CN102690347B - 分离i型前胶原氨基末端肽的方法 - Google Patents
分离i型前胶原氨基末端肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102690347B CN102690347B CN201210153802.7A CN201210153802A CN102690347B CN 102690347 B CN102690347 B CN 102690347B CN 201210153802 A CN201210153802 A CN 201210153802A CN 102690347 B CN102690347 B CN 102690347B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer
- 10000rpm
- centrifugal
- precipitation
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种分离I型前胶原氨基末端肽的方法,解决了I型前胶原氨基末端肽的大量提取方法、效率、纯度、活性的问题,第一步采用硫酸氨分级分离发法,去除了大量的杂蛋白。采用等电点分离法又去除大部分的杂蛋白。采用Qsepharose FF,上样量大,流速快,提高了纯化效率。最后用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200,进一步提高纯度,经SDS-PAGE分析纯度达98%。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离I型前胶原氨基末端肽(PINP)的方法。
背景技术
PINP是一个非常灵敏的骨转化速率的指标;PINP的变化与骨密度的变化高度相关,并与抗骨吸收的疗效相关。PINP在用于检测抗骨吸收治疗的时候,在短短的几个月内对骨转化的治疗作用给予评价。相反如果通过检测病人的骨密度(BMD)来判断治疗效果,这一过程需要大约两年时间。最近的数据也表明PINP对于检测骨质疏松病人的合成代谢治疗的效果特别有效。早期通过PINP来评定骨质疏松的治疗,不仅能帮助患者选择正确的治疗方案,而且能增强患者治疗的信心。乳腺癌的发病程度与PINP的水平相关。
PINP的分子量35KD,高度磷酸化,在体内的浓度男性20-76μg/L,女性19-84μg/L。PINP最初由羊水分离,并命名为胎儿抗原2,测序表明其大部分为两条a1链形成的同聚体,少部分为2条a1和一条a2链非共价键组成的三联体结构。然而,传统方法要求用第4~6个月的胎儿羊水,使PINP的生产受到极大的限制。因此,本发明主要寻求一种更高效、更实用的PINP制备方法。
发明内容
本发明是要解决I型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问题。采用硫酸氨分级分离发法,第一步去除了大部分的杂蛋白。采用等电点分离法又去除大部分的杂蛋白。Qsepharose FF,上样量大,流速快,分辩高,大大提高了效率。最后用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200,进一步提高纯度。经SDS-PAGE分析纯度达98%,活性和纯度非常满意。
附图说明
图1:腹水纯化前后SDS/PAGE电泳结果
图2:superdex200分子筛层析
具体实施方式
取癌性病人腹水2升,10000RPM离心,取上清。目的是去掉组织块和癌性细胞;这一步必须穿戴防护手套和眼镜,因为决大多数肝癌病人都携带肝炎病毒;
首先,我们采用硫酸铵分级沉淀法,收集硫酸铵浓度达到40~60%的馏分。方法为先加入40%硫酸铵后搅拌过夜,10000RPM离心,弃沉淀,上清继续加硫酸铵至60%,10000RPM离心,留沉淀。沉淀用Buffer A溶解、透析,每隔12小时换液,透析两天,其中BufferA的配方为:20mM Tris,1mM EDTA,50mMNaCl,pH7.4;透析液的配方为:20mM Tris,1mM EDTA,50mM NaCl,pH7.4。
其次,我们根据序列分析,PINP的等电点为6.2。上述第一步透析好的样品,10000RPM离心,留上清。上清用盐酸调溶液的pH为6.2,搅拌4个小时,10000RPM离心,留沉淀;沉淀用生理盐水溶解后,用Buffer A透析过夜,取出透析好的样品,10000RPM离心,留上清。
采用柱层析法:第二步中经过Buffer A透析的样品上阴离子交换柱Q-SepharoseFF,用Buffer A和Buffer B(20mM Tris,1mM EDTA,1M NaC)进行梯度洗脱,收集40~60%Buffer B部分洗脱液;此收集物用BufferC(0.1MHAC-NaAC,pH4.4)透析,上阳离子交换柱CM-SepharoseFF,用Buffer C和Buffer A进行梯度洗脱,收集20~50%Buffer A馏分;浓缩成5mg/ml,取200μl上superdex200分子筛层析,收集35KD位置的峰,浓缩成1mg/ml,加入0.1%叠氮钠,1mM PMSF,-20℃保存即可。其中Buffer B的配方是:20mM Tris,1mMEDTA,1M NaCl;Buffer C的配方是:0.1M HAC-NaAC,pH4.4。
标记底物是放免药盒的重要组成部分,其质量对药盒至关重要。对于标记底物质量的检定,最终通过标记后对药盒的各个指标来体现的。用芬兰公司的I型前胶原肽免放药盒UniQPINP RIA(国家食品药品监督管理局特殊药品进口准许证P-04-05-27-03)检验各峰中PINP的含量,获得纯度高的PINP(见附图1、2)。通过标记物替代实验,各项指标都完全达到要求。
纯度鉴定:经多步纯化可得到95%的目的蛋白,结果见附图1、图2。图1:A:蛋白质分子量标准,B:腹水稀释1000倍,C:Q-SepharoseFF后蛋白,D:CM-SepharoseFF后蛋白,E:superdex200分子筛后蛋白。图2:superdex200分子筛层析结果,2号为目标峰。目标峰经用芬兰试剂盒检测,结果稀释1000倍后测值仍然大于250ng/ml。
Claims (1)
1.一种分离I型前胶原氨基末端肽的方法:
第一步,采用硫酸铵分级沉淀法:利用废弃的癌性病人的腹水,10000RPM离心,取上清;上清中加入40%硫酸铵后搅拌过夜,10000RPM离心,弃沉淀,上清继续加硫酸铵至60%,10000RPM离心,留沉淀;沉淀用Buffer A溶解、透析,每隔12小时换液,透析两天,其中BufferA的配方为:20mM Tris,1mMEDTA,50mM NaCl,pH7.4;透析液的配方为:20mM Tris,1mM EDTA,50mMNaCl,pH7.4,
第二步,采用等电点分离法:PINP的等电点为6.2,上述第一步透析好的样品,10000RPM离心,留上清,上清用盐酸调溶液的pH为6.2,搅拌4个小时,10000RPM离心,留沉淀;沉淀用生理盐水溶解后,用BufferA透析过夜,取出透析好的样品,10000RPM离心,留上清,
第三步,采用柱层析法:第二步中经过Buffer A透析的样品上阴离子交换柱Q-SepharoseFF,用Buffer A和Buffer B进行梯度洗脱,收集40~60%BufferB部分洗脱液,此收集物用Buffer C透析;经过Buffer C透析的样品上阳离子交换柱CM-SepharoseFF,用Buffer C和Buffer A进行梯度洗脱,收集20~50%Buffer A部分洗脱液;浓缩成5mg/ml,取200μl上superdex200分子筛层析,收集35KD位置的峰,浓缩成lmg/ml,加入0.1%叠氮钠,1mM PMSF,-20℃保存即可;其中Buffer B的配方是:20mM Tris,1mMEDTA,1M NaCl;Buffer C的配方是:0.1M HAC-NaAC,pH4.4。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210153802.7A CN102690347B (zh) | 2012-05-18 | 2012-05-18 | 分离i型前胶原氨基末端肽的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210153802.7A CN102690347B (zh) | 2012-05-18 | 2012-05-18 | 分离i型前胶原氨基末端肽的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102690347A CN102690347A (zh) | 2012-09-26 |
CN102690347B true CN102690347B (zh) | 2014-06-25 |
Family
ID=46856099
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210153802.7A Active CN102690347B (zh) | 2012-05-18 | 2012-05-18 | 分离i型前胶原氨基末端肽的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102690347B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105866415A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-08-17 | 北京北方生物技术研究所有限公司 | I型胶原氨端肽定量检测试剂盒及其制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0738735B1 (en) * | 1995-04-19 | 2003-09-17 | Orion-yhtymä Oyj | Aminoterminal propeptide of type I procollagen, antibody thereto and assay method using it |
WO2005079776A1 (en) * | 2004-02-23 | 2005-09-01 | Hormos Medical Ltd. | Method for treatment or prevention of osteoporosis in individuals with high bone turnover |
CN102093465A (zh) * | 2009-12-10 | 2011-06-15 | 北京北方生物技术研究所 | 分离ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法 |
-
2012
- 2012-05-18 CN CN201210153802.7A patent/CN102690347B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0738735B1 (en) * | 1995-04-19 | 2003-09-17 | Orion-yhtymä Oyj | Aminoterminal propeptide of type I procollagen, antibody thereto and assay method using it |
WO2005079776A1 (en) * | 2004-02-23 | 2005-09-01 | Hormos Medical Ltd. | Method for treatment or prevention of osteoporosis in individuals with high bone turnover |
CN102093465A (zh) * | 2009-12-10 | 2011-06-15 | 北京北方生物技术研究所 | 分离ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Immunoassay for intact amino-terminal propeptide of human type I procollagen;JUKKA MELKKO et al;《Clinical Chemistry》;19961231;第42卷(第6期);全文,尤其是第948页右栏第2段,第949页左栏左后两段 * |
JUKKA MELKKO et al.Immunoassay for intact amino-terminal propeptide of human type I procollagen.《Clinical Chemistry》.1996,第42卷(第6期),第947-954页. |
阮光强.骨转换生化标志物在骨质疏松症治疗中的临床应用.《临床和实验医学杂志》.2011,第10卷(第2期),第111-112页. |
骨转换生化标志物在骨质疏松症治疗中的临床应用;阮光强;《临床和实验医学杂志》;20110131;第10卷(第2期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102690347A (zh) | 2012-09-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101730709B (zh) | 一种cxc趋化因子受体4(cxcr4)拮抗多肽 | |
US20090318674A1 (en) | Process for purification of antibodies | |
CN103059125B (zh) | 重组人促卵泡激素的纯化方法 | |
Odani et al. | Purification and complete amino acid sequence of novel β2-microglobulin | |
EA025663B1 (ru) | Композиции этанерцепта, стабилизированные ионами металлов | |
CN100425286C (zh) | 纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物 | |
US10350274B2 (en) | Method for the preparation of human albumin with reduced level of dissolved oxygen | |
JP2019070016A (ja) | ヘプラペプチドの製剤 | |
CN102690347B (zh) | 分离i型前胶原氨基末端肽的方法 | |
Lesnaw et al. | The structure of tobacco necrosis virus: I. The protein subunit and the nature of the nucleic acid | |
Bhattacharyya et al. | Isolation and characterization of a pulmonary glycoprotein from human amniotic fluid | |
Wingfield et al. | Preparation and characterization of bovine growth hormones produced in recombinant Escherichia coli | |
JP4264257B2 (ja) | 熱ショックタンパク質に由来する免疫調節ペプチドとその使用 | |
JPH01308300A (ja) | ヘパリン結合性脳ミトゲン | |
CN103804486B (zh) | 一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺 | |
CN106279406B (zh) | 猪皮中分离纯化的皮抑素g1的活性成分四连接素及其应用 | |
CN104311656B (zh) | cFGF‑21蛋白及其在治疗类风湿关节炎中的应用 | |
CN103805622A (zh) | 基因工程IFNα-2b融合蛋白质新型制备工艺 | |
Fonović et al. | Determination of Sex Based on Sexually Dimorphic Amelogenin Peptides in Human Tooth Enamel | |
CN102093465A (zh) | 分离ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法 | |
Pages et al. | Immunological comparison of major outer membrane proteins from different strains of Escherichia coli | |
Haq et al. | Fractionation of black seed (Nigella sativa Linn) proteins by using rotofor | |
Adams-Mayne et al. | Purification and characterization of four Bence-Jones proteins | |
CN112316117B (zh) | 重组蛋白hID2在制备治疗结肠炎药物中的应用 | |
Sun et al. | AP30, a differential protein marker for perilymph and cerebrospinal fluid in middle ear fluid, has been purified and identified as human apolipoprotein D |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100076 Beijing city Fengtai District pan Temple No. 20 Patentee after: BEIJING NORTH INSTITUTE OF BIOLOGICAL TECHNOLOGY Address before: 100076 Beijing city Fengtai District pan Temple No. 20 Patentee before: Beijing North Institute of Biological Technology |