ES2207665T3

ES2207665T3 - Propeptido aminoterminal de procolageno de tipo 1, su anticuerpo y metodo de analisis utilizando el mismo.

Info

Publication number: ES2207665T3
Application number: ES96302639T
Authority: ES
Inventors: Juha Risteli; Leila Risteli; Jukka Melkko; Saila Kauppila
Original assignee: Orion Yhtyma Oy
Current assignee: Orion Oyj
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-16
Publication date: 2004-06-01
Anticipated expiration: 2016-04-16
Also published as: DK0738735T3; GB9507985D0; US6093803A; NO320120B1; EP0738735A2; DE69629976D1; JP3245052B2; AU707232B2; AU5069596A; CA2174559A1; CA2174559C; JPH08291197A; ATE250084T1; US6090920A; EP0738735A3; DE69629976T2; EP0738735B1; NO961543D0; NO961543L; US5895746A

Abstract

EL PROPEPTIDO AMINOTERMINAL PROCOLAGENO DEL TIPO I MEXISTE EN SUERO DE DOS FORMAS: PROCOLAGENO CLASICO TIPO I EL CUAL ES UN HETEROTRIMERO QUE CONTIENE DOS CADENAS PRO{AL}1 Y UNA CADENA PRO{AL}2 PROCOLAGENO DEL TIPO I, Y UN PROCOLAGENO {AL}1HOMOTRIMERO TIPO I QUE CONTIENE TRES CADENAS PRO{AL}1 IDENTICAS. ESTOS INTEGROS PROPEPTIDOS AMINOTERMINALES TRIMERICOS PUEDEN SER AISLADOS SIN EL USO DE ENZIMAS PROTEOLITICAS Y LOS PROPEPTIDOS RESULTANTES PUEDEN SER USADOS PARA PREPARAR ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA EL PROPEPTIDO TRIMERICO INTEGRO, NO TENIENDO AFINIDAD PARA LA FORMA MONOMERICA DEL PROPEPTIDO. DICHOS ANTICUERPOS SON UTILES EN METODOS DE ENSAYO DEL PROPEPTIDO INTEGRO AMINOTERMINAL TRIMERICO PROCOLAGENO DEL TIPO I EN SUERO, SIN LA FALSA INFORMACION RESULTANTE DE ENSAYOS INADVERTIDOS DE LA FORMA MONOMERICA DEL PROPEPTIDO.

Description

Propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I, su anticuerpo y método de análisis utilizando el mismo.

La presente invención se refiere a un método de análisis mejorado para la determinación inmunológica de propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I, bien clásico o bien \alpha1-homotrímero, intacto, en una muestra tal como suero, y a la preparación de un antisuero adecuado para utilizarse en dicho método.

El colágeno de tipo I es el tipo de colágeno más abundante en el cuerpo humano. La mayor parte del mismo se encuentra en los huesos, aunque otros tejidos conectivos blandos contienen también cantidades considerables del mismo. En tejidos mineralizados, tal como hueso, aproximadamente el 90% de la matriz orgánica es colágeno de tipo I, no existiendo otros tipos de colágeno en tales tejidos. De este modo, el análisis de colágeno de tipo I es importante en enfermedades que afectan a los huesos, tales como enfermedades metabólicas de los huesos, incluyendo osteoporosis primaria y secundaria, metástasis óseas en carcinomas de mama o prostáticos, artritis reumatoide y varias enfermedades genéticas tal como osteogenesis imperfecta. También se sabe que la velocidad de síntesis de colágeno en el hueso se ve afectada por varias hormonas, por ejemplo, hormona del crecimiento, tiroxina, cortisol y estrógenos.

El colágeno de tipo I se sintetiza como un procolágeno, que contiene extensiones propéptidas en ambos extremos de la molécula. La velocidad de síntesis de colágeno de tipo I puede ser así evaluada determinando la cantidad de propéptido liberado durante la conversión de procolágeno a colágeno. Ya se conoce la forma de analizar el propéptido carboxiterminal de procolágeno de tipo I (abreviado como PICP) en suero (Melkko J, Niemi S, Risteli L, Risteli J: Clin. Chem. 1990; 36; 1328-1332). Sin embargo, existen ciertos individuos en los cuales se encuentra deteriorada la velocidad de eliminación de este propéptido de la circulación, conduciendo ello a niveles en suero muy elevados de PICP, los cuales no están relacionados con la velocidad de síntesis de procolágeno de tipo I. Por otro lado, los análisis anteriores desarrollados para el propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I han estado basados en péptidos lineales monoméricos sintéticos (Ebeling PR, Peterson JM, Riggs BL; J. Bone Miner. Res. 1992; 7: 1243-1250 y Linkhart SG, Linkhart TA, Taylor AD, Wergedahl JE, Bettica P, Baylink DJ: Clin. Chem. 1993; 39; 2254-2258 y WO 93/15107) o en propéptidos aislados del fluido amniótico (Teisner B, Boje Rasmussen H, Hoejrup P, Yde-Anderson E, Skjoedt K: APMIS 1992; 100; 1106-1114 y Price KM, Silman R, Armstrong P, Grudzinskas JG: Clin. Chim. Acta 1994; 224; 95-102) o de medio de cultivo de células (Jukkola A, Risteli L, Melkko J Risteli J: J. Bone Miner. Res. 1993; 8; 651-657). Se ha comprobado que dichos análisis detectan dos formas antígenas en suero humano, que difieren con respecto a su peso molecular. Una de las formas corresponde al propéptido trímero auténtico en cuanto a tamaño y la otra consiste en su producto de degradación adicional, que se asemeja al dominio globular, denominado Col1, del propéptido.

La evidencia disponible al respecto sugiere que estos productos de degradación de pequeño peso molecular no se derivan de la degradación adicional del propéptido liberado, sino muy probablemente de la degradación de moléculas de procolágeno de tipo I que han retenido el propéptido aminoterminal en los tejidos (el denominado colágeno de tipo I pN). Dichas moléculas se encuentran en la superficie de fibras de colágeno de tipo I, principalmente en tejidos conectivos blandos y temporalmente en osteoide no mineralizado recientemente sintetizado. Además, se ha demostrado que el propéptido aminoterminal auténtico se elimina de la circulación por vía del barredor-receptor de las células endoteliales del hígado, mientras que los productos de degradación relacionados con Col1, más pequeños, se eliminan por vía de los riñones. De este modo, la enfermedad del riñón, al mismo tiempo que disminuye la eliminación del péptido relacionado con Col1, afectará en gran medida a la concentración en suero de dichos péptidos y proporcionará resultados falsos con respecto a la síntesis de colágeno. Puesto que los propéptidos aminoterminales, intactos, de procolágeno de tipo I no son excretados en la orina, el análisis de la presente invención es aplicable a suero y otros fluidos biológicos excepto orina. Además, el estado catabólico suele encontrarse en pacientes seriamente enfermos que aumentan la degradación en tejidos de colágeno de tipo I pN, aumentando similarmente la concentración de Col1 en suero y proporcionando información falsa sobre la capacidad anabólica del paciente. Por tanto, sería deseable solucionar el problema de interpretación de los resultados, causado por los diferentes orígenes y vías de eliminación de las dos formas de propéptido, y proporcionar un método cuantitativo que sea rápido y simple de poner en práctica, para analizar únicamente el propéptido aminoterminal intacto de procolágeno de tipo I en suero humano, con la exclusión de los productos de degradación relacionados con Col1.

El propéptido intacto se encuentra en forma de un trímero, mientras que el producto de degradación comprende el dominio Col1 globular monómero de la cadena \alpha1 de procolágeno de tipo I. Cuando se aísla el propéptido aminoterminal, trímero, intacto de procolágeno de tipo I a partir de fluido pleural de un paciente con carcinoma, se descubrieron sorprendentemente dos propéptidos separados, los cuales diferían con respecto a sus cadenas constituyentes. Se encontraron dos cadenas polipéptidas diferentes en la forma de propéptido que eluía en primer lugar de la columna de cromatografía DEAE, puesto que el procolágeno de tipo I clásico es un heterotrímero que contiene dos cadenas pro \alpha1 y una cadena pro \alpha2 de procolágeno de tipo I. El propéptido más ácido carecía de la segunda cadena polipéptida que se mueve más rápida en electrofóresis y que como se sabe se deriva de la cadena pro \alpha2 de procolágeno de tipo I. Este propéptido atípico se derivó del procolágeno de tipo I \alpha1-homotrímero que contiene tres cadenas pro \alpha1 idénticas. Dicho colágeno ha sido descrito anteriormente en una forma totalmente procesada a partir de tejidos de pacientes con ciertos estados de enfermedad, por ejemplo, carcinomas de mama, pulmón y estómago, pero los correspondientes propéptidos no han sido identificados. Puesto que la porción aminoterminal de la cadena pro \alpha2 está truncada con respecto a la cadena pro \alpha1 y carece de la totalidad del dominio Col1, el propéptido \alpha1-homotrímero tiene tres dominios Col1 y el propéptido clásico solo tiene dos. Puesto que los dominios Col1 están fosforilados, estos dos propéptidos intactos pueden ser separados entre sí en base a la diferencia en su carga, por ejemplo, empleando cromatografía DEAE a pH 5. Puesto que el propéptido \alpha1-homotrímero tiene tres dominios Col1 y el propéptido clásico solo tiene dos, este último eluye más pronto en la cromatografía de intercambio aniónico. Ambos propéptidos son susceptibles a ser desnaturalizados a pH bajo (menor de 5); algo que no es fácilmente detectado pero que puede causar problemas a la hora de producir anticuerpos en el caso de que no se tomen las precauciones adecuadas.

Los antisueros usados previamente para analizar el propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I tienen afinidad no solo por el propéptido trímero intacto, sino también, en un grado considerable, por la forma monómera. Esto es debido a la naturaleza del antígeno usado para promover los antisueros. Cuando para promover los anticuerpos se emplea un péptido sintético lineal, o un propéptido derivado de fluido amniótico y aislado en una forma monómera, dichos anticuerpos reaccionan preferentemente con los productos de degradación monómeros de Col1. Por otro lado, cuando el propéptido se aísla a partir de un fluido de cultivo de células, primeramente se purifica en forma de un procolágeno, el cual es posteriormente digerido por colagenasa bacteriana para liberar el propéptido del propio colágeno. Dado que el propéptido auténtico contiene todavía un dominio colagenoso, parte de la colagenasa bacteriana se une al mismo, pero no es capaz de digerir el propéptido durante los breves procedimientos de incubación y aislamiento in vivo . En consecuencia, cuando se emplea dicho propéptido como un inmunógeno, la enzima es capaz de funcionar, conduciendo a la degradación in vivo del propéptido y a la producción de anticuerpos hacia sus productos de degradación. Además, también es necesario evitar aquellas condiciones y métodos (por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución a pH menor de 5) que desnaturalizarían incluso una pequeña porción del propéptido durante el procedimiento de aislamiento del propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I. Esto es debido, en contraste con el correspondiente propéptido de procolágeno de tipo III (EP-A-0-304292), a que el aminoterminal de procolágeno de tipo I no tiene enlaces disulfuro entre las cadenas, los cuales estabilizarían la estructura y facilitarían una renaturalización rápida después de una desnaturalización accidental de pequeña importancia durante el procedimiento de purificación. De este modo, la separación de enzimas contaminantes del procolágeno de tipo III puede efectuarse mediante separación en fase inversa a pH bajo. Sin embargo, esto conduciría a la desnaturalización de PINP trímero de procolágeno de tipo I debido a su carencia de enlaces disulfuro estabilizantes.

En consecuencia, los materiales de partida para los métodos de la invención están preferentemente libres de dichas enzimas proteolíticas contaminantes.

La presente invención proporciona propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I, clásico, trímero, intacto, aislado y propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I, \alpha1-homotrímero, trímero, intacto, aislado, cuyos propéptidos pueden ser obtenidos sin el uso de una enzima proteolítica. Por tanto, los propéptidos aislados están libres de enzimas tal como colagenasa bacteriana, que son capaces de degradar el propéptido a su forma monómera. Los propéptidos de la invención pueden ser marcados, usando cualquier marcador adecuado. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen radiomarcadores, biotina (la cual puede ser detectada por avidita o estreptavidina conjugada a peroxidasa), lantánidos, fosfatasa alcalina y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína y rodamina).

La presente invención proporciona también un procedimiento de purificación para los propéptidos aminoterminales de procolágeno de tipo I, \alpha1-homotrímeros, clásicos,intactos. También proporciona un anticuerpo promovido contra cualquiera de las dos formas del propéptido intacto, preferentemente contra la forma \alpha1-homotrímera, cuyo anticuerpo tiene poca o ninguna afinidad, preferentemente ninguna afinidad, por la forma monómera del propéptido. Se ha descubierto que el propéptido \alpha1-homotrímero proporciona en particular una conformación tridimensional adecuada, que es capaz de promover anticuerpos que reconocen únicamente la configuración espacial correcta encontrada en los propéptidos intactos, y no en las cadenas monoméricas.

La presente invención proporciona también un procedimiento de purificación de los propéptidos aminoterminales de procolágeno de tipo I, \alpha1-homotrímeros, clásicos, intactos. Como material de partida se puede emplear una fuente biológica, por ejemplo, pleura humana, fluido ascítico o amniótico que contiene dichos propéptidos en cantidades suficientes. El propéptido \alpha1-homotrímero se ha encontrado muy frecuentemente en fluido pleural maligno, raramente en fluido ascítico y no mucho en fluido amniótico. Además, durante el procedimiento de aislamiento, no deberán estar presentes enzimas proteolíticas activas que puedan degradar parcialmente a los propéptidos. Por ejemplo, se ha comprobado que el fluido amniótico humano, en términos amplios en particular, y muchos fluidos ascíticos malignos proporcionan preparados de propéptido en bruto que asumen la forma monómera durante el aislamiento. Esto se puede demostrar mediante análisis repetido de filtración en gel, en donde un propéptido previamente trímero se divide, en un análisis posterior, en dos picos correspondientes al propéptido auténtico y a su dominio Col1 monomérico. El procedimiento de aislamiento preferido es en esencia como sigue. Se separa albúmina, la proteína contaminante presente en la mayor cantidad. Esto puede efectuarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo mediante precipitación del propéptido con sulfato amónico (saturación menor del 50%, preferentemente 40%). Por este medio se separa la albúmina debido a que esta no precipita. El material conteniendo propéptido es purificado adicionalmente mediante una primera etapa cromatográfica DEAE, preferentemente a pH neutro, tal como pH 6,5 a 7,5, por ejemplo, pH 7,4; una etapa de filtración en gel; una segunda etapa cromatográfica DEAE, preferentemente a pH bajo, tal como pH 8,4 a 5,2, por ejemplo, pH 5,0; y separación en fase inversa, preferentemente a pH neutro, tal como pH 6,5 a 7,5, en particular pH 7,4.

Puesto que los propéptidos son ácidos debido a la fosforilación de ciertos residuos de serina, los mismos se unirán fuertemente a una columna DEAE en un amplio intervalo de pH (de 5 a 8,5) y eluirán en un pico pronunciado con NaCl. Durante la primera etapa de cromatografía DEAE, es preferible un pH neutro con el fin de mantener en solución las grandes cantidades de otras proteínas contaminantes. Esto permite una separación eficaz de los propéptidos de interés. La posterior filtración en gel separa las proteínas más grandes y más pequeñas que los propéptidos. La columna puede ser desarrollada con varios tampones, por ejemplo, con bicarbonato amónico 0,2 M, pH 7,9, el cual tiene la ventaja de que puede ser separado posteriormente por liofilización. La segunda etapa de cromatografía DEAE a pH bajo (por ejemplo, alrededor de 5,0) separa los restos de proteínas que previamente no se separaron del todo debido a la gran cantidad de material presente. La purificación final se obtiene por medio de separación en fase inversa, la cual deberá efectuarse a pH neutro, tal como pH 6,5 a 7,5, por ejemplo 7,4, para conservar la conformación trímera natural del propéptido. Una separación en fase inversa ampliamente utilizada, en 0,1% TFA como fase móvil, conduce a un bajo rendimiento de propéptidos debido a una desnaturalización parcial y a problemas a la hora de obtener anticuerpos trímeros específicos. El ejemplo 1 describe con detalle la forma en la cual los propéptidos pueden ser aislados de fluido pleural maligno.

La invención proporciona también un anticuerpo que es específico para propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I, clásico, heterotrímero, intacto, o bien para propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I, \alpha1-homotrímero, trímero, intacto; cuyo anticuerpo no se une específicamente a la forma monómera de dicho propéptido. De este modo, los anticuerpos de la invención tienen poca o ninguna afinidad, preferentemente ninguna afinidad, por la forma monómera del propéptido, pero se unen a una o ambas formas trímeras. El anticuerpo tiene utilidad en la detección y determinación cuantitativa de PINP humano y, por tanto, es útil en la diagnosis de enfermedades y estados asociados con niveles anormales de PINP, tales como las enfermedades y estados que se han indicado anteriormente.

El anticuerpo es preferentemente monoclonal, pero puede ser también policlonal. El anticuerpo puede ser marcado. Ejemplos de marcadores de anticuerpos adecuados incluyen radiomarcadores, biotina (que puede ser detectada por avidita o estreptavidina conjugada a peroxidasa), lantánidos, fosfatasa alcalina y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína y rodamina). El término "anticuerpo" se emplea aquí para incluir tanto moléculas de anticuerpo completas como fragmentos de las mismas. Los fragmentos preferidos contienen al menos un sitio de unión a antígeno, tal como los fragmentos Fab y F(ab')_{2}. Dentro del término "anticuerpo" quedan incluidos también los anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos.

El anticuerpo se produce promoviendo anticuerpos en un animal hospedante contra un propéptido aminoterminal de acuerdo con la invención o contra un epitopo antígeno del mismo (de aquí en adelante "el inmunógeno"). Como es lógico, el epitopo será representativo de la forma trímera intacta del propéptido, es decir, un anticuerpo al epitopo no reconocerá la forma monómera del propéptido. Habitualmente, dicho epitopo comprende dos o más secuencias cortas de aminoácidos de diferentes cadenas que están próximas entre sí debido a la configuración del propéptido trímero, es decir, un epitopo discontinuo en lugar de un epitopo continuo. Esta configuración no existirá en la forma monómera del péptido, de manera que los anticuerpos a dichos epitopos no reconocerán al monómero. Normalmente, los anticuerpos de la invención están dirigidos contra la mayor parte del dominio globular, aminoterminal, no colagenoso de PINP. La forma clásica de PINP es un heterotrímero que contiene cadenas derivadas de ambas cadenas pro-\alpha1 y pro-\alpha2 de procolágeno de tipo I. La cadena pro-\alpha2 está truncada en el terminal amino y no contiene el dominio globular que induce a la formación de anticuerpos. Para distinguir las formas trímera y monómera del propéptido, los anticuerpos deben reaccionar con la conformación tridimensional y no con una cadena individual. De este modo, el PINP \alpha1-homotrímero, que contiene tres cadenas similares, teniendo todas ellas dicho dominio globular, resulta particularmente adecuado para promover anticuerpos de la invención que reconocen una característica de la conformación de los propéptidos que contienen tres o dos cadenas diferentes en la conformación correcta y que están implicados en el determinante antigénico. Dichos anticuerpos pueden no formarse cuando se emplean, como inmunógenos, péptidos sintéticos lineales o cadenas monómeras.

Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales son bien conocidos en la técnica y cualquiera de tales métodos se puede emplear para preparar los anticuerpos según la invención. Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar un animal hospedante adecuado, por ejemplo un animal experimental, con el inmunógeno y utilizar suero adecuadamente diluido o aislar inmunoglobulinas del suero. De este modo, el animal puede ser inoculado con el inmunógeno, extrayéndose posteriormente sangre del animal y purificándose la fracción de IgG. Los métodos para producir un anticuerpo monoclonal comprenden habitualmente inmortalizar células que producen el anticuerpo deseado. Las células de hibridomas pueden ser producidas mediante fusión de células del bazo de un animal experimental inoculado con células tumorales (Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497, (1975)). El anticuerpo puede ser también producido mediante la tecnología del ADN recombinante, por ejemplo, en la forma descrita por Skerra et al (1988) (Science 240, 1038-1041).

Mediante un procedimiento convencional se puede seleccionar una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado. Los hibridomas se pueden hacer crecer en cultivo o pueden ser inyectados intraperitonealmente para la formación de fluido ascítico o en la corriente sanguínea de un hospedante alogénico u hospedante inmunocomprometido. Se pueden preparar anticuerpos humanos mediante inmunización in vivo de linfocitos humanos, seguido por transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.

Para la producción de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, el animal experimental es adecuadamente una cabra, un conejo, un pollo, una oveja, un coballo, una rata o un ratón. Si se desea, el inmunógeno puede ser administrado como un conjugado en donde el inmunógeno está acoplado, por ejemplo por vía de una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos, a un soporte adecuado. La molécula de soporte es generalmente un soporte fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede ser aislado y, si se desea, purificado, por ejemplo a una pureza de hasta 70%, de hasta 80%, de hasta 90%, de hasta 95%, de hasta 99% o de hasta 100%.

La presente invención también proporciona un método de análisis del propéptido aminoterminal intacto de procolágeno de tipo I, cuyo método comprende poner en contacto una muestra a analizar con un anticuerpo de la invención en presencia de un marcador, de manera que el marcador se une al complejo de propéptido/anticuerpo formado, y analizar la cantidad de marcador unido y/o sin unir.

En principio, se puede emplear cualquier técnica de análisis que permita la detección, y preferentemente la cuantificación, bien del propéptido heterotrímero clásico o bien del \alpha1-homotrímero, y que confíe en la unión específica a uno de estos péptidos mediante un anticuerpo de la invención. Un tipo preferido de método está basado en el uso de anticuerpos marcados, preferentemente anticuerpos radiomarcados. En dichos métodos, se analiza la cantidad de complejo de propéptido (marcado) (antígeno)/anticuerpo, para obtener así una medida de la cantidad de propéptido (antígeno) en la muestra.

Otro tipo preferido de método confía en el uso de antígeno marcado (propéptido trímero intacto bien en el tipo clásico o bien en el tipo \alpha1-homotrímero) junto con un anticuerpo de la invención. En tales métodos, se añade una cantidad conocida de antígeno marcado, preferentemente radiomarcado, a una muestra que contiene una cantidad desconocida de propéptido sin marcar (antígeno). Tanto el antígeno marcado como el antígeno sin marcar se unen al anticuerpo, por ejemplo de un modo competitivo, y se puede utilizar un análisis de la cantidad de propéptido marcado unido en comparación con la cantidad conocida añadida, para determinar cuanta cantidad de antígeno sin marcar está presente en la muestra. Más adelante y con mayor detalle, se describen métodos de dichos tipos preferidos.

En el caso de que haya de analizarse el propéptido \alpha1-homotrímero, la muestra ha de ser tratada, por ejemplo mediante cromatografía DEAE, antes del análisis, con el fin de separar los propéptidos clásico y \alpha1-homotrímero y el propéptido \alpha1-homotrímero marcado y usado como trazador, puesto que el análisis por sí mismo no distingue entre estas dos formas de propéptidos.

La invención proporciona un método para detectar y/o determinar cuantitativamente, en una muestra, PINP humano, trímero, intacto, cuyo método comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo de la invención, por ejemplo anticuerpo marcado tal como un anticuerpo radiomarcado; y

(b) detectar y/o determinar cuantitativamente la unión del anticuerpo a cualquiera de las formas trímeras intactas de PINP.

Más particularmente, la invención proporciona un método para analizar propéptido aminoterminal, trímero, intacto de procolágeno de tipo I, cuyo método comprende poner en contacto en cualquier orden: (i) una muestra de un fluido corporal humano, de cuya muestra se conoce o se sospecha que contiene dicho propéptido; y (ii) un anticuerpo que se une específicamente a propéptido trímero intacto de procolágeno de tipo I pero no a dicho propéptido cuando este se encuentra en forma monómera; y (iii) una cantidad conocida de propéptido trímero marcado de la invención, que actúa como un antígeno, de manera que el marcador se une al anticuerpo en una cantidad que depende de la cantidad de propéptido sin marcar presente en la muestra; y analizar la cantidad del marcador unido y/o sin unir como una medida del nivel sin marcar de propéptido aminoterminal, trímero, intacto de procolágeno de tipo I en la muestra.

El fluido corporal humano puede ser, por ejemplo, sangre, plasma, suero, fluido de heridas en curación, fluido ascítico, fluido cerebral, fluido pleural, fluido sinobial, fluido succionado de ampollas en la piel o fluido amniótico.

Un método para detectar o determinar cuantitativamente PINP humano, trímero, intacto, consiste en el método de transferencia Western. Dicho método puede comprender las etapas de:

(i) someter una muestra que contiene o de la que se sospecha que contiene un PINP humano, trímero, intacto, diana, a electrofóresis en gel, para separar los péptidos presentes en la muestra;

(ii) transferir los péptidos separados sobre un soporte sólido (por ejemplo, un soporte de nitrocelulosa) mediante el método de transferencia antes indicado; y

(iii) permitir que un anticuerpo marcado según la invención se una al PINP humano, trímero, intacto, diana.

Los métodos de determinación cuantitativa incluyen métodos ELISA (inmunoanálisis unido a una enzima) o un método de radioinmunoanálisis. Generalmente, el método ELISA comprende las etapas de:

(i) inmovilizar, sobre un soporte sólido, un anticuerpo sin marcar de acuerdo con la invención;

(ii) añadir una muestra que contiene o de la que se sospecha que contiene el PINP humano, trímero, intacto, diana, de manera que el PINP sea capturado por el anticuerpo sin marcar;

(iii) añadir un anticuerpo marcado según la invención; y

(iv) determinar cuantitativamente la cantidad de anticuerpo marcado y unido.

Generalmente, el método de radioinmunoanálisis comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra que contiene o de la que se sospecha que contiene el propéptido a detectar con un primer anticuerpo según la invención y con un propéptido marcado, preferentemente radiomarcado, de la invención;

(ii) poner en contacto el material resultante con un segundo anticuerpo inmovilizado que se une al primer anticuerpo;

(iii) separar el material inmovilizado respecto del material no inmovilizado; y

(iv) comparar la radioactividad del material inmovilizado o no inmovilizado con la actividad obtenida usando muestras de concentración conocida de propéptido, para determinar la concentración de propéptido en la muestra que está siendo analizada.

La presente invención proporciona también un kit adecuado para llevar a cabo un método de análisis de la invención. El kit puede comprender un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo marcado, como se ha descrito anteriormente, específico a propéptido aminoterminal, trímero, intacto de procolágeno de tipo I que tiene poca o ninguna afinidad, preferentemente ninguna afinidad, por la forma monómera del propéptido. Alternativamente, el kit puede comprender un anticuerpo de la invención y un propéptido marcado, preferentemente radiomarcado, de la invención que actúa como un antígeno y que permite determinar la cantidad de antígeno sin marcar presente en la muestra.

Los siguientes ejemplos ilustran y explican adicionalmente la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de los propéptidos aminoterminales, clásico y \alpha1-homotrímero,intactos de procolágeno de tipo I en conformación natural sin utilizar enzimas proteolíticas

Se precipitan de 5 a 10 litros de fluido pleural humano, extraído de pacientes con cáncer de pulmón por razones paliativas, con (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido (saturación 40%) en presencia de inhibidores de proteasas ( 3 mg/l de fluido de fenilmetilsulfonilo, N-etilmaleimida y p-hidroximercuribenzoato y 10 mM EDTA). Las proteínas precipitadas son recogidas por centrifugado a 15.000 x g durante 30 minutos y disueltas en 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, conteniendo los inhibidores de proteasas anteriores, y son dializadas contra este tampón. La muestra es entonces cromatografiada en una columna DEAE-Sephacel (5 x 50 cm) equilibrada en este tampón. La elución se efectúa con un gradiente lineal de NaCl (0 a 0,5 M NaCl, 4.000 + 4.000 ml). Los propéptidos aminoterminales, clásico y \alpha1-homotrímero, intactos de colágeno de tipo I humano se eluyen en último lugar en el gradiente, después de hacerlo el grueso de otras proteínas. Cuando se utiliza un inmunoanálisis que detecta ambos propéptidos monómero y trímero, en primer lugar se eluye la cantidad menor de péptidos monómeros relacionados con Col1, luego el propéptido clásico intacto y por último el propéptido aminoterminal \alpha1-homotrímero de procolágeno de tipo I humano. Las fracciones que contienen los dos propéptidos son reunidas por separado y purificadas independientemente, aplicando el procedimiento descrito a continuación. Las fracciones reunidas son dializadas contra 0,2 M NH_{4}HCO_{3}, pH 7,9 y liofilizadas. Las muestras se disuelven en 0,2 M NH_{4}HCO_{3}, y se someten a cromatografía en una columna Sephacryl S-300 (1,5 x 110 cm) equilibrada en esta solución. Las fracciones que contienen la antigenicidad del propéptido (entre las posiciones de elución de IgG humana y de albúmina) son reunidas y liofilizadas. Las muestras se disuelven entonces en tampón de acetato amónico 50 mM, pH 5, se dializan brevemente contra el mismo y se someten a cromatografía en una columna de intercambio aniónico (Protein-Pak DEAE-5P) usando un instrumento de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los propéptidos son eluídos usando un gradiente lineal de NaCl (0 a 0,3 M, 0 a 60 min, velocidad de flujo 1 ml/min). La purificación final del propéptido se efectúa empleando HPLC mediante inyección directa de las fracciones que contienen el propéptido en una columna de fase inversa de pH estable (Vydac, Hesperia, CA) en acetato amónico al 0,4%, pH 7,4, y eluyendo el propéptido unido con concentraciones cada vez mayores de acetonitrilo (0 a 70%, 0 a 45 min). El propéptido es eluído como un pico pronunciado en la primera mitad del gradiente, es localizado por inmunoanálisis, reunido y liofilizado. La pureza de los propéptidos aminoterminales, clásico y \alpha1-homotrímero, de procolágeno de tipo I humano, aislados de fluido pleural humano, se muestra en la figura 1 en donde se utiliza electrofóresis en SDS-gel de poliacrilamida (gel de separación: 15%). Dado que el procolágeno de tipo I no contiene enlaces disulfuro entre las cadenas, las cadenas constituyentes son disociadas por este procedimiento.

En contraste con el propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo III (PIIINP), ni la forma clásica ni la forma \alpha1-homotrímera del propéptido PINP contiene enlaces disulfuro entre las cadenas, que en el caso del PIIINP enlazan covalentemente las tres cadenas constituyentes entre sí. De este modo, las cadenas individuales del PINP queda a parte de la electrofóresis en plancha de dodecilsulfato sódico (SDS)-gel (figura 1). En la figura 1, la banda A se debe a la cadena \alpha1 del propéptido derivado de la cadena pro \alpha1 de procolágeno de tipo I y la banda B se debe a la cadena \alpha2 del propéptido derivado de la cadena pro \alpha2 de procolágeno de tipo I. La estructura trímera no puede ser verificada. Sin embargo, los propéptidos clásico y \alpha1-homotrímero, aislados, son trímeros puesto que solo se encuentra un pico inmunoreactivo correspondiente al tamaño del propéptido auténtico en la cromatografía por exclusión de tamaños y no se observa reacción alguna en la posición de elución de los productos de degradación del propéptido. Cuando los propéptidos, después de guardarlos en estado congelado, fueron analizados de forma repetida mediante filtración en gel no se observó degradación alguna a formas más pequeñas.

Ejemplo 2 Producción de antisuero

Se promovieron anticuerpos policlonales contra PINP en conejos blancos de Nueva Zelanda mediante inyecciones intradérmicas de 150 \mug/conejo de PINP \alpha1-homotrímero altamente purificado (libre de enzimas proteolíticas), disuelto en 1 ml de NaCl al 0,9% y mezclado con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. En intervalos de tres semanas se administraron varias inyecciones de refuerzo (75 \mug/conejo de PINP \alpha1-homotrímero en 1 ml de NaCl al 0,9% y mezclado con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund). Para cada conejo se preparó el depósito de antisuero a partir de varias sangrías.

Ejemplo 3 Comportamiento del tipo de radioinmunoanálisis en equilibrio

Se marcan 10 microgramos del propéptido aminoterminal clásico (o \alpha1-homotrímero) de procolágeno de tipo I con 1 milicurie de ^{125}yodo por Chloramine-T (10 microgramos) y el propéptido marcado se separa del yodo libre mediante filtración en gel en una columna Sephacryl S-300 (1 x 20 cm) equilibrada con tampón de PBS conteniendo albúmina de suero bovino (1 g/litro). El propéptido marcado se eluye de la columna como un pico pronunciado bastante antes que el yodo libre. Se preparan curvas de unión con antisuero con 50.000 cuentas por minuto del propéptido marcado. La concentración de propéptido en una muestra desconocida de suero, o en otro fluido biológico a excepción de orina, se determina en el siguiente análisis de radioinmunoinhibición. Se incuba un antisuero diluido previamente ensayado (200 \mul) con la muestra desconocida (50 \mul) y con 50.000 cuentas por minuto del trazador (en 200 \mul de tampón de PBS conteniendo 1 g/l de albúmina de suero bovino) durante 2 horas a 37º C. Entonces se añade un segundo anticuerpo en fase sólida contra gamma-globulina de conejo y, después de una incubación de 20 minutos a 20º C, el antígeno unido en el inmunocomplejo se separa de la solución por centrifugado (2.000 x g durante 20 minutos). La actividad de inhibición de la muestra desconocida se compara con la actividad de concentraciones de referencia del propéptido aminoterminal sin marcar de procolágeno de tipo I.

Ejemplo 4 Separación entre sí de los propéptidos aminoterminales, clásico y \alpha1-homotrímero, de procolágeno de tipo I en una muestra antes del radioinmunoanálisis

Si la muestra, bien suero o bien otro fluido biológico a excepción de orina, contiene ambos propéptidos aminoterminales, clásico y \alpha1-homotrímero, de procolágeno de tipo I, entonces estos pueden ser separados mediante cromatografía en una columna de intercambio aniónico (Protein-Pak DEAE-5P) usando cromatografía líquida de alta resolución. Se dializa una muestra de 1 ml contra tampón de acetato amónico 50 mM, pH 5, inyectada en la columna y eluída usando un gradiente lineal de NaCl (0 a 0,3 M, 0 a 60 min, velocidad de flujo 1 ml/min) recogiendo fracciones de 1 ml. Las fracciones son analizadas entonces por radioinmunoanálisis respecto al propéptido aminoterminal clásico de procolágeno de tipo I y se detectan la presencia y la posición de las dos formas de los propéptidos aminoterminales de procolágeno de tipo I. En el caso de que sea necesario realizar una medición precisa de la cantidad correcta, se reúnen las fracciones que contienen dichos propéptidos, se dializan brevemente contra agua destilada, se liofilizan y por último se disuelven en tampón de PBS usando el volumen original de la muestra y se determinan las concentraciones de los propéptidos mediante radioinmunoanálisis respecto al propéptido aminoterminal clásico de procolágeno de tipo I.

Empleando el trazador adecuado es posible medir el \alpha1-homotrímero o el heterotrímero clásico.

Claims

1. Propéptido aminoterminal \alpha1-homotrímero, trímero, intacto, aislado de procolágeno de tipo I obtenible sin el uso de una enzima proteolítica.

2. Propéptido aminoterminal (clásico) heterotrímero, intacto, aislado de procolágeno de tipo I obtenible sin el uso de una enzima proteolítica.

3. Propéptido según la reivindicación 1 o 2, que está libre de una enzima capaz de degradar el propéptido a su forma monómera.

4. Propéptido según la reivindicación 1 o 2, que está libre de colagenasa bacteriana.

5. Propéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está marcado.

6. Propéptido según la reivindicación 5, en donde el marcador es un marcador radioactivo, un lantánido, una enzima o un marcador luminiscente o fluorescente.

7. Procedimiento para la producción de un propéptido como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende someter el propéptido a cromatografía bajo condiciones no desnaturalizantes.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en donde las condiciones no desnaturalizantes comprenden aplicar purificación por intercambio aniónico a un pH de alrededor de 5,0 y separación en fase inversa a pH neutro.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en donde la separación en fase inversa se efectúa a un pH por encima de 5,0.

10. Anticuerpo que es específico para un propéptido como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o como es producido mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, que no tiene afinidad por la forma monómera del propéptido.

12. Anticuerpo según la reivindicación 10 u 11, que está marcado.

13. Método de análisis de propéptido aminoterminal \alpha1- homotrímero, trímero, intacto de procolágeno de tipo I o de propéptido aminoterminal (clásico) heterotrímero, intacto de procolágeno de tipo I, cuyo método comprende poner en contacto una muestra que ha de ser analizada con un primer anticuerpo como el reivindicado en la reivindicación 10 u 11 en presencia de un marcador, de manera que el marcador se une al complejo de propéptido/primer anticuerpo así formado, y analizar la cantidad de marcador unido y/o sin unir.

14. Método según la reivindicación 13, en donde dicha muestra se pone en contacto con un anticuerpo marcado según la reivindicación 12.

15. Método según la reivindicación 13, en donde el propéptido aminoterminal marcado de procolágeno de tipo I y la muestra a analizar se ponen en contacto con un primer anticuerpo sin marcar, y el complejo de propéptido/primer anticuerpo así formado se separa del material no complejado y se analiza el marcador complejado o sin complejar.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde el complejo de propéptido/anticuerpo se pone en contacto con un segundo anticuerpo específico al primer anticuerpo, y el complejo de propéptido/primer anticuerpo/segundo anticuerpo se separa del material sin complejar.

17. Método según la reivindicación 16, en donde el segundo anticuerpo está unido a un soporte sólido.

18. Anticuerpo según la reivindicación 12 o método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en donde el marcador es un marcador radioactivo, un lantánido, una enzima o un marcador luminiscente o fluorescente.

19. Kit de análisis adecuado para utilizarse en el método según cualquiera de las reivindicaciones 13 y 15 a 18, cuyo kit comprende un anticuerpo como el reivindicado en la reivindicación 10 u 11, y un propéptido marcado según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 o preparado mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

20. Kit de análisis según la reivindicación 19, en donde el propéptido marcado está radiomarcado.

21. Kit para utilizarse en la realización del método según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 16, que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.