KR100585450B1 - 유전자 결실을 위한 선형 ｄｎａ 단편, 이를 이용하여생물막 형성이 억제된 대장균 변이주 및 이의 제조 방법 - Google Patents

유전자 결실을 위한 선형 ｄｎａ 단편, 이를 이용하여생물막 형성이 억제된 대장균 변이주 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항생제 민감도와 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주에 관한 것으로, 상기 변이주는 생물막(biofilm)의 형성이 억제되어, 생물막에 의한 항생제와 분비물 및 외래 유전자에 대한 확산의 저해가 최소화된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하여, 대장균의 유전자 조작 실험 도중의 변이주 선별 과정에 있어서, 보다 적은 양의 항생제로 원하는 변이주를 선별할 수 있고, 선별하고자 하는 변이주가 아닌 균주가 생물막을 형성하여 항생제에 내성을 보여서 선별의 효율을 떨어뜨리는 것을 방지할 수 있다. 또한, 분비물의 확산 효율이 증가됨으로써 배지 내로 분비되는 생산물의 수득률을 증가시킬 수 있다. 그리고 형질전환 효율이 증가됨으로써 유용 물질의 대량생산을 보다 용이하게 할 수 있다.

Description

유전자 결실을 위한 선형 ＤＮＡ 단편, 이를 이용하여 생물막 형성이 억제된 대장균 변이주 및 이의 제조 방법{LINEAR DNA FRAGMENT FOR MARKERLESS DELETION, NOVEL STRAIN HAVING INHIBITED FORMATION OF BIOFILM AND PREPARATION METHOD THEREOF}
도 1은 대장균 염색체 일부를 제거하기 위한 선형 DNA 단편을 나타낸 것이다.
도 2는 선형 DNA 단편을 이용하여 대장균의 특정 유전자를 제거하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 선형 DNA 단편의 제조에 사용된 PCR 과정을 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 대장균 변이주의 생물막 제거를 부착도(adherence percentage)의 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 대장균 변이주의 항생제 암피실린에 대한 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 대장균 변이주의 항생제 스트렙토마이신에 대한 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 대장균 변이주의 항생제 리팜피신에 대한 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 대장균 변이주의 생산물 분비 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 항생제 민감도, 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주의 제조에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전자의 제거 후 선별 마커(selectable marker)가 남지 않는 결실(markerless deletion) 방법을 이용하여 생물막(biofilm) 관련 유전자를 제거시킴으로써, 항생제에 대하여 증가된 민감도를 갖고 생산물의 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주에 관한 것이다.
생물막은 생물학적 또는 비생물학적 물질의 표면에 붙어서 자라는 미생물의 군집을 의미한다. 생물막이 형성되면, 미생물들 간의 공간이 생물막의 구성물들에 의해 차단됨으로써, 배지 등의 주변 환경에서 용질이 확산되는 것이 억제된다. 이러한 용질들 중 하나인 항생제의 확산도 차단되어, 생물막 안쪽의 미생물들은 항생제에 대하여 내성을 보이게 된다. 따라서, 선별 대상이 아닌 균주가 원하지 않는 항생제 내성을 보이게 되어, 항생제에 의하여 죽거나 생장이 저해되어 제거되어야 하는 균주가 살아남아 생장을 계속하게 될 수 있다. 그 결과, 각종 변이주의 제조에 있어서, 원하는 변이주가 아닌 친주가 살아남아 선별 효율을 떨어뜨릴 수 있다는 문제점이 발생하게 된다.
또한, 생산된 물질을 미생물 외부로 분비하여 배지로부터 분리함으로써 그 생산물의 수득을 용이하게 하는 과정에 있어서, 생물막으로 인하여 분비될 생산물의 확산이 저해되어 수득률이 저하되는 결과도 발생한다. 또한, 외래 유전자가 도입된 형질전환체를 제조하는 공정에 있어서, 상기 생물막으로 인하여 외래 유전자의 숙주세포로의 전달 및 도입이 억제되어 형질전환 효율이 저하될 수 있다. 특히, 생물 산업 공정에서 생산 효율을 높이기 위하여 고농도 배양을 하는 경우, 배양 시간의 증가와 미생물의 배지 내 농도의 증가로 인하여 생물막 형성이 증가되기 때문에, 이러한 문제점들이 더욱 큰 영향을 주게 된다.
이와 같은 생물막 형성으로 인한 문제점을 해소하기 위하여, 미생물의 유전자 조작 실험 또는 생물 산업 공정에 있어서 생물막의 형성을 방지하거나 최소화하기 위한 전처리 등의 해결책이 필요하게 되었다. 생물막의 형성을 방지하기 위한 수단으로서, 다량의 생물막 형성 억제 물질을 가하는 방법이 제안되었으나, 비용의 증가와 환경 오염 문제로 인하여 바람직하지 못하여 그 사용이 점차 감소하고 있다. 또한, 미생물이 부착할 수 없어서 생물막이 형성되지 못하는 물질을 배양조 등에 사용하는 방법을 개발하기 위한 시도가 있었으나, 아직 그 성공 사례가 보고된 바 없다.
본 발명의 목적은 생물막의 형성을 억제하여 항생제 민감도와 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주를 제공하는 것이다. 이러한 본 발명의 목적은 생물막의 형성에 관련된 유전자들을 제거함으로써 생물막 형성이 억제 된 대장균 변이주들에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 항생제 민감도와 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주의 제조에 관한 것으로, 유전자의 제거 후 선별마커(selectable marker)가 남지 않는 결실 방법(markerless deletion)을 이용하여 생물막(biofilm) 관련 유전자를 제거시킴으로써, 항생제에 대한 민감도, 생산물의 분비 효율 및 외래 유전자의 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
대장균에 있어서, 컬리(curli)와 타입 I 필리(type I pili)가 미생물이 생물막 형성에 필수적인 물질들로서, 물질의 표면에 부착되거나 미생물들 간의 연결에 필수적인 것이고, 콜라닌산(colanic acid)이 미생물 간의 공간을 채우고 있는 것으로 보고되어 있다. 즉, 대장균이 컬리와 타입 I 필리를 이용하여 물질의 표면에 부착되고, 동일한 컬리와 타입 I 필리를 이용하여 대장균 상호간의 연결이 이루어진 후, 콜라닌산이 그 사이의 공간을 메움으로써 생물막을 형성하게 된다.
본 발명에서는 대장균 염색체로부터 이들 컬리, 타입 I 필리 및 콜라닌산의 형성에 관련된 것으로 알려진 csg 유전자군 및/또는 fim 유전자군 및/또는 wca 유전자군을 제거함으로써, 생물막의 형성이 억제되어 항생제 민감도, 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주를 제조하였다.
본 명세서에서 사용되는 "대장균 변이주"라는 용어는 생물막의 형성이 억제된 대장균 변이주를 의미한다. 상기 변이주에는, 예컨대, wca 유전자군, fim 유전 자군, 및 csg 유전자군 중 어느 한 가지 이상이 제거되어서 항생제 민감도, 생산물 분비 효율 및 형질전환 효율이 증가된 대장균 변이주가 포함된다.
또한, "생물막(biofilm)"이라 함은 생물학적 또는 비생물학적 물질의 표면에 붙어 자라는 미생물 군집을 의미한다. 생물막 형성의 억제는 아래에서 보다 구체적으로 설명되는 부착성(adherence property) 테스트 방법에 의하여 측정될 수 있다.
또한, "항생제 민감도의 증가"는 더 적은 양의 항생제로 같은 정도의 양의 미생물을 죽일 수 있게 됨을 의미한다. 항생제 민감도는, 예컨대, 아래에서 보다 구체적으로 설명되는 암피실린(ampicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 리팜피신(rifampicin) 등에 대한 항생제 민감도 측정방법에 의하여 측정될 수 있다.
또한, "생산물 분비 효율의 증가"는 동일한 시간동안 더 많은 양의 생산물을 배지 내로 분비함을 의미한다. 생산물 분비 효율은, 예컨대, 아래에서 보다 구체적으로 설명되는 배지 내 리파아제(lipase)에 대한 활성 측정방법에 의하여 측정될 수 있다.
또한, "형질전환 효율의 증가"는 아래에서 보다 구체적으로 설명되는 염화칼슘-열충격 형질전환법 등에 의하여 측정될 수 있다.
csg 유전자군(csgDEFGBA, b1037~b1043, Blattner,F.R., Plunkett,G. III, Bloch,C.A., Perna,N.T., Burland,V., Riley,M., Collado-Vides,J., Glasner,J.D., Rode,C.K., Mayhew,G.F., Gregor,J., Davis,N.W., Kirkpatrick,H.A., Goeden,M.A., Rose,D.J., Mau,B. and Shao,Y. Science 277, 1453, 1997)은 컬리의 생합성 및 합성된 컬리의 세포 외부로의 수송을 담당하는 유전자이며, fim 유전자군 (fimBEAICDEF, b4312~b4320, Blattner,F.R., Plunkett,G. III, Bloch,C.A., Perna,N.T., Burland,V., Riley,M., Collado-Vides,J., Glasner,J.D., Rode,C.K., Mayhew,G.F., Gregor,J., Davis,N.W., Kirkpatrick,H.A., Goeden,M.A., Rose,D.J., Mau,B. and Shao,Y. Science 277, 1453, 1997)은 타입 I 필리의 생합성 및 합성된 필리의 세포 외부로의 수송을 담당하는 유전자이며, wca 유전자군(wza wzb wzc wcaABCDEF gmd wcaGHI manC manB wcaJ wzx wcaKL, b2044~b2062, Blattner,F.R., Plunkett,G. III, Bloch,C.A., Perna,N.T., Burland,V., Riley,M., Collado-Vides,J., Glasner,J.D., Rode,C.K., Mayhew,G.F., Gregor,J., Davis,N.W., Kirkpatrick,H.A., Goeden,M.A., Rose,D.J., Mau,B. and Shao,Y. Science 277, 1453, 1997)은 콜라닌산의 생합성 및 합성된 콜라닌산의 세포 외부로의 수송을 담당하는 유전자이다.
본 발명은 대장균에서의 생물막 형성에 관여하는 상기의 3 가지 유전자군 중 한 가지 이상이 제거되어, 항생제 민감도와 생산물 분비 효율이 증가된 대장균 변이주를 제공한다. 본 발명의 한 구체예로서, 상기 3 가지 유전자군이 모두 제거된 변이주 DEB31은, 야생형 대장균과 비교하여, 암피실린에 대하여 약 25 배, 스트렙토마이신에 대해서는 약 4 배, 리팜피신에 대해서는 약 5 배 증가한 항생제 민감성을 나타내고, 리파아제의 분비에 있어서, 약 11 % 증가된 분비 효율을 나타내고, pUC19 플라스미드 벡터를 사용하는 형질전환에 있어서는, 20 배 이상의 형질전환 효율을 나타내었다.
본 발명에서 사용하는 각종 실험방법을 살펴보면 다음과 같다.
우선, 상기와 같은 유전자군이 제거된 대장균 변이주는
(1) 선별 마커, SacB 유전자(SEQ ID NO:31), I-SceI 제한효소 절제부위(SEQ ID NO:32), 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위가 포함된 선형 DNA 단편을 제조하는 단계,
(2) 상기 제조된 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체시키는(replacement) 단계,
(3) 상기 형질변환된 미생물 염색체에 I-SceI 제한효소 발현벡터를 도입하고 자당(sucrose)이 포함된 선택배지에서 배양하여 선별 마커를 제거하는 단계를 포함하고, 임의적으로,
(4) 상기 염색체 일부가 제거된 변이주에 상기 (2) 및 (3) 단계를 반복 수행하여 연속적으로 특정 유전자들을 제거하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법으로 얻을 수 있다.
상기 선형 DNA 단편은 선별마커; 람다-레드 재조합에 필요한 요소인 약 500 bp 상동부위 A 및 C; 선별 마커 제거에 필요한 I-SceI 제한효소 절단부위 및 상동부위 B; 및 선별 마커의 제거 여부의 확인인자로서 sacB 유전자를 포함한다(도 1 참조).
상기 선별 마커로서 주로 항생제 저항 유전자를 사용하며, 이를 포함하는 DNA 단편으로 재조합된 염색체를 갖는 변이주는 해당하는 항생제에 저항성을 갖게 되므로 원하는 변이주의 선별이 가능해진다.
상기 상동부위는 염색체가 변형될 미생물의 염색체 일부와 상동인 부분으로, 서열목록 및 도면 상에 상동부위(homology arm) A, B 및 C로 표시되어 있다. 이들 중 상동부위 A 및 C는 제거될 미생물 염색체 부위 양 말단과 연결된 약 500 bp를 PCR 하여 얻은 상동부위로서, 선형 DNA 단편의 양쪽 말단에 위치하며, 선형 DNA 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여한다. 상동부위 B는 상동부위 A 또는 C와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 연결된 약 500 bp를 PCR 하여 얻은 상동부위로서, 선형 DNA 단편의 한 쪽 말단에 위치하며, 선별 마커 제거시의 동성 재조합에 관여한다(도 2 참조). 상기 상동부위 B가 상동부위 A와 연결되어 위치하는 경우, 상동부위 B는 상동부위 C와 연결된 500 bp와 상동이다. 이 때, 상기 상동부위 A, B 및 C는 대상 미생물과 제거하고자 하는 유전자에 따라 달라진다.
또한, 상기 I-SceI 제한효소 절제부위(SEQ ID NO:32)는 18 염기쌍으로 되어 있고, 선별 마커 제거시의 동성 재조합에 관여하는 상동부위 B에 연결되어 있으며, 대장균(E. coli) 염색체에는 I-SceI 제한효소 절제부위가 존재하지 않기 때문에, 유전자 일부 절제를 위한 선형 DNA 단편이 상기 부위를 포함하고 있어야 한다.
상기의 단계는 500 bp 정도의 상동부위를 사용하므로, 보다 특이적인 재조합이 일어나서, 원하는 부분을 보다 정확하게 제거할 수 있다는 장점이 있다.
상기 선형 DNA 단편은 통상적인 일렉트로포레이션(electrophoration) 방법을 통하여 미생물 균주에 전달될 수 있으며, 선형 DNA 단편의 양 말단에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위 A 및 C와 이와 상동인 미생물 염색체상의 부위 간의 람다-레드 재조합에 의하여 상기 DNA 단편을 미생물 균주 염색체의 특정 위치에 대체(replacement)시켜 해당 부분을 제거시킨 후, 상기 선형 DNA 단편이 대체된 미생물 변이주를 선별 마커의 종류에 따라 해당 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 선별한다.
선별된 변이주 내로 I-SceI 제한효소 유전자를 포함하는 I-SceI 제한효소 발현 벡터를 도입시키고 I-SceI 제한효소 유전자를 발현시켜서, 상기 선형 DNA 단편의 한쪽 말단에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위 B 및 이와 상동성을 갖는 미생물 염색체 부위 사이의 동성 재조합을 촉진시킴으로써, 미생물 변이주 내의 선별 마커를 제거한다. 본 발명의 구체예에서는 상기 발현 벡터로서 pST98AS (SEQ ID NO:33, ACCESSION AF170483, Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15) 발현 벡터를 사용하였다. 그리고 나서, 상기 미생물 변이주를 자당(sucrose)이 포함된 배지에서 배양하여, 미생물 변이주 내에 도입된 선형 DNA 단편 내의 sacB 유전자를 발현시켜 독성을 유발시킨다. 일반적으로, sacB 유전자는 레반수크라아제(levansucrase)를 발현시키며, 이는 자당(sucrose)을 포도당(glucose)과 과당(fructose)으로 분해하고, 과당을 중합체인 레반(levan)으로 합성한다. 이 때, 상기 레반이 미생물에 대하여 독성을 가지고 있기 때문에, sacB 유전자를 지닌 미생물은 자당이 포함된 배지에서 생존하지 못한다. 따라서, 동성 재조합에 의하여 선별 마커와 함께 sacB 유전자가 제거된 미생물 변이주를 자당을 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별할 수 있다.
또한, 상기 제 (2) 단계와 제 (3) 단계를 반복 실시함으로써, 미생물 내 염 색체의 특정 유전자 부위를 연속적으로 제거시킬 수 있다.
이와 같은 염색체 제거 과정을 도 2에 나타내었다. 도 2에 있어서, a는 선별 마커, SacB 유전자, I-SceI 제한효소 절제부위 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위 A, B 및 C가 포함된 선형 DNA 단편을, b는 상기 상동부위 A, B 및 C를 포함하는 제거하고자 하는 숙주 염색체 부분을, c는 람다-레드 재조합에 의하여 숙주 염색체의 제거하고자 하는 부분에 상기 선형 DNA 단편이 대체된 형질전환 염색체를, d는 I-SceI 제한효소에 의한 선형 DNA 단편 상의 상동부위 B와 숙주 염색체 상의 상동부위 B간에 일어나는 동성 재조합을 나타내고, e는 이와 같이 얻어진 특정 유전자 부위가 제거된 숙주 염색체를 나타낸다.
상기와 같은 방법으로 wca 유전자군, fim 유전자군, 및 csg 유전자군 중 어느 한 가지 이상이 제거된 변이주의 부착성 측정은 도렐의 방법(Dorel C. et al., FEMS Microbiology Letters, 178, 169, 1999)을 따랐다. 즉, 2 ml의 LB 배지가 들어있는 24 웰 폴리스티렌 프레이트에 변이주를 접종하여 생물막이 형성될 수 있도록 48시간 배양한 후, 각 웰의 상층액을 따라내어 따로 보관한 것과 2번 LB로 씻어낸 것을 혼합하여 이것을 부유 세포(planktonic cell)로 보고, 웰 벽에 붙어있는 생물막 세포들을 1 ml의 LB를 이용하여 피펫팅하여 수득하였다. 이렇게 얻은 플랑크톤 세포와 생물막 세포 샘플들의 각각의 세포 농도를 플레이트 카운팅을 통하여 측정하였다. 이것을 수치화하여 비교하기 위하여, 생물막 세포(biofilm cells)의 농도를 부유 세포와 생물막 세포의 농도를 합한 전체 세포의 농도로 나누어, 전체 중 웰에 붙어서 자란 생물막 세포의 비율(adherence percentage)을 계산하였다.
상기 변이주의 항생제 민감도는 화이틀리의 방법(Whiteley M., Nature, 413, 860, 2001)을 변형시켜서 측정하였다. 즉, 0.2 ml의 LB 배지가 들어있는 96 웰 폴리스티렌 플레이트에 변이주를 접종하여 생물막이 형성될 수 있도록 24시간 배양한 후, 각 웰에 0.25 ㎍ 에서 64 ㎍ 까지의 다양한 농도의 항생제를 첨가한 다음, 10 시간 동안 배양한 후, 살아있는 미생물의 수를 플레이트 카운팅을 통하여 측정하였다.
상기 변이주의 리파아제 분비 효율은 안의 방법 (Ahn J.H., J. Bacteriol, 181, 1847, 1999)를 따랐다. 본 발명의 구체 예에서는 리파아제의 생산을 위한 유전자를 가지고 있는 pHOPE (Ahn J.H., J. Bacteriol, 181, 1847, 1999) 발현벡터와 리파아제의 분비를 위한 유전자들을 가지고 있는 pABC-ACYC (Ahn J.H., J. Bacteriol, 181, 1847, 1999) 발현벡터를 사용하였다. 상기 발현벡터들을 통상적인 일렉트로포레이션(electrophoration) 방법을 이용하여 미생물 균주에 전달하였다. 50 ml의 LB 배지가 들어있는 250 ml 플라스크에 변이주를 접종하여 배양한 후, 일정 시간마다 1 ml의 배지를 수확한 다음, 13000 rpm 으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 이들 상층액 중 200 ㎕를 100 μM 의 파라-니트로페닐 팔미테이트 (p-nitrophenyl palmitate) 용액 3 ml와 혼합한 후 45 ℃에서 10 분간 배양한 다음, 405 nm의 파장의 빛에 대한 흡광도를 측정함으로써 리파아제의 활성을 측정하였다. 리파아제의 활성은 1 μmol의 파라-니트로페닐 팔미테이트를 1 분에 분해할 수 있는 양을 1 unit으로 정의하였다.
상기 변이주의 형질전환 효율은 몰차노바의 염화칼슘-열충격 형질전환 방법 (Molchanova, E. S., Genetika, 19, 375, 1983)을 변형하여 측정하였다. 통상적으로 많이 이용되는 플라스미드 벡터 pUC19(New England Biolabs, Beverly, MA)를 야생형 대장균과 본 발명의 생물막 형성이 저해된 DEB31에 전달하였다. 얼음 속에 놓여진 각 변이주 competent cell 0.2 ml에 1ng에서 100ng까지의 다양한 농도의 플라스미드 벡터를 첨가하고 정치한 다음, 30분 후 열충격을 42 ℃에서 90초간 주고 800ml의 LB 배지를 추가한 뒤 37 ℃에서 1 시간동안 정치하였다. 이렇게 벡터가 전달된 대장균들을 암피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 후, 37 ℃에서 16 시간 배양한 다음 살아있는 변이주의 수를 확인하였다.
본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1
생물막 형성 관련 유전자가 제거된 대장균 변이주의 제조
대장균 K-12 (F- lambda-)인 MG1655(서울대학교 미생물학과 노정혜 교수)로부터 각각 csg 유전자군, fim 유전자군, 또는 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주 DEB11, DEB12, 및 DEB13, 상기 유전자군 중 두 개의 유전자군이 동시에 제거된 대장균 변이주 DEB21, DEB22, 및 DEB23, 및 상기 세 개의 유전자군이 모두 제거된 대장균 변이주 DEB31를 얻었다.
1-1. csg 유전자군( csgDEFGBA )이 제거된 대장균 변이주 DEB11의 제조
우선, I-SceI 제한효소 절제부위(SEQ ID NO:32)를 갖는 pST76K (Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15) 벡터와 CmR 유전자(SEQ ID NO:34)를 갖는 pSG76C (Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15) 벡터를 각각 두 개의 제한효소 KpnI(New England Biolabs, Beverly, MA)와 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 그리고 나서, 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 CmR 유전자를 KpnI(New England Biolabs, Beverly, MA)와 BamHI (New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 절단시킨 선상의 pST76K 벡터에 삽입하고, 이를 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 한 번 더 절단한 후, 여기에 pDELTA(GIBCOBRL-DELETION FACTORY SYSTEM VERSION 2.) 벡터를 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 절단하여 얻은 sacB 유전자(SEQ ID NO:31)를 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 삽입하여 벡터를 제조하였다.
그리고 나서, 대장균 염색체 중 제거될 부분(csgDEFGBA)양 말단 부분의 약 500 염기쌍 부분을 PCR 하여, 제거될 염색체 양 말단 부분과 상동인 상동부위 A(SEQ ID NO:7) 및 C(SEQ ID NO:9)를 얻었다. 상기 상동부위 A 및 C는 상기 벡터의 양 말단에 결합하여 람다-레드 동성 재조합에 관여하게 된다. 또한, 상기 제거될 염색체 양 말단 부분 중 어느 한쪽과 인접한 약 500bp 염기서열 부분을 PCR 하여, 상기 벡터의 한 쪽 말단에 결합하여 선별 마커 제거시의 동성 재조합에 관여하는 상동부위 B(SEQ ID NO:8)를 얻었다. 상기 벡터 양 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한 쪽 말단에 상동부위 B를 위치시킨 후, PCR 반응시켜서 선형 DNA 단편(SEQ ID NO:10)을 얻었다. 도 2의 (a)는 상동부위 A, B 및 C를 얻기 위한 PCR 과정을 나타내며, (b)는 선형 DNA 단편을 얻기 위한 PCR 과정을 나타내는 것으로, 여기에 사용되는 프라이머들은 다음과 같다.
프라이머 AA: 5'-ggtgactggaaactggtgtta-3' (SEQ ID NO:1)
프라이머 AB: 5'-attatcggttatgaaagcaac-3' (SEQ ID NO:2)
프라이머 BA: 5'-gttgctttcataaccgataataccattattcctgaagtcactct-3' (SEQ ID NO:3)
프라이머 BB: 5'-attaatttcgataagccagatcagttcatttctacgggtgatga-3' (SEQ ID NO:4)
프라이머 CA: 5'-gagtcgacctgcaggcatgcattgcagcaatcgtattct-3' (SEQ ID NO:5)
프라이머 CB: 5'-taaaggttatctgactggaaa-3' (SEQ ID NO:6)
증폭된 DNA는 뉴클레오진 겔-추출 키트(Nucleogene Gel-Extraction KIT)를 사용하여 분리하였다.
이와 같이 제작된 선형 DNA 단편을 표준적인 일렉트로포레이션법 [Bio-RAD, Bacterial electro-transformation and Plus Controller Instruction Manual, Cat.No 165-2098; Thompson, JR, et al. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electrophoration. Yeast 14, 565-571 (1998); Grant, SG, et al. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methyllation-restriction mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4645-4649 (1990)]을 통해서 대장균 MG1655(서울대학교 미생물학과 노정혜 교수) 균주내로 전달시켰다. 이 때, 상기 선형 DNA 단편은 균주 염색체와 두 부분의 상동부위(A 및 C)를 가지므로 이 두 부분 사이의 균주 유전자가 제거되고 선형 DNA 단편으로 대체된다. 상기 선형 DNA 단편으로 대체된 대장균 변이주는 선형 DNA 단편에 존재하는 CmR 유전자 때문에 클로람페니콜 저항성을 가지므로, 클로람페니콜 배지에서 선별하였다.
이와 같이, csg 유전자군이 대체되고 선별 마커를 갖는 대장균 변이주에 I-SecI 발현 벡터로서 pST98AS(ACCESSION AF170483, Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15)를 도입시켰다.
pST98AS에 존재하는 I-SceI 제한효소 유전자는 테트라사이클린 프로모터에 의해 전사 조절되므로, 클로로테트라사이클린이 존재하는 배지에서 배양하여 I-SceI 제한효소를 발현시켰다. 이 때, 상기 배지에 자당(sucrose)을 포함시킴으로써, 상기 대장균에 도입된 선형 DNA 단편 상에 존재하는 sacB 유전자의 발현을 유도하였다. I-SceI 제한효소에 의한 미생물 염색체의 특정부위가 절제되어, 상기 도 입된 선형 DNA 단편들에 존재하는 미생물 유래의 부위와, 이와 동성을 갖는 미생물 염색체에 존재하는 부위와의 동성 재조합이 유도되어 선별 마커 및 sac B 유전자 부위가 대장균 염색체에서 제거되어, 레반 독성을 잃게 되므로, 자당이 포함된 배지에서 배양하여 선별 마커가 제거된 변이주를 선별할 수 있다(도 2 참조). 선별된 변이주를 PCR 반응하여 csgDEFGBA 유전자가 제거되었음을 확인하였고, 이를 DEB11이라고 명명하였다.
1-2. fim 유전자군( fimBEAICDFGH )이 제거된 대장균 변이주 DEB12의 제조
실시예 1-1과 동일한 방법으로, 다음과 같은 서열의 상동부위 A(SEQ ID NO:17), B(SEQ ID NO:18), C(SEQ ID NO:19) 및 프라이머를 사용하여 제작된 선형 DNA 단편(SEQ ID NO:20)을 이용하여, 유전자 fimBEAICDFGH이 제거된 대장균 변이주를 제작하고, 이를 DEB12라 명명하였다.
프라이머 AA: 5'-caatctcatggcgtaagct-3' (SEQ ID NO:11)
프라이머 AB: 5'-gatttcactatgggtcagga-3' (SEQ ID NO:12)
프라이머 BA: 5'-cctgacccatagtgaaatcgtctgggattaacggcaa-3' (SEQ ID NO:13)
프라이머 BB: 5'-attaatttcgataagccagatctagatccagcaactggtca-3' (SEQ ID NO:14)
프라이머 CA: 5'-gagtcgacctgcaggcatgcccggaaaccattacagact-3' (SEQ ID NO:15)
프라이머 CB: 5'-ccgtgttattcgctggaa-3' (SEQ ID NO:16)
1-3. wca 유전자군( wza wzb wzc wcaABCDEF gmd wcaGHI manC manB wcaJ wzx wcaKL )이 제거된 대장균 변이주 DEB13의 제조
실시예 1-1과 동일한 방법으로, 다음과 같은 서열의 상동부위 A(SEQ ID NO:27), B(SEQ ID NO:28), C(SEQ ID NO:29) 및 프라이머를 사용하여 제작한 선형 DNA 단편(SEQ ID NO:30)을 이용하여, 유전자 wza wzb wzc wcaABCDEF gmd wcaGHI manC manB wcaJ wzx wcaKL이 제거된 대장균 변이주를 제작하고, 이를 DEB13라 명명하였다.
프라이머 AA: 5'-gttatgaaatccctggcgt-3' (SEQ ID NO:21)
프라이머 AB: 5'-ggctttatagaggagaacgcat-3' (SEQ ID NO:22)
프라이머 BA: 5'-atgcgttctcctctataaagccccgcttatcaaggttactgac-3' (SEQ ID NO:23)
프라이머 BB: 5'-attaatttcgataagccagatcgtcaacctaaagaaactcctaa-3' (SEQ ID NO:24)
프라이머 CA: 5'-gagtcgacctgcaggcatgcccattgtgtgttagcacca-3' (SEQ ID NO:25)
프라이머 CB: 5'-gctgatttcgatctcgaca-3' (SEQ ID NO:26)
1-4. csg 유전자군과 fim 유전자군이 제거된 대장균 변이주 DEB21의 제조
실시예 1-1 및 1-2를 연속 수행하여 csg 유전자군과 fim 유전자군이 제거된 대장균 변이주를 제작하고, 이를 DEB21이라 명명하였다.
1-5. csg 유전자군과 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주 DEB22의 제조
실시예 1-1 및 1-3을 연속 수행하여 csg 유전자군과 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주를 제작하고, 이를 DEB22라 명명하였다.
1-6. fim 유전자군과 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주 DEB23의 제조
실시예 1-2 및 1-3을 연속 수행하여 fim 유전자군과 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주를 제작하고, 이를 DEB23이라 명명하였다.
1-7. csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주 DEB31의 제조
실시예 1-1, 1-2 및 1-3을 연속 수행하여 csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군이 제거된 대장균 변이주를 제작하고, 이를 DEB31이라 명명하고, 2002년 11월 13일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC 10374BP로 기탁하였다.
실시예 2
생물막 억제 확인
실시예 1-1 내지 1-7에서 얻은 대장균 변이주들의 생물막 형성이 친주인 MG1655와 비교하여 억제되었는지를 알아보기 위하여, 상기한 도렐의 방법을 이용하여 상기 변이주들과 친주 MG1655의 부착도(adherence percentage)를 측정하여 도 4에 나타내었다.
Figure 112004039872119-pat00001
그 결과, 하나의 유전자군만 제거된 변이주들인 DEB11, DEB12와 DEB13에서도 벽에 붙어서 자라는 미생물의 수가 급격히 감소함을 볼 수 있었고, 그 중에서도 특히 DEB11, 즉, 컬리가 제거되는 경우가 붙어서 자라는 대장균의 수를 15%가량 줄일 수 있음이 나타났다.
또한, 제거된 유전자군이 2 개 또는 3 개로 늘어날수록 붙어서 자라는 대장균의 수가 더욱 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 3개의 유전자군이 모두 제거된 대장균 변이주 DEB31의 경우에는 단지 약 6% 가량의 대장균만이 붙어서 자라는 것을 알 수 있었다(도 4).
실시예 3
변이주의 항생제 민감도 측정
실시예 2에서 생물막에 관련된 유전자군들을 제거함으로써 생물막의 형성이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었던 대장균 변이주들을 가지고 실질적으로 생물막의 형성이 감소한 것이 항생제에 대한 민감도를 증가시켰는지를 확인하기 위한 실험을 실시하였다.
200㎕의 LB배지가 들어있는 96 웰 플레이트에 각 변이주들을 24시간동안 배양한 다음, 암피실린의 경우 0 에서 128㎍/ml까지, 스트렙토마이신의 경우 0에서 64㎍/ml까지, 그리고 리팜피신의 경우 0 에서 256㎍/ml 까지 2 배씩 농도를 증가시키며 첨가해 주었다. 이렇게 항생제들이 첨가된 것을 추가로 10시간 동안 30 ℃에서 배양한 후, 플레이트 카운팅을 통하여 살아있는 변이주의 수를 확인하여 각각 도 5, 도 6 및 도7에 나타내었다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 암피실린의 경우, 일반적으로 선별에 쓰이 는 농도인 50㎍/ml에서의 친주인 MG1655의 살아남은 대장균 수와 세 개의 유전자군이 제거된 DEB31에서 상기 농도의 약 1/25인 2㎍/ml 에서의 살아남은 대장균 수가 동일한 결과가 나왔다. 즉, 본 발명의 상기 세 개의 유전자군이 제거된 대장균 변이주는 암피실린에 대하여 25 배 증가된 민감도를 가지며, 25 배 감소된 양의 암피실린으로 동일한 정도의 선별 효과를 얻을 수 있었다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 스트렙토마이신의 경우, 일반적으로 선별에 쓰이는 농도인 30㎍/ml에서의 친주인 MG1655의 살아남은 대장균 수와 세 개의 유전자군이 제거된 DEB31에서 상기 농도의 약 1/4인 8㎍/ml 에서의 살아남은 대장균 수가 동일한 결과가 나왔다. 즉, 본 발명의 상기 세 개의 유전자군이 제거된 대장균 변이주는 스트렙토마이신에 대하여 4 배 증가된 민감도를 가지며, 4 배 감소된 양의 스트렙토마이신으로 동일한 정도의 선별효과를 얻을 수 있었다.
이러한 결과는 리팜피신에 대해서도 동일하게 나타났다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 일반적으로 균주 선별에 쓰이는 리팜피신 농도인 150㎍/ml에서의 친주인 MG1655의 살아남은 대장균 수가 세 개의 유전자군이 제거된 DEB31에서 상기 농도의 약 1/5인 32㎍/ml에서 살아남은 대장균 수와 동일한 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 대장균 변이주가 리팜피신에 대하여 5 배 정도 더 민감하게 반응함을 확인할 수 있었다.
실시예 4
변이주의 생산물 분비효율 측정
실시예 2에서 생물막에 관련된 유전자군을 제거함으로써 생물막의 형성이 현 저히 감소하였음을 확인할 수 있었던 대장균 변이주들을 가지고 실질적으로 생물막의 형성이 감소한 것이 생산물의 분비효율을 증가시켰는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
리파아제의 생산을 위한 유전자를 가지고 있는 pHOPE (Ahn J.H., J. Bacteriol, 181, 1847, 1999) 발현벡터와 리파아제의 분비를 위한 유전자들을 가지고 있는 pABC-ACYC (Ahn J.H., J. Bacteriol, 181, 1847, 1999) 발현벡터를 통상적인 일렉트로포레이션(electrophoration)을 방법을 이용하여 미생물 균주에 전달하였다. 50ml의 LB 배지가 들어있는 250ml 플라스크에 변이주를 접종하여 배양한 후, 일정 시간마다 1ml의 배지를 수확한 다음, 13000rpm 으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 이들 상층액중 200 μl를 100 μM 의 파라-니트로페닐 팔미테이트 (p-nitrophenyl palmitate) 용액 3 ml과 혼합한 후 45 ℃에서 10분간 배양한 다음, 405nm의 파장의 빛에 대한 흡광도를 측정함으로써 리파아제의 활성을 측정하였다. 리파아제의 활성은 1 μmol의 파라-니트로페닐 팔미테이트를 1 분에 분해할 수 있는 양을 1 unit으로 정의하였다.
실험 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 리파아제의 배지 내 분비량이 최대값에 이르는 24시간 후에는 약 11%정도 DEB31 변이주가 더 높은 리파아제 활성을 보였다. 또한, 시간이 24시간을 지나 더 길어질수록 그 차이가 커짐을 확인할 수 있었다.
실시예 5
변이주의 형질전환 효율 측정
실시예 2에서 생물막에 관련된 유전자군을 제거함으로써 생물막의 형성이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었던 대장균 변이주들을 가지고 실질적으로 생물막의 형성이 감소한 것이 플라스미드 벡터의 형질전환 효율을 증가시켰는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
통상적으로 널리 이용되는 플라스미드 벡터 pUC19를 염화칼슘-열충격 형질전환 방법(Molchanova, E. S., Genetika, 19, 375, 1983)을 이용하여 야생형 대장균과 생물막 형성이 저해된 DEB31에 전달하였다. 이렇게 벡터가 전달된 대장균들을 암피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 후, 37 ℃에서 16 시간 배양한 다음 살아있는 변이주의 수를 확인하여 표 1에 나타내었다.
표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 생물막 형성이 억제된 변이주가 야생형 보다 형질전환 효율이 20배 더 큰 것으로 나타났다.
생물막 형성 억제 변이주의 형질전환 효율
형질전환된 pUC19 양(ng) 형질전환 효율 (CFU/㎍)
MG1655 DEB31
1 3.3 x 105 7.4 x 106
10 3.4 x 105 8.1 x 106
100 3.6 x 105 8.1 x 106
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은, 기존 대장균의 생물막 형성에 관여된 유전자를 제거함으로써 항생제에 대해 민감도가 높아져, 균주의 선별 등에 있어 더 적은 양의 항생제로도 같은 효과를 얻을 수 있게 하며, 같은 양의 항생제에 있어서 는 원하지 않는 균주가 살아남을 확률을 줄여주기 때문에 대장균을 이용한 산업용 변이주의 개발에 유리할 뿐만 아니라, 산업공정에서도 더 적은 항생제를 필요로 함으로 인해 비용절감의 효과를 거둘 수 있다. 또한, 생물막의 제거로 인해 생산물의 분비 효율이 증가됨으로써, 배지 내로 분비하여 수득하는 생산물들의 생산효율을 증가시키는 효과를 거둘 수 있다. 그리고, 생물막 형성의 저해로 외래 유전자의 형질 전환 효율이 증가하여 유용 물질 생산이 더욱 용이하다. 부가적으로, 생물막의 형성으로 인해 산업공정에 사용되는 장비들이 빠르게 노화되는 것을 막을 수 있어 이로 인한 비용절감의 효과를 거둘 수 있다.
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Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 양 말단에 람다-레드 재조합을 위한 약 500 bp의 상동부위 A 및 C를 포함하고, 그 내부에 선별 마커, I-SceI 제한효소 절단부위(SEQ ID NO: 32) 및 sacB 유전자(SEQ ID NO: 31)를 포함하고, 상기 상동부위 A 및 C 내부에 이들 중 하나와 연결하여 위치하는 동성 재조합을 위한 상동부위 B를 포함하는 미생물 유전자 결실을 위한 선형 DNA 단편으로서,
    상기 상동부위 A 및 C는 각각 제거될 미생물 유전자 부위의 양 말단과 연결된 500 bp의 미생물 유전자 부위와 상동이고,
    상기 상동부위 B는 상기 제거될 미생물 유전자 부위의 양 말단 중 어느 하나와 연결된 500 bp의 미생물 유전자 부위와 상동인 것인 선형 DNA 단편을 사용하는 람다-레드 재조합 및 동성 재조합에 의하여,
    대장균 유전자 중 대장균 생물막 형성에 관여하는 csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군으로 이루어진 군 중에서 한 가지 이상이 제거되어 생물막 형성이 억제된 것을 특징으로 하는 대장균 변이주.
  4. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO:10, 20 및 30의 염기 서열을 갖는 선형 DNA 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 사용하는 람다-레드 재조합 및 동성 재조합에 의하여, csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군 중 한 가지 이상이 제거되어 생물막 형성이 억제된 것을 특징으로 하는 대장균 변이주.
  5. 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO:10, 20 및 30의 염기 서열을 갖는 선형 DNA 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 두 가지 이상을 사용하는 연속적인 람다-레드 재조합 및 동성 재조합에 의하여, csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군 중에서 두 가지 이상이 제거되어 생물막 형성이 억제된 것을 특징으로 하는 대장균 변이주.
  6. 제 5 항에 있어서, SEQ ID NO:10, 20 및 30의 염기 서열을 갖는 선형 DNA 단편을 모두 사용하는 연속적인 람다-레드 재조합 및 동성 재조합에 의하여, csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군이 모두 제거되어 생물막 형성이 억제된 것을 특징으로 하는 대장균 변이주.
  7. 제 6 항에 있어서, DEB31(수탁번호 KCTC 10374BP)인 대장균 변이주.
  8. 양 말단에 람다-레드 재조합을 위한 약 500 bp의 상동부위 A 및 C를 포함하고, 그 내부에 선별 마커, I-SceI 제한효소 절단부위(SEQ ID NO: 32) 및 sacB 유전자(SEQ ID NO: 31)를 포함하고, 상기 상동부위 A 및 C 내부에 이들 중 하나와 연결하여 위치하는 동성 재조합을 위한 상동부위 B를 포함하는 미생물 유전자 결실을 위한 선형 DNA 단편으로서, 상기 상동부위 A 및 C는 각각 제거될 미생물 유전자 부위의 양 말단과 연결된 500 bp의 미생물 유전자 부위와 상동이고, 상기 상동부위 B는 상기 제거될 미생물 유전자 부위의 양 말단 중 어느 하나와 연결된 500 bp의 미생물 유전자 부위와 상동인 것인 선형 DNA 단편을 제조하고 (제 1 단계),
    상기 선형 DNA 단편을 미생물에 도입시키고, 상기 상동부위 A 및 C와 이들의 미생물 유전자 상동부위 간의 람다-레드 재조합 및 이어지는 상기 상동부위 B와 이의 미생물 유전자 상동부위 간의 동성 재조합에 의하여 미생물의 제거하고자 하는 염새체 부위를 상기 선형 DNA 단편으로 대체시켜, 미생물을 상기 선형 DNA 단편으로 형질전환시킨 후, 선별 마커에 해당하는 항생제 함유 배지에서 배양하여 형질전환된 미생물을 선별하고 (제 2 단계),
    상기 선별된 형질전환된 미생물에 I-SceI 제한효소 발현벡터를 도입하여, 상기 선별 마커와 sacB 유전자를 제거한 후, 자당이 포함된 배지에서 배양하여, 선별마커가 제거된 형질전환체를 선별하는 단계(제 3 단계)를 포함하는,
    미생물 유전자 중 생물막 형성에 관여하는 csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군으로 이루어진 군 중에서 한 가지 이상을 제거하는 것을 특징으로 하는 미생물 변이주의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 제 2 단계 및 상기 제 3 단계를 반복 수행하여 연속적으로 다수의 유전자 부위를 제거시키는 것을 특징으로 하는 미생물 변이주의 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 상동부위 A, B, 및 C로서,
    SEQ ID NO: 7, 8 및 9를 사용하여 csg 유전자군을 제거하거나;
    SEQ ID NO: 17, 18 및 19를 사용하여 fim 유전자군을 제거하거나; 또는
    SEQ ID NO: 27, 28 및 29를 사용하여 wca 유전자군을 제거하는 것을 특징으로 하는 것을 미생물 변이주의 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군으로 이루어진 군 중에서 두 가지 이상을 제거하는 것을 특징으로 하는 미생물 변이주의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, csg 유전자군, fim 유전자군 및 wca 유전자군을 모두 제거하는 것을 특징으로 하는 미생물 변이주의 제조 방법.
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