JPH08231596A - 体液中の高分子未損傷ラミニン形態の選択的免疫学的測定のためのモノクローナル抗体 - Google Patents
体液中の高分子未損傷ラミニン形態の選択的免疫学的測定のためのモノクローナル抗体Info
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- JPH08231596A JPH08231596A JP7224501A JP22450195A JPH08231596A JP H08231596 A JPH08231596 A JP H08231596A JP 7224501 A JP7224501 A JP 7224501A JP 22450195 A JP22450195 A JP 22450195A JP H08231596 A JPH08231596 A JP H08231596A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 体液中の高分子未損傷ラミニン形態の選択的
免疫学的測定のためのモノクローナル抗体。 【解決手段】 ラミニン群およびペプシン消化によりヒ
ト胎盤から調製され得るラミニンＰ１フラグメント由来
のタンパク質に特異性を有するモノクローナル抗体であ
って、該抗体は好ましくは天然の仕方で折りたたまれた
ラミニンのラミニンＰ１ドメイン構造に結合し、未損傷
の天然のラミニンへの該抗体の親和性がラミニンＰ１フ
ラグメントへの該抗体の親和性とほぼ等しいものである
モノクローナル抗体。
免疫学的測定のためのモノクローナル抗体。 【解決手段】 ラミニン群およびペプシン消化によりヒ
ト胎盤から調製され得るラミニンＰ１フラグメント由来
のタンパク質に特異性を有するモノクローナル抗体であ
って、該抗体は好ましくは天然の仕方で折りたたまれた
ラミニンのラミニンＰ１ドメイン構造に結合し、未損傷
の天然のラミニンへの該抗体の親和性がラミニンＰ１フ
ラグメントへの該抗体の親和性とほぼ等しいものである
モノクローナル抗体。
Description
【０００１】本発明は体液中の高分子ラミニン形態の選
択的免疫学的測定のためのモノクローナル抗体、これら
の抗体の調製方法、および、疾患の診断のためのその使
用に関する。
択的免疫学的測定のためのモノクローナル抗体、これら
の抗体の調製方法、および、疾患の診断のためのその使
用に関する。
【０００２】ラミニンは全ての基底膜内に存在するマル
チドメイン蛋白であり、ニドゲン、ヘパランスルフェー
トプロテオグリカンまたはコラーゲンIVのような基底膜
のその他の成分と複合体を形成する（Timpl, R.（198
9）Eur. J. Biochem. 180；487-502）。これは３種類の
異なるジスルフィド結合ポリペプチドから構成されてい
る。これによりラミニンは非対称の十字型の構造となる
（図１および図２）。かなり最近になって、多くの構造
的変異体が同定されており、これらは８種類（現時点で
知られているもの）の異なるサブユニットを組み立てた
ものとして存在している。ラミニンのイソフォームを得
るためには、３種類の異なる分子クラスのポリペプチ
ド、即ち、α鎖（前のＡ鎖）、β鎖（前のＢ１鎖）およ
びγ鎖（前のＢ２鎖）を常時組み立てる必要がある（Bu
rgeson, R.E.；等（1994）Matrix Biology, Vol. 14, 2
09-211）。多くの興味深い生物学的機能、例えば細胞の
生育、細胞の拡張および軸索の生育並びに分化過程に対
する作用などが、ラミニンにあるとされている（Timpl,
R.（1989）Eur. J. Biochem. 180；487-502）。
チドメイン蛋白であり、ニドゲン、ヘパランスルフェー
トプロテオグリカンまたはコラーゲンIVのような基底膜
のその他の成分と複合体を形成する（Timpl, R.（198
9）Eur. J. Biochem. 180；487-502）。これは３種類の
異なるジスルフィド結合ポリペプチドから構成されてい
る。これによりラミニンは非対称の十字型の構造となる
（図１および図２）。かなり最近になって、多くの構造
的変異体が同定されており、これらは８種類（現時点で
知られているもの）の異なるサブユニットを組み立てた
ものとして存在している。ラミニンのイソフォームを得
るためには、３種類の異なる分子クラスのポリペプチ
ド、即ち、α鎖（前のＡ鎖）、β鎖（前のＢ１鎖）およ
びγ鎖（前のＢ２鎖）を常時組み立てる必要がある（Bu
rgeson, R.E.；等（1994）Matrix Biology, Vol. 14, 2
09-211）。多くの興味深い生物学的機能、例えば細胞の
生育、細胞の拡張および軸索の生育並びに分化過程に対
する作用などが、ラミニンにあるとされている（Timpl,
R.（1989）Eur. J. Biochem. 180；487-502）。
【０００３】ラミニンは全ての基底膜の典型的な成分で
あるが、種々のイソフォームの個別の特徴は、これらが
極めて特異的な組織分布を示すことである。例えば、メ
ロシン（＝ラミニン２；α２、β１、γ１）はSchwann
細胞、横紋筋および栄養膜の基底膜の構成要素である
（Leivo, Ｉ.；Engvall, E.（1988）Proc. Natl. Acad.
Sci. USA85；1544-1548）。別の変異体であるｓ−ラミ
ニン（＝ラミニン３；α１、β２、γ１）は神経筋末端
プレートの接合部の基底膜、血管内皮および糸球体ポド
細胞中に存在する（Hunter, D.D.；Shah, V.；Merlie,
J.P.；Sanes, J.R.（1989）Nature 338；229-234）。第
３の例、Ｋ−ラミニン（＝ラミニン６；α３、β１／β
２、γ１）は皮膚の基底膜に特有のものである（Marink
ovich, M.P.；Lunstrom, G.P.；Burgeson, R.E.（1992
a）J. Biol. Chem. 267；17900-17906）。カリニン／ナ
イセイン（＝ラミニン５；α３、β３、γ２）は表皮組
織に典型的なものであり、この部位は係留フィラメント
の成分として存在する（Marinkovich, M.P.；Lunstrom,
G.P.；Keene, D.R., Burgeson, R.E.（1992b）J. Cel
l. Biol. 119；695-703）。
あるが、種々のイソフォームの個別の特徴は、これらが
極めて特異的な組織分布を示すことである。例えば、メ
ロシン（＝ラミニン２；α２、β１、γ１）はSchwann
細胞、横紋筋および栄養膜の基底膜の構成要素である
（Leivo, Ｉ.；Engvall, E.（1988）Proc. Natl. Acad.
Sci. USA85；1544-1548）。別の変異体であるｓ−ラミ
ニン（＝ラミニン３；α１、β２、γ１）は神経筋末端
プレートの接合部の基底膜、血管内皮および糸球体ポド
細胞中に存在する（Hunter, D.D.；Shah, V.；Merlie,
J.P.；Sanes, J.R.（1989）Nature 338；229-234）。第
３の例、Ｋ−ラミニン（＝ラミニン６；α３、β１／β
２、γ１）は皮膚の基底膜に特有のものである（Marink
ovich, M.P.；Lunstrom, G.P.；Burgeson, R.E.（1992
a）J. Biol. Chem. 267；17900-17906）。カリニン／ナ
イセイン（＝ラミニン５；α３、β３、γ２）は表皮組
織に典型的なものであり、この部位は係留フィラメント
の成分として存在する（Marinkovich, M.P.；Lunstrom,
G.P.；Keene, D.R., Burgeson, R.E.（1992b）J. Cel
l. Biol. 119；695-703）。
【０００４】ヒト血清中のラミニンを検出するための特
異的測定方法が種々の疾患の診断のために開発されてい
る。検討中の考えられる適応症は、肝線維症／肝硬変、
アルコール性肝線維症、ＢＭの糖尿病性合併症、腎疾
患、慢性炎症性間接／慢性多発関節炎、および、腫瘍で
ある（Kropf, J.；等（1991）Clin Chem. 37；30；Niem
elae, O.；Risteli, L.；Sotaniemi, E.A.；Ristelli,
J.（1985）Eur. J. Clin. Invest. 15；132-137；Katay
ama, M.；Kamihagi, K.；Hirai, S.；Murakami,K.；Hin
o, F.；Kate, I.（1992）Br. J. Cancer 65；509-514；
Brocks, D.G.；Strecker, H.；Neubauer, H.P.；Timpl,
R.（1986）Clin. Chem. 32.；787-791；Horikoshi,
S.；Koide, H.（1991）Clin. Chim, Acta 196；185-19
2）。
異的測定方法が種々の疾患の診断のために開発されてい
る。検討中の考えられる適応症は、肝線維症／肝硬変、
アルコール性肝線維症、ＢＭの糖尿病性合併症、腎疾
患、慢性炎症性間接／慢性多発関節炎、および、腫瘍で
ある（Kropf, J.；等（1991）Clin Chem. 37；30；Niem
elae, O.；Risteli, L.；Sotaniemi, E.A.；Ristelli,
J.（1985）Eur. J. Clin. Invest. 15；132-137；Katay
ama, M.；Kamihagi, K.；Hirai, S.；Murakami,K.；Hin
o, F.；Kate, I.（1992）Br. J. Cancer 65；509-514；
Brocks, D.G.；Strecker, H.；Neubauer, H.P.；Timpl,
R.（1986）Clin. Chem. 32.；787-791；Horikoshi,
S.；Koide, H.（1991）Clin. Chim, Acta 196；185-19
2）。
【０００５】現在、ラミニン測定のための３種類の方法
が行われている。 方法１：ポリクローナル抗血清の使用に基づくラミニン
Ｐ１の測定方法が登録商標RIA-gnostRの下でBehringwer
ke AGから販売されている（Brocks, D.G.；Strecker,
H.；Neubauer, H.P.；Timpl, R.（1986）Clin. Chem. 3
2；787-791）。 方法２：ラミニンのＥＩＡ免疫検定法は２種類のモノク
ローナル抗体の使用によるものである（TAKARA, Shuzo
Co., LTD；Katayama等, 1992；Katayama, M.；Kamihag
i, K.；Hirai, S.；Murakami, K.；Hino, F.；Kate, I.
（1992）Br. J. Cancer 65；509-514）。 方法３：１段階サンドイッチ酵素免疫検定法は、２種類
のモノクローナル抗体の使用によるものである（Fuji C
hemical Ltd.；Iwata, K.（1990）Clin. Chim. Acta 19
1；211-220）。
が行われている。 方法１：ポリクローナル抗血清の使用に基づくラミニン
Ｐ１の測定方法が登録商標RIA-gnostRの下でBehringwer
ke AGから販売されている（Brocks, D.G.；Strecker,
H.；Neubauer, H.P.；Timpl, R.（1986）Clin. Chem. 3
2；787-791）。 方法２：ラミニンのＥＩＡ免疫検定法は２種類のモノク
ローナル抗体の使用によるものである（TAKARA, Shuzo
Co., LTD；Katayama等, 1992；Katayama, M.；Kamihag
i, K.；Hirai, S.；Murakami, K.；Hino, F.；Kate, I.
（1992）Br. J. Cancer 65；509-514）。 方法３：１段階サンドイッチ酵素免疫検定法は、２種類
のモノクローナル抗体の使用によるものである（Fuji C
hemical Ltd.；Iwata, K.（1990）Clin. Chim. Acta 19
1；211-220）。
【０００６】ペプシン耐性断片“Lam P1”に対する抗体
は方法１および３で用いられているが、方法２はWewer
等の方法により単離された“天然のラミニン”に対する
抗体の使用に基づいている（ＥＤＴＡ非存在下のペプシ
ンを用いた穏やかな消化；Wewer, U.；Albrechtsen,
R.；Manthrope, M.；Varon, S.；Engvall, E.；Rouslah
ti, E.（1983）J. Biol. Chem. 285；12654-12660）。K
atayama等の研究から明らかなとおり（方法２）、TAKAR
Aの免疫検定法、RIA-gnostR法のものとは異なる抗原分
布が（肺）腫瘍血清中に存在するものの、RIA-gnost
R（Behringwerke）法と比較的よく相関している（ｒ＝
０.６８）。即ち、ゲル濾過クロマトグラフィーの後、
分子量範囲３３０〜１５０kDaの２つの抗原ピークが、
“天然のラミニン”に対する抗体により血清中で検出さ
れる。その大きさから、これらの抗原ピークは“血清ラ
ミニン”の分解生成物のはずである。これとは対照的
に、RIA-gnostR法（方法１）は１００〜９００kDaの範
囲の２つのピーク、即ち、明らかに、天然（未損傷）お
よび分解された構造の両方を診断する。しかしなお、未
損傷および分解されたラミニンの構造を同時に認識する
ことは、一方では正常なコホートと患者のコホートが重
複し、一方では１つのピークの濃度の変化がもう１つの
ピークの含有量の逆方向の変動により均一化される場合
があるため、診断予測における不確実性の原因となる。
Fujiの免疫検定（方法３）はいかなる血清クロマトグラ
フィーも含んでいない。しかしながらＳＤＳゲル電気泳
動および免疫ブロットによれば、使用する抗体は正常な
血清および「肝硬変血清」における２００kDaのバンド
を認識しており、即ち、ラミニンの分解フラグメントに
特異的に反応していることは明らかである。
は方法１および３で用いられているが、方法２はWewer
等の方法により単離された“天然のラミニン”に対する
抗体の使用に基づいている（ＥＤＴＡ非存在下のペプシ
ンを用いた穏やかな消化；Wewer, U.；Albrechtsen,
R.；Manthrope, M.；Varon, S.；Engvall, E.；Rouslah
ti, E.（1983）J. Biol. Chem. 285；12654-12660）。K
atayama等の研究から明らかなとおり（方法２）、TAKAR
Aの免疫検定法、RIA-gnostR法のものとは異なる抗原分
布が（肺）腫瘍血清中に存在するものの、RIA-gnost
R（Behringwerke）法と比較的よく相関している（ｒ＝
０.６８）。即ち、ゲル濾過クロマトグラフィーの後、
分子量範囲３３０〜１５０kDaの２つの抗原ピークが、
“天然のラミニン”に対する抗体により血清中で検出さ
れる。その大きさから、これらの抗原ピークは“血清ラ
ミニン”の分解生成物のはずである。これとは対照的
に、RIA-gnostR法（方法１）は１００〜９００kDaの範
囲の２つのピーク、即ち、明らかに、天然（未損傷）お
よび分解された構造の両方を診断する。しかしなお、未
損傷および分解されたラミニンの構造を同時に認識する
ことは、一方では正常なコホートと患者のコホートが重
複し、一方では１つのピークの濃度の変化がもう１つの
ピークの含有量の逆方向の変動により均一化される場合
があるため、診断予測における不確実性の原因となる。
Fujiの免疫検定（方法３）はいかなる血清クロマトグラ
フィーも含んでいない。しかしながらＳＤＳゲル電気泳
動および免疫ブロットによれば、使用する抗体は正常な
血清および「肝硬変血清」における２００kDaのバンド
を認識しており、即ち、ラミニンの分解フラグメントに
特異的に反応していることは明らかである。
【０００７】一方、本発明の目的は、好ましくは未損傷
の天然のラミニン、特に天然の状態で折りたたまれてい
るラミニンのラミニンＰ１ドメインの構造に結合するよ
うな、モノクローナル抗体、および、その調製方法に関
する。
の天然のラミニン、特に天然の状態で折りたたまれてい
るラミニンのラミニンＰ１ドメインの構造に結合するよ
うな、モノクローナル抗体、および、その調製方法に関
する。
【０００８】本発明の別の基本的な目的は、これらの抗
体に基づくラミニンの免疫学的測定のための方法であ
り、その方法はラミニンの分解生成物の同時検出を回避
することによりラミニンの高分子量群のみを検出し、こ
れにより、体液中の未損傷のラミニンまたはラミニンの
２つのサブ集団の含有量をより正確に測定できるように
なっている。この方法によるラミニンの測定に基づいた
診断方法は、これまでの知られた測定方法を用いた場合
に許容せざるをえなかった診断予測における不正確さを
排除する。
体に基づくラミニンの免疫学的測定のための方法であ
り、その方法はラミニンの分解生成物の同時検出を回避
することによりラミニンの高分子量群のみを検出し、こ
れにより、体液中の未損傷のラミニンまたはラミニンの
２つのサブ集団の含有量をより正確に測定できるように
なっている。この方法によるラミニンの測定に基づいた
診断方法は、これまでの知られた測定方法を用いた場合
に許容せざるをえなかった診断予測における不正確さを
排除する。
【０００９】本発明によれば以下のようなモノクローナ
ル抗体により目的が達成される。 １．ラミニン群およびペプシン消化によりヒト胎盤から
調製できるラミニンＰ１フラグメントに由来する蛋白に
対する特異性を有し、その抗体の特徴として、天然の状
態で折りたたまれているラミニンのラミニンＰ１ドメイ
ンの構造に良好に結合し、未損傷の天然のラミニンに対
するその親和性がラミニンＰ１フラグメントに対する親
和性とほぼ等しく、 ２．好ましくは更に、ミエローマ細胞系由来の細胞と、
予めラミニンＰ１で免疫化した脊椎動物由来のリンパ球
を細胞融合することにより得られたハイブリドーマによ
り形成され、次いで表４〜表７に示すとおり精製しそし
てその後選択され、そして胎盤由来の精製ヒトラミニン
に対する高い結合親和性に加えてヒト血清から単離され
たラミニンの高分子量体とも高い反応性を有する抗体で
あり、 ３．本発明の抗体は好ましくは更に表１および表２に示
す結合特性を示し、そして、 ４．好ましくは本発明の付加的な抗体とともに対として
抗原に結合する能力を有する。
ル抗体により目的が達成される。 １．ラミニン群およびペプシン消化によりヒト胎盤から
調製できるラミニンＰ１フラグメントに由来する蛋白に
対する特異性を有し、その抗体の特徴として、天然の状
態で折りたたまれているラミニンのラミニンＰ１ドメイ
ンの構造に良好に結合し、未損傷の天然のラミニンに対
するその親和性がラミニンＰ１フラグメントに対する親
和性とほぼ等しく、 ２．好ましくは更に、ミエローマ細胞系由来の細胞と、
予めラミニンＰ１で免疫化した脊椎動物由来のリンパ球
を細胞融合することにより得られたハイブリドーマによ
り形成され、次いで表４〜表７に示すとおり精製しそし
てその後選択され、そして胎盤由来の精製ヒトラミニン
に対する高い結合親和性に加えてヒト血清から単離され
たラミニンの高分子量体とも高い反応性を有する抗体で
あり、 ３．本発明の抗体は好ましくは更に表１および表２に示
す結合特性を示し、そして、 ４．好ましくは本発明の付加的な抗体とともに対として
抗原に結合する能力を有する。
【００１０】本発明の目的は更に前記１〜４に記載した
特性を有する抗体を産生し、ミエローマ細胞系由来の細
胞と、予めラミニンＰ１で免疫化した脊椎動物由来のリ
ンパ球を細胞融合し、その後ハイブリッドにより産生さ
れた抗体もまた胎盤由来の精製ヒトラミニンに対する高
い結合親和性のほかに、ヒト血清から単離されたラミニ
ンの高分子量体とも高い反応性を有するかどうかに基づ
いてハイブリッドを選択することにより作成できる、ハ
イブリドーマ細胞系により達成される。このようなハイ
ブリドーマ細胞系は好ましくは、リンパ球がラミニンＰ
１で免疫化されたマウスＢａｌｂ／ｃ系から採取されミ
エローマ細胞系がマウスミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａ
Ｇ８.６５３であるという特徴を有する。
特性を有する抗体を産生し、ミエローマ細胞系由来の細
胞と、予めラミニンＰ１で免疫化した脊椎動物由来のリ
ンパ球を細胞融合し、その後ハイブリッドにより産生さ
れた抗体もまた胎盤由来の精製ヒトラミニンに対する高
い結合親和性のほかに、ヒト血清から単離されたラミニ
ンの高分子量体とも高い反応性を有するかどうかに基づ
いてハイブリッドを選択することにより作成できる、ハ
イブリドーマ細胞系により達成される。このようなハイ
ブリドーマ細胞系は好ましくは、リンパ球がラミニンＰ
１で免疫化されたマウスＢａｌｂ／ｃ系から採取されミ
エローマ細胞系がマウスミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａ
Ｇ８.６５３であるという特徴を有する。
【００１１】上記した特性を有する３種類のハイブリド
ーマ細胞系はブダペスト条約の条項に従ってドイツ微生
物培養細胞コレクション（Deutsche Sammlung von Micr
oorganismen und Zellkulturen GmbH（DMS）, Maschero
der Weg lb, D-38124-Braunschweig）に、寄託番号 Ｄ
ＳＭ ＡＣＣ２１８１、ＤＳＭ ＡＣＣ２１８０およびＤ
ＳＭ ＡＣＣ２１８２の下に１９９４年７月１２日に寄
託されている。これらのハイブリドーマ細胞系は前記１
〜４に示す好都合な性質を示すモノクローナル抗体を産
生する。ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８１
およびＤＳＭ ＡＣＣ２１８０は各々ＩｇＧ ２ａサブク
ラスの抗体を産生するが、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ
ＡＣＣ２１８２はＩｇＧ １サブクラスの抗体を産生す
る。
ーマ細胞系はブダペスト条約の条項に従ってドイツ微生
物培養細胞コレクション（Deutsche Sammlung von Micr
oorganismen und Zellkulturen GmbH（DMS）, Maschero
der Weg lb, D-38124-Braunschweig）に、寄託番号 Ｄ
ＳＭ ＡＣＣ２１８１、ＤＳＭ ＡＣＣ２１８０およびＤ
ＳＭ ＡＣＣ２１８２の下に１９９４年７月１２日に寄
託されている。これらのハイブリドーマ細胞系は前記１
〜４に示す好都合な性質を示すモノクローナル抗体を産
生する。ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８１
およびＤＳＭ ＡＣＣ２１８０は各々ＩｇＧ ２ａサブク
ラスの抗体を産生するが、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ
ＡＣＣ２１８２はＩｇＧ １サブクラスの抗体を産生す
る。
【００１２】本発明の目的を達成するためには： ａ） ペプシン消化によりヒト胎盤から調製できるラミ
ニンＰ１フラグメントで脊椎動物を免疫化し、 ｂ） リンパ球を免疫化された脊椎動物から単離し、ミ
エローマ細胞と融合させ、 ｃ） ハイブリッドを、前記１〜４記載の特性を有する
抗体の存在を考慮して選択し、そしてクローニングし、
そして、 ｄ） 抗体をこれらのクローンから単離する ことによる本発明のモノクローナル抗体を調製するため
の方法も提供される。この工程では好ましくは、ハイブ
リドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８１、ＤＳＭ ＡＣＣ
２１８０またはＤＳＭ ＡＣＣ２１８２を段階ｄ）を実
施するために使用する。
ニンＰ１フラグメントで脊椎動物を免疫化し、 ｂ） リンパ球を免疫化された脊椎動物から単離し、ミ
エローマ細胞と融合させ、 ｃ） ハイブリッドを、前記１〜４記載の特性を有する
抗体の存在を考慮して選択し、そしてクローニングし、
そして、 ｄ） 抗体をこれらのクローンから単離する ことによる本発明のモノクローナル抗体を調製するため
の方法も提供される。この工程では好ましくは、ハイブ
リドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８１、ＤＳＭ ＡＣＣ
２１８０またはＤＳＭ ＡＣＣ２１８２を段階ｄ）を実
施するために使用する。
【００１３】その外、本願の目的は、支持体物質に、接
着により、または、共有結合的に、結合しているコーテ
ィング抗体、および、コーティング抗体に結合した抗原
を認識する標識された第２の抗体を用い、そして、コー
ティング抗体が本発明のモノクローナル抗体である、天
然のラミニンの免疫学的測定のための方法により達成さ
れる。しかしながら好ましくは本発明の目的は、支持体
物質に、接着により、または、共有結合的に、結合して
いるコーティング抗体、および、コーティング抗体に結
合した抗原を認識する標識された第２の抗体を用い、そ
して、標識された第２の抗体が本発明のモノクローナル
抗体である、天然のラミニンの免疫学的測定のための方
法により達成される。
着により、または、共有結合的に、結合しているコーテ
ィング抗体、および、コーティング抗体に結合した抗原
を認識する標識された第２の抗体を用い、そして、コー
ティング抗体が本発明のモノクローナル抗体である、天
然のラミニンの免疫学的測定のための方法により達成さ
れる。しかしながら好ましくは本発明の目的は、支持体
物質に、接着により、または、共有結合的に、結合して
いるコーティング抗体、および、コーティング抗体に結
合した抗原を認識する標識された第２の抗体を用い、そ
して、標識された第２の抗体が本発明のモノクローナル
抗体である、天然のラミニンの免疫学的測定のための方
法により達成される。
【００１４】この観点において、コーティング抗体はま
た、本発明のモノクローナル抗体であってよく、好まし
くは、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８１に
より産生され、表３に示す結合定数を示す抗体である。
本発明のモノクローナル抗体は、特に、生体から採取で
きるが生体に戻すことのできない体液を用いて、体液中
のラミニン含有量の変動に関係のある疾患を診断するた
めの方法に用いることができる。
た、本発明のモノクローナル抗体であってよく、好まし
くは、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８１に
より産生され、表３に示す結合定数を示す抗体である。
本発明のモノクローナル抗体は、特に、生体から採取で
きるが生体に戻すことのできない体液を用いて、体液中
のラミニン含有量の変動に関係のある疾患を診断するた
めの方法に用いることができる。
【００１５】以下に本発明および特に好ましい実施態様
を詳述する。モノクローナル抗体を調製するためには、
動物、好ましくはげっ歯動物、例えばマウス、ラット、
ウサギおよびモルモットをアジュバントの存在下、実施
例１の方法に従って単離したラミニンＰ１で免疫化する
ことができる。マウス、特にＢａｌｂ／ｃ系統のマウス
が好ましく用いられる。例えば免疫応答は４〜８週の間
隔で反復二次注射により増幅される。免疫化が成功した
かどうかはそれ自体当該技術者により知られるＥＬＩＳ
Ａを用いて特定の抗体の濃度を測定することによりモニ
ターすることができる。リンパ球をミエローマ細胞系と
融合させる数日前に動物にアジュバントを用いずにラミ
ニンＰ１で処理する。リンパ球を動物から単離し、上記
した動物種の１つ、好ましくはマウスに由来するミエロ
ーマ細胞系、特に細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.６５３と融
合させる。好都合にはリンパ球を同じ種に由来するミエ
ローマ細胞系と融合させる。融合、および、その後の細
胞クローンの培養は、免疫学的結合試験により測定され
る細胞培養物の上澄み中の特異的抗体の濃度を用いて当
該技術分野で知られる方法で実施する。免疫学的方法で
用いるのに適する細胞クローンは表４および５に記載の
スクリーニング配列を用いて融合で生じるクローンから
選択する。特に好ましくは、Balb／ｃ系統のマウスに由
来する抗ラミニンＰ１リンパ球をマウスミエローマ細胞
系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.６５３と融合させることにより調
製した細胞系を使用する。
を詳述する。モノクローナル抗体を調製するためには、
動物、好ましくはげっ歯動物、例えばマウス、ラット、
ウサギおよびモルモットをアジュバントの存在下、実施
例１の方法に従って単離したラミニンＰ１で免疫化する
ことができる。マウス、特にＢａｌｂ／ｃ系統のマウス
が好ましく用いられる。例えば免疫応答は４〜８週の間
隔で反復二次注射により増幅される。免疫化が成功した
かどうかはそれ自体当該技術者により知られるＥＬＩＳ
Ａを用いて特定の抗体の濃度を測定することによりモニ
ターすることができる。リンパ球をミエローマ細胞系と
融合させる数日前に動物にアジュバントを用いずにラミ
ニンＰ１で処理する。リンパ球を動物から単離し、上記
した動物種の１つ、好ましくはマウスに由来するミエロ
ーマ細胞系、特に細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.６５３と融
合させる。好都合にはリンパ球を同じ種に由来するミエ
ローマ細胞系と融合させる。融合、および、その後の細
胞クローンの培養は、免疫学的結合試験により測定され
る細胞培養物の上澄み中の特異的抗体の濃度を用いて当
該技術分野で知られる方法で実施する。免疫学的方法で
用いるのに適する細胞クローンは表４および５に記載の
スクリーニング配列を用いて融合で生じるクローンから
選択する。特に好ましくは、Balb／ｃ系統のマウスに由
来する抗ラミニンＰ１リンパ球をマウスミエローマ細胞
系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.６５３と融合させることにより調
製した細胞系を使用する。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体は免疫グロブ
リン、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ蛋白クラ
スのグループに属する。ＩｇＧ ２ａおよびＩｇＧ １サ
ブクラスの抗体が特に好都合に用いられる。本発明の抗
体の特徴は、特に、未損傷のラミニンに対するその親和
性がペプシン消化により得られる免疫化抗原ラミニンＰ
１に対するその親和性とほぼ等しい点である（表２およ
び表３）。表４および表５に記載したスクリーニング法
は、融合から単離されるクローンの大多数がペプシン処
理により得られる人工のラミニンＰ１フラグメントを認
識するのみのモノクローナル抗体を産生することを、明
らかに示している。これらの抗体が、蛋白分解的鎖切断
の結果人工的に形成され、そして天然の蛋白構造中には
存在しないような免疫原的構造と反応する確立は高い。
しかしながら、単離されたモノクローナル抗体のうち数
種類のみ、特に、本発明の抗体のみが、ラミニンの中央
ドメインにおいてペプシン消化により発生されない天然
の構造と反応する。
リン、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ蛋白クラ
スのグループに属する。ＩｇＧ ２ａおよびＩｇＧ １サ
ブクラスの抗体が特に好都合に用いられる。本発明の抗
体の特徴は、特に、未損傷のラミニンに対するその親和
性がペプシン消化により得られる免疫化抗原ラミニンＰ
１に対するその親和性とほぼ等しい点である（表２およ
び表３）。表４および表５に記載したスクリーニング法
は、融合から単離されるクローンの大多数がペプシン処
理により得られる人工のラミニンＰ１フラグメントを認
識するのみのモノクローナル抗体を産生することを、明
らかに示している。これらの抗体が、蛋白分解的鎖切断
の結果人工的に形成され、そして天然の蛋白構造中には
存在しないような免疫原的構造と反応する確立は高い。
しかしながら、単離されたモノクローナル抗体のうち数
種類のみ、特に、本発明の抗体のみが、ラミニンの中央
ドメインにおいてペプシン消化により発生されない天然
の構造と反応する。
【００１７】本発明の抗体の調製と特性化において重要
な点は、免疫化抗原およびスクリーニングに必要な種々
の構造変異体の両方を単離するのに適する材料が得られ
るという点である。ヒトラミニンＰ１および種々のラミ
ニン調製物は、実施例に記載の方法を用いてヒト胎盤か
ら精製される。少なくとも２種類のラミニンのイソフォ
ームがこの臓器から得ることができる（Brown, C.J.；W
iedemann, H.；Timpl,R.（1994）J. Cell Sci. 107；32
9-338）。
な点は、免疫化抗原およびスクリーニングに必要な種々
の構造変異体の両方を単離するのに適する材料が得られ
るという点である。ヒトラミニンＰ１および種々のラミ
ニン調製物は、実施例に記載の方法を用いてヒト胎盤か
ら精製される。少なくとも２種類のラミニンのイソフォ
ームがこの臓器から得ることができる（Brown, C.J.；W
iedemann, H.；Timpl,R.（1994）J. Cell Sci. 107；32
9-338）。
【００１８】本発明の抗体は種々の免疫学的方法、例え
ばクロラミンＴまたはBolton-Hunter試薬でトレーサー
抗体を標識した後の免疫放射線試験、および、その他の
競合的および非競合的結合測定法、例えば蛍光免疫検定
法、酵素免疫検定法、化学ルミネセンス免疫検定法、ま
たは、全てのラジオイムノアッセイを含むその他の種類
の免疫検定法で使用することができる（Harlow, E.；La
ne, D.（1988）Antibodies：A Laboratory Manual, CS
H；第２版；New York；319-359；553-612）。この点に
おいて、コーティング抗体がポリスチレンチューブ、ポ
リスチレンビーズ、半磁性粒子または何れかの種類の活
性化カラム材料に、共有結合的に結合しているか、また
は非共有結合的に結合しているかは、問題ではない。こ
の理由から、モノクローナル抗体は組織および体液中の
ラミニンの単離および特性化、並びに、定量的測定のた
めの免疫学的方法で用いることができる。それ自体当該
分野で知られる方法を用いて、溶液中または好ましくは
固体支持体に結合した状態の本発明のモノクローナル抗
体の１つとラミニンを含有する液体試料を反応させ、形
成した抗原／抗体複合体を用いてラミニンの量を測定す
る。これらの免疫検定は、体液中のラミニン分解生成物
を認識するのではなく、未損傷のラミニン構造のみを認
識する。従来の免疫検定は上記分解生成物を同時に検出
するかあるいはそれのみを認識するものであった。
ばクロラミンＴまたはBolton-Hunter試薬でトレーサー
抗体を標識した後の免疫放射線試験、および、その他の
競合的および非競合的結合測定法、例えば蛍光免疫検定
法、酵素免疫検定法、化学ルミネセンス免疫検定法、ま
たは、全てのラジオイムノアッセイを含むその他の種類
の免疫検定法で使用することができる（Harlow, E.；La
ne, D.（1988）Antibodies：A Laboratory Manual, CS
H；第２版；New York；319-359；553-612）。この点に
おいて、コーティング抗体がポリスチレンチューブ、ポ
リスチレンビーズ、半磁性粒子または何れかの種類の活
性化カラム材料に、共有結合的に結合しているか、また
は非共有結合的に結合しているかは、問題ではない。こ
の理由から、モノクローナル抗体は組織および体液中の
ラミニンの単離および特性化、並びに、定量的測定のた
めの免疫学的方法で用いることができる。それ自体当該
分野で知られる方法を用いて、溶液中または好ましくは
固体支持体に結合した状態の本発明のモノクローナル抗
体の１つとラミニンを含有する液体試料を反応させ、形
成した抗原／抗体複合体を用いてラミニンの量を測定す
る。これらの免疫検定は、体液中のラミニン分解生成物
を認識するのではなく、未損傷のラミニン構造のみを認
識する。従来の免疫検定は上記分解生成物を同時に検出
するかあるいはそれのみを認識するものであった。
【００１９】本発明を以下の実施例により詳細に説明す
る。 〔実施例１〕 ヒトラミニンＰ１（免疫化抗原）の調製 免疫化抗原ラミニンＰ１はペプシンで胎盤組織を高度に
消化した後に抽出単離できる２００〜２５０kDaの大き
さのラミニンフラグメントである。このフラグメントは
α、βおよびγラミニン鎖の短い腕の内部の棒型のドメ
イン（IIIドメイン）を有している（Risteli, L.；Timp
l, R.（1981）Biochem. J. 193, 749-755）。３つのポ
リペプチド鎖（うちいくつかのイソフォームが存在す
る）はジスルフィド架橋により連結しており、同一の３
次元構造により特徴づけられる。図２に示されるとお
り、７〜１４の構造モチーフから、ともに線状に伸び全
て同様の層状化パターンにより特徴づけられる、いわゆ
るＥＧＦ様リピートがラミニンサブユニットの個々の鎖
セグメント内に存在する。ＥＧＦ様リピートの各々に存
在する５０〜６０のアミノ酸は、ジスルフィド結合の典
型的な所定の配列の結果として、クローバーの葉の形状
の構造を有する。配列のレベルでは、短ラミニン鎖のＥ
ＧＦ様リピートの間には３０％より大きい同一性（アイ
デンティティー）が有る（Engel, J.（1989）FEBS Let
t. 251, No. 1.2；1-7）。
る。 〔実施例１〕 ヒトラミニンＰ１（免疫化抗原）の調製 免疫化抗原ラミニンＰ１はペプシンで胎盤組織を高度に
消化した後に抽出単離できる２００〜２５０kDaの大き
さのラミニンフラグメントである。このフラグメントは
α、βおよびγラミニン鎖の短い腕の内部の棒型のドメ
イン（IIIドメイン）を有している（Risteli, L.；Timp
l, R.（1981）Biochem. J. 193, 749-755）。３つのポ
リペプチド鎖（うちいくつかのイソフォームが存在す
る）はジスルフィド架橋により連結しており、同一の３
次元構造により特徴づけられる。図２に示されるとお
り、７〜１４の構造モチーフから、ともに線状に伸び全
て同様の層状化パターンにより特徴づけられる、いわゆ
るＥＧＦ様リピートがラミニンサブユニットの個々の鎖
セグメント内に存在する。ＥＧＦ様リピートの各々に存
在する５０〜６０のアミノ酸は、ジスルフィド結合の典
型的な所定の配列の結果として、クローバーの葉の形状
の構造を有する。配列のレベルでは、短ラミニン鎖のＥ
ＧＦ様リピートの間には３０％より大きい同一性（アイ
デンティティー）が有る（Engel, J.（1989）FEBS Let
t. 251, No. 1.2；1-7）。
【００２０】免疫化抗原ラミニンＰ１は以下に説明する
ように調製した。 １．解凍 １.２kgのヒト胎盤を水５００ml＋ＰＩ中１６〜２０時
間４℃で解凍した。（ＰＩ＝プロテアーゼ阻害剤＝１mM
ＮＥＭ, １mm ＰＭＳＦおよび０.２８mM ＰＣＭＢ） ２．ホモゲナイズ 解凍後、試料の容量を２.５リットルに調整し、試料をU
ltraturraxで３〜５分間ホモゲナイズした。試料を最後
に４℃で１０分６５００Ｇで遠心分離した。 ３．洗浄 得られた沈殿を３Ｍ ＮａＣｌ、０.１％ トリトンＸ−
１００、０.０２Ｍ トリス／塩酸、pH７.４＋ＰＩ各々
１.８リットルとともに８回撹拌し、次に４℃で１０分
間６５００Ｇで遠心分離した。最後に沈殿を水中で撹拌
し、再度遠心分離した。次に沈殿を緩衝液（１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１％ トリトンＸ−１００、
０.０２Ｍ トリス／塩酸、pH８.６＋ＰＩ）３リットル
で６４時間４℃で抽出した。不溶の物質を２６０００Ｇ
で遠心分離（３０分間）することにより分離し、その後
の処理に付した。
ように調製した。 １．解凍 １.２kgのヒト胎盤を水５００ml＋ＰＩ中１６〜２０時
間４℃で解凍した。（ＰＩ＝プロテアーゼ阻害剤＝１mM
ＮＥＭ, １mm ＰＭＳＦおよび０.２８mM ＰＣＭＢ） ２．ホモゲナイズ 解凍後、試料の容量を２.５リットルに調整し、試料をU
ltraturraxで３〜５分間ホモゲナイズした。試料を最後
に４℃で１０分６５００Ｇで遠心分離した。 ３．洗浄 得られた沈殿を３Ｍ ＮａＣｌ、０.１％ トリトンＸ−
１００、０.０２Ｍ トリス／塩酸、pH７.４＋ＰＩ各々
１.８リットルとともに８回撹拌し、次に４℃で１０分
間６５００Ｇで遠心分離した。最後に沈殿を水中で撹拌
し、再度遠心分離した。次に沈殿を緩衝液（１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１％ トリトンＸ−１００、
０.０２Ｍ トリス／塩酸、pH８.６＋ＰＩ）３リットル
で６４時間４℃で抽出した。不溶の物質を２６０００Ｇ
で遠心分離（３０分間）することにより分離し、その後
の処理に付した。
【００２１】４．ペプシン消化 最終沈殿を０.５Ｍ 酢酸、１０mM ＥＤＴＡ ３.０リッ
トル中で撹拌し、次に３分間Ultraturraxでホモゲナイ
ズし、更に２時間撹拌した。試料のpHをギ酸で２.５に
調節した。４℃でペプシン１００mgを添加することによ
り蛋白分解消化を行い、４０時間継続した。ペプシン消
化後、存在する白濁を３０分間２６０００Ｇで遠心分離
（４℃）することにより除去した。 ５．酸性ＮａＣｌ析出 撹拌しながらＮａＣｌ ３６６.１ｇ（＝１.９Ｍ）を遠
心上澄み（３.１６リットル）に添加し、次にこれを更
に２時間撹拌した。形成した沈殿を、６５００Ｇ（４
℃、１０分間）で遠心分離することにより酸性緩衝液か
ら分離し、０.０２Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ 尿素、０.０５Ｍ
トリス／塩酸、pH８.６ １.８リットル中に溶解し、次
に、同じ緩衝液８リットルで７回透析した。溶液の白濁
を遠心分離（２６０００Ｇ、３０分間、４℃）により除
去した。
トル中で撹拌し、次に３分間Ultraturraxでホモゲナイ
ズし、更に２時間撹拌した。試料のpHをギ酸で２.５に
調節した。４℃でペプシン１００mgを添加することによ
り蛋白分解消化を行い、４０時間継続した。ペプシン消
化後、存在する白濁を３０分間２６０００Ｇで遠心分離
（４℃）することにより除去した。 ５．酸性ＮａＣｌ析出 撹拌しながらＮａＣｌ ３６６.１ｇ（＝１.９Ｍ）を遠
心上澄み（３.１６リットル）に添加し、次にこれを更
に２時間撹拌した。形成した沈殿を、６５００Ｇ（４
℃、１０分間）で遠心分離することにより酸性緩衝液か
ら分離し、０.０２Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ 尿素、０.０５Ｍ
トリス／塩酸、pH８.６ １.８リットル中に溶解し、次
に、同じ緩衝液８リットルで７回透析した。溶液の白濁
を遠心分離（２６０００Ｇ、３０分間、４℃）により除
去した。
【００２２】６．ＱセファロースＦＦ（５×１５cm）上
のクロマトグラフィー 各々３５０mlの試料をカラムに投入して５回の分離を行
った。 実験条件： 緩衝液Ａ：0.02M NaCl、0.05M トリス／塩酸、１mM EDTA、pH7.4 緩衝液Ｂ：１M NaCl、0.05M トリス／塩酸、１mM EDTA、pH7.4 流量：３ml／min 一次勾配：(90ml),0.02〜0.1M NaCl段階勾配：0.1M NaCl含有緩衝液300ml 0.25M NaCl含有緩衝液450ml 0.5M NaCl含有緩衝液300ml 個々のクロマトグラフィー画分をRIA-gnostRラミニンＰ
１試験を用いて分析し、ラミニンＰ１を含有する画分
（０.２５Ｍ ＮａＣｌで溶離）を合わせた。
のクロマトグラフィー 各々３５０mlの試料をカラムに投入して５回の分離を行
った。 実験条件： 緩衝液Ａ：0.02M NaCl、0.05M トリス／塩酸、１mM EDTA、pH7.4 緩衝液Ｂ：１M NaCl、0.05M トリス／塩酸、１mM EDTA、pH7.4 流量：３ml／min 一次勾配：(90ml),0.02〜0.1M NaCl段階勾配：0.1M NaCl含有緩衝液300ml 0.25M NaCl含有緩衝液450ml 0.5M NaCl含有緩衝液300ml 個々のクロマトグラフィー画分をRIA-gnostRラミニンＰ
１試験を用いて分析し、ラミニンＰ１を含有する画分
（０.２５Ｍ ＮａＣｌで溶離）を合わせた。
【００２３】７．硫酸アンモニウム沈殿 合わせたラミニンＰ１含有分を３Ｍ 硫酸アンモニウム
で３：１に希釈し、２時間４℃でインキュベートした。
沈殿を３０分間２６０００Ｇ（４℃）で遠心分離するこ
とにより回収した。
で３：１に希釈し、２時間４℃でインキュベートした。
沈殿を３０分間２６０００Ｇ（４℃）で遠心分離するこ
とにより回収した。
【００２４】８．スーパローズ（Superose）６prep グ
レード １６／５０上のクロマトグラフィー 沈殿した蛋白を適当な容量の５０mM リン酸ナトリウ
ム、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％ アジ化ナトリウ
ム、pH２.０に溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィーに
より２mlずつ分画した。 実験条件： 緩衝液：50mMリン酸ナトリウム,0.15M NaCl,0.02％アジ
化ナトリウム,pH2.0 流量：1.0ml／min 個々のクロマトグラフィー画分を再度RIA-gnostRラミニ
ンＰ１を用いて分析した。２５回の個別のクロマトグラ
フィー実験から得られたラミニン含有画分を合わせて、
２Ｍ ＮａＯＨで処理することによりpH８.０に調整し
た。次に溶液を３Ｍ 硫酸アンモニウム溶液で３：１に
処理し、一夜インキュベートした。形成した沈殿を２６
０００Ｇ（３０分、４℃）で遠心分離し、０.２Ｍ 炭酸
水素アンモニウム２０mlに溶解した。
レード １６／５０上のクロマトグラフィー 沈殿した蛋白を適当な容量の５０mM リン酸ナトリウ
ム、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０２％ アジ化ナトリウ
ム、pH２.０に溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィーに
より２mlずつ分画した。 実験条件： 緩衝液：50mMリン酸ナトリウム,0.15M NaCl,0.02％アジ
化ナトリウム,pH2.0 流量：1.0ml／min 個々のクロマトグラフィー画分を再度RIA-gnostRラミニ
ンＰ１を用いて分析した。２５回の個別のクロマトグラ
フィー実験から得られたラミニン含有画分を合わせて、
２Ｍ ＮａＯＨで処理することによりpH８.０に調整し
た。次に溶液を３Ｍ 硫酸アンモニウム溶液で３：１に
処理し、一夜インキュベートした。形成した沈殿を２６
０００Ｇ（３０分、４℃）で遠心分離し、０.２Ｍ 炭酸
水素アンモニウム２０mlに溶解した。
【００２５】９．コラゲナーゼによる消化 コラゲナーゼ約１mg、塩化マグネシウムおよび塩化カル
シウムスパチュラ１さじ分を溶液に添加し、これを４時
間３７℃でインキュベートした。蛋白分解消化はギ酸３
mlの添加により停止した。 １０．スーパローズ（Superose）６prep グレード１６
／５０上のクロマトグラフィー 消化後、クロマトグラフィーを再度上記した通り実施し
た。ＲＩＡで陽性であった画分を（２Ｍ ＮａＯＨでpH
８.０に調整した後）３Ｍ硫酸アンモニウムで３：１に
希釈し、この状態で４℃で保存した。形成した沈殿を３
Ｍ硫酸アンモニウムに懸濁し、次にこの懸濁液を各々
０.５mlの２２試料に分割し、各々Eppendorf遠心分離器
で４分間遠心分離した。上澄み０.４８mlを試料各々か
ら採取した。単離したラミニンＰ１は含有量低下を伴わ
ず少なくとも４ヶ月４℃で硫酸アンモニウム沈殿の状態
で保存できる。 １１．収率／特性 RIA-gnostRラミニンＰ１試験を用いた濃度の測定：１０
８,６００Ｅ（２３.９mg） ＲＩＡにおける特性：一次阻害曲線ＳＯ結合＝６６.９
％；５０％切片＝１.３０２Ｅ／ml；正常血清＝１.７２
Ｅ／ml
シウムスパチュラ１さじ分を溶液に添加し、これを４時
間３７℃でインキュベートした。蛋白分解消化はギ酸３
mlの添加により停止した。 １０．スーパローズ（Superose）６prep グレード１６
／５０上のクロマトグラフィー 消化後、クロマトグラフィーを再度上記した通り実施し
た。ＲＩＡで陽性であった画分を（２Ｍ ＮａＯＨでpH
８.０に調整した後）３Ｍ硫酸アンモニウムで３：１に
希釈し、この状態で４℃で保存した。形成した沈殿を３
Ｍ硫酸アンモニウムに懸濁し、次にこの懸濁液を各々
０.５mlの２２試料に分割し、各々Eppendorf遠心分離器
で４分間遠心分離した。上澄み０.４８mlを試料各々か
ら採取した。単離したラミニンＰ１は含有量低下を伴わ
ず少なくとも４ヶ月４℃で硫酸アンモニウム沈殿の状態
で保存できる。 １１．収率／特性 RIA-gnostRラミニンＰ１試験を用いた濃度の測定：１０
８,６００Ｅ（２３.９mg） ＲＩＡにおける特性：一次阻害曲線ＳＯ結合＝６６.９
％；５０％切片＝１.３０２Ｅ／ml；正常血清＝１.７２
Ｅ／ml
【００２６】〔実施例２〕 ラミニンの調製、バッチＩ 洗浄段階と抽出は実施例１に記載のとおり行った。抽出
した蛋白を、Ultrasette（３００kDa）を用いて２Ｍ 尿
素、０.０５Ｍ トリス／塩酸、０.０２Ｍ ＮａＣｌ、２
mM ＥＤＴＡ、pH７.４中に再度緩衝液処理し、Ｑセファ
ロースＦＦ６０／１４カラムに導入した。結合蛋白を導
入緩衝液中に溶解した０.１５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶離
した。溶出液をUltrasette（３００kDa）を用いて再度
濃縮し、流量１ml／minで、ＰＢＳ、２mM ＥＤＴＡ中、
Superose ６prep. グレード１６／５０上のクロマトグ
ラフィーに付した。ラミニン含有画分（RIA-gnostRラミ
ニンＰ１により測定）を合わせ、Ultrasetteで濃縮し、
２時間より長い時間、室温でベンゾナーゼ（純度II）５
０００単位を用いてインキュベートした。次に試料を
０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５Ｍ トリス／塩酸、pH７.
４で平衡化しておいたConA−セファロース４Ｂカラム
（２.６×１０cm）上に導入した。次にラミニンを平衡
化緩衝液中０.４Ｍ メチルアルファ−Ｄ−マンノピラノ
シドを用いて、１ml／minの流量で再度溶離した。更に
精製するために、そして、ＰＢＳ＋２mM ＥＤＴＡ緩衝
液に移すために、流量１ml／minで、溶出液をセファク
リルＳ５００スーパーファインカラム（２.６×１４０c
m）上のクロマトグラフィーに付した。
した蛋白を、Ultrasette（３００kDa）を用いて２Ｍ 尿
素、０.０５Ｍ トリス／塩酸、０.０２Ｍ ＮａＣｌ、２
mM ＥＤＴＡ、pH７.４中に再度緩衝液処理し、Ｑセファ
ロースＦＦ６０／１４カラムに導入した。結合蛋白を導
入緩衝液中に溶解した０.１５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶離
した。溶出液をUltrasette（３００kDa）を用いて再度
濃縮し、流量１ml／minで、ＰＢＳ、２mM ＥＤＴＡ中、
Superose ６prep. グレード１６／５０上のクロマトグ
ラフィーに付した。ラミニン含有画分（RIA-gnostRラミ
ニンＰ１により測定）を合わせ、Ultrasetteで濃縮し、
２時間より長い時間、室温でベンゾナーゼ（純度II）５
０００単位を用いてインキュベートした。次に試料を
０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５Ｍ トリス／塩酸、pH７.
４で平衡化しておいたConA−セファロース４Ｂカラム
（２.６×１０cm）上に導入した。次にラミニンを平衡
化緩衝液中０.４Ｍ メチルアルファ−Ｄ−マンノピラノ
シドを用いて、１ml／minの流量で再度溶離した。更に
精製するために、そして、ＰＢＳ＋２mM ＥＤＴＡ緩衝
液に移すために、流量１ml／minで、溶出液をセファク
リルＳ５００スーパーファインカラム（２.６×１４０c
m）上のクロマトグラフィーに付した。
【００２７】〔実施例３〕 ラミニンの調製、バッチII 実施例１に記載の通り洗浄段階および抽出を行った。ラ
ミニン含有ＥＤＴＡ抽出液をUltrasette（３００kDa）
を用いて２５mlまで濃縮し、同時に５０mM トリス／塩
酸、１mM 塩化マグネシウム、pH８.０中に再度緩衝液処
理した。次にこの溶液をベンゾナーゼ５０００単位とと
もに２時間室温でインキュベートした。このようにして
処理しておいた溶液を次に、ラミニンＰ１と未損傷のラ
ミニンの両方に対する結合親和性を有する４種類のモノ
クローナル抗体を共有結合させておいた（製造者の記載
による）抗Ｐ１Ｍａｂアフィニティーカラムに通した。
発明者らが区別するために用いている名称で以下に示す
モノクローナル抗体を活性化ＣＮＢｒ−セファロース４
Ｂ（６ml）カラム上に固定化した：Ａ２５／２／２
（２.７mg）、Ａ２７／２／１（１.５mg）、Ａ９／２／
１（０.６mg）およびＡ２８／１／１（５.２mg）。
ミニン含有ＥＤＴＡ抽出液をUltrasette（３００kDa）
を用いて２５mlまで濃縮し、同時に５０mM トリス／塩
酸、１mM 塩化マグネシウム、pH８.０中に再度緩衝液処
理した。次にこの溶液をベンゾナーゼ５０００単位とと
もに２時間室温でインキュベートした。このようにして
処理しておいた溶液を次に、ラミニンＰ１と未損傷のラ
ミニンの両方に対する結合親和性を有する４種類のモノ
クローナル抗体を共有結合させておいた（製造者の記載
による）抗Ｐ１Ｍａｂアフィニティーカラムに通した。
発明者らが区別するために用いている名称で以下に示す
モノクローナル抗体を活性化ＣＮＢｒ−セファロース４
Ｂ（６ml）カラム上に固定化した：Ａ２５／２／２
（２.７mg）、Ａ２７／２／１（１.５mg）、Ａ９／２／
１（０.６mg）およびＡ２８／１／１（５.２mg）。
【００２８】ＥＤＴＡ抽出液２５mlを１ml／minの流量
で、アフィニティーカラム（０.１ＭＮａＣｌ、０.０５
Ｍ トリス／塩酸、１０mM ＥＤＴＡ、０.１Ｍ Pefablo
c、pH７.４で平衡化）上に導入し、０.１Ｍ グリシン／
塩酸、pH２.７で溶離した。溶出液のpHを即座に０.８Ｍ
トリス溶液で中性とし、Macrosep １００kDaを用いて
最終的に０.１Ｍ 炭酸水素アンモニウム＋２mM ＥＤＴ
Ａに再度緩衝液処理した。
で、アフィニティーカラム（０.１ＭＮａＣｌ、０.０５
Ｍ トリス／塩酸、１０mM ＥＤＴＡ、０.１Ｍ Pefablo
c、pH７.４で平衡化）上に導入し、０.１Ｍ グリシン／
塩酸、pH２.７で溶離した。溶出液のpHを即座に０.８Ｍ
トリス溶液で中性とし、Macrosep １００kDaを用いて
最終的に０.１Ｍ 炭酸水素アンモニウム＋２mM ＥＤＴ
Ａに再度緩衝液処理した。
【００２９】〔実施例４〕 ハイブリドーマ作成 Ｂａｌｂ／ｃ系のマウスを、実施例１に従って得られた
ラミニンＰ１ ２０μｇで、Freundの完全アジュバント
の存在下、皮下免疫化した。４週間後、および、３ヶ月
後、Freundの不完全アジュバントの存在下、ラミニン２
０μｇを更に皮下注射することにより、免疫反応を増幅
した。融合の３日前、ラミニンＰ１ １００μｇを更に
腹腔内注射することにより免疫応答を増幅した。
ラミニンＰ１ ２０μｇで、Freundの完全アジュバント
の存在下、皮下免疫化した。４週間後、および、３ヶ月
後、Freundの不完全アジュバントの存在下、ラミニン２
０μｇを更に皮下注射することにより、免疫反応を増幅
した。融合の３日前、ラミニンＰ１ １００μｇを更に
腹腔内注射することにより免疫応答を増幅した。
【００３０】融合のために、動物を屠殺し、脾細胞を取
り出した。脾細胞をポリエチレングリコールの存在下、
ミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.６５３と融合させ
た。２週間ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン
培地中の融合混合物を培養することにより、脾細胞×Ｐ
３Ｘ６３ＡＧ８.６５３ハイブリッドを選択した。得ら
れた細胞クローンを反復してサブクローニングし、安定
な細胞系を得た。得られた細胞コロニーの抗体産生につ
いて、種々の免疫学的結合試験で試験した。得られた細
胞系からは、我々の識別のためにＡ２７／２／１、Ａ９
／２／１およびＡ３３／２／２０と命名した抗体が得ら
れ、これらの細胞系は、１９９４年７月１２日に、ブタ
ペスト条約の条項に従って、ドイツ微生物細胞培養コレ
クション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un
d Zellkulturen GmbH（DSM）, Mascheroder Weg lb, D-
38124 Braunschweig）に寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１８
１、ＤＳＭ ＡＣＣ２１８０およびＤＳＭ ＡＣＣ２１８
２の下に寄託した。
り出した。脾細胞をポリエチレングリコールの存在下、
ミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.６５３と融合させ
た。２週間ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン
培地中の融合混合物を培養することにより、脾細胞×Ｐ
３Ｘ６３ＡＧ８.６５３ハイブリッドを選択した。得ら
れた細胞クローンを反復してサブクローニングし、安定
な細胞系を得た。得られた細胞コロニーの抗体産生につ
いて、種々の免疫学的結合試験で試験した。得られた細
胞系からは、我々の識別のためにＡ２７／２／１、Ａ９
／２／１およびＡ３３／２／２０と命名した抗体が得ら
れ、これらの細胞系は、１９９４年７月１２日に、ブタ
ペスト条約の条項に従って、ドイツ微生物細胞培養コレ
クション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un
d Zellkulturen GmbH（DSM）, Mascheroder Weg lb, D-
38124 Braunschweig）に寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１８
１、ＤＳＭ ＡＣＣ２１８０およびＤＳＭ ＡＣＣ２１８
２の下に寄託した。
【００３１】〔実施例５〕 特定のモノクローナル抗体の特性化と同定を目的とした
実験 スクリーニングの年代順配列を表４および表５に示す。
ラミニンＰ１でマウスを免疫化することにより、非常に
大多数の抗体産生ハイブリドーマクローンが得られた。
その結果、本来のラミニン分子の適切なドメイン中に存
在する構造モチーフに対するモノクローナル抗体を産生
するクローンを検出するためには、考えられる最も広範
囲の種類の免疫学的分析方法を用いて本来の、または、
天然の構造へのモノクローナル抗体の結合が検出できる
判別スクリーニングを行わなければならなかった。精製
ラミニンＰ１と反応するだけの抗体は即座に除外した。
実験を行うために、本来のラミニンをヒト胎盤から抽出
しなければならない（実施例２および３参照）。しかし
ながらこの際、ラミニンの主要な形態を過度に精製し
て、存在する可能性のあるラミニンイソフォームのスペ
クトルを過剰に制限しないように注意しなければならな
い。Brown等の研究（Brown, C.J.；Wiedemann, H.；Tim
pl, R.（1994）J. Cell Sci. 107；329-338）から、少
なくとも２つの異なるラミニン変異体（ラミニン２およ
びラミニン４）が胎盤から得ることができることが明ら
かである。スクリーニング操作の初期の段階であって
も、血清中に存在するラミニン構造とのモノクローナル
抗体の反応を試験することは極めて重要であると考えら
れた。これらの検査のためには、血清ラミニンをセファ
デックスＳ−４００カラム（１.０×３０cm）を用い
て、健常者の血清約２０mlから単離しなければならなか
った。血清抗原はカラムから２つのブロードなピークと
して溶出し、ピーク１は分子量が６００kDaより大きい
抗原構造を有している。ピーク２は、免疫化抗原の大き
さ（約２００kDa）のオーダーの分子量を有する血清ラ
ミニンの分解生成物、および、より小さいフラグメント
も含んでいる。スクリーニングの過程において、精製ヒ
ト胎盤ラミニンに対する結合親和性の他に、「血清ラミ
ニン」に対する、好ましくはこのラミニンの高分子量形
態に対する高い反応性も示すような抗体（クローン）の
みを選択する。第２のモノクローナル抗体とともに１対
として抗原に結合する能力は、選択のためのもう１つの
基準となる。表６は、一例として同じ免疫化により得ら
れたモノクローナル抗体を用いて、どのようにして個々
の「スクリーニングモジュール」（表４および表５参
照）が、全体として、本発明のモノクローナル抗体を特
性化し、選択することを可能とするかを示すものであ
る。表７は、標準物質の認識と比較した場合の血清ラミ
ニンに対する結合親和性を分析することを目的とした試
験をまとめたものである。
実験 スクリーニングの年代順配列を表４および表５に示す。
ラミニンＰ１でマウスを免疫化することにより、非常に
大多数の抗体産生ハイブリドーマクローンが得られた。
その結果、本来のラミニン分子の適切なドメイン中に存
在する構造モチーフに対するモノクローナル抗体を産生
するクローンを検出するためには、考えられる最も広範
囲の種類の免疫学的分析方法を用いて本来の、または、
天然の構造へのモノクローナル抗体の結合が検出できる
判別スクリーニングを行わなければならなかった。精製
ラミニンＰ１と反応するだけの抗体は即座に除外した。
実験を行うために、本来のラミニンをヒト胎盤から抽出
しなければならない（実施例２および３参照）。しかし
ながらこの際、ラミニンの主要な形態を過度に精製し
て、存在する可能性のあるラミニンイソフォームのスペ
クトルを過剰に制限しないように注意しなければならな
い。Brown等の研究（Brown, C.J.；Wiedemann, H.；Tim
pl, R.（1994）J. Cell Sci. 107；329-338）から、少
なくとも２つの異なるラミニン変異体（ラミニン２およ
びラミニン４）が胎盤から得ることができることが明ら
かである。スクリーニング操作の初期の段階であって
も、血清中に存在するラミニン構造とのモノクローナル
抗体の反応を試験することは極めて重要であると考えら
れた。これらの検査のためには、血清ラミニンをセファ
デックスＳ−４００カラム（１.０×３０cm）を用い
て、健常者の血清約２０mlから単離しなければならなか
った。血清抗原はカラムから２つのブロードなピークと
して溶出し、ピーク１は分子量が６００kDaより大きい
抗原構造を有している。ピーク２は、免疫化抗原の大き
さ（約２００kDa）のオーダーの分子量を有する血清ラ
ミニンの分解生成物、および、より小さいフラグメント
も含んでいる。スクリーニングの過程において、精製ヒ
ト胎盤ラミニンに対する結合親和性の他に、「血清ラミ
ニン」に対する、好ましくはこのラミニンの高分子量形
態に対する高い反応性も示すような抗体（クローン）の
みを選択する。第２のモノクローナル抗体とともに１対
として抗原に結合する能力は、選択のためのもう１つの
基準となる。表６は、一例として同じ免疫化により得ら
れたモノクローナル抗体を用いて、どのようにして個々
の「スクリーニングモジュール」（表４および表５参
照）が、全体として、本発明のモノクローナル抗体を特
性化し、選択することを可能とするかを示すものであ
る。表７は、標準物質の認識と比較した場合の血清ラミ
ニンに対する結合親和性を分析することを目的とした試
験をまとめたものである。
【００３２】〔実施例６〕 モノクローナル抗体Ａ２７／２／１およびＡ９／２／１
の放射活性標識 ０.０５Ｍ リン酸塩緩衝液pH７.４中にモノクローナル
抗体４０μｇを含有する溶液０.２mlをまずポリスチレ
ン試験管（１２×５５mm）に入れ、０.５Ｍ リン酸塩緩
衝液pH７.４で緩衝液処理したＮａ125Ｉ溶液１００MBq
を添加した。クロラミンＴ ２０μｇの水性溶液５０μ
ｌを添加した後、試料を１分間混合した。次にヨウ化反
応を２亜硫酸ナトリウム２０μｇの水溶液５０μｌを添
加することにより終了した。次に未反応のＮａ125Ｉを
アニオン交換樹脂上のクロマトグラフィーまたはＰＤ−
１０上のゲル濾過クロマトグラフィーにより125Ｉ標識
モノクローナル抗体から分離した。精製した125Ｉ標識
抗体は比放射能５〜１２mCi／mg（１８０〜４５０MBq／
mg）を有していた。
の放射活性標識 ０.０５Ｍ リン酸塩緩衝液pH７.４中にモノクローナル
抗体４０μｇを含有する溶液０.２mlをまずポリスチレ
ン試験管（１２×５５mm）に入れ、０.５Ｍ リン酸塩緩
衝液pH７.４で緩衝液処理したＮａ125Ｉ溶液１００MBq
を添加した。クロラミンＴ ２０μｇの水性溶液５０μ
ｌを添加した後、試料を１分間混合した。次にヨウ化反
応を２亜硫酸ナトリウム２０μｇの水溶液５０μｌを添
加することにより終了した。次に未反応のＮａ125Ｉを
アニオン交換樹脂上のクロマトグラフィーまたはＰＤ−
１０上のゲル濾過クロマトグラフィーにより125Ｉ標識
モノクローナル抗体から分離した。精製した125Ｉ標識
抗体は比放射能５〜１２mCi／mg（１８０〜４５０MBq／
mg）を有していた。
【００３３】〔実施例７〕 抗体による試験管のコーティング ポリスチレン試験管（１２×７５mm）にモノクローナル
抗体Ａ２７／２／１を結合するために、モノクローナル
抗体Ａ２７／２／１ ０.５mlを、ＰＢＳ中、２０μｇ／
mlの濃度で各々の試験管中２０時間室温でインキュベー
トした。抗体溶液を吸引した後、試験管を１時間室温で
１ml ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックした。溶液を吸引
した後、試験管を冷蔵庫に保存した。
抗体Ａ２７／２／１を結合するために、モノクローナル
抗体Ａ２７／２／１ ０.５mlを、ＰＢＳ中、２０μｇ／
mlの濃度で各々の試験管中２０時間室温でインキュベー
トした。抗体溶液を吸引した後、試験管を１時間室温で
１ml ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックした。溶液を吸引
した後、試験管を冷蔵庫に保存した。
【００３４】〔実施例８〕 イムノラジオメトリック試験 検定変異体１：Ａ２７／２／１−125Ｉ Ａ９／２／１ 試料５０μｌまたは標準物質１００μｌを１７〜２５℃
でコーティングされた試験管の各々にピペットで計量投
入し、その後、試験管にＰＢＳ／ツイーン１５０μｌを
充填した。２時間試験管をインキュベートした後、液体
を吸引し、試験管を２回洗浄した。次に125Ｉ Ａ９／２
／１ ２００μｌを添加し、試験管を再度２時間室温で
インキュベートした。液体を吸引し、２回洗浄した後、
結合活性をγカウンターで測定した。
でコーティングされた試験管の各々にピペットで計量投
入し、その後、試験管にＰＢＳ／ツイーン１５０μｌを
充填した。２時間試験管をインキュベートした後、液体
を吸引し、試験管を２回洗浄した。次に125Ｉ Ａ９／２
／１ ２００μｌを添加し、試験管を再度２時間室温で
インキュベートした。液体を吸引し、２回洗浄した後、
結合活性をγカウンターで測定した。
【００３５】検定変異体２：Ａ２７／２／１−125Ｉ Ａ
３３／２／２０ ２００μｌの試料または標準物質を１７〜２５℃でコー
ティングされた試験管の各々にピペットで計量投入し
た。次にトレーサー２００μｌを添加し、試験管を４時
間室温でインキュベートした。液体を吸引し、２回洗浄
した後、結合活性をγカウンターで測定した。 標準抗原 RIA-gnostR Ｌａｍ−Ｐ１キット（Behringwerke AG, Ma
rburg）より得たラミニンＰ１を標準物質として用い
た。この方法では、２つの検定は共通の参照標準物質量
を有しており、容易に相互に、そして、RIA-gnostR Ｌ
ａｍ−Ｐ１試験と比較することができる。
３３／２／２０ ２００μｌの試料または標準物質を１７〜２５℃でコー
ティングされた試験管の各々にピペットで計量投入し
た。次にトレーサー２００μｌを添加し、試験管を４時
間室温でインキュベートした。液体を吸引し、２回洗浄
した後、結合活性をγカウンターで測定した。 標準抗原 RIA-gnostR Ｌａｍ−Ｐ１キット（Behringwerke AG, Ma
rburg）より得たラミニンＰ１を標準物質として用い
た。この方法では、２つの検定は共通の参照標準物質量
を有しており、容易に相互に、そして、RIA-gnostR Ｌ
ａｍ−Ｐ１試験と比較することができる。
【００３６】〔実施例９〕 上記した試験方法で反応する正常血清および病原性血清
中の標準試料および抗原の分子量分布の測定 ラミニンＰ１、ヒトラミニン（バッチII）および種々の
血清をセファロースＳ−４００カラムを用いて分子量に
より分画した。次にラミニン抗原性のサイズ分布をイム
ノラジオメトリック試験法により検査した。正常血清を
合わせたものから得られた結果をRIA-gnostR Ｌａｍ−
Ｐ１試験と比較した。標準物質および正常血清を合わせ
たものについて得られたクロマトグラムを図３〜５に示
す。 カラム寸法：１.０×３０cm 溶離緩衝液：ＰＢＳ＋０.０４％ツイーン２０＋０.０２
％アジ化ナトリウム 流量： ０.２ml／min
中の標準試料および抗原の分子量分布の測定 ラミニンＰ１、ヒトラミニン（バッチII）および種々の
血清をセファロースＳ−４００カラムを用いて分子量に
より分画した。次にラミニン抗原性のサイズ分布をイム
ノラジオメトリック試験法により検査した。正常血清を
合わせたものから得られた結果をRIA-gnostR Ｌａｍ−
Ｐ１試験と比較した。標準物質および正常血清を合わせ
たものについて得られたクロマトグラムを図３〜５に示
す。 カラム寸法：１.０×３０cm 溶離緩衝液：ＰＢＳ＋０.０４％ツイーン２０＋０.０２
％アジ化ナトリウム 流量： ０.２ml／min
【００３７】分子量マーカーであるチログロブリン（６
７０kDa）、免疫グロブリン（１５６kDa）、卵アルブミ
ン（４４kDa）およびミオグロビン（１７kDa）を用いて
カラムをカリブレーションした。アルコール性肝臓疾
患、ＰＢＣおよびＣＡＨを有する患者の個体別血清を図
６〜８に示す。図９は、還元（＋ＳＨ）条件下および非
還元（−ＳＨ）条件下でＳＤＳゲル電気泳動（Novex re
ady-to-useゲル、４〜１２％ポリアクリルアミド含有）
により、約１μｇのラミニンバッチII（実施例３）を分
離した後に非連続緩衝液系を用いて標準プロトコルによ
り得られた半乾燥ブロットを示す。ニトロセルロースメ
ンブレンを短冊状に分割し、個々の短冊をモノクローナ
ル抗体Ａ９／２／１、Ａ２７／２／１およびＡ３３／２
／２０とともにインキュベートした。抗マウスアルカリ
ホスファターゼ（Sigma A 5153）を第２の抗体として用
いた。
７０kDa）、免疫グロブリン（１５６kDa）、卵アルブミ
ン（４４kDa）およびミオグロビン（１７kDa）を用いて
カラムをカリブレーションした。アルコール性肝臓疾
患、ＰＢＣおよびＣＡＨを有する患者の個体別血清を図
６〜８に示す。図９は、還元（＋ＳＨ）条件下および非
還元（−ＳＨ）条件下でＳＤＳゲル電気泳動（Novex re
ady-to-useゲル、４〜１２％ポリアクリルアミド含有）
により、約１μｇのラミニンバッチII（実施例３）を分
離した後に非連続緩衝液系を用いて標準プロトコルによ
り得られた半乾燥ブロットを示す。ニトロセルロースメ
ンブレンを短冊状に分割し、個々の短冊をモノクローナ
ル抗体Ａ９／２／１、Ａ２７／２／１およびＡ３３／２
／２０とともにインキュベートした。抗マウスアルカリ
ホスファターゼ（Sigma A 5153）を第２の抗体として用
いた。
【００３８】典型的な、各々の場合において特徴的な高
原分布パターンが本発明の検定法を用いて記録された。
これは明らかに、２つの免疫学的測定方法が異なる形態
のラミニンを特異的に認識していることを示している。
このほか、モノクローナル抗体は還元により形成される
変性された構造に対して反応性を示さないことが解る。
結果的に、本発明のモノクローナル抗体は本来の状態で
特異的に層状化されているラミニンＰ１ドメインの構造
的モチーフを認識している。
原分布パターンが本発明の検定法を用いて記録された。
これは明らかに、２つの免疫学的測定方法が異なる形態
のラミニンを特異的に認識していることを示している。
このほか、モノクローナル抗体は還元により形成される
変性された構造に対して反応性を示さないことが解る。
結果的に、本発明のモノクローナル抗体は本来の状態で
特異的に層状化されているラミニンＰ１ドメインの構造
的モチーフを認識している。
【００３９】〔実施例１０〕 種々のラミニン／ラミニンＰ１調製物の結合親和性の測
定 種々のラミニン調製物を調べることにより、何れのラミ
ニン構造が２通りの検定により認識されるか予備的に検
討した。以下に示す表は決定的な分類をおこなうもので
はないが、２通りの試験が異なる優先順位（親和性）で
特定の変異体と結合することを明らかに示している。示
したデータはラミニンのどちらのイソフォームが記載し
た試験方法により認識されるかという問題について明ら
かにすることはできない。幾つかの精製されたイソフォ
ームがその本来の形態で入手できた場合にのみこの問題
を解決することができるであろう。
定 種々のラミニン調製物を調べることにより、何れのラミ
ニン構造が２通りの検定により認識されるか予備的に検
討した。以下に示す表は決定的な分類をおこなうもので
はないが、２通りの試験が異なる優先順位（親和性）で
特定の変異体と結合することを明らかに示している。示
したデータはラミニンのどちらのイソフォームが記載し
た試験方法により認識されるかという問題について明ら
かにすることはできない。幾つかの精製されたイソフォ
ームがその本来の形態で入手できた場合にのみこの問題
を解決することができるであろう。
【００４０】 試料中の総蛋白濃度に基づいた％で測定した濃度 A27／A9 A27／A33 ラミニン（Chemicon；Wewer 1983）(*) 2.7 1.4 メロシン（Chemicon；Ehrig 1990）(**) 35.8 13.3 ヒトラミニン、精製品（実施例２参照） 21.4 2.8 ヒトラミニン、精製品（実施例３参照） 59.8 80.4 Lam-P1：RIA-gnostR標準品7；％結合は使用カウントに基づく 64.9％ 35.4％ *) Wewer, U.；Albrechtsen, R.；Manthorpe, M.；Varon, S.；Engvall, E. ；Rouslahti, E.（1983）J. Biol. Chem. 258；12654-12600 **) Ehrig, K.；Leivo, I.；Argraves, S.W.；Ruoslahti, E.；Engvall, E.（ 1990）；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87；3264-3268
【００４１】〔実施例１１〕 交叉反応 表８は、選択されたヒト結合組織および血清蛋白との有
意な交叉反応は２通りの新しいラミニン検定を用いて検
出できないことを示している。同様に、ラミニン／ニド
ゲンおよびマウスＥＨＳ腫瘍由来ラミニンＰ１との交叉
反応も観察されなかった。
意な交叉反応は２通りの新しいラミニン検定を用いて検
出できないことを示している。同様に、ラミニン／ニド
ゲンおよびマウスＥＨＳ腫瘍由来ラミニンＰ１との交叉
反応も観察されなかった。
【００４２】〔実施例１２〕 種々の疾患を有する患者コホートにおける平均血清含有
量の測定 実施例８に従って本発明のイムノラジオメトリック検定
法を用いて種々の血清コホートを分析した。含有量測定
の結果を表９〜表１７にまとめる。両方の被験変異体は
適応症であるアルコール性肝臓疾患、ＰＢＣ、ＣＡＨ、
後肝硬変、代償不全肝硬変、原因不明の肝硬変、およ
び、腫瘍血清における上昇したラミニン濃度を診断し
た。明らかに低下したラミニン含有量が適応症である糖
尿病で認められた。本発明の検定法と表に示したRIA-gn
ostRラミニンＰ１試験との間の相関によると、２つの免
疫学的方法は相互に異なっており、２つの検定方法はRI
A-gnostR試験による診断と異なっていた。これは、実施
例９に記載した作用、即ち、抗原分布パターンにおける
差を確認するものである。
量の測定 実施例８に従って本発明のイムノラジオメトリック検定
法を用いて種々の血清コホートを分析した。含有量測定
の結果を表９〜表１７にまとめる。両方の被験変異体は
適応症であるアルコール性肝臓疾患、ＰＢＣ、ＣＡＨ、
後肝硬変、代償不全肝硬変、原因不明の肝硬変、およ
び、腫瘍血清における上昇したラミニン濃度を診断し
た。明らかに低下したラミニン含有量が適応症である糖
尿病で認められた。本発明の検定法と表に示したRIA-gn
ostRラミニンＰ１試験との間の相関によると、２つの免
疫学的方法は相互に異なっており、２つの検定方法はRI
A-gnostR試験による診断と異なっていた。これは、実施
例９に記載した作用、即ち、抗原分布パターンにおける
差を確認するものである。
【００４３】略記方法 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン４酢酸 ＮＥＭ： Ｎ−エチルマレイミド ＰＢＳ： リン酸塩緩衝食塩水（緩衝溶液ＰＭ １６、S
erva） ＰＣＭＢ：４−ヒドロキシ水銀安息香酸ナトリウム塩 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド 薬剤と酵素 コラゲナーゼ、Worthington（CLSPA） ペプシン、Boehringer Mannheim（No. 108057） ベンゾナーゼ、Merck Darmstadt（No. 1654） 用いた薬剤は全て特定の“p.A.”であり、Riedel d.H.
およびMerckから入手した。
erva） ＰＣＭＢ：４−ヒドロキシ水銀安息香酸ナトリウム塩 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド 薬剤と酵素 コラゲナーゼ、Worthington（CLSPA） ペプシン、Boehringer Mannheim（No. 108057） ベンゾナーゼ、Merck Darmstadt（No. 1654） 用いた薬剤は全て特定の“p.A.”であり、Riedel d.H.
およびMerckから入手した。
【００４４】分離媒体 Ｑセファロース（Q SepharoseR）FF, Pharmacia スーパーローズ（SuperoseR）6 (16／50), Pharmacia ウルトラセット（UltrasetteR）(300kDa), Filtron BrCN−活性化セファロースR, Pharmacia ConA−セファロースR 4B, Pharmacia セファデックスR S-400, Pharmacia
【００４５】表１〜表３の説明 BIAcore試験 生物特異的相互作用をPharmacia BiosensorのBIAcoreR
システムを用いてオンラインで行った。測定の原理は、
金膜上に結合している質量により影響される光学的現象
（表面プラズモン共鳴）に基づくものである。簡単に説
明すると、このシステムは金センサー表面上の微細アフ
ィニティークロマトグラフィーを含むものである。特異
的に結合したリガンドの量を共鳴シグナルの形態で図形
的に求めることができる（Chaiken, I.；Rosea, S.；Ka
rlsson, R.（1992）Anal. Biochem. 201；197-210；Kar
lsson, R.；Altschuh, D.；van Regenmortel, M.H.V.
（1992）抗体親和性の測定、出典：抗原の構造、CRC Pr
ess（van Regenmortel出版）；Boca Raton, Fl.；127-1
48）。
システムを用いてオンラインで行った。測定の原理は、
金膜上に結合している質量により影響される光学的現象
（表面プラズモン共鳴）に基づくものである。簡単に説
明すると、このシステムは金センサー表面上の微細アフ
ィニティークロマトグラフィーを含むものである。特異
的に結合したリガンドの量を共鳴シグナルの形態で図形
的に求めることができる（Chaiken, I.；Rosea, S.；Ka
rlsson, R.（1992）Anal. Biochem. 201；197-210；Kar
lsson, R.；Altschuh, D.；van Regenmortel, M.H.V.
（1992）抗体親和性の測定、出典：抗原の構造、CRC Pr
ess（van Regenmortel出版）；Boca Raton, Fl.；127-1
48）。
【００４６】１．固定化ラミニンＰ１上の直接スクリー
ニング ラミニンＰ１をユーザーマニュアルの指示にしたがっ
て、１０mM 酢酸ナトリウム、pH４.０中２００μｇ／ml
の濃度でセンサーチップ上に固定化した。１００mM Ｈ
Ｃｌ ４μｌのダブルパルスを発生させてLam Ｐ１アフ
ィニティーマトリックスを再発生した。ラミニンＰ１の
層は極めて安定であり、品質の低下を伴うことなく約２
ヶ月（３００回を超える分析）使用できる。強力な抗体
をスクリーニングするために、個々の細胞コロニーから
培養上澄み４〜２５μｌを直接アフィニティーマトリッ
クスに通し、１〜５分後、結合（相対強度）をＲＵおよ
びシグナルの一定性から検出する。これにより、迅速か
つ有効な方法で対象クローンを選択できる。中断して再
生を行うことなく引き続き種々の培養上澄みを注入する
ことにより、抗原の種々のエピトープに同時に結合でき
る抗体をスクリーニングすることができる。
ニング ラミニンＰ１をユーザーマニュアルの指示にしたがっ
て、１０mM 酢酸ナトリウム、pH４.０中２００μｇ／ml
の濃度でセンサーチップ上に固定化した。１００mM Ｈ
Ｃｌ ４μｌのダブルパルスを発生させてLam Ｐ１アフ
ィニティーマトリックスを再発生した。ラミニンＰ１の
層は極めて安定であり、品質の低下を伴うことなく約２
ヶ月（３００回を超える分析）使用できる。強力な抗体
をスクリーニングするために、個々の細胞コロニーから
培養上澄み４〜２５μｌを直接アフィニティーマトリッ
クスに通し、１〜５分後、結合（相対強度）をＲＵおよ
びシグナルの一定性から検出する。これにより、迅速か
つ有効な方法で対象クローンを選択できる。中断して再
生を行うことなく引き続き種々の培養上澄みを注入する
ことにより、抗原の種々のエピトープに同時に結合でき
る抗体をスクリーニングすることができる。
【００４７】２．サブクラスの測定 上記した通りハイブリドーマ上澄みをBIAcoreRチップの
Lam Ｐ１層上に通過させた。抗体が結合（試料が通過）
した後、サブクラス特異的抗マウス抗体４μｌを順次注
入した。相互結合を再度シグナルの増加により表した。
これにより、５分以内にサブクラスを明確に分類でき
た。
Lam Ｐ１層上に通過させた。抗体が結合（試料が通過）
した後、サブクラス特異的抗マウス抗体４μｌを順次注
入した。相互結合を再度シグナルの増加により表した。
これにより、５分以内にサブクラスを明確に分類でき
た。
【００４８】３．濃度測定 選択的および可逆的なマウス抗体の結合を行うために、
特定の抗体（ウサギ抗マウスＦｃ−特異的；ＲＡＭ−Ｆ
ｃ）を標準的な方法でBIAcoreRセンサーチップ上に固定
化した。測定システムのシグナルが結合リガンドの質量
に直接関与しているため、標準物質と分析すべき試料が
同じ分子量を有している場合には特に、濃度測定が可能
となる。本実施例の場合のように、結合の特異性はセン
サーチップ上の所望のリガンドの質量を保持するのみで
あるため、複合混合物中の特定の蛋白の濃度を測定する
ことも可能である。培養上澄み中に存在する抗体の量
（＝クローンの合成能力）の測定のための標準曲線は、
実験室で入手できる良好に特性化されたモノクローナル
抗体（Ｍａｂ２３８）を用いて作成した。２連の測定の
平均である未知試料（培養上澄み）のシグナルを標準曲
線を用いて濃度（μｇ／ml モノクローナル抗体）に変
換できる。このような複雑で時間のかかる一連の測定を
行う場合は、BIAcoreRシステムでは無作為化プログラム
を用いることによりアフィニティーマトリックスの磨耗
や断裂または操作寿命の差による誤差の発生源を無視で
きるようにしている。
特定の抗体（ウサギ抗マウスＦｃ−特異的；ＲＡＭ−Ｆ
ｃ）を標準的な方法でBIAcoreRセンサーチップ上に固定
化した。測定システムのシグナルが結合リガンドの質量
に直接関与しているため、標準物質と分析すべき試料が
同じ分子量を有している場合には特に、濃度測定が可能
となる。本実施例の場合のように、結合の特異性はセン
サーチップ上の所望のリガンドの質量を保持するのみで
あるため、複合混合物中の特定の蛋白の濃度を測定する
ことも可能である。培養上澄み中に存在する抗体の量
（＝クローンの合成能力）の測定のための標準曲線は、
実験室で入手できる良好に特性化されたモノクローナル
抗体（Ｍａｂ２３８）を用いて作成した。２連の測定の
平均である未知試料（培養上澄み）のシグナルを標準曲
線を用いて濃度（μｇ／ml モノクローナル抗体）に変
換できる。このような複雑で時間のかかる一連の測定を
行う場合は、BIAcoreRシステムでは無作為化プログラム
を用いることによりアフィニティーマトリックスの磨耗
や断裂または操作寿命の差による誤差の発生源を無視で
きるようにしている。
【００４９】４．ヒトラミニンに対する結合親和性のス
クリーニング 調製物中のヒトラミニン（ラミニンバッチＩ）はごく僅
かに強化されているため、これを直接固定化することは
不可能であった（例えばLam Ｐ１の場合）。従って異種
の溶液からラミニンを単離することのできるアフィニテ
ィーマトリックスを作成することが必要であった。培養
上澄みに由来する特異的抗体を結合させてＲＡＭ−Ｆｃ
（上記）を固定化し、これによりヒトラミニンに対する
（非共有結合）アフィニティーマトリックスを作成し
た。次にラミニン試料をこれらの特異的な層の上を通過
させた。認識があった場合はシグナルが更に増大した。
クリーニング 調製物中のヒトラミニン（ラミニンバッチＩ）はごく僅
かに強化されているため、これを直接固定化することは
不可能であった（例えばLam Ｐ１の場合）。従って異種
の溶液からラミニンを単離することのできるアフィニテ
ィーマトリックスを作成することが必要であった。培養
上澄みに由来する特異的抗体を結合させてＲＡＭ−Ｆｃ
（上記）を固定化し、これによりヒトラミニンに対する
（非共有結合）アフィニティーマトリックスを作成し
た。次にラミニン試料をこれらの特異的な層の上を通過
させた。認識があった場合はシグナルが更に増大した。
【００５０】５．結合定数の測定 会合相、結合平衡の確立および解離相を時間的に離れた
過程として示すことができるため、BIAcoreRシステムを
用いて、リガンドの結合を定量的に測定することが可能
である（Chaiken, I.；Rosea, S.；Karlsson, R.（199
2）Anal. Biochem. 201；197-210；Karlsson, R.；Alts
chuh, D.；van Regenmortel, M.H.V.（1992）抗体親和
性の測定、出典：抗原の構造、CRC Press（van Regenmo
rtel出版）；Boca Raton, Fl.；127-148）。装置のソフ
トウエアは相当する表計算に比較的単純に測定データを
変換できる。結合定数を求めるために、特異的抗体（必
ずしも予め精製しなくてよい）を例えば何段階かに希釈
したアフィニティーマトリックスに通過させなければな
らない。会合相の間は、プログラムは、ユーザーの定義
した間隔で、ＲＵ値および曲線の実際の傾きを測定し、
これにより傾き／Ｒをプロットすることが可能になる。
会合定数Kassは分析した全濃度に対するこの関数の傾き
が存在する実際の濃度（ｎＭ）に関連する場合に測定で
きる。最も高い抗体濃度では、実験の解離相は極めて長
くなる。解離定数Ｋdissは時間に対してｌｎＲ１／Ｒｎ
をプロットすることにより求めることができる。平衡定
数ＫＤは式Ｋass／Ｋdissから得られる。
過程として示すことができるため、BIAcoreRシステムを
用いて、リガンドの結合を定量的に測定することが可能
である（Chaiken, I.；Rosea, S.；Karlsson, R.（199
2）Anal. Biochem. 201；197-210；Karlsson, R.；Alts
chuh, D.；van Regenmortel, M.H.V.（1992）抗体親和
性の測定、出典：抗原の構造、CRC Press（van Regenmo
rtel出版）；Boca Raton, Fl.；127-148）。装置のソフ
トウエアは相当する表計算に比較的単純に測定データを
変換できる。結合定数を求めるために、特異的抗体（必
ずしも予め精製しなくてよい）を例えば何段階かに希釈
したアフィニティーマトリックスに通過させなければな
らない。会合相の間は、プログラムは、ユーザーの定義
した間隔で、ＲＵ値および曲線の実際の傾きを測定し、
これにより傾き／Ｒをプロットすることが可能になる。
会合定数Kassは分析した全濃度に対するこの関数の傾き
が存在する実際の濃度（ｎＭ）に関連する場合に測定で
きる。最も高い抗体濃度では、実験の解離相は極めて長
くなる。解離定数Ｋdissは時間に対してｌｎＲ１／Ｒｎ
をプロットすることにより求めることができる。平衡定
数ＫＤは式Ｋass／Ｋdissから得られる。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【表３】
【００５４】上記した３つの表によれば、３つのモノク
ローナル抗体は極めて高い結合特性を示し、抗体の特徴
として、極めて堅固に固定化抗原に結合した。例えば、
ラミニン層を用いる場合は、抗体は何れも分析時間中
（３０分）解離しなかった。しかしなお、溶解した抗原
が例えばＡ２７／２／１ 層上を通過する場合は、同じ
く急速な速度論的特性で会合が起こる（Kass １.２×１
０5／Ｍｓ）。しかしながら、その後、明らかな解離相
がみとめられ、これにより、約１×１０9の平衡定数が
ラミニン結合について測定される。興味深いことにLam
Ｐ１への結合定数はLam Ｐ１が固定化されているかどう
か（高い局所的濃度）または溶液から生じているはずの
ものであるかどうかにより、１,０００のファクターで
異なる。この作用は、ヒト血清中の高分子量ピーク（未
損傷の血清ラミニン）の占有的な認識のための根拠とな
り得る（下記参照）。
ローナル抗体は極めて高い結合特性を示し、抗体の特徴
として、極めて堅固に固定化抗原に結合した。例えば、
ラミニン層を用いる場合は、抗体は何れも分析時間中
（３０分）解離しなかった。しかしなお、溶解した抗原
が例えばＡ２７／２／１ 層上を通過する場合は、同じ
く急速な速度論的特性で会合が起こる（Kass １.２×１
０5／Ｍｓ）。しかしながら、その後、明らかな解離相
がみとめられ、これにより、約１×１０9の平衡定数が
ラミニン結合について測定される。興味深いことにLam
Ｐ１への結合定数はLam Ｐ１が固定化されているかどう
か（高い局所的濃度）または溶液から生じているはずの
ものであるかどうかにより、１,０００のファクターで
異なる。この作用は、ヒト血清中の高分子量ピーク（未
損傷の血清ラミニン）の占有的な認識のための根拠とな
り得る（下記参照）。
【００５５】
【表４】
【００５６】
【表５】
【００５７】
【表６】
【００５８】
【表７】
【００５９】３コーティングチューブ方法の試験条件の
継続性 コーティング抗体 ＝Ａ２７／２／１ Ｂ２ 第２の抗体 ＝Ａ９／２／１ Ｂ２ ＝Ａ３３／２／２０ ＝ポリクローナル抗Ｌａｍ Ｐ１ ＩｇＧ
継続性 コーティング抗体 ＝Ａ２７／２／１ Ｂ２ 第２の抗体 ＝Ａ９／２／１ Ｂ２ ＝Ａ３３／２／２０ ＝ポリクローナル抗Ｌａｍ Ｐ１ ＩｇＧ
【００６０】３コーティングチューブ方法を用いた試験
測定 正常血清中の抗原分布の測定 正常濃度の測定 交叉反応性試験 種々の適応症に対する使用
測定 正常血清中の抗原分布の測定 正常濃度の測定 交叉反応性試験 種々の適応症に対する使用
【００６１】表６ モノクローナル抗ラミニンＰ１抗体の特性化 BIAcoreを用いて濃度とサブクラスを測定した。「ＥＬ
ＩＳＡ」の欄の値は４０５nmにおけるＯＤとして表し
た。「ブロット」の欄では−ＳＨは非還元を示し、＋Ｓ
Ｈは還元を意味し、＋＋＋は極めて強い反応を示し、＋
＋は強い反応を示し、＋は検知可能な反応を示し、そし
て、−は反応が無いことを示している。各々２バッチの
ラミニンＰ１（バッチ１およびバッチ２）およびラミニ
ン（バッチＩおよびII）を用いて、BIAcoreの結合試験
を行った。「ペア」の欄は１欄に記載した抗体と同時に
ラミニンＰ１に結合できるような抗体またはクローンを
示す。
ＩＳＡ」の欄の値は４０５nmにおけるＯＤとして表し
た。「ブロット」の欄では−ＳＨは非還元を示し、＋Ｓ
Ｈは還元を意味し、＋＋＋は極めて強い反応を示し、＋
＋は強い反応を示し、＋は検知可能な反応を示し、そし
て、−は反応が無いことを示している。各々２バッチの
ラミニンＰ１（バッチ１およびバッチ２）およびラミニ
ン（バッチＩおよびII）を用いて、BIAcoreの結合試験
を行った。「ペア」の欄は１欄に記載した抗体と同時に
ラミニンＰ１に結合できるような抗体またはクローンを
示す。
【００６２】
【表８】
【００６３】
【表９】
【００６４】
【表１０】
【００６５】
【表１１】
【００６６】
【表１２】
【００６７】
【表１３】
【００６８】
【表１４】
【００６９】
【表１５】
【００７０】
【表１６】
【００７１】
【表１７】
【００７２】
【表１８】
【００７３】
【表１９】
【００７４】
【表２０】
【００７５】
【表２１】
【００７６】
【表２２】
【００７７】
【表２３】
【００７８】この試験では１１〜１４年間の糖尿病の病
歴を有し（Stracke, H.；Wiek, K.；Guenzler, V.；Fed
erlin, K.（1983）Die Medizinische Welt 44；383-38
5）掌疾患（３６％）、網膜症（４８％）、神経病（６
６％）および腎臓病（３９％）が診断された入院患者８
２人（Ｉ型３２％、II型６８％）から採取した血清を検
査した。
歴を有し（Stracke, H.；Wiek, K.；Guenzler, V.；Fed
erlin, K.（1983）Die Medizinische Welt 44；383-38
5）掌疾患（３６％）、網膜症（４８％）、神経病（６
６％）および腎臓病（３９％）が診断された入院患者８
２人（Ｉ型３２％、II型６８％）から採取した血清を検
査した。
【図１】異なるジスルフィド結合ポリペプチドから構成
されるラミニンの構造を示す。
されるラミニンの構造を示す。
【図２】ラミニンの部分構造の詳細を示す。
【図３】ラミニンＰ１のクロマトグラムを示す。
【図４】ヒトラミニン（バッチII）のクロマトグラムを
示す。
示す。
【図５】正常血清を合わせたもののクロマトグラムを示
す。
す。
【図６】アルコール性肝臓疾患の患者の血清のクロマト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図７】ＰＢＣを有する患者の血清のクロマトグラムを
示す。
示す。
【図８】ＣＡＨを有する患者の血清のクロマトグラムを
示す。
示す。
【図９】還元（＋ＳＨ）条件下および非還元（−ＳＨ）
条件下でＳＤＳゲル電気泳動によりラミニンバッチを分
離した後に非連続緩衝液系を用いて得られるブロットを
示す。
条件下でＳＤＳゲル電気泳動によりラミニンバッチを分
離した後に非連続緩衝液系を用いて得られるブロットを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マンフレート・クヴイント ドイツ連邦共和国デー−65193ヴイースバ ーデン．ゾネンベルクシユトラーセ80ツエ ー (72)発明者 ルーペルト・テイムプル ドイツ連邦共和国デー−82131ガウテイン グ．ユーリウス−ヘルリン−シユトラーセ ３
Claims (21)
- 【請求項１】 ラミニン群およびペプシン消化によりヒ
ト胎盤から調製され得るラミニンＰ１フラグメント由来
のタンパク質に特異性を有するモノクローナル抗体であ
って、該抗体は好ましくは天然の仕方で折りたたまれた
ラミニンのラミニンＰ１ドメイン構造に結合し、未損傷
の天然のラミニンへの該抗体の親和性がラミニンＰ１フ
ラグメントへの該抗体の親和性とほぼ等しいものである
モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ミエローマ細胞系由来の細胞とラミニン
Ｐ１で予め免疫化された脊椎動物に由来するリンパ球と
の細胞融合により得られ、その後選択されたハイブリド
ーマにより生成された抗体であって、生成された抗体
は、胎盤由来の精製ヒトラミニンに対する高い結合親和
性の他に、ヒト血清から単離したラミニンの高分子量体
に対してもまた高い反応性を示す、請求項１記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項３】 表１および表２に示した結合特性を有す
る請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 請求項１〜３の何れか１項に記載の付加
的な抗体とともに一対として抗原に結合する能力を有す
る請求項１〜３の何れか１項に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項５】 ＩｇＧ ２ａサブクラスに分類される請
求項１〜４の何れか１項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 ＩｇＧ １サブクラスに分類される請求
項１〜４の何れか１項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２
１８１により産生される請求項５記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項８】 ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２
１８０により産生される請求項５記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項９】 ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２
１８２により産生される請求項６記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項１０】 請求項１〜４の何れか１項に記載の抗
体を産生し、そして、ミエローマ細胞系由来の細胞とラ
ミニンＰ１で予め免疫化された脊椎動物に由来するリン
パ球とを細胞融合させた後ハイブリッドにより産生され
た抗体も胎盤由来の精製ヒトラミニンに対する高い結合
親和性の他にヒト血清から単離したラミニンの高分子量
体に対する高い反応性も示すかどうかに基づいてハイブ
リッドを選択することにより作成できる、ハイブリドー
マ細胞系。 - 【請求項１１】 リンパ球を、ラミニンＰ１で免疫化し
たＢａｌｂ／ｃ系統マウスから単離し、そしてミエロー
マ細胞系がマウスミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８.
６５３である請求項１０記載のハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項１２】 ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ
２１８１。 - 【請求項１３】 ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ
２１８０。 - 【請求項１４】 ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ
２１８２。 - 【請求項１５】 ａ） ペプシン消化によりヒト胎盤か
ら調製できるラミニンＰ１フラグメントで脊椎動物を免
疫化し、 ｂ） リンパ球を免疫化された脊椎動物から単離し、ミ
エローマ細胞と融合させ、 ｃ） ハイブリッドを、請求項１〜４記載の特性を有す
る抗体の存在を考慮して選択し、そしてクローニング
し、そして、 ｄ） 抗体をこれらのクローンから単離する請求項１〜
６の何れか１項に記載のモノクローナル抗体の調製方
法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の段階ｄ）を実施す
るためにハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ ＡＣＣ２１８
１、ＤＳＭ ＡＣＣ２１８０またはＤＳＭ ＡＣＣ２１８
２を用いる請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 支持体物質に、接着により、または、
共有結合的に、結合しているコーティング抗体、およ
び、コーティング抗体に結合した抗原を認識する標識さ
れた第２の抗体を用い、そして、コーティング抗体が請
求項１〜９の何れか１項に記載のモノクローナル抗体で
ある、天然のラミニンの免疫学的測定のための方法。 - 【請求項１８】 支持体物質に、接着により、または、
共有結合的に、結合しているコーティング抗体、およ
び、コーティング抗体に結合した抗原を認識する標識さ
れた第２の抗体を用い、そして、標識された第２の抗体
が請求項１〜９の何れか１項に記載のモノクローナル抗
体である、天然のラミニンの免疫学的測定のための方
法。 - 【請求項１９】 コーティング抗体が請求項１〜９の何
れか１項に記載のモノクローナル抗体である請求項１８
に記載の方法。 - 【請求項２０】 コーティング抗体が請求項７に記載の
モノクローナル抗体である請求項１８または１９に記載
の方法。 - 【請求項２１】 体液中のラミニン含量の変化に関係す
る疾患を診断するための請求項１〜９の何れか１項に記
載の１つ以上の異なるモノクローナル抗体の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4428481:0 | 1994-08-11 | ||
| DE4428481 | 1994-08-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08231596A true JPH08231596A (ja) | 1996-09-10 |
| JP3342252B2 JP3342252B2 (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=6525471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22450195A Expired - Fee Related JP3342252B2 (ja) | 1994-08-11 | 1995-08-10 | 体液中の高分子未損傷ラミニン形態の選択的免疫学的測定のためのモノクローナル抗体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5811268A (ja) |
| EP (2) | EP0696597B1 (ja) |
| JP (1) | JP3342252B2 (ja) |
| AT (1) | ATE390443T1 (ja) |
| CA (1) | CA2155793C (ja) |
| DE (1) | DE59511090D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US9404932B2 (en) * | 2007-11-05 | 2016-08-02 | Nordic Bioscience A/S | Pathology biomarker assay |
| US11021733B2 (en) | 2011-09-26 | 2021-06-01 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
| AU2012314515B2 (en) | 2011-09-26 | 2018-03-15 | Preanalytix Gmbh | Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids |
| US10724074B2 (en) | 2012-09-25 | 2020-07-28 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
| JP6381628B2 (ja) | 2013-03-18 | 2018-08-29 | キアゲン ゲーエムベーハー | 生物試料の安定化 |
| US11203777B2 (en) | 2015-11-20 | 2021-12-21 | Qiagen Gmbh | Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids |
| CN110308283B (zh) * | 2019-06-28 | 2021-09-10 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种层粘连蛋白校准品及质控品 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3331627A1 (de) * | 1983-09-01 | 1985-03-21 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Verfahren zur immunologischen bestimmung fuer proteine in koerperfluessigkeiten, unter verwendung monovalenter antikoerperfragmente |
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