗한 배지에서 2-3회 세포를 재접종한, 비선택적 조건하에서 37℃의 LB 상에서 성장되었다. 형질전환 또는 화학적 전기천공에서 컴피턴트 세포가 제조되었다. Amp 플레이트 상에 플레이팅된 컴피턴트 세포 내로 플라스미드 pBADαβγ (100-200 ng)가 형질전환되었다. Kan 및 Amp 플레이트 상에서 Kan 민감성/Amp 내성인 콜로니 백개를 면봉으로 선택하였다.

새로운 타겟 단편을 사용함으로써 그리고 상기 단계를 반복함으로써 선택된 콜로니가 결실의 다음 라운드에서 사용될 수 있다. 비선택적 조건 하에서 세포가 성장하면서 (Amp가 추가되지 않음), 만약 더 이상의 결실이 필요하지 않다면, 세포의 큰 분율로부터 pBADαβγ의 자발적 손실이 발생한다.

결실 방법 2

이 방법은 방법 1과 유사하지만, pKSUC1이 pSTKST으로 치환된다. 이 플라스 미드는 pBADαβγ와 양립가능하며, 온도 민감성 레플리콘을 가지며, 그리고 I-SceI의 발현은 클로르테트라사이클린(CTC)에 의한 유도를 요구한다. 장점은 42℃에서 배양물의 성장에 의해 세포로부터 pSTKST의 제거가 용이하게 수행된다는 것이다.

PCR에 의한 선형 타겟 단편의 구축 및 그 단편의 삽입에 의한 게놈 영역의 치환이 방법 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.

컴피턴트 세포의 삽입된 서열을 결실시키는 것은 올바른 삽입을 품고 있는 선택된 콜로니로부터 유도된 배양물로부터 제조된다. 세포는 pSTKST에 의해 형질 전환되고, Kan＋Cam 플레이트 상에 플레이팅되며 그리고 30℃에서 배양되었다. 이 플레이트로부터 열처리된 인듀서(inducer) CTC (최종 농도 25 ㎍/ml)가 보충된 10 ml의 LB＋Kan 내로 콜로니가 접종되었으며 그리고 30℃에서 24시간 동안 성장하였다. 본 단계는 I-SceI의 발현의 유도를 제공한다. 이후 배양물의 희석물이 LB＋Kan 플레이트 상에 도말되었으며 30℃에서 밤새 배양하였다. 프라이머 D 및 E를 사용하여 PCR에 의하여 정확한 결실에 대하여 6-12 콜로니를 체크하였다. 정확한 결실을 운반하는 콜로니를 선택하였다.

세포로부터 헬퍼 플라스미드를 제거하기 위해, 배양물을 42℃의 LB (항생제가 첨가되지 않은)에서 성장시켰다.

방법 3

pBADαβγ 및 pSTKST가 양립할 수 있는 레플리콘을 운반하기 때문에, 동일한 숙주에서 연속적인 결실이 이루어지는 때에는 플라스미드의 반복된 형질전환이 필요하지 않다. 항생제 선택 (Kan＋Amp)에 의한 연속적인 결실 구축을 통해 두 플라스미드가 숙주 세포에서 유지된다. 재조합 효소 및 특정 뉴클레아제 기능은 단지 필요할 때만 유도된다. pSTKST의 복제가 온도에 민감하기 때문에, 세포는 30℃에서 성장하여야 한다.

pBADαβγ 및 pSTKST가 세포 내로 단지 1회 형질전환되며, 그리고 세포 내에서 두 플라스미드의 보수가 필요할 때까지, 배양물은 30℃에서 성장하며, 그리고 Amp＋Kan이 배지에 포함되어 있다는 것을 제외하고는, 본 방법은 방법 2와 동일하다. 노트: 2 (Amp+Kan) 또는 3 (Amp+Kan+Cam) 항생제의 존재하에서 30℃에서 세포를 성장시키는 것이 어렵다는 것을 본 발명자들은 때때로 경험하였다.

방법 4

동일한 세포에서 몇개의 연속적인 결실이 이루어져야 할 때 이는 바람직한 방법이다. 각각 하나의 삽입물을 운반하며, 일련의 재조합 세포를 제조해내는 삽입물 (pBADαβγ를 운반하는 숙주 세포의 게놈 내로의 선형 단편의 재조합)은 나란히 이루어진다. 이후 이들 삽입물은 pSTKST를 운반하며 모든 기존의 결실을 품고 있는 세포 내로 P1 형질도입에 의하여 하나씩 차례로 전달된다. 모든 외인성 서열의 제거는 이 최종 숙주에서 pSTKST를 유도함으로써 행해진다. 기존의 방법에 비해, 주된 차이는 삽입 단계 및 삽입된 서열의 제거가 분리된 세포에서 수행된다는 것이다. 삽입이 나란히 이루어지기 때문에, 연속적인 결실의 구축이 더 빠르다.다른 장점은 단지 첫번째 결실 구축의 출발시에만 플라스미드에 의해 세포가 형질전환된다는 것이다.

이미 pSTKST를 품고 있는 결실 균주에 대해 PI 형질 도입에 의해 개별 삽입이 전달된다는 것을 제외하고는, 기술적으로 본 방법은 방법 2와 동일하다. 각 PI 형질도입 단계 이후, 삽입된 서열을 제거하기 위해 I-SceI 발현이 유도된다.

결과

이콜라이 균주 K-12 MG1655로부터 12개의 연속적인 결실이 이루어졌다. 부분적으로, 이콜라이 균주 0157: H7 EDL933 및 균주 K-12 MG1655의 게놈 DNA 서열의 비교 결과로서, 12개의 결실된 영역이 결실을 위해 선택되었다. 결실은 이하의 표 1에 나열하였다. 서열 넘버링은 공개된 K-12 서열에 따른다.

첫번째 결실 MD1은 Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)에 기재된 방법을 사용하여 이루어졌다. MD1 결실을 제조하기 위해 이 방법을 사용하면, 결실 부위의 염색체에서 FRT 부위를 포함하는 114- bp pSG76-CS 벡터 서열을 남긴다. 전술한 방법 1을 사용하여 MD2 내지 MD6 결실이 이루어졌다. 방법 4와 방법 1 또는 2의 조합을 사용하여 결실 MD7 내지 MD12가 이루어졌다. 각 새로운 결실의 균주 표기 및 유전자 좌표는 다음과 같다: MD1 263080-324632; MD2 1398351-1480278; MD3 2556711-2563500; MD4 2754180-278970; MD52064327-2078613; MD6 3451565-3467490; MD7 2464565-2474198; MD8 1625542-1650865; MD9 4494243- 4547279; MD10 3108697-3134392; MD11 1196360-1222299; MD12 564278-585331.

총 378,180 염기쌍, 본래 K-12 MG1655 이콜라이 유전자의 대략 8.1%가 이 스테이지에서 제거되었다. 유전자로부터 이 영역을 제거하는 것은 박테리아의 생존 또는 성장에 영향을 미치지 않는다.

이하의 표 2는 또다른 결실에 대한 후보로서 확인된 이콜라이 유전자의 다른 조각, 유전자 및 영역을 나열한다. 박테리아 게놈으로부터 그 조각은 또한 성공적으로 제거되었다. 다시 말하면, 실험실 및 산업상 박테리아를 이용하기 위한 유용성에 어떤 명백한 유해한 영향 없이 이들 결실이 이루어졌다. 또한 서열 표기는 공개된 K-12 서열에 따른다. 결실의 주 세트는 본래 박테리아 게놈의 14%로 집계된다. 숙주의 성장 및 생존에 필수적인 유전자를 파괴하지 않는 측면 DNA에 한해서만 측면 DNA를 따라 스스로 유전자를 제거하는 것이 가능하다는 것을 기억하여야 한다.

방법 1에서, 선형 단편의 삽입의 효율은 특정 게놈 장소에 따라 다양하다. 콜로니의 1-100% (정상적으로 20-100%)에서 정확한 부위 삽입이 발생한다. 42 내지 74 bp 범위에서 측면 위치 상동성(homology)이 사용되었다. 더 긴 상동성이 더 나은 삽입 효율을 제공한다. 복제된 서열 사이에서 정확한 부위 절단이 1-100% (정상적으로 10-100%)의 콜로니에서 발생하며 복제 영역의 길이에 좌우된다. 더 긴 복제가 일반적으로 더 효율적이다. 복제된 서열의 길이는 42 내지 50 bp의 범위이다. 삽입 및 절단의 효율의 편차는 표면상 동일하게 반복되는 실험 사이에도 존재하며 아직 완전히 이해되지 않는다.

결실 MD2를 다시 제조함으로써 방법 3이 시험되었다. 선형 DNA-단편의 정확한 부위 삽입이 콜로니의 6.6 %에서 발생하였다. 삽입된 서열의 결실이 매우 효과적이었다. 제조된 25개의 콜로니가 Cam＋Amp＋Kan 및 Amp＋Kan 플레이트 상에서 복제 플레이팅되었으며, 그 중 19개가 Cam에 민감한 것으로 증명되었다. 그 콜로니 중 5개가 이후 PCR에 의해 시험되었으며, 5개 모두 삽입된 서열의 예상된 손실을 보였다.

표 8 및 표 9는 랜드마크로부터 결실되었거나 또는 결실될 유전자의 결실 종말점의 더 정밀한 설명을 보여준다. 이콜라이 균주 MDS12, MDS40 및 MDS73 (표 8 및 9)이 랜드마크 균주를 구축하는데 사용된 중간체 균주에 대한 결실의 종말점이다. 표 9에 나열된 유전자가 "b" 넘버로 확인되었으며 Blattner et al., Science, supra에 기재된 표기 및 GenBank 접수 번호 400096에 근거한다. 표 8의 넘버링은 또한 Blattner et al. supra에 근거한다.

결실 균주의 특징

형질전환 빈도

숙주 박테리아 세포는 그들이 분할되고 성장하면서 일체화된 DNA를 유지할 수 있는 그런 방식으로 외인성 DNA를 이콜라이의 게놈 결실된 균주를 도입하는 것이 바람직하다. 박테리아 숙주 게놈 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법을 형질전환이라고 부르며 외인성 DNA를 품고 있는 생명체를 형질전환된 생명체라고 부른다.

부모 이콜라이 균주 MG1655에서 39 결실(대략 14.1%의 유전자)을 얻어냄으로써 이콜라이 균주 MDS39가 구축되며 전기천공에 의해 효율적으로 형질전환되는 것으로 밝혀졌다. 형질전환의 이런 고효율은, 광범위한 적용예에 대해 특히 가치 있는 균주 MDS39를 얻어내는 대형 크기 BAC (박테리아의 인공 염색체) DNA를 섭취하는 데까지 확장된다.

이콜라이 균주 MDS39의 형질전환 효율을 시험하기 위하여, 외인성 DNA를 품고 있으면서 안정하게 유지되는, 3개 균주, DH10B, MDS31 및 MDS39를 600nm에서 광학 밀도 0.5의 표준 성장 조건하에서 성장시켰다. 세포 배양물을 스핀 다운(spin down) 시키고, 세포 펠렛을 물로 수회 세척하고 최종적으로 물에 재현탁시켰다 (원래 배양 부피의 1/1000로). 25ng의 pBR322 DNA 또는 메틸화된 BAC DNA 또는 메틸화되지 않은 BAC DNA가 100 ㎕의 세포 현탁액에 추가되었으며, 표준 전기천공 프로토콜을 사용하여, 즉, Invitrogen Electroporator II^TM 장치를 사용하여 0.1 cm 전기천공 큐벳에서 1.8 kV 및 저항 150 ohms으로 전기천공을 수행하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 EcoK 부위 및 pBR322 DNA에서 메틸화된 BAC DNA가 이콜라이 균주 MG1655에서 제조되었다. 메틸화되지 않은 BAC DNA가 E.coli 균주 DH10B에서 제조되었다.

표 3은 두 균주, MDS31 및 MDS39이, 분자 중량 4,363 염기쌍을 갖는 pBR322 DNA 및 분자 중량 100,000 염기쌍을 갖는 메틸화된 BAC DNA에 의해 효율적으로 형질전환되는 것을 보여준다. 균주 MDS31 및 MDS39에 대한 메틸화된 BAC DNA에 의한 형질전환의 효율은, 현재 최대의 형질전환 효율을 갖는 균주 중의 하나로 간주되는 균주 DH10B에 대한 형질전환의 효율과 비교할만한 하다.

메틸화되지 않은 BAC DNA에 의해 형질전환될 때, 균주 MDS39에 대한 형질전환의 효율은 균주 DH10B에 대한 형질전환의 효율보다 높은 반면 (표 3), 균주 MDS31에 대한 형질전환의 효율은 두 균주 MDS39 및 DH10B에 대한 형질전환의 효율보다 낮아진다. 균주 MDS31에 대한 낮은 형질전환 효율은, MDS31가 r^＋m^＋ 균주인 반면, 두 균주 DH10B 및 MDS39는 r^－m^－ 균주가기 때문에, 메틸화되지 않은 DNA가 균주에서 제한의 대상이 된다는 사실 때문이다.

MDS39에 의한 최근의 작업은 서열 gb_ba:ecu 95365에서 잔류 삽입 서열 IS5의 가능한 존재를 밝혀내었다. MDS39로부터 거주하는 IS 서열의 결실에 대한 결실의 효과를 측정하기 위해, 서열을 결실하는데 본원에 기재된 방법이 사용되었다. MDS40에서 결실의 종말점은 표 8 및 9의 균주가다. 제조된 균주 MDS40은 이후 후술하는 그것의 형질전환 제공 및 성장 특징 (결과)에 대하여 시험되었다.

Invitrogen Electroporator II 메뉴얼에서 전기천공-컴피턴트 세포가 기재된 바와 같이 제조되었다. 요약하면, 200ml 배양물이 OD₅₅₀＝0.5로 성장되었으며, 이후 원심분리에 의해 세포를 수확하였으며 반복하여 원심분리 및 현탁시키면서 찬 얼음물로 2회 세척 및 얼음으로 냉각된 10% 글리세롤로 1회 세척하였다. 최종 단계에서 세포 펠렛을 0.4ml 10% 글리세롤에 현탁시켰으며, 40㎕ 분율을 분취하여 -80℃에서 보관하였다.

세포는 통상적으로 Electroporator II 장치 (Invitrogen)를 이용하여 0.1-cm 전기천공 큐벳에서 1.8 kV 및 저항 150 Ω으로 플라스미드 DNA 양 10-100 ng으로 전기천공되었다. 이후 세포를 1 ml LB로 희석하였으며, 진동기에서 1시간 동안 배양하고, 선택 배지 상에 플레이팅하였다.

몇개의 실험이 수행되었으며, 결과는 크기의 순서에 의해 다양할 수 있다. 통상 2회 평균, 독립적 실험 (각각 2회 병렬)이 표 5에 보여졌다.

화학적 형질전환 방법에 사용된 MG1655, MDS40 및 DH10B에 대한 형질전환 효율이 또한 사용되었다. 컴피턴트 세포가 간단한 방법으로 제조되었다. 50ml 배양물을 냉장시키고 OD₅₅₀＝0.4에서 원심분리에 의해 수확하였으며, 이후 반복하여 원심분리 및 현탁시키면서 1/20 부피의 얼음 냉각된 CaCl₂ 용액 (10 mM 트리스 pH 7.5, 15% 글리세롤, 60 mM CaC1₂)로 2회 세척하였다. 이후 세포를 1시간 동안 얼음상에서 배양하고, 200 ㎕ 분율을 분취하여 -80℃에서 보관하였다.

형질전환을 위해, 세포는 통상적으로 100 ng 플라스미드 DNA와 혼합되었으며, 얼음 상에서 30분 동안 배양되었고, 42℃에서 2분 동안 열충격되었으며, 이후 0.8 ml LB가 추가되었다. 세포는 37℃에서 0.5-1 시간 동안 배양되었으며, 이후 희석물을 선택 배지 상에 플레이팅하였다. 결과는 표 6에 보였다.

성장 특성

전술한 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 제조된 결실 균주는 임의의 배양 조건하에서도 확고한 성장 능력을 갖는 것으로 기대된다. 성장 연구는 앞으로 계속된다.

37℃에서 수분 내에 이콜라이 균주 세포의 배가시간을 진동시키면서 96 웰 플레이트 판독기 (SpectraMax plus, Molecular Devices)로 측정하였다. 플레이트 상에서 6개의 복제물에 대해 평균 배가시간 및 표준편차를 측정하는데 성장 곡선의 로그 선형 분율이 사용되었다. 이 장치는, 비교 측정을 편리한 방식으로 제공하는 반면, 세포의 면적을 매우 잘 계산하지 못해서 진동 플라스크에서 얻어진 세포의 성장 속도가 약 2배 느려진다.

미니말 배지에서 결실 균주가 본래의 MG1655 만큼 동일한 속도로 성장하지만 실질적인 밀도가 동일하지 않다는 것은 명백하다. 영양분이 정의된 배지 상에서 결실물은 덜 빠르게 성장하지만 실질적인 밀도가 동일하다. 이들 작은 차이에 대한 이유를 연구하는 것은 흥미있을 것이지만, 미니말 배지에서 확고하게 성장하는 능력을 보유하는 반면 실질적으로 게놈을 감소시키기 위한 목적이 명백하게 얻어져야 한다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

[표 8]

[표 9]

Claims (70)

1. 본래 부모 이콜라이(E. coli) 균주의 게놈보다 5% 이상 더 작도록 유전적으로 조작된 게놈을 갖는 이콜라이 박테리아로서, 플라젤라 유전자, 제한 변형(restriction modification) 시스템 유전자, 리포폴리사카리드 표면 유전자, 삽입 서열, rhs 요소, 독소 유전자, 병원성 유전자, 핌브리아(fimbrae) 유전자, 인바신(invasin) 유전자, 주변세포질(periplasmic) 단백질 유전자, 막단백질 유전자, 프로파지, 슈도유전자(pseudogene), K 아일랜드, 박테리오파지 수용체 유전자, 비전사 영역 및 본래 부모 균주와 동종 또는 연관된 종의 임의의 두 박테리아 균주 둘 다에 존재하지 않는 유전자 또는 임의의 기타 DNA 단편 중에서 선택된 1 이상의 DNA 단편이 박테리아의 게놈으로부터 결실되어 있는 것인 이콜라이 박테리아.
2. 제1항에 있어서, 박테리아의 게놈은 본래 부모 균주의 게놈보다 8% 내지 20% 더 작은 것인 이콜라이 박테리아.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 4.27 Mb보다 더 작거나 또는 4.00 Mb보다 더 작은 게놈을 갖는 것인 이콜라이 박테리아.
5. 제1항에 있어서, 본래 부모와 비교할 때 단백질 코딩 유전자의 9% 이상이 결핍되어 있는 것인 이콜라이 박테리아.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 주변세포질 내로 분비되거나 또는 주변세포질 내에서 가공되는 단백질을 코딩하는 1 이상의 유전자가 결실된 것인 이콜라이 박테리아.
8. 제7항에 있어서, 상기 1 이상의 유전자가 fliY, yedO, nfnB, tauA, mppA, tynA, chiA, imC, fecB, ygiH, yagP, 또는 yhcA 중에서 선택되는 것인 이콜라이 박테리아.
9. (i) 한쪽 말단에는, 결실되는 게놈 영역의 왼쪽 측면상의 서열과 동일한 서열 1로서, 결실되는 게놈 영역의 오른쪽 측면상의 서열과 동일한 서열 2가 따라오는 서열 1;

   (ii) 다른 말단에는, 결실되는 게놈 영역 내의 서열과 동일한 서열 3; 및

   (iii) 서열 2와 서열 3 사이에는 박테리아의 게놈에 존재하지 않는 서열-특이적 뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 인공 DNA 분자

   를 제조하는 단계,

   서열 1과 서열 3 및 박테리아의 게놈 내의 서열들 사이에 상동성 재조합을 우세하게 일어나게 하는 조건하에서 상기 인공 DNA 분자를 박테리아 내로 도입하여 재조합 박테리아를 형성하는 단계;

   인식 부위를 인식하는 서열-특이적 뉴클레아제에 대한 발현 벡터를 상기 재조합 박테리아 중 1 이상으로 도입하는 단계;

   상기 박테리아 중 1 이상에서 서열-특이적 뉴클레아제를 발현시키는 단계; 및

   서열-특이적 뉴클레아제의 발현에서 생존하며 정확한 결실을 포함하는 박테리아를 수집하는 단계

   를 포함하는, 제1항의 이콜라이 박테리아를 제조하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 인공 DNA 분자를 운반하는 벡터에 의해 인공 DNA 분자를 박테리아 내로 도입하거나, 인공 DNA 분자를 박테리아 내로 직접 도입하는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상동성 재조합을 증가시킬 수 있는 시스템에 대한 발현 벡터를 박테리아의 적어도 일부에 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 시스템에 대한 발현 벡터는 뉴클레아제에 대한 발현 벡터와 양립가능하고, 뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터의 조절하에 있는 것인 방법.
12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 서열-특이적 뉴클레아제가 I-SceI인 것인 방법.
13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 인공 DNA 분자가 서열 2와 서열 3 사이에 선별 마커 유전자를 더 포함하는 것인 방법.
14. 제11항에 있어서, 인공 DNA 분자가 서열 2와 서열 3 사이에 선별 마커 유전자를 더 포함하는 것인 방법.
15. 서열-특이적 뉴클레아제 인식 부위 및 2가지 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계로서, 2가지 DNA 서열 중 하나는 한쪽에서 결실되는 게놈 영역의 측면 서열과 동일하며 다른 하나는 반대쪽 상의 게놈 영역의 측면 서열과 동일하고, 2가지 DNA 서열은 벡터상에서 서로 옆에 위치하며, 서열-특이적 뉴클레아제 인식 부위는 벡터상에서 2가지 DNA 서열의 바깥쪽에 위치하는 것인 단계;

    상기 벡터를 박테리아 내로 도입하여 1 이상의 벡터로 형질전환된 박테리아를 형성하는 단계;

    인식 부위를 인식하는 서열-특이적 뉴클레아제에 대한 발현 벡터를 상기 벡터로 형질전환된 박테리아 중 1 이상으로 도입하여, 1 이상의 뉴클레아제로 형질전환된 박테리아를 형성하는 단계;

    상동성 재조합의 빈도를 증가시킬 수 있는 시스템을 상기 뉴클레아제로 형질전환된 박테리아 중 1 이상으로 도입하고, 서열-특이적 뉴클레아제를 발현시키는 단계; 및

    결실하고자 하는 게놈 영역이 결실된 1 이상의 박테리아를 확인하는 단계

    를 포함하는, 제1항의 박테리아를 제조하는 방법.
16. 제13항에 있어서, 상동성 재조합의 빈도를 증가시킬 수 있는 시스템이 파지 λ Red 재조합효소 시스템인 것인 방법.
17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상동성 재조합의 빈도를 증가시킬 수 있는 시스템이 파지 λ Red 재조합효소 시스템인 것인 방법.
18. 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 시그날 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항의 박테리아 내로 도입하는 단계; 및

    DNA에 의해 코딩되는 단백질을 발현시키기에 적당한 영양 조건 하에서 박테리아를 성장시키는 단계

    를 포함하는, 박테리아 내에서 재조합 단백질을 발현시키는 방법.
19. 제18항에 있어서, 발현 제어 서열이 구조적으로(constitutively) 발현되거나 발현 제어 서열이 유도성 프로모터인 것인 방법.
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