JPH02156898A - 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 - Google Patents
抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法Info
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- JPH02156898A JPH02156898A JP63308776A JP30877688A JPH02156898A JP H02156898 A JPH02156898 A JP H02156898A JP 63308776 A JP63308776 A JP 63308776A JP 30877688 A JP30877688 A JP 30877688A JP H02156898 A JPH02156898 A JP H02156898A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、低密度型C以下、LD型と略記する)ヘパラ
ン硫酸プロテオグリカンに対して特異性の高いモノクロ
ーン抗体、それを産生ずる細胞ならびに基底膜の異常ま
たは損傷を伴う腎炎、アルツハイマー病および動脈硬化
症の診断のために、そのモノクローン抗体を用いるLD
型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法に関するも
のである。
ン硫酸プロテオグリカンに対して特異性の高いモノクロ
ーン抗体、それを産生ずる細胞ならびに基底膜の異常ま
たは損傷を伴う腎炎、アルツハイマー病および動脈硬化
症の診断のために、そのモノクローン抗体を用いるLD
型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法に関するも
のである。
[従来の技術とその課題]
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(以下rH3−PGJと
いう)は、動物の組織におけるその分布や機能の違いか
ら、細胞表層型および基底膜型の2種の系列に分類され
ている(Stow et al、、Proc。
いう)は、動物の組織におけるその分布や機能の違いか
ら、細胞表層型および基底膜型の2種の系列に分類され
ている(Stow et al、、Proc。
Natl、Acad、Sci、USA、82:3296
−3300 :J、Ce1l Biol。
−3300 :J、Ce1l Biol。
10(1:975−980.1985a、1Q85b
: Jalkanen et al、、J。
: Jalkanen et al、、J。
Ce1l Biol、1O1:976−984 .1
9851゜基底膜型H3−PGに対する抗体は、マウス
のEngelbreth−Ho1m−5warm腫瘍(
以下、rEH3腫瘍」という)組織由来のものに対して
、最初に、BM−1種体として調製された(Hasse
l et al、。
9851゜基底膜型H3−PGに対する抗体は、マウス
のEngelbreth−Ho1m−5warm腫瘍(
以下、rEH3腫瘍」という)組織由来のものに対して
、最初に、BM−1種体として調製された(Hasse
l et al、。
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 US
A、 77 : 4494−4498.19801゜こ
れらの抗体を用いた免疫組織化学的研究により、抗原は
、種々の組織中に普遍的に存在する成分H3−PGであ
ることが示唆された(Hasselet al、、Pr
oc、Natl、Acad、Sci、USA、77:4
494−4498゜1980 : Kimata et
al、、J、Embryol、Exp、Morph、
89:243−257.1985 ; Theslef
f et al、、Dev、Biol、81:182−
192.1!181)。
A、 77 : 4494−4498.19801゜こ
れらの抗体を用いた免疫組織化学的研究により、抗原は
、種々の組織中に普遍的に存在する成分H3−PGであ
ることが示唆された(Hasselet al、、Pr
oc、Natl、Acad、Sci、USA、77:4
494−4498゜1980 : Kimata et
al、、J、Embryol、Exp、Morph、
89:243−257.1985 ; Theslef
f et al、、Dev、Biol、81:182−
192.1!181)。
しかしながら、その後、E HS腫瘍に存在する[(S
−PGは低密度型(以下、rLD型」という)および高
密度型(以下、rHD型」という)の2種の形状に分類
されることが判明しくDziadeket al、、E
ur、Mo1.Biol、Organ、J、4:905
−912.1985;Fujiwara et al、
、Eur、、1.Biochem、143 :145−
157゜1984; t(aseLl st al、、
J、Biol、chem、260 : 8098−81
(15,19851、さらに、最近、LD型とHD型と
はコア蛋白部分およびグリコサミノグリカンの糖鎖構造
のいずれにおいても異分子であることが、本発明者らに
よって明らかにされた(Kato et al、。
−PGは低密度型(以下、rLD型」という)および高
密度型(以下、rHD型」という)の2種の形状に分類
されることが判明しくDziadeket al、、E
ur、Mo1.Biol、Organ、J、4:905
−912.1985;Fujiwara et al、
、Eur、、1.Biochem、143 :145−
157゜1984; t(aseLl st al、、
J、Biol、chem、260 : 8098−81
(15,19851、さらに、最近、LD型とHD型と
はコア蛋白部分およびグリコサミノグリカンの糖鎖構造
のいずれにおいても異分子であることが、本発明者らに
よって明らかにされた(Kato et al、。
J、Biol、Chem、、 262.7180−71
88(1987))。
88(1987))。
すなわち、LD型1(S−PGは1本のコア蛋白分子(
M r =450.000:結合オリゴ糖鎖の量の差に
よりM r = 360.000のものも含まれる)に
ヘパラン硫酸を結合した巨大なプロテオグリカンであり
、他方、HD型は4種の異なった分子サイズのコア蛋白
分子(M r = 34.000.29.000.27
. (]I)0.21.000)からなる小さなプロテ
オグリカンであり、そのほとんどにヘパラン硫酸および
コンドロイチン硫酸を結合しているものである。
M r =450.000:結合オリゴ糖鎖の量の差に
よりM r = 360.000のものも含まれる)に
ヘパラン硫酸を結合した巨大なプロテオグリカンであり
、他方、HD型は4種の異なった分子サイズのコア蛋白
分子(M r = 34.000.29.000.27
. (]I)0.21.000)からなる小さなプロテ
オグリカンであり、そのほとんどにヘパラン硫酸および
コンドロイチン硫酸を結合しているものである。
このLD型H5−PGは、ヒトをはじめ多くの動物組織
の基底膜に特異的な成分であって、各種動物組織の構造
的、代謝的異常は基底膜の機能異常を引き起こすことが
インビトロの実験で証明されているので、各動物固有の
LD型H3−PGの存在状況を検出することができれば
、基底膜異常を伴うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、
動脈硬化症、種々の腫瘍、アルツハイマー病等の病理検
査の手段に活用できる点で有用である。
の基底膜に特異的な成分であって、各種動物組織の構造
的、代謝的異常は基底膜の機能異常を引き起こすことが
インビトロの実験で証明されているので、各動物固有の
LD型H3−PGの存在状況を検出することができれば
、基底膜異常を伴うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、
動脈硬化症、種々の腫瘍、アルツハイマー病等の病理検
査の手段に活用できる点で有用である。
一方、該HK−102抗体を用いて種の異なる動物、例
えばヒトの組織中のLD型H5−PGの存在分布の確認
が可能か否かについては、通常、マウス由来のHS−P
Gと他種動物のHS−PGとは分子構造が異なると考え
られ、構造認識性(特異性)の高いMo−Ab/)(K
−102により交差反応が起こらないと考えられる。
えばヒトの組織中のLD型H5−PGの存在分布の確認
が可能か否かについては、通常、マウス由来のHS−P
Gと他種動物のHS−PGとは分子構造が異なると考え
られ、構造認識性(特異性)の高いMo−Ab/)(K
−102により交差反応が起こらないと考えられる。
しかし、本発明者らの知見によれば、驚くべきことに、
ヒトのアルツハイマー病患者の脳組織細胞所見において
、アミロイド繊維部分に、正常者にみられないHK−1
02の免疫組織染色像が確認された。このことは、ヒト
の基底膜の成分が疾病に伴い異性化し、構造的にマウス
のHS−PGと近似構造に変換されたことを示唆する。
ヒトのアルツハイマー病患者の脳組織細胞所見において
、アミロイド繊維部分に、正常者にみられないHK−1
02の免疫組織染色像が確認された。このことは、ヒト
の基底膜の成分が疾病に伴い異性化し、構造的にマウス
のHS−PGと近似構造に変換されたことを示唆する。
したがって、HK−102を用い、ヒトの病理組織のL
D型HS−PGを検出することにより、基底膜異常を伴
うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、動脈硬化症1種々
の腫瘍、アルツハイマー病等の診断に有用な方法となり
つる。
D型HS−PGを検出することにより、基底膜異常を伴
うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、動脈硬化症1種々
の腫瘍、アルツハイマー病等の診断に有用な方法となり
つる。
本発明は、HS−PGのLD型に対して特異性の高いモ
ノクローン抗体を産生する細胞を見出し、このモノクロ
ーン抗体を調製し、これを用いて種々の組織におけるH
S−PGのLD型を検出する方法を提供することを目的
とする。
ノクローン抗体を産生する細胞を見出し、このモノクロ
ーン抗体を調製し、これを用いて種々の組織におけるH
S−PGのLD型を検出する方法を提供することを目的
とする。
〔課題を解決するための手段1
本発明は、LD型H3−PGを含有する組織由来のHS
−PGを抗原として予め免疫したラットの脾細胞とマウ
スのミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイ
ブリドーマから産生される抗LD型H5−PGモノクロ
ーン抗体、該モノクローン抗体を産生ずるハイブリドー
マ、および該モノクローン抗体を用いることを特徴とす
るLD型H5−PGの検出方法に関するものである。
−PGを抗原として予め免疫したラットの脾細胞とマウ
スのミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイ
ブリドーマから産生される抗LD型H5−PGモノクロ
ーン抗体、該モノクローン抗体を産生ずるハイブリドー
マ、および該モノクローン抗体を用いることを特徴とす
るLD型H5−PGの検出方法に関するものである。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の目的を達成するための第一段階は、抗体を産生
する新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の3工程から成る。
する新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の3工程から成る。
■、免疫
2 細胞融合
3 ハイブリドーマの選択と単りローン化灸現
本発明において、抗原として用いるH3−PGとしては
、LD型H3−PGを含有する組織、例えばマウスのE
F(S腫瘍組織、マウスの腎、血管、悩等の組織由来の
ものであれば、如何なるものでもよいが、特にLD型H
3−PGに富んだ組織由来のもの、例えばE HS l
li瘍組織組織由来3PGを用いることが好ましい。
、LD型H3−PGを含有する組織、例えばマウスのE
F(S腫瘍組織、マウスの腎、血管、悩等の組織由来の
ものであれば、如何なるものでもよいが、特にLD型H
3−PGに富んだ組織由来のもの、例えばE HS l
li瘍組織組織由来3PGを用いることが好ましい。
免疫動物としては、マウスおよびラットを用いるが、異
種抗原による免疫を行なうことが効率的であるので、マ
ウス抗原の場合にはラットを免疫動物として用いる。
種抗原による免疫を行なうことが効率的であるので、マ
ウス抗原の場合にはラットを免疫動物として用いる。
通常、免疫は数回に分けて行うが、初回免疫はアジュバ
ントと共に投与することが好ましい。
ントと共に投与することが好ましい。
アジュバントとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、
フロインドアジュバント等が使用される。
フロインドアジュバント等が使用される。
細胞融合
最終免疫後にリンパ節或は牌臓を摘出し、得られるリン
パ球を細胞融合に供する。一方、細胞融合に使用される
腫瘍細胞株としては、通常、マウスのB A L B
/ c由来のP 3−N5−1/1−Ag4−1、Ps
X63 Ag8 Ul(P −U l ) 、
P s X 63 A g 8 653、SP2
10−Ag 14等を用いる。
パ球を細胞融合に供する。一方、細胞融合に使用される
腫瘍細胞株としては、通常、マウスのB A L B
/ c由来のP 3−N5−1/1−Ag4−1、Ps
X63 Ag8 Ul(P −U l ) 、
P s X 63 A g 8 653、SP2
10−Ag 14等を用いる。
バイプリドーマの選択と単クローン化
ハイプリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清を種々の分
析法(例えば旧A、プラーク法、凝集反応、ELISA
等)で目的の抗体産生ハイブリドマを選択する。ハイプ
リドーマを得たならクローニングを行う。クローニング
の方法としてはFAC5(Fluorescent A
ctivated Ce1l 5orterl を用い
たり、5oft Agarを用いてコロニーを拾い上げ
る方法の他に、一般によく用いられる限界希釈法等があ
る。クローニングはコロニーが一つのハイブリドーマか
ら形成されるような細胞濃度で行う。
析法(例えば旧A、プラーク法、凝集反応、ELISA
等)で目的の抗体産生ハイブリドマを選択する。ハイプ
リドーマを得たならクローニングを行う。クローニング
の方法としてはFAC5(Fluorescent A
ctivated Ce1l 5orterl を用い
たり、5oft Agarを用いてコロニーを拾い上げ
る方法の他に、一般によく用いられる限界希釈法等があ
る。クローニングはコロニーが一つのハイブリドーマか
ら形成されるような細胞濃度で行う。
限界希釈法では96ウエルプレートの1ウエルあたり細
胞が1個以下になるように行う。どの方法を用いてもク
ローニングは2回繰返し行い、単一クローンとする。
胞が1個以下になるように行う。どの方法を用いてもク
ローニングは2回繰返し行い、単一クローンとする。
抗L D型HS −P Gモノクローン抗体の産生クロ
ーンを確立したなら抗体は大量にin vitr。
ーンを確立したなら抗体は大量にin vitr。
で培養するか、或はin vivoで培養するかによっ
て産生される。in vitroで産生された抗体は他
の抗体の混入はないが抗体価は低い。in vivoで
産生された抗体は宿主抗体が若干混じるが、抗体価はi
n vitroに比し非常に高い。どちらの方法で抗体
を産生させるかは目的による。
て産生される。in vitroで産生された抗体は他
の抗体の混入はないが抗体価は低い。in vivoで
産生された抗体は宿主抗体が若干混じるが、抗体価はi
n vitroに比し非常に高い。どちらの方法で抗体
を産生させるかは目的による。
上記方法により、抗LD型H5−PGモノクロン抗体が
得られる。
得られる。
LD型)TS−PGの検出
抗LD型H5−PGモノクローン抗体を用いて特異的に
LD型)Is−PGを検出するためには、常法に従って
酵素抗体法、蛍光抗体法、重金属抗体法、ビオチン−ア
ビジンシステム、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダー
ゼ法等によって行われる。
LD型)Is−PGを検出するためには、常法に従って
酵素抗体法、蛍光抗体法、重金属抗体法、ビオチン−ア
ビジンシステム、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダー
ゼ法等によって行われる。
[発明の実施例]
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
なお、本発明において、試藁、器具等は、以下のものを
使用した。
使用した。
・ミオシン
フ
・ポリスチレン96穴プレート・・・リンプロ(Lin
bro−Flow Lab、 Hamden) 社製(USA) ・パーオキシダーゼ標識 Protein A (テンマーク) イー・ワイ・ラボラトリーズ (E、Y、Laboratories1社(TJSA)
製 ・FITC標識ヤギ抗ウサギ ・・−カッペル研究所 IgGイムノグロブリン (CappelLabo
ratories 社(USA)製 ・ラットイムノグロブリンの・−・ マイルス(Mil
esモノクローン抗体タイビ Labo、)社(U
SA)ングキット 製 ・ヘパリチナーゼ ・・・ 生化学工業社(日本)製・
抗BMIポリクローン抗体 National In5titute of t(e
alth (USA)のHassel、 Barrac
h およびMartin博士より供与を受けた。
bro−Flow Lab、 Hamden) 社製(USA) ・パーオキシダーゼ標識 Protein A (テンマーク) イー・ワイ・ラボラトリーズ (E、Y、Laboratories1社(TJSA)
製 ・FITC標識ヤギ抗ウサギ ・・−カッペル研究所 IgGイムノグロブリン (CappelLabo
ratories 社(USA)製 ・ラットイムノグロブリンの・−・ マイルス(Mil
esモノクローン抗体タイビ Labo、)社(U
SA)ングキット 製 ・ヘパリチナーゼ ・・・ 生化学工業社(日本)製・
抗BMIポリクローン抗体 National In5titute of t(e
alth (USA)のHassel、 Barrac
h およびMartin博士より供与を受けた。
・ラミニンおよび1■型コラーゲン
E)Isマウス腫瘍からKlelnmanらの方法(B
iochemistry、21 : 6188−619
3.19851により調製。
iochemistry、21 : 6188−619
3.19851により調製。
・抗コラーゲン血清
−Kimataらの方法(J、Embryol、Exp
、Morph、89:243−257.1985)によ
り、マウスEH8Ilffi瘍IV型コラーゲンで免疫
したウサギから調製した。この抗血清はわずかにラミニ
ンと交叉反応を示したので、ラミニン標識セファロース
4Bカラムを通したところ、酵素免疫反応(ELISA
法)および免疫プロット法で調べても、他の基底膜成分
、ラミニン、H3−PGgよび他のコラーゲンとは反応
しなかった。
、Morph、89:243−257.1985)によ
り、マウスEH8Ilffi瘍IV型コラーゲンで免疫
したウサギから調製した。この抗血清はわずかにラミニ
ンと交叉反応を示したので、ラミニン標識セファロース
4Bカラムを通したところ、酵素免疫反応(ELISA
法)および免疫プロット法で調べても、他の基底膜成分
、ラミニン、H3−PGgよび他のコラーゲンとは反応
しなかった。
実施例
+1)H3−PGの調製
EH5腫瘍をマウスに移植して増殖させ、これを摘出し
た。この腫瘍より、J、 R,HasselLらの方法
(J、Biol、Chem、260:8098−810
5.1985)およびKatoらの方法(J、Biol
、Chem、 262ニア180−7188.1987
1に従ってH3−PGを精製し、採取した。
た。この腫瘍より、J、 R,HasselLらの方法
(J、Biol、Chem、260:8098−810
5.1985)およびKatoらの方法(J、Biol
、Chem、 262ニア180−7188.1987
1に従ってH3−PGを精製し、採取した。
すなわち、新鮮な腫瘍組織を、4M グアニジン−HC
l、、50mM トリス−I((12(pH7,4)
、1%(w/vl CHA P S、プロテアーゼ阻害
剤(1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド)、
10mMN−エチルマレイミドおよびlomM ED
TAからなる溶液にて抽出し、抽出液を塩化セシウム沈
降平衡遠心法(初期濃度ρ。=1.35g/m℃)で分
画した。
l、、50mM トリス−I((12(pH7,4)
、1%(w/vl CHA P S、プロテアーゼ阻害
剤(1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド)、
10mMN−エチルマレイミドおよびlomM ED
TAからなる溶液にて抽出し、抽出液を塩化セシウム沈
降平衡遠心法(初期濃度ρ。=1.35g/m℃)で分
画した。
ボトム画分(ρ>1.35g/m氾)をプールし、7M
尿素、50mM ト リス−)ICR(pH7,4
)、0.5%(v/v) )−リドンX100gよび
プロテアーゼ阻害剤(上記と同様)で平衡化したD E
A E 5ephacelカラムに供した。
尿素、50mM ト リス−)ICR(pH7,4
)、0.5%(v/v) )−リドンX100gよび
プロテアーゼ阻害剤(上記と同様)で平衡化したD E
A E 5ephacelカラムに供した。
カラムに結合した成分をO〜0.75MNaCffの直
線濃度勾配により溶出し、H5−PG画分を得た。
線濃度勾配により溶出し、H5−PG画分を得た。
+21 L D型およびE(D型H3−PGの相互 離
は)で得たH3−PGのカラム溶出物のうち、ヘキスロ
ン酸陽性の両分(0,3−0,6MNaCβ溶出画分)
をプールし、4M グアニジン−HCl、50mM
トリス−Hcpt (pH7,4) 、1%h/vl
CHA P Sおよびプロテアーゼ阻害剤(上記と同
様)で平衡化した5epharose CL −4Bカ
ラムに供した。
は)で得たH3−PGのカラム溶出物のうち、ヘキスロ
ン酸陽性の両分(0,3−0,6MNaCβ溶出画分)
をプールし、4M グアニジン−HCl、50mM
トリス−Hcpt (pH7,4) 、1%h/vl
CHA P Sおよびプロテアーゼ阻害剤(上記と同
様)で平衡化した5epharose CL −4Bカ
ラムに供した。
溶出画分(K、v=O−0,5)をプールし、さらにま
た塩化セシウム濃度勾配(ρ、=1.50g/ml2)
で分画し、LD型およびHD型の2つの成分を分離した
。
た塩化セシウム濃度勾配(ρ、=1.50g/ml2)
で分画し、LD型およびHD型の2つの成分を分離した
。
(3)度反凰ユ且1
mで得たHS−PG画分(LDおよびHDの混合物)を
4M グアニジン−HCffおよび100mM トリ
ス−HCl2 (pH8,0)中で、lomM ジチ
オスレイトールを添加して、50°Cで2間接還元処理
した。次いで、終濃度30 m Mになるよう固体ヨー
ドアセトアミドを添加した後、還元処理したHS−PG
の標品を暗所で3時間室温下に放置した。
4M グアニジン−HCffおよび100mM トリ
ス−HCl2 (pH8,0)中で、lomM ジチ
オスレイトールを添加して、50°Cで2間接還元処理
した。次いで、終濃度30 m Mになるよう固体ヨー
ドアセトアミドを添加した後、還元処理したHS−PG
の標品を暗所で3時間室温下に放置した。
還元処理を行なったHS−PGおよび未処理のHS−P
Gをエタノール沈殿法(Kimata et al、。
Gをエタノール沈殿法(Kimata et al、。
J、Biol、Chem、249二1646−1653
.19741 により脱塩し、沈殿物をそれぞれリン酸
緩衝化生理食塩水(PBS)に溶解した。
.19741 により脱塩し、沈殿物をそれぞれリン酸
緩衝化生理食塩水(PBS)に溶解した。
(4)訟
(3)で得られた還元処理したHS−PGおよび未処理
のHS−PGの混合物(各成分は、250μ℃のPBS
中に、タンパク含量として200μgの)Is−PGを
含有)を、等量のフロイント完全アジュバントと混合し
て、5週令のWistar系ラットの皮下に注射して感
作した。次いで、2週間毎に計5回、上記と同様の注射
を行なった。
のHS−PGの混合物(各成分は、250μ℃のPBS
中に、タンパク含量として200μgの)Is−PGを
含有)を、等量のフロイント完全アジュバントと混合し
て、5週令のWistar系ラットの皮下に注射して感
作した。次いで、2週間毎に計5回、上記と同様の注射
を行なった。
各注射後1週間目に採血し、血中の抗体価をELISA
法により調べた。5回の注射により高力価の抗体価(>
50000)になったので、6回目の注射後3日目に、
ラットを殺して肺臓を摘出し、常法により浮遊脾細胞を
得た。
法により調べた。5回の注射により高力価の抗体価(>
50000)になったので、6回目の注射後3日目に、
ラットを殺して肺臓を摘出し、常法により浮遊脾細胞を
得た。
(5)細胞融合およびハイブリドーマの選択こうして得
たラット脾細胞の細胞浮遊液(1,5X108細胞)と
マウスのミエローマNS−1細胞をlo:1の割合で混
合し、ポリエチレングリコール4000を用いて細胞融
合を行った。次いで、この細胞を1.5X105細胞/
ウエルになるようにRPMI培地(10%牛脂児血清お
よびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン含有)
に浮遊させ、96穴の培養プレートに幡種した。
たラット脾細胞の細胞浮遊液(1,5X108細胞)と
マウスのミエローマNS−1細胞をlo:1の割合で混
合し、ポリエチレングリコール4000を用いて細胞融
合を行った。次いで、この細胞を1.5X105細胞/
ウエルになるようにRPMI培地(10%牛脂児血清お
よびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン含有)
に浮遊させ、96穴の培養プレートに幡種した。
ハイブリドーマの培養上清をELISA法により調べ、
免疫原として用いたHS−PGに対して陽性反応を示し
たハイブリドーマを常法によりクローン化し、さらに限
定希釈法で二次クローニングを行なった。
免疫原として用いたHS−PGに対して陽性反応を示し
たハイブリドーマを常法によりクローン化し、さらに限
定希釈法で二次クローニングを行なった。
本実施例において、EL、ISA法は、Ren、nar
dらの方法[A、 B、 B、、−ハ巨、 399 (
198111に従って行なった。
dらの方法[A、 B、 B、、−ハ巨、 399 (
198111に従って行なった。
(6)スクリーニング
(5)により得られたクローン細胞が産生ずる抗体につ
いて、 ELISA法に従いスクリーニングを行い、L
D型HS−PGを識別する細胞株を探した。 ELI
SA法は、Rennardらの方法を若干改良して行な
った。
いて、 ELISA法に従いスクリーニングを行い、L
D型HS−PGを識別する細胞株を探した。 ELI
SA法は、Rennardらの方法を若干改良して行な
った。
すなわち、Voller’S 緩衝液中に、 (2)
で調製したLD型H3−PG、[(D型H3−PG、ラ
ミニン、IV型コラーゲン(タンパクとして各0. 1
μgを含有)をそれぞれ含有する抗原溶液を96穴ポリ
スチレンプレートの各ウェルに添加し、プレートを4℃
で1晩インキエベートした。次いで、溶液を、100u
nPBSおよび1%(V/V)BSAからなる溶液に置
換した後、37℃で1時間インキュベートし、抗体溶液
が非特異的に結合することをブロッキングした。さらに
、ウェルをPBSおよび0,05%(v/vl ツイー
ン2oからなる溶液(PBS/ツイーン)200μ℃で
3回洗浄した。
で調製したLD型H3−PG、[(D型H3−PG、ラ
ミニン、IV型コラーゲン(タンパクとして各0. 1
μgを含有)をそれぞれ含有する抗原溶液を96穴ポリ
スチレンプレートの各ウェルに添加し、プレートを4℃
で1晩インキエベートした。次いで、溶液を、100u
nPBSおよび1%(V/V)BSAからなる溶液に置
換した後、37℃で1時間インキュベートし、抗体溶液
が非特異的に結合することをブロッキングした。さらに
、ウェルをPBSおよび0,05%(v/vl ツイー
ン2oからなる溶液(PBS/ツイーン)200μ℃で
3回洗浄した。
なお、LD型H3−PGのコア蛋白分子を識別対象とす
る場合には、各ウェルは、ブロッキングする前に0.0
1ミリ単位のへバリチナーゼ100uI2 (l 00
mMトリス−HCl2 (pH’L 2)、5mM酢酸
カルシウムおよびプロテアーゼ阻害剤含有)からなる溶
液で処理して(Kat。
る場合には、各ウェルは、ブロッキングする前に0.0
1ミリ単位のへバリチナーゼ100uI2 (l 00
mMトリス−HCl2 (pH’L 2)、5mM酢酸
カルシウムおよびプロテアーゼ阻害剤含有)からなる溶
液で処理して(Kat。
et al、、Anal、Biochem、148 :
479−784.1985)用いた。
479−784.1985)用いた。
次に、プレートの各ウェルに (5)で得られたハイプ
リドーマ培地(p)(を7.4にトリスHCβで調製)
100μ℃を添加し、2時間室温にてインキュベートし
た後、PBS/ツイーンで3回洗浄し、100μβのパ
ーオキシダーゼ標識抗ラットI g (G +M)血清
(終希釈度1:500 PBS/ツイーン)を各ウェ
ルに加え、プレートを室温にて1時間インキュベートし
た。
リドーマ培地(p)(を7.4にトリスHCβで調製)
100μ℃を添加し、2時間室温にてインキュベートし
た後、PBS/ツイーンで3回洗浄し、100μβのパ
ーオキシダーゼ標識抗ラットI g (G +M)血清
(終希釈度1:500 PBS/ツイーン)を各ウェ
ルに加え、プレートを室温にて1時間インキュベートし
た。
それぞれのハイブリドーマの反応性は、パーオキシダー
ゼの結合量を0.03%fV/v)過酸化水素を含む0
.O1%fw/v) o−フェナンスロリンを用いて、
発色量で測定した。ポジティブコントロールとしては、
免疫したラットから得た血清をPBSで1000倍に希
釈した、希釈ラット抗HS−PG抗血清を用いた。非特
異的な発色は、これらの条件下ではほとんどみられなか
った。
ゼの結合量を0.03%fV/v)過酸化水素を含む0
.O1%fw/v) o−フェナンスロリンを用いて、
発色量で測定した。ポジティブコントロールとしては、
免疫したラットから得た血清をPBSで1000倍に希
釈した、希釈ラット抗HS−PG抗血清を用いた。非特
異的な発色は、これらの条件下ではほとんどみられなか
った。
その結果、HK−84および)(K−102と命名した
2つの細胞株がLD型H3−PGおよびヘパリチナーゼ
処理H3−PG (LDのコア蛋白分子)を識別し、H
D型1(S−PG、ラミニン、IV型コラーゲンとは反
応しないことがわかった。
2つの細胞株がLD型H3−PGおよびヘパリチナーゼ
処理H3−PG (LDのコア蛋白分子)を識別し、H
D型1(S−PG、ラミニン、IV型コラーゲンとは反
応しないことがわかった。
なお、HK−84細胞および)IK−102細胞は、公
知の細胞株である。
知の細胞株である。
これらの細胞株が産生ずるモノクローン抗体は、マイル
ス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド(以下「マ
イル又社」という。)のモノクローナルタイピングキッ
トを用いて分析し、クラス丁gGzaと同定された。
ス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド(以下「マ
イル又社」という。)のモノクローナルタイピングキッ
トを用いて分析し、クラス丁gGzaと同定された。
Katoらの方法(Anal、Biochem、148
: 479−784゜19851 に従って、 (2
]で得られたH5−PGのLD型(タンパクとして1μ
g含有)を1ミリ単位のヘパリチナーゼを用いて、37
°Cで1時間処理した。処理後の消化物(LD型H3−
PGのコア蛋白分子)を5%の分離用ゲル(Laemm
li。
: 479−784゜19851 に従って、 (2
]で得られたH5−PGのLD型(タンパクとして1μ
g含有)を1ミリ単位のヘパリチナーゼを用いて、37
°Cで1時間処理した。処理後の消化物(LD型H3−
PGのコア蛋白分子)を5%の分離用ゲル(Laemm
li。
Nature (Land、 l 、 227 :68
0−685.1970)を用いて、非還元状態で、SD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
0−685.1970)を用いて、非還元状態で、SD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
電気泳動後、タンパクはTowbinらの方法(Pro
cNatl−Acad、Sci、USA、76:435
0−4354.19791に従って、ニトロセルロース
膜に移転させた。
cNatl−Acad、Sci、USA、76:435
0−4354.19791に従って、ニトロセルロース
膜に移転させた。
次いで、この膜を0.15M NaCl2.50mM
トリス−HCP (pH7,4)(TBS)および
1%(w/VI B S Aの混合物中に、37°C
で1Ff?間浸漬した後、室温で2時間、 (6)で見
出したHK−84およびHK−102の各ハイブリドー
マ培地とインキュベートした。
トリス−HCP (pH7,4)(TBS)および
1%(w/VI B S Aの混合物中に、37°C
で1Ff?間浸漬した後、室温で2時間、 (6)で見
出したHK−84およびHK−102の各ハイブリドー
マ培地とインキュベートした。
続いて、この膜を3回TBSおよび0.02%fv/v
) ツイーン20 (TBS/ツイーン)で洗浄後、
パーオキシダーゼ標識抗う・ントIg(G+M)(終希
釈度1:500 TBS/ツイーン)で室温にて1時
間処理した。さらに、TBS/ツイーンで4回洗浄後、
結合したパーオキシダーゼをTBSに0.03%fv/
vl過酸化水素を含有した0、05%(w/v] 4−
クロロ−1−ナフトール溶液を用いて発色させた。
) ツイーン20 (TBS/ツイーン)で洗浄後、
パーオキシダーゼ標識抗う・ントIg(G+M)(終希
釈度1:500 TBS/ツイーン)で室温にて1時
間処理した。さらに、TBS/ツイーンで4回洗浄後、
結合したパーオキシダーゼをTBSに0.03%fv/
vl過酸化水素を含有した0、05%(w/v] 4−
クロロ−1−ナフトール溶液を用いて発色させた。
タンパクの検出は、SDSゲルを用い同時に泳動後、ク
マジーブルーR250で染色して行なった。
マジーブルーR250で染色して行なった。
その結果、HK−84およびHK−102は、LD型1
(S−PGココア白分子のM r = 450.000
および360.000のいずれをも識別することがわか
った・ (8)モノクローン抗体によるLD型)Is−PGのV
8−プロテアーゼフラグメントの検出(2)で得られた
H5−PGのLD型(タンパクとして4μg含有)を■
8プロテアーゼ(プロテオグリカン:プロテアーゼ 1
00:1 乾燥重量比)と50mMトリス−HCff
(pH7,4)中、37°Cで5時間インキュベート
して処理した。次いで、処理後の消化物を、5−15%
のグラジェントゲルを用いたSOSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供した。
(S−PGココア白分子のM r = 450.000
および360.000のいずれをも識別することがわか
った・ (8)モノクローン抗体によるLD型)Is−PGのV
8−プロテアーゼフラグメントの検出(2)で得られた
H5−PGのLD型(タンパクとして4μg含有)を■
8プロテアーゼ(プロテオグリカン:プロテアーゼ 1
00:1 乾燥重量比)と50mMトリス−HCff
(pH7,4)中、37°Cで5時間インキュベート
して処理した。次いで、処理後の消化物を、5−15%
のグラジェントゲルを用いたSOSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供した。
続いて、 (7)で行なったと同様に、イムノブロッテ
ィングを行なった。
ィングを行なった。
タンパクの検出は、同時にSDSゲル泳動後、クマジー
ブルーR250て染色して行なった。
ブルーR250て染色して行なった。
ミオシン重ii (M r = 200.000 )
、ホスホリラーゼb (M r =94.0OO) 、
アルブミン(Mr=67.000) 、卵白アルブミン
(M r =43.000) 、脱炭酸酵素(Mr=
30.000 ) トリプシンインヒビター(M r
= 20.000 ) 、 a−ラクトアルブミン(M
r = 14.000)を免疫反応陽性バンドの分子
量を決定する標準マーカ〜として用いた。
、ホスホリラーゼb (M r =94.0OO) 、
アルブミン(Mr=67.000) 、卵白アルブミン
(M r =43.000) 、脱炭酸酵素(Mr=
30.000 ) トリプシンインヒビター(M r
= 20.000 ) 、 a−ラクトアルブミン(M
r = 14.000)を免疫反応陽性バンドの分子
量を決定する標準マーカ〜として用いた。
HK−84は、LD型H3−PGのV、プロテアーゼ処
理により得られたM r = 180.000.150
.000 、 120.000、92.000.80
.000、64.00口、 のフラグメントを識別し、
HK−102は、I(K84が認識するフラグメントお
よび該フラグメントよりさらに小さなフラグメントであ
るMr=51.000.44.000.37.000お
よび31,000をも識別した。
理により得られたM r = 180.000.150
.000 、 120.000、92.000.80
.000、64.00口、 のフラグメントを識別し、
HK−102は、I(K84が認識するフラグメントお
よび該フラグメントよりさらに小さなフラグメントであ
るMr=51.000.44.000.37.000お
よび31,000をも識別した。
この)TK−84およびHK−102の反応性の相違か
ら、F(K−84のエピトープが、64.000のフラ
グメントか、それより小さいフラグメントに分解すると
きに放出されるペプチド上に存在することがわかる。
ら、F(K−84のエピトープが、64.000のフラ
グメントか、それより小さいフラグメントに分解すると
きに放出されるペプチド上に存在することがわかる。
(9)免騙Jわ賢家舊
4週令のC57ブラツクマウスの組織を凍結切片(6μ
m厚さ)として固定を施さずに調製した。これをHK−
84およびHK−102のハイプリドーマ培地または希
釈した抗マウスIV型コラゲン抗体(PBSで1.30
に希釈)とインキュベートした。これをKimataら
の方法(J、EmbryolExp、 Morph、
89 : 243−257.1985)に従って免疫蛍
光染色した。ポジティブコントロールとしてEH3腫瘍
切片を上述のように染色した。ネガティブコントロール
としてRPMIおよび10%(V/Vl牛脂児血清、ま
たはPBSで30倍に希釈した希釈非免疫ラット血清を
ハイブリドーマ培地に代えて用いた。
m厚さ)として固定を施さずに調製した。これをHK−
84およびHK−102のハイプリドーマ培地または希
釈した抗マウスIV型コラゲン抗体(PBSで1.30
に希釈)とインキュベートした。これをKimataら
の方法(J、EmbryolExp、 Morph、
89 : 243−257.1985)に従って免疫蛍
光染色した。ポジティブコントロールとしてEH3腫瘍
切片を上述のように染色した。ネガティブコントロール
としてRPMIおよび10%(V/Vl牛脂児血清、ま
たはPBSで30倍に希釈した希釈非免疫ラット血清を
ハイブリドーマ培地に代えて用いた。
4週令のC57ブラツクマウスから得た種々組織(骨格
筋、心筋、肺、全脂(含大脳、中脳、小脳)および腎)
各1gを7M 尿素、0.15MNaCl2.50mM
トリス−HCl2 (pH7,4)、0.5%(V
/V) l−リドンX−100およびプロテアーゼ阻
害剤からなる溶液7.5mg。
筋、心筋、肺、全脂(含大脳、中脳、小脳)および腎)
各1gを7M 尿素、0.15MNaCl2.50mM
トリス−HCl2 (pH7,4)、0.5%(V
/V) l−リドンX−100およびプロテアーゼ阻
害剤からなる溶液7.5mg。
でガラスホモゲナイザーにてホモゲナイズした後、上記
と同様の溶液にて4℃、12時間の抽出を2回行なった
。
と同様の溶液にて4℃、12時間の抽出を2回行なった
。
抽出物をD E A E 5ephacelカラム(1
,5%3cm)に供し、結合成分を、抽出溶液にIMに
なるようにNaCβを加え、カラム容量の2倍量で溶出
した。溶出物をエタノール沈殿後、10mMトリス−H
CQ (pH7,0)、l OmMKCff、3mM
MgCρ2およびフェニルメチルスルホニルフルオリ
ドからなる溶液2m℃に渚解した。
,5%3cm)に供し、結合成分を、抽出溶液にIMに
なるようにNaCβを加え、カラム容量の2倍量で溶出
した。溶出物をエタノール沈殿後、10mMトリス−H
CQ (pH7,0)、l OmMKCff、3mM
MgCρ2およびフェニルメチルスルホニルフルオリ
ドからなる溶液2m℃に渚解した。
この試料を200ugのDNaseIを用いて37°C
で15分処理し、次いて、エタノール沈殿によりDNA
フラグメントを除去した。この試料(ヘキスロン酸とし
て各2nモル)を10ミリ単位のヘパリチナーゼで37
°C1時間消化処理した後、5%−15%のグラジェン
トゲルを用いたSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供し、さらに、 (7)で行なったと同様のイムノブ
ロッティングを行なった。
で15分処理し、次いて、エタノール沈殿によりDNA
フラグメントを除去した。この試料(ヘキスロン酸とし
て各2nモル)を10ミリ単位のヘパリチナーゼで37
°C1時間消化処理した後、5%−15%のグラジェン
トゲルを用いたSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供し、さらに、 (7)で行なったと同様のイムノブ
ロッティングを行なった。
ポジティブコントロールとしてEH3腫瘍切片1gを上
述と同様にして調製したものを用い、また、アフィニテ
ィー精製した抗BMIポリクローン抗体(TBS/ツイ
ーンで1:2000に希釈)を基底膜H3−PGのプロ
ーブとして用い、パーオキシダーゼ標識 Protei
n A (T B S /ツイーンで1:1O00に希
釈)で検出した。免疫反応陽性バンドの分子量の決定は
、 (8)と同様に行なった。
述と同様にして調製したものを用い、また、アフィニテ
ィー精製した抗BMIポリクローン抗体(TBS/ツイ
ーンで1:2000に希釈)を基底膜H3−PGのプロ
ーブとして用い、パーオキシダーゼ標識 Protei
n A (T B S /ツイーンで1:1O00に希
釈)で検出した。免疫反応陽性バンドの分子量の決定は
、 (8)と同様に行なった。
これらの免疫蛍光染色の結果、[(K−84および[(
K−102の産生するモノクローン抗体を用いると、マ
ウスの組織では、骨格筋線維周囲の基底膜(endom
ysiuml、心筋細胞周囲の基底膜、肺の肺胞気管支
基底膜が染色され、血管壁内皮の基底膜は全組織で強く
染色され、特に脳ではこれらは特徴的な像を呈した。ま
た、大脳と小脳の間に有為な違いは観察されなかった。
K−102の産生するモノクローン抗体を用いると、マ
ウスの組織では、骨格筋線維周囲の基底膜(endom
ysiuml、心筋細胞周囲の基底膜、肺の肺胞気管支
基底膜が染色され、血管壁内皮の基底膜は全組織で強く
染色され、特に脳ではこれらは特徴的な像を呈した。ま
た、大脳と小脳の間に有為な違いは観察されなかった。
腎では、ボウマン王女、糸球体、尿細管のすべての基底
膜が強く染色された。
膜が強く染色された。
これらの組織を、マウスの1V型コラ一ゲン抗体を用い
て染色した場合、)IK−84およびHK102の産生
する抗体を用いた場合と完全に一致して染色された。
て染色した場合、)IK−84およびHK102の産生
する抗体を用いた場合と完全に一致して染色された。
1−V型コラーゲンは、全ての基底膜の構成成分である
ことが特徴的であることから、HK−84およびHK−
102の産生する抗体に対する抗原が全ての基底膜に存
在していることが示唆された。
ことが特徴的であることから、HK−84およびHK−
102の産生する抗体に対する抗原が全ての基底膜に存
在していることが示唆された。
また、イムノブロッティングの結果から、ヘパリチナー
ゼ処理により、LD型H5−PGのコア蛋白分子と同一
の、M r = 450.000の巨大なコア蛋白分子
が全ての組織から得た試料の主要なバンドとして検出さ
れた。
ゼ処理により、LD型H5−PGのコア蛋白分子と同一
の、M r = 450.000の巨大なコア蛋白分子
が全ての組織から得た試料の主要なバンドとして検出さ
れた。
さらに、組織特異的な違いがみられるバンドもあり、骨
格筋、心筋では、約M r = 360.000の2本
のバンドが、肺では、M r = 360.000の1
本のバンドが、腎では、M r = 360.000お
よび280.000の2本のバンドが検出された。
格筋、心筋では、約M r = 360.000の2本
のバンドが、肺では、M r = 360.000の1
本のバンドが、腎では、M r = 360.000お
よび280.000の2本のバンドが検出された。
(10)糸球 の 製とHS −P Gの 析糸球体は
Kobayashiらによる段階的ふるい分は技法(J
、Biol、Chem、 258:12051−120
57.1983)により単離した。
Kobayashiらによる段階的ふるい分は技法(J
、Biol、Chem、 258:12051−120
57.1983)により単離した。
すなわち、以下のようにして行なった。
まず、出発材料としてC53ブラツクマウス20匹から
得た40個の腎を用い、これらの標品は、少なくとも7
0%の純粋な糸球体を含有していることを、位相差顕微
鏡で確認した。
得た40個の腎を用い、これらの標品は、少なくとも7
0%の純粋な糸球体を含有していることを、位相差顕微
鏡で確認した。
次いで、尿素およびトリトンX−100により糸球体抽
出を行ない、抽出液をD E A E 5ephace
lカラム(0,sxi、5cm)に (9)と同様に供
した。結合した成分を溶出し、 (9)と同様にして、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブ
ロッティングを行なった。
出を行ない、抽出液をD E A E 5ephace
lカラム(0,sxi、5cm)に (9)と同様に供
した。結合した成分を溶出し、 (9)と同様にして、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブ
ロッティングを行なった。
その結果、糸球体標品においては、Mr=360、00
0および280.000の2本のバンドが検出された。
0および280.000の2本のバンドが検出された。
以上の実施例の結果から、本発明により、LD型H3−
PGを特異的に識別するモノクローン抗体が得られ、ま
た、このモノクローン抗体を用いた免疫蛍光染色法によ
り、マウスの骨格筋、心筋、肺、脳、腎のすべての組織
の基底膜が染色され、さらに、免疫プロッティング法に
より、これらの組織の全プロテオグリカン画分に、LD
型H5−PGの分子サイズと一致するH3−PGのコア
蛋白分子が共通に存在することを見出した。
PGを特異的に識別するモノクローン抗体が得られ、ま
た、このモノクローン抗体を用いた免疫蛍光染色法によ
り、マウスの骨格筋、心筋、肺、脳、腎のすべての組織
の基底膜が染色され、さらに、免疫プロッティング法に
より、これらの組織の全プロテオグリカン画分に、LD
型H5−PGの分子サイズと一致するH3−PGのコア
蛋白分子が共通に存在することを見出した。
このことから、本発明のモノクローン抗体は、LD型H
3−PGを特異的に識別し、これを用いることにより、
組織におけるLD型H3−PGを特異的に検出できるこ
とがわかった。
3−PGを特異的に識別し、これを用いることにより、
組織におけるLD型H3−PGを特異的に検出できるこ
とがわかった。
[発明の効果]
本発明によれば、LD型H5−PGのみを認識するモノ
クローン抗体およびそれを産生するハイブリドーマを提
供でき、これを用いることによりLD型H3−PGを特
異的に検出することができる。
クローン抗体およびそれを産生するハイブリドーマを提
供でき、これを用いることによりLD型H3−PGを特
異的に検出することができる。
したがって、LD型H5−PGを検出することにより、
基底膜異常を伴うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、動
脈硬化症、種々の腫瘍、アルツハイマー病等の診断に有
用な方法となりつる。
基底膜異常を伴うヒトの疾病、例えば急性慢性腎炎、動
脈硬化症、種々の腫瘍、アルツハイマー病等の診断に有
用な方法となりつる。
Claims (3)
- (1)低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有す
る組織由来のヘパラン硫酸プロテオグリカンを抗原とし
て予め免疫したラットの脾細胞とマウスのミエローマ細
胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマから産
生される抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノ
クローン抗体。 - (2)低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有す
る組織由来のヘパラン硫酸プロテオグリカンを抗原とし
て予め免疫したラットの脾細胞とマウスのミエローマ細
胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマであっ
て、抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクロ
ーン抗体を産生するハイブリドーマ。 - (3)請求項1に記載のモノクローン抗体を用いること
を特徴とする低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの
検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63308776A JPH02156898A (ja) | 1988-12-08 | 1988-12-08 | 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63308776A JPH02156898A (ja) | 1988-12-08 | 1988-12-08 | 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02156898A true JPH02156898A (ja) | 1990-06-15 |
Family
ID=17985167
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63308776A Pending JPH02156898A (ja) | 1988-12-08 | 1988-12-08 | 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02156898A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0869362A2 (en) * | 1997-04-04 | 1998-10-07 | Seikagaku Corporation | Quantitative determination method for heparan sulfate and diagnostic method using the same |
EP0816851A3 (en) * | 1991-01-15 | 2000-08-23 | Oy Biotie Therapies | Detection of syndecan content in body fluids for indication of malignant transformation of cells |
-
1988
- 1988-12-08 JP JP63308776A patent/JPH02156898A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0816851A3 (en) * | 1991-01-15 | 2000-08-23 | Oy Biotie Therapies | Detection of syndecan content in body fluids for indication of malignant transformation of cells |
EP0869362A2 (en) * | 1997-04-04 | 1998-10-07 | Seikagaku Corporation | Quantitative determination method for heparan sulfate and diagnostic method using the same |
EP0869362A3 (en) * | 1997-04-04 | 1998-10-14 | Seikagaku Corporation | Quantitative determination method for heparan sulfate and diagnostic method using the same |
US6150115A (en) * | 1997-04-04 | 2000-11-21 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Quantitative determination method for heparan sulfate and diagnostic method using the same |
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