JPH0772147A - 抗アネキシンｖ抗体並びに該抗体の製法及び利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトの心筋壊死及び虚血性障害などにより血
中及び組織標本に現れるアネキシンＶについて測定及び
検出して、心筋梗塞及び狭心症の患者の診断、病勢及び
治療効果の判定を可能にする抗アネキシンＶ抗体を提供
する。 【構成】 イヌの臓器に含有されるアネキシンＶ抗原に
対して免疫されたイヌと異種の哺乳動物の血清を精製し
て、ヒトアネキシンＶ、イヌアネキシンＶ及び前記免疫
された哺乳動物と異種の哺乳動物のアネキシンＶと特異
的に交差する抗アネキシンＶ抗体を得ること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ヒト、イヌ及びラッ
トの血液中に存在するタンパク質アネキシンＶに交差す
るアネキシンＶ抗体並びにその製法に関し、容易に得ら
れる哺乳動物のアネキシンＶ抗原、例えばイヌ、特にビ
ーグル犬のアネキシンＶ抗原により免疫された、容易に
得られるイヌに対し異種の哺乳動物、例えば、ラツト、
ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ又はヤギより、ヒト
及びイヌのタンパク質アネキシンＶと交差するアネキシ
ンＶ抗体を製造する方法及び該製法により製造されたヒ
ト及びイヌのタンパク質アネキシンＶと交差するアネキ
シンＶ抗体に関する。また、本発明は、抗イヌアネキシ
ンＶウサギポリクローナル抗体等の抗イヌアネキシンＶ
ポリクローナル抗体により、ヒト及び哺乳動物の血液中
に存在するタンパク質アネキシンＶ濃度を、免疫測定に
より測定することが可能な、ヒト及び哺乳動物のアネキ
シンＶ測定用抗体の開発及びその利用に関するものであ
り、特に、例えば、心筋梗塞などの急激な細胞壊死を起
こす疾患及び虚血性障害を示す狭心症についての診断
を、細胞又は血液中のタンパク質のアネキシンＶ濃度を
測定することによって行うことができるアネキシンＶの
診断用抗体の開発及びその利用に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アネキシンは、種々の動物やヒトの組織
及び細胞に存在するカルシウム結合タンパク質で、細胞
質の可溶成分に存在する。このタンパク質は、アミノ酸
配列よりファミリーを形成しており、現在、アネキシン
Ｉ〜ＸＩＩが知られている。このタンパク質は、リン脂
質やアクチンとカルシウム濃度に依存して結合し、抗炎
症作用及び抗血液凝固作用があることが知られている。

【０００３】組織又は細胞が壊死を起こした患者の場
合、例えば心筋梗塞の場合、壊死した心筋細胞内に含ま
れる種々の物質が血液内に漏出する。現在、このように
血中に漏出した種々の物質を測定して、急性心筋梗塞の
診断が行われているが、このような急性心筋梗塞の診断
についての血清生化学的検査法として使われている物質
としては、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵
素 （ＬＤＨ）、ミオシン軽鎖Ｉ及びトロポニン−Ｔ
（ＴｎＴ）などがある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの急性
心筋梗塞の診断についての血清生化学的検査法の検査対
象となる物質は、何れも心筋から血中に逸脱するもので
あるが、これらの物質が血中に増加するまで、特に、そ
の血中濃度が最も高値（ピーク）になるまでには、時間
を要し、また、被検者によっては、その時間はかなり異
なるために、これらのタンパク質による心筋梗塞の診断
では、極めて早期の心筋梗塞の診断が困難であり、問題
とされていた。殊に、狭心症については、血清生化学的
検査法の検査対象となる物質が確定されていないので狭
心症についての血清生化学的検査法による診断は、一般
に困難であり、狭心症についての血清生化学的検査法に
よる診断が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトの心
筋に存在するタンパク質のアネキシンの中で、心筋の可
溶画分に存在し、クレアチンキナーゼの分子量（８１，
０００）より小さい分子量を有するアネキシンＶ（３
５，０００）が、一般に、心筋梗塞及び狭心症の患者の
早期の段階で、壊死した心筋から漏出するので、アネキ
シンＶについて血中濃度等を測定することが、心筋梗塞
の患者の診断に寄与すると考え、また、虚血性障害を示
す狭心症においても、アネキシンＶの漏出がみられるの
で、アネキシンＶについて血中濃度等を測定すること
が、狭心症の患者の診断に寄与すると考え、本発明を意
図した。さらに、例えばイヌ、ウサギ及びラットの動物
の心臓、腎臓、肝臓、肺臓などの臓器からアネキシンＶ
を抽出し、この抽出されたタンパク質のアネキシンＶ抗
原に対する抗体が、ヒト、イヌ及び抗体作製用の免疫哺
乳動物以外の哺乳動物のアネキシンＶ、特に、ヒトアネ
キシンＶに特異的に交差することを発見して、本発明に
至ったものである。また、本発明は、このようにして、
例えばヒトの組織又は細胞の壊死に係り、血中に現れる
タンパク質の中のアネキシンファミリーについて、夫
々、血中濃度を測定し、例えば、それらの血中濃度よ
り、心臓、肺、肝臓、脳などの臓器の疾患についての診
断が、可能であることを見出されたことに、基づくもの
である。

【０００６】即ち、本発明は、イヌの臓器に含有される
アネキシンＶ抗原に対して免疫された、前記イヌに対し
異種の哺乳動物の血清から精製されたポリクローナル抗
体であって、ヒトアネキシンＶ、イヌアネキシンＶ及び
前記免疫された哺乳動物と種が相違する哺乳動物のアネ
キシンＶと特異的に交差するものであることを特徴とす
る、ヒト、イヌ及び前記免疫された哺乳動物と異種の哺
乳動物のアネキシンＶ診断用抗体にあり、また、本発明
は、ヒト、イヌ及び前記免疫された哺乳動物と異種の哺
乳動物のアネキシンＶ診断用抗体が、標識化されている
ものであることを特徴とする狭心症及び心筋梗塞診断剤
にあり、さらに、本発明は、イヌの臓器から抽出された
アネキシンＶを、抗原として、前記イヌに対し異種の哺
乳動物に免疫し、この免疫された哺乳動物の血清を塩析
して、粗製免疫グロブリンＧ画分を分離し、塩析により
分離された免疫グロブリンＧ画分をイオン交換クロマト
グラフィにより精製して、ヒトアネキシンＶ、イヌアネ
キシンＶ及び前記免疫された哺乳動物に対し異種の哺乳
動物のアネキシンＶと特異的に交差する抗体を得ること
を特徴とするポリクローナルアネキシンＶ抗体の製造方
法にある。そして、本発明は、イヌの臓器から抽出され
たアネキシンＶを、抗原として、前記イヌに対し異種の
哺乳動物に免疫し、この免疫された哺乳動物の血清を塩
析して、粗製免疫グロブリンＧ画分を分離し、塩析によ
り分離された免疫グロブリンＧ画分をイオン交換クロマ
トグラフィにより精製して得られたヒトアネキシンＶ、
イヌアネキシンＶ及び前記免疫された哺乳動物以外の哺
乳動物のアネキシンＶと特異的に交差するポリクローナ
ルアネキシンＶ抗体を、一次抗体とし、摘出された心筋
細胞と反応させ、この反応させた心筋細胞にビオチン標
識された二次抗体を反応させ、この反応させた心筋細胞
を酵素標識法により標識することを特徴とするヒト、イ
ヌ及び前記免疫された哺乳動物に対し異種の哺乳動物の
心筋細胞障害の診断方法にあり、また、本発明は、イヌ
の臓器から抽出されたアネキシンＶを、抗原として、前
記イヌに対し異種の哺乳動物に免疫し、この免疫された
哺乳動物の血清を塩析して、粗製免疫グロブリンＧ画分
を分離し、塩析により分離された免疫グロブリンＧ画分
をイオン交換クロマトグラフィにより精製して得られた
ヒトアネキシンＶ、イヌアネキシンＶ及び前記免疫され
た哺乳動物に対し異種の哺乳動物のアネキシンＶと特異
的に交差するポリクローナルアネキシンＶ抗体を、標識
化し、この標識化されたポリクローナル抗体を、試料血
清に加え、吸光光度を測定して、血中のアネキシンＶ濃
度を測定することを特徴とするヒト、イヌ及び前記免疫
された哺乳動物に対し異種の哺乳動物の血中のアネキシ
ンＶの測定方法にあり、さらに、本発明は、イヌの臓器
から抽出されたアネキシンＶを、抗原として、前記イヌ
に対し異種の哺乳動物に免疫し、この免疫された哺乳動
物の血清を塩析して、粗製免疫グロブリンＧ画分を分離
し、塩析により分離された免疫グロブリンＧ画分をイオ
ン交換クロマトグラフィにより精製して得られたヒトア
ネキシンＶ、イヌアネキシンＶ及び前記免疫された哺乳
動物に対し異種の哺乳動物のアネキシンＶと特異的に交
差するポリクローナルアネキシンＶ抗体を、標識化し、
この標識化されたポリクローナル抗体を、試料血清に加
え、吸光光度を測定して、血中のアネキシンＶ濃度を測
定することを特徴とする狭心症及び心筋梗塞の診断方法
にある。

【０００７】本発明において、ヒトアネキシンＶ抗原に
対して特異的に交差する抗体を得るための抗原タンパク
質のアネキシンＶは、イヌ、特にビーグル犬の心臓、腎
臓、肝臓、肺臓などの臓器から抽出することができる。

【０００８】また、本発明において、ヒトアネキシンＶ
抗原、特に、ヒト心筋アネキシンＶ抗原に対する抗体の
特異的交差反応性は、抗原タンパク質のアネキシンＶで
免疫された他の動物種の免疫グロブリンＧ画分ごとに相
違するので、前記免疫された他の動物種の血清から得ら
れた免疫グロブリンＧ画分からの抗体の夫々について、
ヒトアネキシンＶとの交差反応性を調べることが必要で
ある。本発明において、ヒトアネキシンＶ及びイヌアネ
キシンＶと特異的に交差する抗アネキシンＶポリクロー
ナル抗体は、例えば、ビーグル犬の心筋より抽出され、
精製されたイヌ心筋アネキシンＶ抗原に免疫されたウサ
ギの血清の免疫グロブリンＧ画分から精製して得ること
ができる。本発明において、ヒトアネキシンＶ及びイヌ
アネキシンＶと特異的に交差する抗アネキシンＶポリク
ローナル抗体が容易に得られる哺乳動物としては、ラッ
ト、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ及びヤギなどを
あげることができる。

【０００９】本発明においては、精製アネキシンＶ抗原
は、例えば、ビーグル犬の心筋より抽出することができ
る。このイヌ心筋アネキシンＶ抗原に対し特異的交差反
応性を有する抗体は、本発明においては、例えば、前記
精製アネキシンＶ抗原をウサギに免疫し、この免疫され
たウサギの血清から作ることができる。このウサギの血
清から得られた抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクロ
ーナル抗体は、例えば、ヒト心筋アネキシンＶ、イヌ心
筋アネキシンＶ及びラット心筋アネキシンＶと特異的に
交差反応するものである。

【００１０】本発明において、このウサギの血清から、
抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクローナル抗体を含
む免疫グロブリンＧ画分を精製して、抗イヌ心筋アネキ
シンＶウサギポリクローナル抗体を作ることができる。
さらに、この抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクロー
ナル抗体にＨＲＰ標識を結合させて、ＨＲＰ標識抗イヌ
心筋アネキシンＶウサギポリクローナル抗体を作ること
ができる。このＨＲＰ標識抗イヌ心筋アネキシンＶウサ
ギポリクローナル抗体は、エライザ法（ＥＬＩＳＡ）に
よるヒト血液中のアネキシンＶの測定に用いることがで
きる。この方法により測定されたアネキシンＶの血中濃
度値は、心筋梗塞症及び狭心症に相関性を有しているこ
とが確かめられたので、前記抗イヌ心筋アネキシンＶウ
サギポリクローナル抗体は、心筋梗塞症及び狭心症の診
断に有用である。

【００１１】本発明においては、アネキシンＶをビーグ
ル犬の心臓より精製して、ヒトアネキシンＶと特異的に
交差反応する抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクロー
ナル抗体を作成したが、精製アネキシンＶは、心臓以外
にも、肺臓、腎臓又は肝臓また免疫する動物種もウサギ
に限らず、例えば、ラツト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ
及びヤギなどの哺乳動物でヒトアネキシンＶに特異的に
交差するものは使用できる。

【００１２】また、当然のことながら、ポリクローナル
抗体に限らずモノクローナル抗体を作成しても血中濃度
の測定が出来る。また、抗イヌ心筋アネキシンＶウサギ
ポリクローナル抗体は、標識化されたアネキシンＶを使
用することにより、アネキシンＶの測定を行うことがで
きる。この抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクローナ
ル抗体によるアネキシンＶの血中濃度の測定は、酵素免
疫法（ＥＩＡ法）に限らず、ラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ法）、ルミネッセンス・イムノアッセイ法（Ｌ
Ｉ法）などの測定法によっても行うことができる。

【００１３】また、本発明の臨床応用としては、心臓に
限らず腎臓、肝臓、肺臓などの臓器における急激な細胞
傷害を起こす疾患の場合、及びアネキシンファミリーが
存在する臓器、組織の壊死の場合に診断ができる。

【００１４】

【作用】本発明によると、ヒトアネキシンＶ、イヌアネ
キシンＶ及びラットアネキシンＶと特異的に交差する抗
イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクローナル抗体が、イ
ヌの臓器に含有されるアネキシンＶ抗原に対して免疫さ
れたウサギの粗製免疫グロブリンＧ画分を精製すること
により、簡単且つ容易に得ることができる。本発明にお
いて、ヒトの血中及び組織中に存在する心筋アネキシン
Ｖの量が、心筋梗塞及び狭心症の病態と関係を有するの
で、抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクローナル抗体
を標識化することにより、血中又は組織中に存在するア
ネキシンＶの測定及び検査に使用して、心筋梗塞及び狭
心症の診断に利用することができる。

【００１５】

【実施例】以下、本発明の実施の態様について、例をあ
げて説明するが、本発明は以下の例示及び説明の内容に
より、何らの制限を受けるものではない。 例１． １．心筋からのアネキシンＶの精製方法 雄性ビーグル成犬（１０ｋｇ）２匹をペントバルビター
ル１５ｍｇ／ｋｇで静注麻酔後、屠殺し、心臓を摘出し
た。カニューレを冠動脈に挿入し、血液を洗い出し、左
心室心筋を取り出し、結合織や脂肪を取り除いた後、は
さみで細かく裁断した。これらの操作は氷上または４℃
の温度下で行った。心筋重量あたり１０倍量の緩衝液Ａ
〔２５０ｍＭのスクロース，０．５ｍＭのエチレングリ
コールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧ
ＴＡ），１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）， １０ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン）ＨＣＬ，ｐＨ ７．４〕を入
れ、スイス連邦のキネマティカ社（ｋｉｎｅｍａｔｉｃ
ａ）製のポリトロンホモジェナイザーを使用してホモジ
ェナイズした後、ホモジェネートを、３，０００×ｇ
で，１５分間遠心分離した。その上清に、終濃度が２ｍ
Ｍになるように、ＣａＣｌ_２の１Ｍ溶液を加えて混合
し、混和後、２８，０００×ｇで、１時間遠心分離し、
その沈殿に、１０ｍＭのＥＧＴＡを２ｍｌ加えて、該沈
殿を懸濁させた。この沈殿の懸濁液を２８，０００×ｇ
で，１時間で遠心分離した。

【００１６】この上清を、ゲル濾過カラムであるファー
マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製のセフアクリル（Ｓ
ｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００（商品名）にかけ、緩衝
液Ｂ〔（０．１ＭＮａＣｌ，３０ｍＭトリス（ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４）〕で溶出した。３５ｋＤａタ
ンパク質を含む画分を集め、陰イオン交換カラム（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社：バイオゲルアガロース（商品名））にか
け、０乃至０．３Ｍの濃度範囲のＮａＣｌを含有する１
０ｍＭトリス塩酸溶液ｐＨ７．４を溶離液として、Ｎａ
Ｃｌ濃度に段階的に勾配をかけて溶離を行うことにより
分離精製した。

【００１７】精製されたタンパク質に、リシルエンドペ
プチアーゼを加え、３７℃の温度下に、１５時間放置
し、タンパク質とリシルエンドペプチアーゼの反応によ
り得られたペプチドを、米国アプライドバイオシステム
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）社製
のエドマン法（Ｅｄｍａｎ Ｐ．著『Ａ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ａｍｉｎｏａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｓｅ ｉｎ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ』 Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ １９４９年発行；第２２巻：第４７５頁
参照）によるアミノ酸配列分析装置〔ガスフェーズプロ
テインシーケンサモデル４７３Ａ（Ｇａｓ−ｐｈａｓｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ
４７３Ａ（商品名））を用いて二つの部分アミノ酸配列
を分析し、ＫＷＧＴＤＥＥＫのアミノ酸配列とＫＹＭＴ
ＩＳＧＦＱＩＥＥＴＩＤＲＥＴＳＧＮＬＥＱＬＬＬＡＶ
ＶＫのアミノ酸配列とでアネキシンＶと同定した（Ｒｏ
ｂｅｒｔ Ｈｕｂｅｒ他『Ｃｒｙｓｔａｌ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆｈｕｍａ
ｎ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｆｔｅｒ ｒｅｆｉｎｅｍ
ｅｎｔ』及び『Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２；第２
２３巻、第６８３〜７０４頁』参照）。

【００１８】２．抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリク
ローナル抗体の作製方法 精製した前記アネキシンＶを抗原として、ウサギにアネ
キシンＶに対する特異的抗体の作成とその抗体を用いＨ
ＲＰ標識抗体を作成した。 （１）使用動物と方法 本例においては、前記精製したアネキシンＶを抗原とし
て、抗イヌ心筋アネキシンＶウサギポリクローナル抗体
を作製するのに、免疫する動物として、ニュージーラン
ドホワイト種、雌性ウサギ１匹を用いた。ウサギの一般
状態を観察して異常が認められないことを確認した後、
免疫した。免疫されたウサギは温度２４±２℃の飼育室
でケージに収容して飼育した。免疫方法は、ソーフロニ
ウら（Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ ＭＶ他著『Ａ ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆｈｉｇｈ ｑｕｌｉｔｙ ａｎｔｉ
ｓｅｒａ ｔｏ ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｏｒ
ｍｏｎｅｓ』（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｚ Ａｎａｌ Ｃ
ｈｅｍ １９７８年発行、第２９０巻、第１６３頁）の
方法に準じて行った。すなわちアネキシンＶとディフコ
ラボラトリス（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥ
Ｓ）製の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）又は不
完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を１：１（Ｖ／
Ｖ）の割合で混合し、油中水型のエマルシヨンを調製
し、ウサギの背部皮内２０カ所以上に投与して免疫し
た。

【００１９】第１回の免疫は、アネキシンＶ０．８ｍｇ
を含有する１ｍｌのトリス緩衝液に、完全フロイントア
ジュバント（ＦＣＡ）１．０ｍｌを混合し、第２回免疫
から第７回免疫まで、２週毎に、アネキシンＶ０．２５
ｍｇを含有する０．３ｍｌトリス緩衝液に、不完全フロ
イントアジュバント０．５ｍｌを混合し、皮内に投与
し、最終免疫後、１週間後に全採血した。得られた抗イ
ヌアネキシンＶウサギポリクローナル抗体は、ヒト心筋
ホモジェネートとに含まれるタンパク質の中、ヒトアネ
キシンＶのみと特異的に交叉することを電気泳動後、イ
ムノブロット法により確認した。

【００２０】（２）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製 抗アネキシンＶウサギ血清９．５ｍｌを硫酸アンモニウ
ム塩析法により、即ち、抗アネキシンＶウサギ血清９．
５ｍｌを、５５％の硫酸アンモニウム溶液で処理し、生
成した沈殿物を緩衝液で溶解し、３３％の硫酸アンモニ
ウム溶液で処理し、生成した沈殿物を緩衝液で溶解し、
再び２０％の硫酸アンモニウム溶液で処理し、上清を分
離し、３３％の硫酸アンモニウム溶液で処理して、粗Ｉ
ｇＧ画分（３６．２ｍｇ）を得た。さらに、このＩｇＧ
画分を、溶離液として、ｐＨ８．０の２０ｍＭのリン酸
ナトリウム緩衝液を使用して、陰イオン交換カラムを使
用して、素通り画分をＩｇＧ画分（１３．８ｍｇ）とし
て分離した。

【００２１】例２． ＨＲＰ標識（過ヨウ素酸法） 精製された前記免疫グロブリンＧの、ＨＲＰ（ｈｏｒｓ
ｅ−ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗体を
作成するために、ＨＲＰ４ｍｇを４ｍＭの過沃素酸ナト
リウム溶液下で処理し、これに抗アネキシンＶＩｇＧ画
分６ｍｇを加え、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．２）の中で、２５℃３時間反応させた。（反応時Ｈ
ＲＰ／ＩｇＧのモル比＝２．５）

【００２２】得られたＨＲＰ標識抗アネキシンＶ抗体の
容量、濃度、標識率は以下の通りであった。 容量：７ｍｌ 濃度：０．７ｍｇ／ｍｌ 標識率：ＨＲＰ／ＩｇＧモル比＝１．１４ 緩衝液：１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４），０．１５ＭのＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌのウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）

【００２３】例３． ヒト突然死における心筋細胞障害の診断に、イヌ心筋よ
り精製したアネキシンＶ−ウサギポリクローナル抗体を
用いて、免疫組織学的に調べる方法について （１）対象 剖検で明らかな死因を特定できず、通常の染色で心筋に
変化を認めない急死例１例で検討した。年齢は４６才、
男性、心重量３１０ｇであった。解剖で得た心筋ブロッ
クを１０％ホルマリンで固定後、脱水、脱肪し、パラフ
インで包埋し、５ミクロンで薄切した。また、正常対照
例として熱傷で死亡した、５０才、男性の心臓を用い
た。

【００２４】（２）ヒトアネキシンＶ抗体の免疫組織学
的方法 例１でイヌ心筋より精製したアネキシンＶ抗原をウサギ
に感作し、抗イヌ心筋アネキシンＶ−ウサギポリクロー
ナル抗体を作製した。ウエスタンブロット法でこの抗体
がヒト心筋と交叉することを確認した。

【００２５】（３）アネキシンＶの免疫組織学染色法 脱パラフィン後、一次抗体は、上記の抗イヌ心筋アネキ
シンＶ−ウサギポリクローナル抗体（５００倍に希釈）
を用い、室温で１５分間放置した。二次抗体として、ピ
オチン標識抗ウサギ及びマウスイムノグロビン・ヤギ抗
体 （ＤＡＫＯ社：２００倍に希釈）を用い、室温で１
５分間反応させた後、ＬＳＡＢキットユニバーサル／Ｈ
ＲＰ標識染色システム（ＤＡＫＯ）により、ジアミノベ
ンチジンで発色させた。

【００２６】（４）結果 アネキシンＶ抗体を用いた検討で、対照（正常心筋）で
は、アネキシンＶは、細胞質にほぼ均一に染色された。
その２００倍に拡大した組織図を図１に示す。一方、突
然死では、アネキシンＶは、細胞質に不均一な濃淡で染
色された。その２００倍に拡大した組織図を図２に示
す。正常心筋と突然死の心筋との差は、組織学的染色の
上で明確であった。図１及び図２において、濃い黒色の
部分がアネキシンＶを示しており、突然死の心筋には、
アネキシンＶの凝集が顕著である。このように、抗イヌ
心筋アネキシンＶ−ウサギポリクローナル抗体を用いた
アネキシンＶの免疫組織学染色法は、心臓性突然死の診
断に有効である。

【００２７】例３． （１）エライザ（ＥＬＩＳＡ）法による健康正常人、心
筋梗塞患者の血中濃度の測定法 ９６ウェルの平底ＥＬＩＳＡ用プレート（ｋｏｒｎｉｎ
ｇ社）の各ウェルに、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．４）に溶解した抗アネキシンＶウサギ血清Ｉ
ｇＧ画分２０μｇ／３０μｌを加えて、室温に２時間静
置した。０．０５％のトゥイーン系非イオン性界面活性
剤のＴｗｅｅｎ−２０（市販名），３％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄
し、ついで３％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに１００
μｌ加え、３７℃、１時間インキュベーションした。

【００２８】その後、健康正常人あるいは心筋梗塞患者
血清を各ウェルに６０μｌ添加し、３７℃、１時間イン
キュベーションした。洗浄後、ＨＲＰ標識抗イヌアネキ
シンＶウサギ抗体３０μｌを各ウェルに添加し、３７
℃、１時間インキュベーションした。各ウェルを５回Ｐ
ＢＳで洗浄後、発色剤のオルトフェニレンジアミン塩酸
１錠を、発色剤溶解液（小野薬品：キット、イムノボー
ルＩＢ−５０（商品名））５ｍｌを用いて、発色前３０
分以内に混合溶解し、各ウェルに０．１ｍｌを加え、暗
所室温に３０分間静置した。６Ｎ硫酸により反応を停止
し、各ウェルの吸光度波長４９２ｎｍでＥＩＡ ｒｅａ
ｄｅｒ（ＥＬＳＩＡ、国際試薬社）（商品名）で測定し
た。別に１で得られた精製イヌ心筋アネキシンＶを用い
て標準線を求め、血中濃度を算出した。

【００２９】（２）測定値 健康正常人６名：男３、女３名 （平均年齢３０歳）、
発症後７時間の急性心筋梗塞疾患者の発症後の経時的な
アネキシンＶの血中濃度の推移は、以下に示すとおりで
あった。また、この患者について、現在、最も一般的に
おこなわれているクレアチンキナーゼ（ＣＫ）値を経時
的に測定し、アネキシンＶの値と比較対比した。採血
は、例３の場合と同様であり、上腕静脈よりヘパリンを
加えた容器内に、静脈血を１ｍｌ採血し、血清１ｍｌに
含まれるアネキシンＶの量をｎｇ／ｍｌ単位で測定し
た。

【００３０】

【００３１】 心筋梗塞疾患者の血中アネキシンＶ濃度とＣＫ値（５１歳、男、発症７時間後 の急性前壁梗塞の患者） アネキシンＶ（ｎｇ／ｍｌ） ＣＫ（ＩＵ／ｍｌ） 発症７時間後 ７５．２ １８４ 発症９時間後 ７３．６ ２４０ 発症１２時間後 ７０．０ ４１８ 発症１５時間後 ５４．８ ６０７ 発症１８時間後 ５１．６ ７０１ 発症２１時間後 ３７．２ ９０４ 発症２４時間後 ４６．４ ８３６ 健康正常人のアネキシンＶの血中濃度（ｎｇ／ｍｌ）
は、最小値４．４〜最大値１６．０平均９．８であっ
た。心筋梗塞症では発症７時間後、７５．２で正常値の
７．６倍を示した。その後時間経過とともに低下した
が、２４時間後も４６．４となお正常値の約４．７倍の
高値であった。ＣＫは発症６時間では有意の心筋梗塞と
診断できる値（正常値に２倍以上）に達しておらず、ア
ネキシンＶの血中濃度測定が心筋梗塞の早期診断に有用
であること示した。

【００３２】狭心症患者の血中アネキシンＶ濃度とＣＫ
値を調べるために、狭心症の患者（７０歳、女）の発症
後の経時的なアネキシンＶの血中濃度の推移は以下に示
すとおりであった。またこの患者について、現在、最も
一般的におこなわれているクレアチンキナーゼ（ＣＫ）
値を経時的に測定し、アネキシンＶの値と比較対比し
た。採血は、上腕静脈より、ヘパリンを加えた容器内
に、静脈血を１ｍｌ採血し、血清１ｍｌに含まれるアネ
キシンＶの量をｎｇ／ｍｌの単位で測定した。 ２０分後のアネキシンＶ、ＣＫ値はいずれも正常範囲で
あった。しかし、６時間後、アネキシンＶは４４で正常
値の４．５倍の異常値を示したが、ＣＫはなお正常範囲
であった。この例はＣＫの最大値が２２４で正常値の２
倍以下であり、狭心症と診断されたが、アネキシンＶは
ＣＫに比べ、早期にピークを示し、狭心症の診断に有用
であることを示した。

【００３３】

【発明の効果】本発明は、イヌ、例えばビーグル犬の臓
器、例えば心臓に含有されるアネキシンＶ抗原に対して
免疫されたウサギの血清から精製された抗アネキシンＶ
ポリクローナル抗体を提供するものであり、この本発明
による抗アネキシンＶ抗体は、ヒトアネキシンＶ、イヌ
アネキシンＶ及びラットアネキシンＶと特異的に交差す
る抗体であり、新規な抗アネキシンＶ抗体である。

【００３４】本発明による抗アネキシンＶ抗体は、イ
ヌ、特にビーグル犬心筋より抽出され且つ精製された抗
アネキシンＶ抗原を、イヌに対して異種の哺乳動物の、
例えばウサギに免疫し、この免疫されたウサギの血清か
ら、塩析及びイオン交換等の精製手段により精製するこ
とにより、容易に且つ簡単に作製できるものであり、需
要に応じることが容易である。本発明は、ヒトのヒトア
ネキシンＶと特異的に交叉する特異性を有しており、ヒ
トの心筋壊死及び虚血性障害などにより血中に漏出する
ヒトアネキシンＶと特異的に交差して、血中のヒトアネ
キシンＶ濃度の測定を可能にし、心筋梗塞症及び狭心症
の診断を可能にするものである。

【００３５】本発明は、ヒトのヒトアネキシンＶと特異
的に交叉する特異性を有しており、ヒトの心筋壊死及び
虚血性障害などにより血中又は心筋標本に現れるヒトア
ネキシンＶと特異的に交差して、ヒトアネキシンＶの確
認を可能にする。心筋からのアネキシンＶの漏出は、比
較的早期の心筋梗塞症、及び狭心症にみられるので、心
筋梗塞症の診断を比較的早期に行うことができ、また狭
心症の診断を行うことができ、さらに測定に要する時間
も比較的短時間である。したがって、本発明による、血
中及び心筋組織についての、アネキシンＶの分析及び検
出は、心筋梗塞症の早期診断及び狭心症の診断、並びに
心筋梗塞症及び狭心症の病勢及び治療効果の判定に寄与
するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の心筋細胞障害の診断方法の実施例にお
いて、対照（正常心筋）でアネキシンＶが細胞質にほぼ
均一に染色されていることを示す、２００倍に拡大した
組織図である。

【図２】本発明の心筋細胞障害の診断方法の実施例にお
いて、突然死の心筋で、アネキシンＶが、細胞質に不均
一な凝集となって染色されていることを示す、２００倍
に拡大した組織図を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】本発明の心筋細胞障害の診断方法の実施例にお
いて、対象（正常心筋）でアネキシンＶが細胞質にほぼ
均一に染色されていることを示す、２００倍に拡大し
た、組織の顕微鏡写真である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】本発明の心筋細胞障害の診断方法の実施例にお
いて、突然死の心筋で、アネキシンＶが、細胞質に不均
一にな凝集となって染色されていることを示す、２００
倍に拡大した、組織の顕微鏡写真である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】（４）結果 アネキシンＶ抗体を用いた検討で、対照（正常心筋）で
は、アネキシンＶは、細胞質にほぼ均一に染色された。
その２００倍に拡大した組織の写真を図１に示す。一
方、突然死では、アネキシンＶは、細胞質に不均一な濃
淡で染色された。その２００倍に拡大した組織の写真を
図２に示す。正常心筋と突然死の心筋との差は、組織学
的染色の上で明確であった。図１及び図２において、濃
い黒色の部分がアネキシンＶを示しており、突然死の心
筋には、アネキシンＶの凝集が顕著である。このよう
に、抗イヌ心筋アネキシンＶ−ウサギポリクローナル抗
体を用いたアネキシンＶの免疫組織学染色法は、心臓性
突然死の診断に有効である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イヌの臓器に含有されるアネキシンＶ抗
   原に対して免疫された、前記イヌに対し異種の哺乳動物
   の血清から精製されたポリクローナル抗体であって、ヒ
   トアネキシンＶ、イヌアネキシンＶ及び前記免疫された
   哺乳動物と種が相違する哺乳動物のアネキシンＶと特異
   的に交差するものであることを特徴とする、ヒト、イヌ
   及び前記免疫された哺乳動物と異種の哺乳動物のアネキ
   シンＶ診断用抗体。
2. 【請求項２】 ヒト、イヌ及び前記免疫された哺乳動物
   と異種の哺乳動物のアネキシンＶ診断用抗体が、標識化
   されているものであることを特徴とする狭心症及び心筋
   梗塞用診断剤。
3. 【請求項３】 イヌの臓器から抽出されたアネキシンＶ
   を、抗原として、前記イヌに対し異種の哺乳動物に免疫
   し、この免疫された哺乳動物の血清を塩析して、粗製免
   疫グロブリンＧ画分を分離し、塩析により分離された免
   疫グロブリンＧ画分をイオン交換クロマトグラフィによ
   り精製して、ヒトアネキシンＶ、イヌアネキシンＶ及び
   前記免疫された哺乳動物に対し異種の哺乳動物のアネキ
   シンＶと特異的に交差する抗体を得ることを特徴とする
   ポリクローナルアネキシンＶ抗体の製造方法。
4. 【請求項４】 イヌの臓器から抽出されたアネキシンＶ
   を、抗原として、前記イヌに対し異種の哺乳動物に免疫
   し、この免疫された哺乳動物の血清を塩析して、粗製免
   疫グロブリンＧ画分を分離し、塩析により分離された免
   疫グロブリンＧ画分をイオン交換クロマトグラフィによ
   り精製して得られたヒトアネキシンＶ、イヌアネキシン
   Ｖ及び前記免疫された哺乳動物以外の哺乳動物のアネキ
   シンＶと特異的に交差するポリクローナルアネキシンＶ
   抗体を、一次抗体とし、摘出された心筋細胞と反応さ
   せ、この反応させた心筋細胞にビオチン標識された二次
   抗体を反応させ、この反応させた心筋細胞を酵素標識法
   により標識することを特徴とするヒト、イヌ及び前記免
   疫された哺乳動物に対し異種の哺乳動物の心筋細胞障害
   の診断方法。
5. 【請求項５】 イヌの臓器から抽出されたアネキシン
   Ｖを、抗原として、前記イヌに対し異種の哺乳動物に免
   疫し、この免疫された哺乳動物の血清を塩析して、粗製
   免疫グロブリンＧ画分を分離し、塩析により分離された
   免疫グロブリンＧ画分をイオン交換クロマトグラフィに
   より精製して得られたヒトアネキシンＶ、イヌアネキシ
   ンＶ及び前記免疫された哺乳動物に対し異種の哺乳動物
   のアネキシンＶと特異的に交差するポリクローナルアネ
   キシンＶ抗体を、標識化し、この標識化されたポリクロ
   ーナル抗体を、試料血清に加え、吸光光度を測定して、
   血中のアネキシンＶ濃度を測定することを特徴とするヒ
   ト、イヌ及び前記免疫された哺乳動物に対し異種の哺乳
   動物の血中のアネキシンＶの測定方法。
6. 【請求項６】 イヌの臓器から抽出されたアネキシン
   Ｖを、抗原として、前記イヌに対し異種の哺乳動物に免
   疫し、この免疫された哺乳動物の血清を塩析して、粗製
   免疫グロブリンＧ画分を分離し、塩析により分離された
   免疫グロブリンＧ画分をイオン交換クロマトグラフィに
   より精製して得られたヒトアネキシンＶ、イヌアネキシ
   ンＶ及び前記免疫された哺乳動物に対し異種の哺乳動物
   のアネキシンＶと特異的に交差するポリクローナルアネ
   キシンＶ抗体を、標識化し、この標識化されたポリクロ
   ーナル抗体を、試料血清に加え、吸光光度を測定して、
   血中のアネキシンＶ濃度を測定することを特徴とする狭
   心症及び心筋梗塞の診断方法。