NO320120B1 - Isolert intakt aminoterminalt propeptid av type 1 prokollagen, fremgangsmate for fremstilling derav, antistoff spesifikt for nevnte propeptid, fremgangsmate for analyse av nevnte propeptid, og analysetestsett som omfatter antistoffet og fremgangsmate for separasjon av to former av propeptid. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert intakt aminoterminalt propeptid av type 1 prokollagen, fremgangsmåte for fremstilling derav, antistoff spesifikt for nevnte propeptid, fremgangsmåte for analyse av nevnte propeptid, og analysetestsett som omfatter antistoffet og fremgangsmåte for separasjon av to former av propeptid.

Oppfinnelsen vedrører en forbedret målemetode for immunologisk bestemmelse av intakt, enten klassisk- eller al-homotrimer, aminoterminalt propeptid av type I prokollagen i en prøve slik som serum, og fremstilling av et antistoff egnet for bruk i fremgangsmåten.

Type I kollagen er den mest rikelig forekommende kollagen-• typen i menneskekroppen. Mesteparten av det finnes i ben, selv om annet bløt-bindevev også inneholder betydelige mengder av det. I mineralisert vev slik som ben, er rundt 90% av den organiske matriks type I kollagen, det finnes ikke andre kollagentyper i slike vev. Derfor er analyse av type I kollagen viktig i sykdommer som affiserer ben, slik som metabolske bensykdommer inkludert primær og sekundær osteoporose, benmetastaser i bryst eller prostatakarsinomer, reumatoid artritt og forskjellige genetiske sykdommer slik som osteogenesis imperfecta. Det er også kjent at kollagensyntese hastighet i ben affiseres med ulike hormoner for eksempel veksthormon, tyroksin, kortisol og østrogener.

Type I kollagen syntetiseres som et prokollagen inneholdende propeptidforlengelser i begge ender av molekylet. Hastigheten av type I kollagensyntese kan derfor bedømmes ved å bestemme mengden av propeptid frigjort under omdannelsen av prokollagen til kollagen. Det er kjent å måle det karboksyterminale propeptidet av type I prokollagen (forkortet PICP) i serum (Melkko J, Niemi S, Risteli L, Risteli J: Clin. Chem. 1990; 3_6; 1328-1332). Imidlertid finnes det enkelte individer i hvilke eliminasjonshåstigheten av dette propeptidet fra sirkulasjonen er svekket, noe som fører til svært høye serumnivåer av PICP, som ikke er relatert til syntese-hastigheten av type I prokollagen. På den annen side har tidligere målemetoder utviklet for aminoterminalt propeptid av type I prokollagen vært basert på enten syntetiske monomere lineære peptider (Ebeling PR, Peterson JM, Riggs BL; J. Bone Miner. Res. 1992; 7; 1243-1250 og Linkhart SG, Linkhart TA, Taylor AD, Wergedahl JE, Bettica P, Baylink DJ: Clin. Chem. 1993; 3_9; 2254-2258) eller på propeptider isolert fra amnionvæske (Teisner B, Boje Rasmussen H, Hoejrup P, Yde-Anderson E, Skjoedt K: APMIS 1992; 100; 1106-1114 og Proce KM, Silman R, Armstrong P, Grudzinskas JG: Clin. Chim. Acta 1994; 224; 95-102) eller celle-kultur medium (Jukkola A, Risteli L, Melkko J. Risteli J: J. Bone Miner. Res. 1993; 8; 651-657). Slike målemetoder har blitt funnet å påvise to antigene former i human serum som er forskjellige med hensyn til deres molekylvekt. En av formene korresponderer til det autentiske trimer propeptidet i størrelse og det andre er dets ytterligere nedbrytningsprodukt som ligner det globulære såkalte Coll domene av propeptidet.

WO 9315107 beskriver syntetiske peptider avledet fra den aminoterminale propeptidregion av prokollagen alfa (a) 1 kjede av type I kollagen. Det produserte peptidet og/eller antistoffet er benyttet for bestemmelse av nivå av prokollagen (a)1-aktivitet. Foreliggende oppfinnelse derimot beskriver en testmetode for immunologisk bestemmelse av intakt, enten klassisk heterotrimer eller al-homotrimer av aminoterminalt propeptid av type I prokollagen. WO 9315107 beskriver på side 5, linje 20 til side 6, linje 1-21, prokollagenpeptider avledet fra N-terminal region og deres kjennetegn. På side 6, linje 3-7, avsløres det at peptidene kan fremstilles syntetisk, eller ved rekombinant DNA-teknologi, og at peptidet fortrinnsvis vil være vesentlig fritt for naturlig forekommende prokollagen al type I proteiner og fragmenter derav. Linjene 20 og 21 på den samme siden åpenbarer at antistoffets spesifisitet er aminoterminalt propeptid av prokollagen al type I.

Som beskrevet i den foreliggende søknadens beskrivelse, er tester basert på peptider kjent fra blant annet WO 9315107, funnet å påvise to antigene former i human serum som skiller seg med hensyn til deres molekylstørrelse. En av formene tilsvarer det autentiske trimere propeptidet i størrelse, mens det andre er dens monomere form, mest sannsynlig et degraderingsprodukt.

Tilgjengelige bevis foreslår at disse nedbrytningsproduktene av lav molekylvekt ikke er avledet fra den videre nedbrytningen av det frigjorte propeptidet, men mest sannsynlig fra nedbrytningen av type I prokollagen molekyler som har beholdt det aminoterminale propeptidet i vevene (såkalt pN type I kollagen). Slike molekyler er funnet på overflaten av type I kollagenfibre, hovedsakelig i bløt-bindevev og temporært i nylig syntetisert ikke-mineralisert osteoid. Videre, har det blitt vist at det autentiske aminoterminale propeptidet elimineres fra sirkulasjonen via "scavenger"-reseptoren på leverendotelcellene, mens det mindre Coll relaterte nedbrytningsproduktet elimineres via nyrene. Følgelig vil nyresykdom, ved å senke klaringen av det Coll-relaterte peptidet, sterkt påvirke serumkonsentrasjonene av slike peptider og gi falske resultater med hensyn til kollagensyntese. Siden de intakte aminoterminale propeptidene av type I prokollagen ikke utskilles i urinen, er analysetestsettet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelig til serum og andre kroppsvæsker, unntatt urin. I tillegg vil, den katabolske tilstand som ofte påtreffes i alvorlig syke pasienter, øke vevsnedbrytningen av pN type I kollagen, og likeledes øke serumkonsentrasjonen av Coll og gi falsk informasjon om den anabolske kapasiteten til pasienten.

Det vil derfor være ønskelig å løse tolkningsproblemene av resultatene forårsaket av de forskjellige opprinnelser og elimina-sjonsveier av de to propeptidformene og å fremskaffe en kvantitativ metode som er rask og enkel å utføre, for måling av kun det intakte aminoterminale propeptid av type I prokollagen i human serum utelukkende de Coll-relaterte nedbrytningsproduktene.

Det intakte propeptidet er i form av en trimer, mens nedbrytningsproduktet omfatter det monomere globulære Coll domene av al-kjeden av type I prokollagen. Når man isolerer det intakte trimere aminoterminale propeptidet av type I prokollagen fra pleuralvæske fra en karsinompasient, ble det overraskende oppdaget to separate propeptider som adskilte seg med hensyn til sine konstituelle kjeder. To ulike polypeptidkjeder ble funnet i propeptidformen som først ble eluert fra DEAE-kromatografikolonnen, siden det klassiske type I prokollagenet er en heterotrimer inneholdende to pro al-kjeder og en pro a2-kjede av type I prokollagen. Det sureste propeptidet manglet den andre polypeptidkjeden som beveger seg raskest i elektroforese og er kjent for å være avledet fra pro a2-kjeden av type I prokollagen. Dette atypiske propeptidet var avledet fra orl-homotrimer type I prokollagenet inneholdende tre identiske pro al-kjeder. Et slikt kollagen har tidligere blitt beskrevet i sin fullstendig prosesserte form fra vev i pasienter med visse sykdomstilstander for eksempel bryst-, lunge- og mage-karsinomer, men de tilsvarende propeptidene har ikke blitt identi-fisert. Siden den aminoterminale delen av pro ct2-kjeden er trunkert med hensyn til pro al-kjeden og mangler hele Coll domene, har al-homotrimer propeptidet tre Coll domener og det klassiske propeptidet bare to. Siden Coll domener er fosforylerte kan disse to intakte propeptidene separeres fra hverandre på basis av forskjellen i ladning for eksempel ved bruk av DEAE-kromatografi ved pH 5,0. Siden al-homotrimer propeptidet har tre Coll domener og det klassiske propeptidet kun to, elueres det sistnevnte først i ionebytterkromatografi. Begge disse propeptidene er mottagelige for å bli denaturert ved lav pH {mindre enn 5,0); noe som ikke er lett å detektere men som kan forårsake problemer under produksjon av antistoffer dersom passende forholdsregler ikke tas.

Antisera benyttet tidligere, for måling av aminoterminalt propeptid av type I prokollagen, har affinitet ikke bare for det intakte trimere propeptidet, men også i vesentlig grad for den monomere formen. Dette skyldes naturen til antigenet som ble benyttet til å fremstille antiserumet. Når et lineært syntetisk peptid, eller et propeptid avledet fra amnionvæske og isolert i en monomer form, benyttes for å fremstille antistoffene, reagerer disse antistoffene fortrinnsvis med de monomere Coll-nedbrytningsproduktene. På den annen side, når propeptidet er isolert fra cellekulturvæske, renses det først i form av et prokollagen som senere spaltes med bakteriell kollagenase for å frigjøre propeptidet skikkelig fra kollagenet. Siden det autentiske propeptidet fortsatt inneholder kollagene domener, bindes deler av den bakterielle kollagenasen til det, men er ikke i stand til å spalte propeptidet i løpet av den korte in vitro inkuberingen og isoleringsprosedyrene. Følgelig, når et slikt propeptid benyttes som et immunogen, er enzymet i stand til å fungere, førende til in vivo nedbrytning av propeptidet og produksjon av antistoffer mot dets nedbrytningsprodukter. I tillegg er det også nødvendig å unngå slike betingelser og metoder {for eksempel høy-prestasjons-væske kromatografi ved pH lavere enn 5,0) som vil denaturere selv en liten del av propeptidet under isoleringsprosedyren av det aminoterminale propeptidet av type I prokollagen. Dette skyldes at, i motsetning til det tilsvarende propeptidet av type III prokollagen {EP-B-0 304 292) har aminoterminalen til type I prokollagen ingen interkjede disulfidbindinger, som ville stabili-sere strukturen og gjøre rask renaturering lettere etter mindre uheldig denaturering under renseprosedyren. Derfor kan fjerning av kontaminerende enzymer fra type III prokollagen utføres med revers fase separasjon ved lav pH. Dette vil imidlertid føre til denaturering av trimer PINP av type I prokollagen fordi det mangler stabiliserende disulfidbindinger.

Følgelig er utgangsmaterialer for fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis fri fra slike kontaminerende proteolytiske enzymer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolert intakt, trimert klassisk aminoterminalt propeptid av type I prokollagen og isolert intakt trimert al-homotrimer aminoterminalt propeptid av type I prokollagen, disse propeptidene kan oppnås uten bruk av proteolytiske enzymer. Følgelig er de isolerte propeptidene fri fra enzymer slik som bakteriell kollagenase, som er i stand til å nedbryte propeptidet til dets monomere form. Propeptidene i henhold til oppfinnelsen kan merkes, ved bruk av en egnet markør. Eksempler på egnede markører inkluderer radiomarkører, biotin (som kan påvises med avidin eller streptavidin konjugert med peroksydase), lantanider, basisk fosfatase og fluorescerende markører (for eksempel fluorescein og rhodamin).

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en renseprosedyre for"de intakte klassisk- og al-homotrimer aminoterminale propeptider av human type I prokollagen. Den tilveiebringer også et antistoff fremstilt mot hver av de to formene av det intakte propeptid, foretrukket mot al-homotrimer formen, hvilket antistoff har liten eller ingen affinitet, fortrinnsvis ingen affinitet for den monomere formen av propeptidet. Det er blitt oppdaget at spesielt al-homotrimer propeptidet fremskaffer en egnet tredimen-sjonal konformasjon, som er i stand til å gi opphav til antistoffer som gjenkjenner kun den korrekte spatiale konfigurasjonen funnet i intakte propeptider og ikke i de monomere kjeder.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en renseprosedyre for intakt klassisk- og al-homotrimer aminoterminale propeptider av human type I prokollagen. Som et utgangsmateriale kan det benyttes en biologisk kilde for eksempel human pleural-, bukhule- eller amnionvæske inneholdende nevnte propeptider i tilstrekkelige mengder, al-homotrimerpropeptid har ofte blitt funnet i malign pleuralvæske, sjelden i bukhulevæske og ikke i amnionvæske. I tillegg, skal det under renseprosedyren ikke være tilstede aktive proteolytiske enzymer som delvis kan nedbryte propeptidene. For eksempel, human amnionvæske, spesielt full-termin, og mange maligne bukhulevæsker har blitt funnet å gi råpropeptid blandinger som faller fra hverandre til monomere former under isolasjonen. Dette kan vises ved repetert gel-filtreringsanalyse hvor et tidligere trimert propeptid senere i analysen er delt i to topper tilsvarende det autentiske propeptidet og dets monomere Coll domene. Den foretrukne isblerings-prosedyren er i korthet slik. Albumin, det forurensende proteinet tilstede i størst mengde, fjernes. Dette kan utføres på enhver passende måte, for eksempel ved presipitering av propeptidet med ammoniumsulfat (metning mindre enn 50% fortrinnsvis 40%). Dette fjerner albumin fordi albumin ikke presipiteres. Det propeptid-inneholdende materiale renses ytterligere med et første DEAE-kromatografitrinn, fortrinnsvis ved en nøytral pH på fra pH 6,5 til pH 7,5 for eksempel pH 7,4; et gelfilteringstrinn,- et andre DEAE kromatografitrinn, fortrinnsvis ved lav pH, slik som fra pH 4,8 til pH 5,2 for eksempel pH 5,0 og revers fase separasjon, fortrinnsvis ved en nøytral pH slik som pH 6,5 til pH 7,5, særlig pH 7,4.

Siden propeptidene er sure på grunn av fosforylering av visse serinenhéter, vil de bindes tett til en DEAE-kolonne over et vidt pH-område (fra 5,0 til 8,5) og elueres i en skarp topp med NaCl. Under det første DEAE-kromatografitrinnet, en nøytral pH er foretrukket for å holde de store mengdene med andre forurensende proteiner i løsning. Dette sikrer effektiv separasjon av propeptidene av interesse. Etterfølgende gelfiltrering fjerner proteiner større og mindre enn propeptidene. Kolonnen kan utvikles med forskjellige bufre, for eksempel med 0,2M ammoniumbikarbonat, pH 7,9, som har den fordelen at det senere kan fjernes med lyo-filisering. Det andre DEAE-kromatografitrinnet ved lav pH (for eksempel rundt 5,0) fjerner rester av proteiner som ikke ble totalt separert tidligere på grunn av de store mengdene materiale tilstede. Endelig rensing oppnås med revers fase separasjon som bør utføres ved nøytral pH, slik som fra pH 6,5 til 7,5 for eksempel 7,4, for å bevare den native trimere konformasjonen av propeptidet. En utbredt benyttet revers fase separasjon i 0,1% TFA som en mobil fase fører til lave utbytter av propeptider på grunn av delvis denaturering og problemer med å oppnå trimerspesifikke antistoffer. Eksempel 1 beskriver i detalj hvordan propeptidene kan isoleres fra malign pleuralvæske.

Oppfinnelsen fremskaffer også et antistoff som er spesifikt for intakt, heterotrimert klassisk aminoterminalt propeptid av type I prokollagen, eller for intakt trimert al-homotrimer aminoterminalt propeptid av type I prokollagen ifølge oppfinnelsen; hvilket antistoff ikke binder seg spesifikt til den monomere formen av nevnte propeptid. Følgelig har antistoffene, i henhold til oppfinnelsen liten eller ingen affinitet, fortrinnsvis ingen affinitet, for den monomere formen av propeptidet, men binder til en eller begge av de trimere formene. Antistoffet har anvendelse i påvisning og kvantitativ bestemmelse av human PINP, og dermed er det nyttig i diagnose av sykdommer og tilstander forbundet med anormale nivåer av PINP slik som sykdommer og tilstander nevnt • over.

Antistoffet er fortrinnsvis monoklonalt, men kan også være polyklonalt. Antistoffet kan være merket. Eksempler på egnede

■antistoffmarkører inkluderer radiomerker, biotin (som kan detek-teres med avidin eller strepavidin konjugert til peroksydase), lantanider, basisk fosfatase og fluorescerende markører (for eksempel fluorescein og rhodamin). Uttrykket "antistoff" benyttes her til å inkludere både komplette antistoffmolekyler og fragmenter derav. Foretrukne fragmenter inneholder minst ett antigen bindingssete, slik som Fab og F(ab")2-fragmenter. Humaniserte antistoffer og fragmenter derav er også inkludert i uttrykket "antistoff"-.

Antistoffet fremstilles ved å produsere antistoffer i vertsdyr mot et aminoterminalt propeptid i henhold til oppfinnelsen, eller mot en antigen epitop derav (heretter kalt "immunogenet"). Epitopen vil selvsagt være representativ for den intakte trimere formen av propeptidet, det vil si at et antistoff mot epitopen ikke vil gjenkjenne den monomere formen av propeptidet. Derfor vil en slik epitop omfatte to eller flere korte aminosyresekvenser fra ulike kjeder som er nær hverandre på grunn av konfigurasjonen av det trimere propeptidet, det vil si en diskontinuerlig heller enn en kontinuerlig epitop. Denne konfigurasjonen vil ikke eksistere i den monomere formen av peptidet, så antistoffer mot slike epitoper vil ikke gjenkjenne monomeren. Typisk er antistoffer ifølge oppfinnelsen rettet mot det mest aminoterminale ikke-kollagene, globulære domene av PINP. Den klassiske formen av PINP er en heterotrimer inneholdende .kjeder avledet fra både pro-0£l- og pro-a2-kjedene av type.I prokollagen. Pro-a2-kjeden er trunkert ved aminoterminalen og inneholder ikke det globulære antistoff dannende induserende område. For å skille de trimere og de monomere formene av propeptidet, må antistoffene reagere med den tredimensjonale konformasjonen og ikke med en individuell kjede. Derfor er al-homotrimer PINP, som inneholder tre like kjeder som alle har dette globulære domene, særlig egnet for fremstilling av antistoffene ifølge oppfinnelsen, som gjenkjenner et trekk av propeptidenes konformasjon inneholdende tre eller to ulike kjeder i den korrekte konformasjon er involvert i den antigene deter-minant. Slike antistoffer kan ikke dannes når lineære syntetiske peptider eller monomere kjeder benyttes som immunogener.

Fremgangsmåter for å fremstille monoklonale og polyklonale antistoffer er velkjente innen teknikkens stilling og enhver av disse fremgangsmåtene kan benyttes til å fremstille antistoffene ifølge oppfinnelsen. En fremgangsmåte for å fremstille et polyklonalt antistoff omfatter immunisering av et passende vertsdyr, for eksempel et forsøksdyr, med immunogenet og benytte riktig fortynnet serum eller isolere immunoglobuliner fra serumet. Dyret kan derfor bli inokulert med immunogenet, med blod som deretter fjernes fra dyret og IgG-fraksjonen som så blir renset. Fremgangsmåter for fremstilling av et monoklonalt antistoff omfatter typisk udødeliggjøring av celler som produserer det ønskede antistoffet. Hybridomaceller kan produseres ved å fusjonere miltceller fra et inokulert forsøksdyr med tumorceller (Kohler og Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975)). Antistoffet kan også produseres ved rekombinant DNA teknologi, for eksempel som beskrevet av Skerra et al. (1988), Science 240, 1038-1041.

En udødeliggjort celle som produserer det ønskede antistoffet kan selekteres ved en konvensjonell prosedyre. Hybridomaceller kan dyrkes i kultur eller injiseres intraperitonealt for dannelse av bukhulevæske eller inn i blodstrømmen til en allogen vert eller en immunokompromittert vert. Human antistoffer kan fremstilles ved in vitro immunisering av human lymfocytter, etterfulgt av transforme-ring av lymfocyttene med Epstein- Barr virus.

For produksjonen av både monoklonale og polyklonale antistoffer, er forsøksdyret passende en geit, kanin, kylling, sau, marsvin, rotte eller mus. Dersom ønsket kan immunogenet admini- ■ streres som et konjugat i hvilket immunogenet er koblet, for eksempel via en sidekjede av en av aminosyrerestene til en passende bærer. Bærermolekylet er typisk en fysiologisk akseptabel bærer. Antistoffet som oppnås kan isoleres og dersom ønsket renses for eksempel til en renhet på opp til 70%, opp til 80%* opp til 90%, opp til 95%, opp til 99% eller opp til 100%. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for analyse av det intakte aminoterminale propeptidet av type I prokollagen, hvilken fremgangsmåte omfatter å kontakte en prøve som skal analyseres med et antistoff ifølge oppfinnelsen i nærvær av en markør, slik at markøren bindes til propeptid/antistoff-komplekset som er dannet og mengden av bundet og/eller ubundet markør analyseres. ;I prinsippet kan enhver analyseteknikk som tillater deteksjon, og fortrinnsvis mengdebestemmeIse av enten det klassiske heterotrimere propeptidet eller al-homotrimeren og som forutsetter spesifikk binding til ett av disse peptidene av et antistoff ifølge oppfinnelsen, utnyttes. En foretrukket fremgangsmåte er basert på bruken av merkede antistoffer, foretrukket radiomerkede antistoffer. I slike fremgangsmåter, analyseres mengden av (merket) propeptid(antigen)/antistoffkompleks, for således å gi et mål for mengden propeptid(antigen) i prøven. ;En annen foretrukket fremgangsmåte er basert på bruken av merket antigen (intakt trimert propeptid i enten den klassiske-eller al-homotrimertypen) sammen med et antistoff ifølge oppfinnelsen. I slike fremgangsmåter, tilsettes en kjent mengde av merket, fortrinnsvis radiomerket, antigen til prøven inneholdende en ukjent mengde av umerket propeptid(antigen). Både det merkede ;og det umerkede antigenet bindes til antistoffet for eksempel på ;en konkurrerende måte og en analyse av mengden bundet merket propeptid sammenlignet med den kjente mengden tilsatt kan benyttes til å bestemme hvor mye umerket antigen som er tilstede i prøven. Fremgangsmåter av disse foretrukne typene beskrives i større ;detalj nedenfor. ;Dersom al-homotrimer propeptidet skal analyseres, må prøven behandles med for eksempel DEAE-kromatografi, før analysen, for å-separere det klassiske- og al-homotrimer propeptidet og merket al-homotrimer propeptid benyttet som tracer, siden analysen selv ikke skiller mellom disse to propeptidformene. ;Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for deteksjon og/eller kvantitativ bestemmelse av intakt, trimert human PINP i en prøve, som omfatter : {a) kontakte en prøve med et antistoff ifølge oppfinnelsen,' for • ;eksempel et merket antistoff slik som et radiomerket antistoff, og ;(b) deteksjon og/eller kvantitativ bestemmelse av bindingen av antistoffet til ethvert av de intakte trimere formene av ;PINP. ;Mer spesielt, tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte ;for analysering av intakt, trimert, aminoterminalt propeptid av , human type I prokollagen, hvilken fremgangsmåte omfatter å kontakte i en hvilken som helst rekkefølge : (i) en prøve av en human kroppsvæske, hvilken prøve er kjent eller mistenkt for å inneholde et slikt propeptid; (ii) et antistoff som spesifikt binder seg til intakt, trimert propeptid av human type I prokollagen, men ikke til nevnte propeptid når det er i monomer form; og (iii) en kjent mengde av merket trimert propeptid ifølge oppfinnelsen, som fungerer som et antigen slik at markøren bindes til antistoffet i en mengde som er avhengig av mengden av umerket propeptid tilstede i prøven; og analysering av mengden av den bundne og/eller ubundne markøren som et mål på nivå av det umerkede intakte, trimere aminoterminale propeptid av human type I prokollagen i prøven. ;Menneskekroppsvæsken kan for eksempel være blod, plasma, serum, helende sårvæske. bukhulevæske, hjernevæske, pleuralvæske, synovialvæske, væske fra væskefylte hudblemmer eller amnionvæske. ;En metode for deteksjon eller kvantitativ, bestemmelse av intakt, trimert human PINP er Western blotting. En slik fremgangsmåte kan omfatte trinnene: (i) utsette en prøve som inneholder eller er mistenkt å inneholde et mål-intakt-trimert human PINP, for gelelektroforese for å separere peptidene i prøven; (ii) overføring av de separerte peptidene til en fast bærer (for eksempel en nitrocellulosebærer) ved blotting; og ■ (iii) tillate et merket antistoff- ifølge oppfinnelsen å binde til målet, det intakte trimere human PINP. Fremgangsmåter for kvantitativ bestemmelse inkluderer ■ ELISA-* (enzymbundet immunoanalyse) fremgangsmåter slik som ELISA-metoder eller en radioimmunoanalysernetode. Typisk omfatter en ELISA-metode følgende trinn: (i) immobilisering av et umerket antistoff, ifølge oppfinnelsen på en fast bærer; (ii) tilsette en prøve inneholdende eller mistenkt for å inneholde mål-intakt-trimert human PINP slik at PINP fanges av det

umerkede antistoffet;

(iii) tilsette et merket antistoff, ifølge oppfinnelsen; og

(iv) kvantitativ bestemmelse av mengden bundet merket antistoff.

Typisk omfatter en radioimmunoanalysemetode, trinnene:

(i) kontakte en prøve inneholdende eller mistenkt å inneholde propeptidet som skal påvises med et første antistoff, ifølge oppfinnelsen og et merket fortrinnsvis radiomerket, propeptid ifølge oppfinnelsen; (ii) kontakte det resulterende materiale med et immobilisert andre antistoff som binder til det første antistoffet; (iii) separere det immobiliserte materiale fra det ikke-immobiliserte materiale; og (iv) sammenligning av radioaktiviteten av det immobiliserte eller ikke-immobiliserte materiale med aktiviteten oppnådd med prøver av kjent konsentrasjon av propeptid for å bestemme konsentrasjonen av propeptid i prøven som analyseres.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også et analysesett (kit) egnet for utførelse av analysemetoden, ifølge oppfinnelsen. Analysesettet kan omfatte et antistoff ifølge oppfinnelsen, for eksempel et merket antistoff som beskrevet over, spesifikt for intakt trimert aminoterminalt propeptid av type I prokollagen som har liten eller ingen affinitet, fortrinnsvis ingen affinitet, for den monomere formen av propeptidet. Alternativt kan analysesettet omfatte et antistoff ifølge oppfinnelsen og et merket, fortrinnsvis radiomerket, propeptid ifølge oppfinnelsen, som fungerer som et antigen og gjør det mulig å bestemme mengden av

■ umerket antigen i prøven.■

De følgende eksempler illustrerer og ytterligere forklarer oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Isolering av intakt klassisk og al-homotrimer aminoterminale propeptider av human type I prokollagen i nativ konformasjon uten bruk av proteolytiske enzymer.

Fem til ti liter av human pleuralvæske fjernet fra lunge-kreftpaBienter av palliative grunner, bunnfelles med fast {NH4)2S04

{40% metning) i nærvær av proteaseinhibitorer (3 mg/l av fenylmetylsulfonylvæske, N-etylmaleimid og p-hydroksykvikk-søl<y>benzoat og lOmM EDTA). De presipiterte proteinene samles ved sentrifugering ved 15000 x g i 30 min og løses i 50mM Tris/HCl, pH 7,4, inneholdende de ovennevnte proteaseinhibitorene, og dialyseres mot denne bufferen. Prøven kromatograferes.deretter på en DEAE Sephacel-kolonne (5x50 cm) ekvilibrert i denne bufferen. Eluering utføres med en lineær gradient av NaCl (0 til 0,5 M NaCl, 4000 + 4000 ml). Det intakt klassiske - og al-homotrimer aminoterminalt propeptid av human type I kollagen elueres sent i gradienten, etter en stor mengde andre proteiner. Når det benyttes en immunoanalyse som påviser både de monomere og trimere propeptidene, vil de små mengdene av monomert Coll-relaterte peptider elueres først, så det intakte klassiske propeptidet og til slutt det al-homotrimer aminoterminale propeptidet av human type I prokollagen. Fraksjonene som inneholder de to propeptidene samles separat og renses uavhengig ved bruk av prosedyren som be^ skrevet nedenunder. De samlede fraksjonene dialyseres mot 0,2M NH4HCO3, pH 7,9 og lyof iliseres. Prøvene løses i 0,2M NH4HC03, og

settes på en Sephacryl S-300-kromatografikolonne (1,5 x 110 cm) ekvilibrert i denne løsningen. Fraksjonene inneholdende propeptid antigenisiteten (mellom elueringsposisjonene til human.IgG og albumin) samles og lyofiliseres. Prøvene løses så i 50mM ammoniumacetatbuffer, pH 5,0, dialyseres kort mot den og kromatograferes på en ionebytterkolonne (Protein-PAK DEAE-5P) ved bruk av et høy-prestasjonsvæske kromatograf (HPLC)-instrument. Propeptidene elueres ved bruk av en lineær gradient av NaCl (0 til 0,3 M, 0 til 60 min, gjennomstrømningshastighet 1 ml/min). Endelig rensing av propeptidet utføres ved bruk av HPLC ved direkte injeksjon av fraksjonene inneholdende propeptidet inn i en pH

stabil revers fase kolonne (Vydac, Hesperia, CA) i 0,4% ammoniumacetat, pH 7,4, og eluering av det bundne propeptid med økende konsentrasjoner acetonitril (0 til 70%, 0 til 45 min). Propeptidet elueres som en skarp topp i den første halvdelen av gradienten, lokalisert med immunoassay, samles og frysetørkes. Renheten av det klassiske og al-homotrimer aminoterminale propeptider av human type I prokollagen isolert fra human pleuralvæske er vist i figur 1 ved bruk av SDS-polyacrylamid gelelektroforese (separerende gel 15%). Fordi type I prokollagen ikke inneholder noen interkjede disulfidbindinger dissosieres de konstitusjonelle kjedene under denne prosedyren.

I motsetning til det aminoterminale propeptid av type III prokollagen (PIIINP) inneholder hverken det klassiske eller den al-homotrimere formen av PINP propeptidet interkjede disulfidbindinger, som i.PIIINP kovalent binder de tre konstitusjonelle kjedene sammen. Følgelig faller de tre individuelle kjedene av PINP fra hverandre i natriumdodecylsulfat (SDS) plategel elektroforese (figur 1) og den trimere strukturen kan ikke veri-fiseres. De isolerte klassiske og al-homotrimere propeptidene er imidlertid trimere siden kun en immunoreaktiv topp korresponde-rende til størrelsen av det autentiske propeptidet blir funnet i størrelsesekslusjonskromatografi og ingen reaksjon kan observeres ved elueringsposisjonen til nedbrytningsproduktene av propeptidet. Når propeptider etter lagring i frossen tilstand, gjentatte ganger ble analysert med gelfiltrering, ble det ikke observert nedbrytning til mindre former.

EKSEMPEL 2

Antiserumproduksjon.

Polyklonale antistoffer mot PINP ble fremstilt i New Zealand White-kaniner ved intradermale injeksjoner av 150 ug/kanin av høyt renset al-homotrimer PINP (fri for proteolytiske enzymer), oppløst i 1 ml av 0,9% NaCl og blandet med et likt volum av komplett Freunds adjuvans. Flere booster-injeksjoner (75 ug/kanin av al-homotrimer PINP i 1 ml av 0,9% NaCl og blandet med et likt volum av ufullstendig Freunds adjuvans) ble gitt i tre ukers inter-valler. Antiserum samlingen ble laget for hver kanin fra flere blødninger.

EKSEMPEL 3

Utføring av likevektstypen av radioimmunoanalyse.

Ti mikrogram av det klassiske (eller al-homotrimeren) aminoterminalt propeptid av type I prokollagen merkes med 1 millicurie av <125>I med Kloramin-T (10 mikrogram) og det merkede propeptidet separeres fra fritt jod ved gelfiltrering på en Sephacryl S-300 kolonne (1 x 20 cm) innstilt til likevekt med PBS-buffer inneholdende bovint serumalbumin (1 gram/liter). Det merkede propeptidet elueres fra kolonnen som en skarp topp lenge før det frie jodet. Antiserum bindingskurver lages med 50 000 tellinger per minutt av det merkede propeptidet. Propeptidkonsentrasjonen i en ukjent prøve av serum, eller andre biologiske væsker unntatt urin, bestemmes i den følgende radioimmunoinhibisjonsanalysen. Et fortestet fortynnet antiserum (200 yl) inkuberes med den ukjente prøven (50 yl) og 50 000 tellinger per minutt av traceren (i 200 yl av PBS- buffer inneholdende 1 gram/liter av bovint serumalbumin) i 2 timer ved 37 °C. Så tilsettes en fast fase andre antistoff mot kanin gammaglobulin og etter 20 minutters inkubering

ved 20 °C separeres antigenet bundet i immunokomplekser med sentrifugering (2000 x g i 20 min) fra løsningen. Inhiberingsaktiviteten av den ukjente prøven sammenlignes med aktiviteten til standardkonsentrasjoner av umerket aminoterminalt propeptid av type I prokollagen.

EKSEMPEL 4

Separasjon av det klassiske- og al-homotrimer aminoterminale propeptider av type I prokollagen i en prøve før radioimmunoanalyse.

Dersom en prøve, enten serum eller en annen biologisk væske unntatt urin, inneholder både klassiske og al-homotrimere aminoterminale propeptider av type I prokollagen,kan disse separeres ved kromatografi på en ionebytterkolonne (Protein-Pak DEAE-5P) ved bruk av en høy-prestasjonsvæskekromatografi. En en-milliliters prøve dialyseres mot 50 mM ammoniumacetatbuffer, pH 5,0, injiseres i en kolonne og elueres med en lineær gradient av NaCl (0 til 0,3M, 0 til 60 min, gjennomstrømningshastighet 1 ml/min) og en milliliters fraksjoner oppsamles. Fraksjonene analyseres så med radioimmunoanalyse for det klassiske aminoterminale propeptidet av type I prokollagen og nærvær og lokalisering av de to formene av aminoterminale propeptider av type I prokollagen påvises. Dersom et nøyaktig mål av mengden er påkrevet, samles fraksjonene som inneholder de nevnte propeptider, dialyseres kort mot destillert buffer, frysetørkes og endelig løses i PBS-buffer ved bruk av det originale volum av prøve og konsentrasjonene av propeptidene bestemmes ved radioimmunoanalyse for det klassiske aminoterminale propeptid av type I prokollagen.

Det er mulig å måle enten den al-homotrimeren eller den klassiske heterotrimeren ved å bruke en passende tracer.

Claims (13)

1. Isolert intakt al-homotrimer eller heterotrimer (klassisk) aminoterminalt propeptid av type I prokollagen, karakterisert ved at det kan oppnås uten bruk av et proteolytisk enzym.

2. Propeptid som krevet i krav 1, karakterisert ved at det er fritt fra et enzym som er i stand til å nedbryte propeptidet til dets monomere form, slik som bakteriell kollagenase.

3. Propeptid ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det er merket fortrinnsvis med en radioaktiv markør, et lantanid, et enzym eller en luminescerende eller fluorescerende markør.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et propeptid ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter å utsette propeptidet for kromatografi under ikke-denaturerende betingelser.

5. En fremgangsmåte som krevet i krav 4, karakterisert ved at de ikke-denaturerende betingelsene omfatter å benytte anionebytter-rensing ved en pH på rundt 5,0 og revers fase separasjon ved nøytral pH, eller ved en pH over 5,0.

6. Antistoff, karakterisert vedat det er spesifikt for et propeptid som krevet i ethvert av kravene 1 til 3 eller er fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 4 og 5.

7. Antistoff som krevet i krav 6, karakterisert ved at det ikke har noen affinitet for den monomere formen av propeptidet og som fortrinnsvis er merket.

8. Fremgangsmåte for analyse av intakt al-homotrimer aminoterminalt propeptid av type I prokollagen, eller intakt heterotrimer {klassisk) aminoterminalt propeptid av type I prokollagen, karakterisert ved at den omfatter å kontakte en prøve som skal analyseres med et første antistoff som krevet i kravene 6- eller 7 i nærvær av en markør slik at markøren bindes til propeptidet/første antistoff-komplekset som er dannet og analyse av mengden av bundet og/eller ubundet markør.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at merket aminoterminalt propeptid av type I prokollagen og en prøve som skal analyseres kontaktes med et umerket første antistoff og propeptid/første antistoff-komplekset som dannes separeres fra det ikke-komplekserte materiale og den kompleksbundne eller ikke-kompleksbundne markøren analyseres.

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 8 og 9, karakterisert ved at den omfatter at propeptid/ antistoff-komplekset kontaktes med et andre antistoff spesifikt til det første antistoffet og fortrinnsvis bundet til en fast bærer og propeptid/første antistoff/andre antistoff-komplekset separeres fra det ikke-kompleksbundne materiale.

11. Antistoff ifølge krav 7 eller en fremgangsmåte ifølge kravene 8-10, karakterisert'ved at markøren er en radioaktiv markør,- et lantanid, et enzym eller en luminescerende eller fluorescerende markør.

12: Analysetestsett egnet for bruk i fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 8-10, karakterisert ved at det omfatter et antistoff som krevet i kravene 6 eller 7 og et merket propeptid ifølge krav 3, fortrinnsvis radiomerket eller fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 4 og 5.

13. Fremgangsmåte for separasjon av det intakt klassiske og det intakt al-homotrimere aminoterminale propeptidet av type I prokollagen i en prøve, karakterisert ved ionebytterkromatografi ved bruk av høyprestasjonsvæskekromatografi før en immunoanalyse.