ES2232196T3 - Inhibidor de la serin proteasa. - Google Patents
Inhibidor de la serin proteasa.Info
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Abstract
Proteína aislada que tiene un peso molecular de aproximadamente 55 kDa y una secuencia de aminoácidos que incluye una o más de las siguientes: (a) SEQ ID No. 1; (b) SEQ ID No. 2; (c) SEQ ID No. 3; (d) SEQ ID No. 4; (e) SEQ ID No. 5; o un fragmento activo de las mismas.
Description
Inhibidor de la serin proteasa.
Esta invención se refiere a una proteína y
composiciones que la contienen. Más particularmente, se refiere a
una proteína que, entre otras cosas, muestra actividad como agente
de unión de cationes metálicos y como agente antitrombina.
La trombina es una serin proteasa involucrada en
la coagulación sanguínea. Tiene especificidad para la escisión de
enlaces arginina-lisina, así como la escisión de un
enlace arginina-treonina en la protrombina,
liberando pretrombina que posteriormente se escinde para producir
trombina activa. Esta trombina activa puede liberar entonces más
trombina a partir de protrombina. En la formación de trombos y la
coagulación sanguínea, la trombina escinde el fibrinopéptido B del
fibrinógeno, así como también convierte los factores sanguíneos IX
en IXa, V en Va, VIII en VIIIa y XIII en XIIIa.
Por tanto, los inhibidores de la trombina inhiben
la coagulación y tienen aplicación en cualquier procedimiento en el
que no se desee la coagulación. Una aplicación tal es en la recogida
y el almacenamiento de productos sanguíneos. Otra es en medicamentos
para prevenir o reducir la coagulación, por ejemplo, en el
tratamiento o la prevención de disfunciones cardiacas.
Se conocen agentes antitrombina. Un ejemplo es la
antitrombina III (AT-III). Sin embargo, la
AT-III sólo puede inhibir eficazmente la trombina en
presencia de heparina.
Los solicitantes han identificado ahora una
proteína novedosa que tiene una variedad de actividades, incluyendo
actividad antitrombina, y que cuando es activa frente a la trombina
no requiere heparina como cofactor. Esta invención se refiere en
líneas generales a esta proteína.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una proteína aislada que tiene un peso molecular de
aproximadamente 55 kDa y una secuencia de aminoácidos que incluye
una o más de las siguientes:
- (a)
- DGEQCNDGQN (SEQ ID NO. 1);
- (b)
- QGGHEVESERVACCVIGRA (SEQ ID NO. 2);
- (c)
- GQSHPEIVH (SEQ ID NO. 3);
- (d)
- YHGHDDA (SEQ ID NO. 4);
- (e)
- VVNEVHH (SEQ ID NO. 5);
o un fragmento activo de las
mismas.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos
de:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
o un fragmento activo de las
mismas.
En un aspecto adicional todavía, la invención
proporciona una proteína aislada que puede obtenerse a partir de la
hemolinfa de Perna canaliculus que tiene un peso molecular
aparente de 75 kDa determinado mediante PAGE (electroforesis en gel
de poliacrilamida) y que tiene actividad como un inhibidor de la
serin proteasa y/o un agente de unión de cationes divalentes, o un
fragmento activo de los mismos.
De manera conveniente, dicha proteína o fragmento
tiene actividad como:
(i) un inhibidor de la serin proteasa; o
(ii) un agente de unión de cationes
divalentes.
La invención proporciona además una proteína que
puede obtenerse a partir de Perna canaliculus o un molusco
distinto a Perna canaliculus y es una variante funcionalmente
equivalente de una proteína o fragmento tal como se describió
anteriormente, porque da reacción cruzada inmunológicamente con una
proteína o fragmento, tal como se describió anteriormente, y tiene
al menos la misma actividad como inhibidor de la serin proteasa y/o
de unión de cationes divalentes como una proteína o fragmento tal
como se describió anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona un
polinucleótido que codifica para una proteína o fragmento tal como
se definió anteriormente.
El polinucleótido puede comprender la secuencia
de nucleótidos de
o una variante de la
misma.
La invención también proporciona un
polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.
8, así como un polinucleótido que se hibrida en condiciones
rigurosas con un polinucleótido tal como se definió
anteriormente.
Todavía más, la presente invención proporciona un
vector o constructo que incluye un polinucleótido tal como se
definió anteriormente, así como una célula huésped que expresa un
polinucleótido tal como se definió anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición que comprende una proteína o fragmento tal como se
definió anteriormente.
La composición puede ser un medicamento, un
alimento, un complemento dietético (que incluye opcionalmente la
proteína o fragmento asociado con o unido a al menos un catión
divalente de importancia en la dieta, tal como calcio, magnesio o
zinc) o un agente de biorremediación.
Aunque la presente invención es en términos
generales tal como se definió anteriormente, también incluye
realizaciones, de las cuales, la siguiente descripción proporciona
ejemplos. En particular, se obtendrá una mejor comprensión de la
presente invención mediante la referencia a los dibujos adjuntos, en
los que
Figura 1: Purificación de pernín de hemolinfa de
mejillón.
- a)
- banda de dispersión de la luz tras centrifugación de hemolinfa de P. canaliculus en CsCl; la hemolinfa se centrifugó en primer lugar a baja velocidad para eliminar los hemocitos y luego a alta velocidad; el sedimento resuspendido se centrifugó después en CsCl.
- b)
- Perfil de absorción UV (longitud de onda de 254 nm) del fraccionamiento del gradiente de CsCl; el material que dispersa la luz aparece como un pico en la figura 1a.
- c)
- Composición proteica en fracciones de 1 ml de un gradiente de CsCl tras electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12%; las bandas fuertemente teñidas (Coomassie) coinciden con la posición de las regiones de dispersión de luz y absorción UV del gradiente; el peso molecular fue de aproximadamente 75 kDa comparado con los patrones polipeptídicos de peso molecular (carril 6) (véase la figura 4a para los patrones). Los carriles 1-5 y 7-9 contenían muestras del gradiente de CsCl.
Figura 2: Partículas similares a virus observadas
mediante microscopía electrónica de transmisión de material en la
banda de dispersión de la luz en un gradiente de CsCl. La barra en
la micrografía representa 100 nm.
Figura 3: Perfil de elución de HPLC de pernín a
una longitud de onda de 280 nm, purificado mediante centrifugación
con gradiente de CsCl.
Figura 4: perfiles de SDS-PAGE
(geles al 12%) de especies de proteína de agregación procedentes de
P. canaliculus y otras especies de molusco.
- a)
- Proteínas extraídas de un molusco completo y purificadas tal como se describe en Materials and Methods: carril 1: patrones de peso molecular (Bio-Rad, EE.UU.): pb fosforilasa B, 97,4 kDa; bsa albúmina de suero bovino, 66 kDa; ova ovoalbúmina, 45 kDa; ca anhidrasa carbónica, 31 kDa; carril 2: mejillón Greenshell^{MR} (de concha verde) P. canaliculus; carril 3: mejillón azul Mytilis edulis; carril 4: ostra Crassostrea gigas; carril 5: pipis Paphies australis.
- b)
- Análisis mediante PAGE de transferrina humana (Sigma, EE.UU., PM aproximadamente 80 kDa), una proteína glicosilada, y pernín de P. canaliculus tras tratamiento con endoglicosidasa F: carril 1: transferrina no tratada; carril 2: transferrina tratada con glicosidasa F; carril 3: pernín no tratado; carril 4: pernín tratado con glicosidasa F.
Figura 5: Actividad de la proteína de hemolinfa
de P. canaliculus tras centrifugación en un filtro de
exclusión por peso molecular de 30 kDa, durante 10 minutos a 1000
g (filtro Ultrafree-MC, exclusión de PM de
30.000, Millipore, EE.UU.).
- a)
- Perfil de SDS-PAGE de la proteína de hemolinfa en diversas fases de purificación. Carril 1: hemolinfa "bruta" (hemocitos eliminados); carril 2: sedimento resuspendido tras ultracentrifugación de hemolinfa "bruta" durante 80 minutos a 250.000 g; carril 3: retenido de pernín; carril 4: filtrado (sin proteínas evidentes); carril 5: marcadores de peso molecular, (véase la figura 4a); carriles 6, 7: diluciones de 10 veces de las muestras de los carriles 2 y 3.
- b)
- Actividad antitrombina del retenido y filtrado del filtro de exclusión de PM de 30.000.
con+ = la dilución 1/41 patrón de plasma
humano (es decir, actividad antitrombina III patrón);
con- = trombina sin plasma añadido
(control de tampón);
filtrado: material que pasó a través del
filtro de exclusión de PM de 30.000;
retenido: proteína pernín retenida por el
filtro de exclusión.
Tal como se ha expuesto en términos generales
anteriormente, en un aspecto la presente invención proporciona una
proteína novedosa. La proteína de la invención tiene un peso
molecular aparente de 75 kDa, calculado mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (PAGE). El peso molecular deducido a partir de
la secuencia génica es de aproximadamente 55 kDa.
Inicialmente, se identificó una proteína
específica de la invención como un extracto procedente del mejillón
de labio verde de Nueva Zelanda P. canaliculus. Por tanto,
puede obtenerse mediante extracción directamente de P.
canaliculus.
Esta proteína tiene la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO. 7.
La proteína de la invención puede incluir su
secuencia de aminoácidos nativa completa o puede incluir sólo partes
de esa secuencia, en las que tales partes constituyen fragmentos que
siguen siendo biológicamente activos (fragmentos activos). Tal
actividad normalmente será como un inhibidor de la serin proteasa o
un agente de unión de cationes divalentes, pero no se limita a estas
actividades.
La invención también incluye dentro de su alcance
variantes funcionalmente equivalentes de la proteína de SEQ ID NO.
7.
La frase "variantes funcionalmente
equivalentes" reconoce que es posible variar los aminoácidos de
una proteína, mientras se mantiene una funcionalidad sustancialmente
equivalente. Por ejemplo, una proteína puede considerarse un
equivalente funcional de otra proteína, para una función específica,
si el péptido equivalente da reacción cruzada inmunológicamente con
y tiene al menos sustancialmente la misma función que la proteína
original.
No es necesario que la proteína funcionalmente
equivalente sea del mismo tamaño que la original. El equivalente
puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína, una fusión de
la proteína con otra proteína o soporte, o una fusión de un
fragmento con aminoácidos adicionales. También es posible sustituir
aminoácidos en una secuencia con aminoácidos equivalentes,
utilizando técnicas convencionales. Grupos de aminoácidos para los
que normalmente se mantiene que son equivalentes son:
a) Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
b) Asn, Asp, Glu, Gln;
c) His, Arg, Lys;
d) Met, Leu, Ile, Val; y
e) Phe, Tyr, Trp.
Pueden alinearse secuencias polipeptídicas y
puede determinarse el porcentaje de aminoácidos idénticos en una
región especificada frente a otra secuencia, utilizando algoritmos
informáticos que están a disposición del público. Puede examinarse
la similitud de secuencias polipeptídicas utilizando el algoritmo
BLASTP. El software BLASTP está disponible en el servidor FTP
anónimo del NCBI (National Center for Biotechnology Information,
Centro Nacional de Información sobre Biotecnología)
(ftp://ncbi.nlm.nih.gov) en /blast/executables/. El uso de
la familia BLAST de algoritmos, incluyendo BLASTP, se describe en el
sitio web del NCBI en la URL
http://www.ncbi.nml.nih.gov/BLAST/newblast.
html y en la publicación de Altschul, Stephen F., y col. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acid Res. 25:3389-34023.
html y en la publicación de Altschul, Stephen F., y col. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acid Res. 25:3389-34023.
La proteína de la invención junto con sus
fragmentos activos y otras variantes pueden generarse por medios
sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que tienen
menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de
aproximadamente 50 aminoácidos, pueden generarse mediante técnicas
bien conocidas para los expertos ordinarios en la técnica. Por
ejemplo, tales péptidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de
las técnicas en fase sólida disponibles comercialmente, tales como
el método de síntesis en fase sólida de Merryfield, en el que se
añaden consecutivamente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en
crecimiento (véase Merryfield, J. Am. Chem. Soc.
85:2146-2149 (1963)). Se dispone comercialmente de
equipo para la síntesis automática de péptidos de proveedores tales
como Perkin Elmer / Applied Biosystems, Inc. y puede hacerse
funcionar según las instrucciones del fabricante.
La proteína, o un fragmento o variante de la
misma, también puede producirse de manera recombinante insertando
una secuencia de polinucleótido (normalmente ADN) que codifica para
la proteína en un vector de expresión y expresando la proteína en un
huésped adecuado. Puede emplearse cualquiera de una variedad de
vectores de expresión conocidos para los expertos ordinarios en la
técnica. La expresión se consigue en cualquier célula huésped
apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de
expresión que contiene una molécula de ADN que codifica para la
proteína recombinante. Células huésped adecuadas incluyen células
procariotas, de levaduras y eucariotas superiores. Preferiblemente,
las células huésped empleadas son E. coli, levaduras o una
línea celular de mamífero, tal como COS o CHO, o una línea celular
de insecto, tal como SF9, utilizando un vector de expresión de
baculovirus. La secuencia de ADN expresada en esta materia puede
codificar para la proteína que se produce de manera natural,
fragmentos de la proteína que se produce de manera natural o
variantes de la
misma.
misma.
Las secuencias de ADN que codifican para la
proteína o fragmentos pueden obtenerse mediante el rastreo
("screening") de una biblioteca de ADN genómico o ADNc de P.
canaliculus apropiada para detectar secuencias de ADN que se
hibriden con oligonucleótidos degenerados derivados de secuencias
parciales de aminoácidos de la proteína. Pueden diseñarse
oligonucleótidos degenerados adecuados y sintetizarse mediante
técnicas habituales y el rastreo puede realizarse tal como se
describe, por ejemplo, en Maniatis y col. Molecular Cloning -
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring
Harbour, NY (1989). Puede emplearse la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para aislar una sonda de ácido nucleico del ADN
genómico, un biblioteca de ADN genómico o ADNc. Entonces, puede
realizarse el rastreo de la biblioteca utilizando la sonda
aislada.
Pueden prepararse variantes de la proteína
utilizando técnicas de mutagénesis habituales tales como mutagénesis
específica del sitio dirigida por el oligonucleótido.
Un polinucleótido específico de la invención
tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 6, tal como
sigue:
Un polinucleótido adicional tiene la secuencia
SEQ ID NO. 8, tal como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
siendo TGA el codón de terminación
ópalo y AATAAA la señal de
poliadenilación.
Las variantes u homólogos de las secuencias de
polinucleótidos anteriores también forman parte de la presente
invención. Las secuencias de polinucleótidos pueden alinearse y,
puede determinarse el porcentaje de nucleótidos idénticos en una
región especificada frente a otra secuencia, utilizando algoritmos
informáticos que están a disposición del público. Dos algoritmos a
modo de ejemplo para alinear e identificar la similitud de
secuencias de polinucleótidos son los algoritmos BLASTN y FASTA. El
software BLASTN está disponible en el servidor FTP anónimo del NCBI
(ftp://ncbi.nlm.nih.gov) en /blast/executables/. Se prefiere
el algoritmo BLASTN versión 2.0.4
[24-feb-1998], fijado en los
parámetros por defecto descritos en la documentación y distribuidos
con el algoritmo, para su uso en la determinación de variantes según
la presente invención. El uso de la familia BLAST de algoritmos,
incluyendo BLASTN, se describe en el sitio web del NCBI en la URL
http://www.ncbi.nml.nih.gov/BLAST/newblast.html
y en la publicación de Altschul, Stephen F., et al. (1997),
"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of
protein database search programs", Nucleic Acid Res.
25:3389-3402. El algoritmo informático FASTA está
disponible en Internet en el sitio ftp
ftp://ftp.virginia.edu.pub/fasta/. La versión 2.0u4, de
febrero de 1996, fijada en los parámetros por defecto descritos en
la documentación y distribuidos con el algoritmo, se prefiere para
su uso en la determinación de variantes según la presente invención.
El uso del algoritmo FASTA se describe en W R Pearson y D.J. Lipman,
"Improved Tools for Biological Sequence Analysis", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988) y W.R.
Pearson, "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and
FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98
(1990).
Todas las secuencias identificadas como
anteriormente se califican como "variantes", tal como se
utiliza este término en el presente documento.
Las secuencias de polinucleótidos variantes
generalmente se hibridarán con la secuencia de polinucleótido citada
en condiciones rigurosas. Tal como se utiliza en el presente
documento, "condiciones rigurosas" se refiere al lavado previo
con una disolución de 6X SSC, 0,2% de SDS, hibridación a 65ºC, 6X
SSC, 0,2% de SDS durante la noche; seguido por dos lavados de 30
minutos cada uno con 1X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC y dos lavados de 30
minutos cada uno con 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC. Tales secuencias
que pueden hibridarse incluyen aquellas que codifican para la
proteína equivalente de orígenes distintos (tales como moluscos) a
P. canaliculus.
Aunque pueden adoptarse los enfoques sintéticos o
recombinantes anteriores para producir la proteína de la invención,
sin embargo, es factible, y de hecho se prefiere en el presente
documento, obtener la proteína mediante su aislamiento de P.
canaliculus. Esto refleja el hallazgo de los solicitantes de que
la proteína es la proteína predominante de la hemolinfa de P.
canaliculus y también que la proteína es de autoagregación. Por
tanto, puede aislarse en cantidades comercialmente significativas
directamente desde el propio mejillón. Por ejemplo, pueden obtenerse
aproximadamente 2 mg de la proteína por ml de hemolinfa.
Una vez obtenida, la proteína se purifica
rápidamente, si se desea. Esto supondrá generalmente centrifugación,
en la que es importante la naturaleza de autoagregación de la
proteína. Sin embargo, también pueden seguirse otros enfoques de
purificación (por ejemplo, cromatografía).
Además, si se ve como deseable, pueden emplearse
etapas adicionales de purificación utilizando enfoques que son
habituales en esta técnica. Estos enfoques pueden suministrar, por
completo, una preparación sumamente pura de la proteína.
Una vez obtenida, la proteína y/o sus fragmentos
activos pueden formularse en una composición. Por ejemplo, la
composición puede ser una composición terapéutica para su aplicación
como producto farmacéutico, o puede ser un complemento dietético o
para la salud. De nuevo, pueden adoptarse los enfoques habituales
para formular tales composiciones.
Todavía más, la composición puede ser un alimento
en el que se incluye la proteína y/o sus fragmentos activos. Esto
puede producirse añadiendo la proteína a un producto alimenticio
preparado previamente o incorporando la proteína en una etapa del
proceso de fabricación del alimento.
Ahora se describirá la invención más
detalladamente en la siguiente sección experimental, que se facilita
sólo con fines ilustrativos.
Sección
1
A.1. Moluscos: se obtuvieron Perna
caniculus (el mejillón de labio verde de Nueva Zelanda; el
mejillón
Greenshell^{MR}) en tiendas de supermercados al por menor o directamente de criadores de mejillón; se obtuvieron otras especies de molusco de tiendas al por menor excepto para el mejillón azul Mytilis edulis que fue suministrado por Sandford's Fisheries (Havelock, Nueva Zelanda).
Greenshell^{MR}) en tiendas de supermercados al por menor o directamente de criadores de mejillón; se obtuvieron otras especies de molusco de tiendas al por menor excepto para el mejillón azul Mytilis edulis que fue suministrado por Sandford's Fisheries (Havelock, Nueva Zelanda).
A.2. Extractos: Se prepararon extractos de
mejillón homogeneizando mejillones con concha, enteros (hasta 120 mm
de longitud) en un procesador de alimentos comercial con la adición
de tampón fosfato de sodio 0,02 M, pH 7,2. Se mezcló diclorometano
(volumen de 1/2) con el extracto acuoso, se centrifugó a baja
velocidad (6000 rpm, rotor GSA, centrífuga Sorvall
RG-5B a 4ºC). Se añadió polietilenglicol (PEG) (PM
de 6000) a la fase acuosa hasta una concentración final del 10%
(p/v) y NaCl hasta 0,5 M y se agitó a 4-6ºC durante
la noche. Tras la centrifugación a baja velocidad, el precipitado
con PEG se resuspendió en aproximadamente un volumen de 1/10 de
tampón fosfato de sodio. Tras otro ciclo de centrifugación a baja
velocidad, el sobrenadante se centrifugó a alta velocidad (50.000
rpm en un rotor Beckman 60Ti a 4ºC durante 60-80
minutos). El sedimento resultante se resuspendió en un pequeño
volumen de tampón fosfato y se clarificó mediante centrifugación a
baja velocidad.
A.3. Electroforesis en gel de
poliacrilamida: Se prepararon geles de poliacrilamida al 12% (8
x 10 cm; 1 mm de espesor) utilizando una disolución madre preparada
según las instrucciones del fabricante (disolución 37,5:1 de bis /
acrilamida al 40%, Bio-Rad, EE.UU.); también se
utilizaron geles al 12% disponibles comercialmente
(Bio-Rad, EE.UU.). Se aplicaron las muestras (10
\mul) a los carriles y se corrieron los geles a 160 V utilizando
un tampón Tris/glicina/SDS patrón (Bio-Rad, catálogo
161-0732) hasta que el marcador de azul de
bromofenol alcanzó la parte inferior del gel. Los geles se tiñeron
con BM Fast Stain Coomassie® (Boehringer Mannheim, Alemania) y se
destiñeron según las instrucciones de fabricante.
A.4. Prueba de glicosilación: Se trataron
las muestras con N-glicosidasa F (PNGasa F de
Flavobacterium meningosepticum; Boehringer Mannheim
Biochemica, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Se
corrieron las muestras tratadas y no tratadas en un gel de
poliacrilamida al 12% habitual.
A.5. Gradientes isopícnicos: Se prepararon
disoluciones de CsCl (Boehringer Mannhein, Alemania) en tampón
fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2 y se filtraron a través de una
membrana de 0,22 \mum (Acrodisc, Gelman Sciences, EE.UU.) para
clarificarlas. Se prepararon gradientes de dos etapas (capa superior
de 1,25 g/cc que contenía la muestra y capa inferior de 1,45 g/cc)
tal como describe Scotti (1985) y se centrifugó durante
aproximadamente 17 horas a 20ºC, en un rotor Beckman 70Ti a 30.000
rpm. El gradiente resultante se fraccionó insertando un tubo capilar
de vidrio de 100 \mul en el gradiente y sacando lentamente el
contenido. Se monitorizó la absorbancia UV haciéndolo pasar a través
de un espectrofotómetro Uvicord (LKB Produkter, Suecia). Se
recogieron las fracciones y se midieron los índices de refracción
utilizando un refractómetro Abbé (Bellingham y Stanley, RU) y se
estimó la densidad utilizando las ecuaciones de regresión según el
método de Scotti (1985).
A.6. Cromatografía en vidrio poroso: Se
trató vidrio de poro controlado (CPG 240-80, Sigma
Chemical Co., EE.UU.) según las instrucciones de los proveedores. Se
preparó una columna de 1 cm x 100 cm (Bio-Rad,
EE.UU.). Se cargaron muestras (1-2 ml) en la columna
y se eluyeron con tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2, a través de
un espectrofotómetro Uvicord, recogiéndose las fracciones a
intervalos regulares.
A.7. Estimación de la concentración de
proteína: Se estimaron las concentraciones utilizando un patrón
de albúmina de suero bovino (Blot Qualified BSA, Promega, EE.UU.)
mediante absorción UV, según el método de Layne (1957) utilizando la
ecuación: proteína mg/ml = 1,55*A_{280} - 0,76*A_{260}.
Alternativamente, se estimó la concentración mediante la reacción de
Bradford, utilizando el reactivo suministrado por
Bio-Rad (EE.UU.) a una longitud de onda de 620
nm.
A.8. Cromatografía líquida de alta
resolución: Se realizó una HPLC en fase inversa en un HPLC HP
1050 serie Ti (Hewlett Packard, EE.UU.) dotado con una columna
analítica Vydac C-18 de 300 \ring{A}, 25 cm x 4,6
mm de d.i. La muestra de 10 \mul en agua se eluyó con un gradiente
de acetonitrilo al 0-100% en agua (v/v) durante 60
minutos y se registró la absorción a 218 y 280 nm.
Se observó una banda de dispersión de la luz tras
la centrifugación de los extractos de mejillones Greenshell^{MR}
enteros en gradientes de CsCl (figuras 1a y 1b). Se estimó que la
densidad de esta banda era de 1,368 g/cc. A veces, se observó una
banda minoritaria a aproximadamente 1,390 g/cc. Al obtener de nuevo
bandas en CsCl, la banda a 1,390 produjo dos bandas (una a 1,390
g/cc y una segunda a 1,368 g/cc). El análisis mediante
SDS-PAGE de las fracciones de cualquier densidad
proporcionó perfiles similares de polipéptidos con una única banda
principal. El peso molecular de la proteína se estimó mediante PAGE
como de 75.000 (75 kDa) (figura 1c). También se observaron varias
bandas minoritarias de peso molecular superior y una banda
minoritaria adicional de 45 kDa. La banda principal (denominada
pernín) a 75 kDa estuvo siempre en un gran exceso comparado con las
bandas minoritarias. Cuando se examinó material del material que
dispersa la luz procedente de los gradientes de CsCl mediante
microscopía electrónica, se observaron partículas que se parecen a
las de pequeños virus de ARN "vacíos" (figura 2). Sin embargo,
un barrido de longitudes de onda de UV indicó (datos no mostrados)
que estaba presente poca cantidad de ácido nucleico, si había
alguna, y que las partículas se componían principalmente de
proteína. La HPLC mostró que la banda de CsCl se componía de casi
únicamente una única especie de proteína (figura 3). Puesto que la
HPLC indicó un alto grado de pureza, se supone que los polipéptidos
de peso molecular superior son multímeros de pernín. Es probable que
la banda minoritaria de peso molecular inferior sea pernín
degragado.
La cromatografía, en una columna CPG
240-80, de extractos semipurificados, o de material
del que se obtienen bandas en CsCl, mostró que la mayoría de pernín
se eluyó en el volumen de exclusión utilizando tampón fosfato o Tris
de baja molaridad como eluyente. Por el contrario, una proteína de
tamaño similar, albúmina de suero bovino (68 kDa) se incluyó en la
matriz de la columna. Por tanto, parece que el pernín no se agrega a
estructuras similares a partículas, grandes en ciertas condiciones,
tal como se sospecha a partir de las partículas observadas en la
figura 2. La HPLC confirmó que el pernín procedente de P.
canaliculus obtenido mediante cromatografía CPG (de permeación
en gel) estaba sumamente purificado. La especie de proteína de
agregación también se detectó en los extractos de otros moluscos: el
mejillón azul Mytilis edulis, la ostra Crassostrea
gigas y pipis de Nueva Zelanda Paphies australis, pero no
en vieiras Pecten novaezealandiae. Estos polipéptidos eran de
peso molecular inferior al pernín (figura 4a). El pernín procedente
de P. canaliculus se N-glicosila tal como se
muestra por una reducción de su peso molecular, cuando se tratan con
endoglicosidasa F antes de PAGE (figura 4b).
El rendimiento de pernín procedente de las
extracciones de mejillones enteros fue en promedio de
aproximadamente 200 \mug/mejillón. Se obtuvieron rendimientos
mejorados de pernín mediante la extracción de hemolinfa directamente
de P. canaliculus vivos. Se realizó una pequeña muesca en la
concha utilizando una lima triangular y se insertó una aguja de
calibre 30 en el músculo aductor posterior. Pudieron extraerse
fácilmente de 1 a 5 ml de hemolinfa. La hemolinfa se centrifugó a
baja velocidad (\approx 1000 g) para eliminar los
hemocitos y el sobrenadante resultante se trató mediante
ultracentrifugación, por ejemplo, a 250.000 g durante 40
minutos, seguido por cromatografía CPG eluyendo con tampón fosfato
de sodio 0,1 M, pH 7,2, u obtención de bandas isopícnicas en CsCl en
tampón fosfato. El pernín obtenido de esta manera no pareció
diferente al purificado a partir de mejillones enteros y tenía la
ventaja de un aumento de 30 veces en el rendimiento a partir de cada
mejillón. La hemolinfa contenía aproximadamente 2 mg/ml (promedio de
\approx 5-6 mg/mejillón) de pernín, que es con
mucho la especie polipeptídica más predominante (figura 5a). El
tiempo para purificar el pernín se redujo desde aproximadamente 5
días hasta 1 día.
Se realizó la microsecuenciación de la región
N-terminal y los fragmentos internos generados por
la escisión química y enzimática del pernín purificado y generó las
siguientes secuencias de fragmentos escindidos:
(a) DGEQCNDGQN
(b) QGGHEVESERVACCVIGRA
(c) GQSHPEIVH
(d) YHGHDDA
(e) VVNEVHH.
Estas secuencias codifican para aminoácidos, tal
como sigue:
- A
- alanina
- C
- cistina
- D
- ácido aspártico
- E
- ácido glutámico
- F
- fenilalanina
- G
- glicina
- H
- histidina
- I
- isoleucina
- K
- lisina
- L
- leucina
- M
- metionina
- N
- asparagina
- P
- prolina
- Q
- glutamina
- R
- arginina
- S
- serina
- T
- treonina
- V
- valina
- W
- triptófano
- Y
- tirosina
Los datos de secuencia se compararon entonces con
las secuencias de aminoácidos en bases de datos informáticas
disponibles para la búsqueda. Se encontró que algunas secuencias
eran de especial interés:
a) una secuencia de un residuo de 10 aminoácidos
del extremo N-terminal de pernín (secuencia (a)
anterior) sólo mostró homología con una secuencia de proteína
antitrombina de 8 bases procedente de sanguijuelas terrestres (datos
de la patente de los EE.UU. 5.455.181, 3 de octubre de 1995:
secuencia 10).
Pernín de Perna caniculus
2 GEQCNDGQ
9
aminoácidos que coinciden G+
CNDGQ
antitrombina de sanguijuela
5 GQSCNDGQ
12
identidades: 6/8 (75%)
positivos: 7/8
(87%);
"+" indica un aminoácido
equivalente;
los números en negrita indican
una posición de
aminoácido
b) Se mostró que un producto de
escisión interna (secuencia (b) anterior) tenía homología con la
clase Cu-Zn de proteínas conocidas cono "SOD"
(superóxido
dismutasas).
Cada uno de los fragmentos (a) a (e) son parte de
una secuencia de aminoácidos de pernín mayor:
(Los caracteres en negrita indican los fragmentos
secuenciados directamente (a) a (e)).
Sección
2
Se examinó la posibilidad de que pernín pudiese
funcionar como un agente antitrombina en un ensayo cinético para
determinar la inhibición de la trombina.
Se realizaron análisis cinéticos utilizando un
kit antitrombina III Accucolor^{MR} (nº de catálogo CRS105, Sigma
Diagnostics, EE.UU.) con los reactivos preparados según las
instrucciones del proveedor. Instrumentation Laboratories (Italia)
suministró plasma patrón y se utilizó en la dilución recomendada de
1/41. Se diluyeron 9/10 las muestras de proteína de mejillón
purificada en agua añadiendo tampón de muestra 10x Sigma. Se
adquirió heparina a Instrumentation Laboratories. Se estimó
colorimétricamente la actividad de la trombina a 405 nm utilizando
un sustrato cromogénico
(H-D-HHT-L-Ala-L-Arg-pNa.2AcOH,
nº de catálogo A 8058, Sigma, EE.UU.) y un lector de placas
Multiskan Biochromatic (Labsystems, Finlandia).
Esto verificó que pernín tenía actividad
inhibidora. Cuando se centrifugó una preparación purificada de
pernín a través de un filtro de exclusión de PM de 30.000 (figura
5a), toda la actividad antitrombina estaba en el retenido y no había
presente actividad detectable en el filtrado (figura 5b). El suero
patrón se diluyó 1/41 tal como se recomienda para este sistema de
ensayo; la concentración de pernín no se determinó directamente pero
estaba en el intervalo de 1 mg/ml. A partir de estos datos
cinéticos, se estimó que la inhibición de pernín era de
aproximadamente el 50% del nivel de plasma humano (aproximadamente
pernín 1 mg/ml diluido 9/10 comparado con la dilución de plasma 1/41
en el sistema de ensayo de ATIII patrón). No se requirió heparina,
un cofactor requerido para la inhibición ATIII de trombina, para la
acción inhibidora por pernín.
Se prepararon columnas de afinidad quelantes Hi
Trap® (Amersham Pharmacia Biotech, de 1 ml de tamaño) según las
instrucciones del fabricante. Las columnas se cargaron entonces con
cloruro cúprico o cloruro de zinc 0,1 M, antes de equilibrarse con
un tampón (fosfato de sodio 0,050 M y cloruro de sodio 0,5 M que
contiene imidazol 0,5 mM, pH 7,0). Las muestras de proteína
purificada utilizando centrifugación en CsCl se suspendieron en este
tampón y se aplicaron a la columna utilizando un sistema
cromatográfico (Econo System, Bio-Rad Laboratories,
EE.UU.). Tras el lavado de la columna durante 5 minutos con tampón,
durante lo cual no apareció proteína en el eluato, se utilizó un
gradiente lineal durante 20 minutos a 1 ml/min para desarrollar la
columna, utilizando tampón con la concentración de imidazol en 100
mM, desde el 0 - 100%. La proteína eluyó en el gradiente
reteniéndose más tiempo en la columna de quelación de cobre que en
la de zinc. Se monitorizó la absorción del eluato a 254 nM.
Se determinó el contenido de iones metálicos
divalentes disolviendo la proteína en agua a 10 mg/ml y analizando
el contenido metálico mediante espectrometría de absorción atómica y
de emisión de plasma, mediante comparación con un blanco de agua. No
hubo un contenido de cationes divalentes significativo en la
proteína purificada mediante este método. Sin embargo, la
purificación mediante otros métodos que no emplean agentes
caotrópicos como CsCl, el alto contenido de histidina acoplada con
residuos de aminoácidos ácidos y el origen probable de esta proteína
procedente de un precursor de SOD, indica que pernín tiene iones
metálicos endógenos como parte de su estructura nativa.
Sección
3
Se sintetizó un juego de cebadores no específicos
denominado pUZ5 por Gibco-BRL, para la secuenciación
inicial basado en la secuencia N-terminal del
pernín. La fórmula general fue:
GAY GGN GAR CAR TGY AAY GAY GGN CAR
AA
En la que Y representa una base pirimidínica, R
representa una base purínica y N representa una cualquiera de las
cuatro bases de nucleótido. Se realizó la secuenciación, utilizando
inicialmente pUZ5 y un cebador de "hebra inferior" basado el
oligo-dT procedente de ADNc amplificado mediante
PCR. Se realizó la secuenciación mediante secuenciación de ciclo de
terminación-tinción utilizando tecnología de Prism
"BigDye" (Applied Biosystems Incorporated, EE.UU.) según sus
instrucciones. Se resolvieron los productos en un secuenciador
automático ABI 377. Tras la secuenciación inicial de aproximadamente
500 pares de bases, se construyeron cebadores específicos para
pernín y se utilizaron para completar la secuenciación del gen de
pernín.
Esto proporcionó lo siguiente:
La presente invención es una proteína novedosa
que puede obtenerse a partir de Perna canaliculus, el
mejillón de labio verde (Greenshell^{MR}) de Nueva Zelanda. La
proteína parece poder autoagregarse en estructuras que se parecen a
pequeñas partículas similares a virus (VLP) de aproximadamente 25 nm
de diámetro, pero que carecen de cualquier ácido nucleico. La
proteína se encontró en extractos de mejillones enteros y parece ser
la proteína predominante en la hemolinfa. Se estimó que el peso
molecular de la proteína era de 75 kDa mediante PAGE y se dedujo que
era de 55 kDa a partir de su secuencia codificante de polinucleótido
pero, debido a su capacidad para agregarse, la proteína puede
sedimentar mediante ultracentrifugación en un corto tiempo (por
ejemplo, 40 minutos a 250.000 g) mientras que la proteína
monomérica no. Cada ml de hemolinfa produce, en promedio,
aproximadamente 2 mg de pernín. La hemolinfa se obtiene fácilmente
extrayendo fluido del músculo aductor posterior del molusco, que
puede producir hasta 5 ml sin daño evidente; no es necesario matar
al mejillón. La hemolinfa obtenida no sólo contiene altos niveles de
pernín sino que está bastante libre de materiales contaminantes,
particularmente si se compara con los extractos de mejillón entero,
de modo que la purificación de pernín es sencilla. Para
preparaciones sumamente puras de pernín, la ultracentrifugación va
seguida de obtención de bandas isopícnicas en un medio con gradiente
de densidad adecuado, tal como CsCl.
La secuencia del extremo
N-terminal de pernín sugirió que la proteína podría
tener actividad antitrombina. Esto se demostró en ensayos cinéticos
con pernín purificado. Puesto que la trombina es una serin
proteasa, pernín también actúa como un inhibidor de la serin
proteasa.
La comparación de las secuencias obtenidas a
partir de varios segmentos de escisión frente a secuencias de
aminoácidos en una base de datos informática sugiere que, además de
la actividad antitrombina de pernín, la proteína también posee otras
actividades. Una de estas actividades es la capacidad de unir
cationes divalentes tales como Zn^{2+} y Cu^{2+}.
La proteína preferida de la invención, pernín,
tiene varias utilidades.
Debido a su actividad antitrombina, pernín es
potencialmente útil como un agente anticoagulante. La trombina
normalmente actúa como una proteasa que convierte el fibrinógeno de
la sangre en fibrina. La coagulación sanguínea se contrarresta por
inhibidores, normalmente antitrombina III (ATIII); pernín también ha
mostrado que inhibe la actividad de la trombina en un sistema de
ensayo de ATIII. A diferencia de ATIII, cuya acción se acelera por
la presencia de heparina (un mucopolisacárido sulfatado), pernín no
requiere heparina como cofactor.
La proteína pernín procedente de P.
canaliculus tiene un valor, por tanto, como producto
farmacéutico. Puesto que es activa como anticoagulante en su estado
nativo, puede ser útil como agente terapéutico natural o complemento
para la salud. Se obtiene fácilmente como producto natural en altas
concentraciones a partir de hemolinfa de mejillón. Para obtener una
preparación sumamente pura, sólo es necesario eliminar los hemocitos
mediante centrifugación (o cualquier otro método adecuado) seguido
por ultracentrifugación (puesto que pernín forma agregados que
sedimentan rápidamente) y resuspensión, obtención de bandas
isopícnicas en un medio adecuado tal como CsCl, filtración de
exclusión a través de una membrana adecuada que retenga pernín, o
cromatografía a través de un medio tal como vidrio de poro
controlado de porosidad adecuada. Esto da como resultado una
preparación sumamente pura de pernín.
El mejillón P. canaliculus produce grandes
cantidades de proteína de manera natural, con pequeño coste o
esfuerzo implicado en la producción, tratamiento o purificación.
Una utilidad adicional de la proteína surge del
hecho de que pernín puede separarse de cationes divalentes (por
ejemplo, mediante obtención de bandas isopícnicas en CsCl o
variación del pH). Esto permite la adición de cationes divalentes de
elección (tales como Mg^{++}, Cd^{++}, Zn^{++} o Ca^{++}) al
pernín separado de metales. Tal proteína, con una carga de cationes
divalentes preseleccionada y modificada, tiene aplicación en las
industrias alimenticia y nutracéutica.
La capacidad de unir cationes metálicos
divalentes también da lugar a aplicaciones de la proteína en
procesos de biorremediación y/o recuperación de cationes. Los
cationes divalentes pueden estar presentes como contaminantes o
polutantes en, por ejemplo, una disolución, y la disolución se pasa
por un sustrato al que está unido la proteína, de modo que se
extraen los cationes.
Todavía una utilidad adicional surge del hecho de
que la proteína es de "autoagregación" y puede formar
estructuras que se parecen a partículas similares a virus vacías de
aproximadamente 25 nm de diámetro. Estas partículas similares a
virus vacías pueden secuestrar otras moléculas en su interior, con
la consiguiente capacidad para funcionar como vehículos de
suministro para esas otras moléculas. Ejemplos de moléculas que
pueden suministrarse de esta manera incluyen principios
farmacéuticamente activos.
Las personas expertas en la técnica entenderán
que la descripción anterior se proporciona a modo de ilustración
únicamente y que la invención sólo está limitada por las
reivindicaciones adjuntas.
Layne, E. (1957),
Spectrophotometric and turbidometric methods for measuring proteins,
Methods in Enzymology III, 447.
Scotti, P.D. (1985). The estimation
of virus density in isopycnic cesium chloride gradients. Journal
of Virological Methods 12, 149.
<110> Instituto de Investigación de la
Horticultura y los Alimentos de Nueva Zelanda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Inhibidor de la serin proteasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 25409 MRB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> NZ 336906
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<440> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gly Glu Gln Cys Asn Asp Gly Gln
Asn}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gly Gly His Glu Val Glu Ser Glu Arg Val
Ala Cys Cys Val Ile}
\sac{Gly Arg Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Ser His Pro Glu Ile Val His}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr His Gly His Asp Asp Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Asn Glu Val His His}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1491
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1491)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1611
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perna canaliculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poliA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1557)..(1563)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feacture
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1492)..(1494)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> codon de terminación opalo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Proteína aislada que tiene un peso molecular
de aproximadamente 55 kDa y una secuencia de aminoácidos que incluye
una o más de las siguientes:
(a) SEQ ID No. 1;
(b) SEQ ID No. 2;
(c) SEQ ID No. 3;
(d) SEQ ID No. 4;
(e) SEQ ID No. 5;
o un fragmento activo de las mismas.
2. Proteína aislada que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID No. 7 o un fragmento activo de la misma.
3. Proteína aislada que puede obtenerse a partir
de la hemolinfa de Perna canaliculus, que tiene un peso
molecular aparente de 75 kDa determinado mediante PAGE y que tiene
actividad como un inhibidor de la serin proteasa y/o un agente de
unión de cationes divalentes, o un fragmento activo de la misma.
4. Proteína o fragmento según la reivindicación 1
o la reivindicación 2, que tiene actividad como:
(i) un inhibidor de la serin proteasa; o
(ii) un agente de unión de cationes
divalentes.
5. Proteína que puede obtenerse a partir de
Perna canaliculus o un molusco distinto a Perna
canaliculus y es una variante funcionalmente equivalente de una
proteína o fragmento según la reivindicación 3 o la reivindicación
4, porque da una reacción cruzada inmunológicamente con una proteína
o fragmento según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 y tiene
al menos la misma actividad de inhibidor de la serin proteasa y/o de
unión de cationes divalentes que una proteína o fragmento según la
reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. Polinucleótido que codifica para una proteína
o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Polinucleótido según la reivindicación 6, que
comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 6 o una variante
de la misma.
8. Polinucleótido que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO. 8.
9. Polinucleótido que se hibrida en condiciones
rigurosas con un polinucleótido según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8.
10. Vector que incluye un polinucleótido según
una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
11. Célula huésped que expresa un polinucleótido
según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
12. Composición que comprende una proteína o
fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Composición según la reivindicación 12, que
es un medicamento, alimento o complemento dietético.
14. Complemento dietético según la reivindicación
13, en el que dicha proteína o fragmento se asocia o se une a al
menos un catión divalente de importancia en la dieta.
15. Complemento dietético según la reivindicación
14, en el que dicho catión divalente es calcio, magnesio o zinc.
16. Medicamento según la reivindicación 13, que
es un agente de biorremediación.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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