ES2260788T3 - Anticuerpos monoclonales especificos para el dominio estracelular de antigeno de membrana especifico de la prostata. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE SE FIJAN AL DOMINIO EXTRACELULAR DEL ANTIGENO MEMBRANARIO ESPECIFICO DE LA PROSTATA (AMEP), LINEAS CELULARES DE HIBRIDOMAS QUE PRODUCEN LOS ANTICUERPOS, Y PROCEDIMIENTOS PARA EL USO DE DICHOS ANTICUERPOS EN EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DEL CANCER. EN PARTICULAR, SE REFIERE A TRES ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE REACCIONAN CON EL AMEP EXPRESADO EN LA SUPERFICIE CELULAR Y EN LOS SUEROS DE PACIENTES DE CANCER DE PROSTATA. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA VARIANTE PROTEINICA (PSM'') DEL AMEP, DETECTADA POR UN ANTICUERPO DE LA INVENCION. LA ACTIVIDAD DE LA HIDROLASA DEL AMEP Y DEL PSM'' PERMITE EL USO DE UN ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA SU DETECCION.

Description

Anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de antígeno de membrana específico de la próstata.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen al dominio extracelular de antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), a líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos y a métodos para usar tales anticuerpos para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. En particular, se refiere a un anticuerpo monoclonal generado contra un péptido sintético substancialmente homólogo a una porción de la región carboxiloterminal de PMSA, anticuerpo que reacciona con PSMA expresado en la superficie de células tumorales y el suero de pacientes con cáncer de próstata. Adicionalmente, se refiere a dos anticuerpos monoclonales generados contra una preparación de membranas de carcinoma prostático, anticuerpos que también reaccionan con PSMA expresado sobre la superficie celular. La presente invención también se refiere a una nueva variante proteínica (PSM') de PSMA detectada por los anticuerpos.

2. Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte de cáncer entre los hombres. De hecho, el cáncer de próstata es el cáncer no cutáneo más común diagnosticado en los varones americanos. El número de hombres diagnosticados con cáncer de próstata está creciendo constantemente como resultado de la población creciente de hombres ancianos así como un conocimiento mayor de la enfermedad que conduce a su diagnóstico más prematuro (Parker y otros, 1997, CA Cáncer J. for Clin. 47:5-28). Se previó que más de 334.500 hombres serían diagnosticados de cáncer de próstata en 1997 y que resultarían aproximadamente 41.800 muertes de la enfermedad. El riesgo para la vida para hombres que desarrollan cáncer de próstata es aproximadamente 1 en 5 para los caucasianos y 1 en 6 para los afroamericanos. Los grupos de alto riesgo están representados por aquellos con una historia familiar positiva de cáncer de próstata o afroamericanos. A lo largo de una vida, más de 2/3 de los hombres diagnosticados con cáncer de próstata muere de la enfermedad (Wingo y otros, 1996, CA Cáncer J. for Clin. 46:113-25). Por otra parte, muchos pacientes que no sucumben al cáncer de próstata requieren un tratamiento continuo para mitigar síntomas tales como dolor, hemorragia y obstrucción urinaria. Así, el cáncer de próstata también representa una causa principal de sufrimiento y gastos de cuidado sanitario incrementados (Catalona, 1994, New Eng. J. Med. 31:996-1004).

El PSMA es una proteína de 120 kDa de peso molecular expresada en tejido de próstata y originalmente fue identificado mediante reactividad con un anticuerpo monoclonal denominado 7E11-C5 (Horoszewicz y otros, 1987, Anticancer Res. 7:927-935; Patente de EE.UU. Nº 5.162.504). El PSMA se obtuvo en forma purificada (Wright y otros, 1990, Antibody Immunoconjugates and Radio Pharmaceuticals 3: Extracto 193) y se caracterizó como una proteína de transmembrana de tipo II que tenía una identidad de secuencia con el receptor de transferrina (Israeli y otros, 1994, Cancer Res. 54:1807-1811) y con actividad de NAALADasa (Carter y otros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A-93:749-753). De forma más importante, el PSMA se expresa en cantidades incrementadas en cáncer de próstata y niveles elevados de PSMA también son detectables en los sueros de estos pacientes (Horoszewicz y otros, 1987, anteriormente; Rochon y otros, 1994, Prostate 25:219-223; Murphy y otros, 1995, Prostate 26:164-168 y Murphy y otros, 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479). Se ha clonado un cDNA que codifica PSMA (Israeli y otros, 1993, Cancer Res. 53:227-230), y produce dos especies de mRNA alternativamente reparadas: una especie de mRNA que contiene 2.653 nucleótidos que codifica PSMA y una segunda especie de mRNA que contiene 2.387 nucleótidos denominada PSM' (Su y otros, 1995, Cancer Res. 55:1441-1443). WO96/08570 describe una proteína de fusión que comprende una porción de la secuencia de aminoácidos que codifica el dominio extracelular de PSMA. También describe métodos para construir un vector de expresión, traducción, purificación y segmentación de la proteína de inmunofusión de PSMA, y el uso de dominio extracelular de PSMA purificado para inmunizar ratones. Sin embargo, no se describe el aislamiento de anticuerpos específicos para el dominio extracelular de PSMA.

WO94/09820 describe cDNA de PSMA (denominado PSM') y vectores para expresar PSM'. Describe además un método para seleccionar péptidos hidrófilos de aminoácidos para usar como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para PSMA. Sin embargo, no se describen anticuerpos específicos para PSMA.

Leek y otros, 1995, Br. J. Cancer, 72, 583-588 describen la caracterización del gen que codifica PSMA, específicamente que los clones genómicos de PSMA se mapea hasta dos loci en el cromosoma humano 11.

Antes de la presente invención, no se sabía si PSM' codificaba un producto proteínico o existía solamente como una especie de mRNA no traducida debido a que nunca se había detectado un producto proteínico de PSM'. Por ejemplo, WO96/26272 describe una secuencia de DNA y mRNA de mamífero aislada que se predice que codifica un antígeno de PSM' alternativamente reparado. Sin embargo en ningún punto este documento describe específicamente un producto proteínico de PSM' traducido procedente de la secuencia de mRNA definida.

Un informe reciente de Carter y otros, (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:749-753) muestra un alto grado de identidad entre 1428 bases que representan una porción del cDNA de PSMA y la secuencia de cDNA de la proteína dipeptidasa ácida conectada en \alpha acetilada en N (NAALADasa). La NAALADasa tiene actividad enzimática hacia el neuropéptido glutamato de N-acetilaspartilo para dar glutamato y N-acetilaspartato. Este informe demuestra la actividad de NAALADasa inherente a la proteína de PSMA, pero no se identificaba la porción catalítica de PSMA. La actividad de NAALADasa se encontró en células LNCaP que expresaban PSMA, pero no en células PC3 que no expresan PSMA. La transfección del cDNA de PSMA en células PC3 producía actividad de NAALADasa y la presencia de PSMA en estas células.

La diferencia entre el cDNA de PSMA y PSM' es la pérdida de las regiones de transmembrana y codificación intracelular que contienen los nucleótidos Nº 1-171 o los aminoácidos Nº 1-57. El PSMA se describe como una proteína de membrana de tipo II y se sabe que el dominio catalítico funcional de las proteínas de membrana de tipo II reside en la región extracelular C-terminal de la molécula (DeVries y otros, 1995, J. Biol. Chem., 270:8712-8722).

El mRNA de PSM' se encuentra en mayores cantidades en tejidos de próstata normales en comparación con tejidos de próstata de pacientes con hiperplasia benigna o cáncer de próstata (Su y otros, 1995, anteriormente). En contraste, el mRNA de PSMA se encuentra en mayores niveles en pacientes con cáncer de próstata en comparación con pacientes sin cáncer de próstata (Su y otro, 1995, anteriormente). Esta diferencia observada está de acuerdo con niveles séricos de proteína de PSMA descritos previamente (Horoszewicz y otros, 1987, anteriormente; Rochon y otros, 1994, anteriormente; Murphy y otros, 1995, anteriormente y Murphy y otros, 1995, anteriormente). En relación con esto, un nivel elevado de PSMA en sueros de pacientes de cáncer de próstata se ha correlacionado con progresión frente a remisión de la enfermedad, y puede usarse como un marcador de pronóstico (Murphy y otros, 1995, anteriormente).

El epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 7E11-C5 se ha mapeado hasta los primeros 6 aminoácidos de la región N-terminal intracelular de PSMA (Troyer y otros, 1995, Urol. Oncol. 1:29-37) (Figura 1). La inmunocitoquímica electrónica usando 7E11-C5 ha localizado su epítopo en el citoplasma, y específicamente en la cara interna de la membrana plasmática (Troyer y otros, 1994, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 35:283, Extracto 1688). Por otra parte, en pruebas in vitro, el anticuerpo monoclonal 7E11-C5 tiñe solo células fijadas y permeabilizadas (Horoszewicz y otros, 1987, anteriormente), lo que está de acuerdo con el mapeo del epítopo de 7E11-C5 hasta el extremo N o el dominio intracelular de PSMA. Aunque 7E11-C5 es útil para detectar cáncer de próstata in vivo, lo que expone presumiblemente su epítopo a través de necrosis y/o apoptosis, un anticuerpo monoclonal específico para el dominio extracelular de PSMA permitiría una detección más eficaz del PSMA sobre la superficie de la célula cancerosa. Además, el anticuerpo monoclonal 7E11-C5 no reconoce PSM', ya que PSM' carece del dominio intracelular de PSMA, basado en la secuencia de su transcrito de mRNA.

La cita o la identificación de cualquier referencia en esta sección o en cualquier otra sección de esta solicitud no debe considerarse como una admisión de que tal referencia esté disponible como técnica anterior para la presente invención.

3. Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de PSMA, a líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos y a métodos para usar los anticuerpos para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer de próstata, así como a una forma proteínica variante de PSMA conocida como PSM' reconocida por tales anticuerpos.

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes de tres anticuerpos monoclonales que reconocen el dominio extracelular de PSMA. Un anticuerpo se generó inmunizando ratones con péptido C-terminal de PSMA que tiene la secuencia de aminoácidos de ESKVDPSK (Nº ID SEC: 1). El anticuerpo reacciona con proteínas de PSMA y PSM' en lisados de células tumorales y en sueros de pacientes con cáncer de próstata. Además, tiñe células tumorales vivas intactas, confirmando su especificidad para el dominio extracelular de proteína de PSMA o PSM'. El anticuerpo también detecta PSM' en fluidos seminales humanos, y el PSM' de los mismos inhibe la actividad de NAALADasa. Dos anticuerpos monoclonales adicionales se generaron contra una preparación de membrana de carcinoma prostático. Estos anticuerpos también reaccionan con el dominio extracelular de PSMA y PSM', incluyendo PSMA natural aislado mediante purificación por inmunoafinidad y PSMA recombinante producido mediante tecnología de DNA recombinante. Los anticuerpos son útiles en combinación con un anticuerpo dirigido al dominio intracelular de PSMA en un ensayo de captura bilocal para detectar la presencia de PSMA en una muestra de prueba. Por otra parte, los tres anticuerpos descritos aquí pueden usarse en un ensayo de captura bilocal para detectar la presencia de PSM' en una muestra de prueba.

Una amplia variedad de usos es abarcada por la presente invención, incluyendo, pero no limitada a, el desarrollo y el uso de un inmunoensayo para detectar o situar el cáncer de próstata en un paciente, obtención de imágenes de cáncer de próstata primario y/o metastático in vivo, usos terapéuticos de los anticuerpos, incluyendo usos de anticuerpos conjugados a un agente citotóxico o quimioterapéutico; y la construcción y el uso de fragmentos de anticuerpo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos bifuncionales.

4. Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencias de aminoácidos deducidas de antígenos PSMA y PSM' (Nº ID SEC: 2) (Israeli y otros, 1994, Cancer Res. 54:1807-1811). El mRNA de PSM' no contiene el extremo 5' del PSMA que codificaría los primeros 57 aminoácidos (primera línea de la secuencia de aminoácidos) y así empieza presumiblemente en el aminoácido 58. Sin embargo, antes de la presente invención, el PSM' nunca se ha identificado en su forma proteínica. La región subrayada es el dominio de transmembrana putativo y la región en negrita (aminoácidos Nº 716-723) es un péptido seleccionado para el desarrollo de anticuerpos monoclonales.

Figura 2. Demostración del anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 (un subclón derivado del hibridoma primario 3F5) y su reactividad con una proteína presente en lisado de LNCaP de 120 kDa de peso molecular correspondiente a PSMA. La transferencia Western se desarrolló con anticuerpo secundario HRP-anti-IgG. Carril 1 = lisado de LNCaP sondeado con 7E11-C5; Carril 2 = lisado de LNCaP sondeado con 3F5.4G6.

Figura 3. Demostración mediante transferencia Western de PSMA en sueros de pacientes con cáncer de próstata (fase D2) usando anticuerpos monoclonales 3F5.4G6 (Carriles 3 y 4) y 7E11-C5 (Carriles 1 y 2) como control.

Figura 4. Ensayo de transferencia Western de lisados de LNCaP usando anticuerpos monoclonales 7E11-C5 (Carril 1) y 3F5.4G6 (Carril 2) y desarrollado con anticuerpo secundario HRP-anti-IgM. Tanto 7E11-C5 como 3F5.4G6 reconocían una proteína de peso molecular 120 kDa. Además, 3F5.4G6 también reconocía una proteína de un peso molecular de 105-110 kDa correspondiente a la forma proteínica predicha de PSM'. Debe apuntarse que 7E11-C5 no reconocía PSM' debido a que el epítopo del anticuerpo monoclonal 7E11-C5 no se encontraba en PSM'. El anticuerpo 3F5.4G6 reconoce la porción C-terminal de la proteína (aminoácido Nº 716-723), que corresponde al dominio extracelular de PSMA y PSM'.

Figura 5. Demostración de que los anticuerpos monoclonales 7E11-C5 y 3F5.4G6 reconocían una proteína idéntica pero que 3F5.4G6 reconocía una proteína adicional correspondiente a PSM'. El lisado de LNCaP se inmunoprecipitó inicialmente con anticuerpo monoclonal 7E11-C5 y el material inmunoprecipitado se separó sobre geles de SDS y se sondeó en un ensayo de transferencia Western con anticuerpos monoclonales 7E11-C5 (Carriles 1-4) o con 3F5.4G6 (Carriles 5-8). Los Carriles 1 y 5 eran lisado de LNCaP en bruto; los Carriles 2 y 6 eran lisado de LNCaP preclarificado; los Carriles 3 y 7 eran material que se inmunoprecipitaba con anticuerpo monoclonal 7E11-C5; y los Carriles 4 y 8 eran proteínas que quedaban en el lisado de LNCaP previamente inmunoprecipitado. El anticuerpo 7E11-C5 inmunoprecipitaba una proteína de 120 kDa (Carril 3) que también era reconocida por 3F5.4G6 (Carril 7). Sin embargo, después de la inmunoprecipitación con 7E11-C5, una segunda proteína era reconocida por 3F5.4G6 (Carril 8) que no era precipitada por 7E11-C5 (Carril 4) y que correspondía a PSM'. Así, 7E11-C5 no reconoce PSM'.

Figura 6. Demostración de que los anticuerpos monoclonales 7E11-C5 y 3F5.4G6 reconocían una proteína de 120 kDa idéntica. El plasma de un lisado de LNCaP se inmunoprecipitó mediante el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6, las proteínas del inmunoprecipitado se separaron sobre un gel de SDS, se transfirieron a Immobilon P y se sondearon en una transferencia Western con anticuerpo monoclonal 7E11-C5. Carril 1 = control de lisado de LNCaP y sondeado con 7E11-C5; Carril 2 = inmunoprecipitación con 3F5.4G6.

Figura 7A y B. Demostración mediante análisis de FACS del reconocimiento por el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 de células LNCaP vivas que ilustran la unión del anticuerpo al dominio extracelular de PSMA. La Fig. 7A representa el control sin anticuerpo primario y la Fig. 7B representa células LNCaP incubadas con 100 \mug/ml de 3F5.4G6 antes del análisis por FACS. El desplazamiento hacia la derecha indica la unión del anticuerpo a las células LNCaP vivas.

Figura 8. Demostración de la reactividad del anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 con PSM' aislado y purificado de fluido seminal. El Carril 1 es lisado de LNCaP y el Carril 2 es PSM' purificado de fluido seminal. Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida en presencia de SDS y se transfirieron a papel Immobilon P y se sondearon con anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 mediante procedimientos de transferencia Western. La proteína purificada de fluido seminal y representada en el Carril 2 es de peso molecular 90 kDa, que es probable que sea un producto no glicosilado o parcialmente glicosilado de PSM' que tiene un peso molecular de 105-110 kDa.

Figura 9. Demostración de la reactividad de anticuerpos monoclonales 3D7-1.1 y 4E10-1.14 con PSMA natural y tres fragmentos de PSMA. Placas de microvaloración de 96 pocillos se revistieron con PSMA natural o uno de tres fragmentos polipeptídicos expresados bacterianamente de PSMA y se hicieron reaccionar con sobrenadantes de hibridoma en un ELISA. Aunque los tres anticuerpos probados mostraban unión comparable a PSMA natural, 3D7-1.1 y 4E10-1.14 reaccionaban fuertemente con un fragmento correspondiente a un epítopo en el dominio extracelular de PSMA.

Figura 10. Análisis por transferencia Western de PSMA usando anticuerpos monoclonales 3D7-1.1. Carril 1 = lisado de LNCaP; Carril 2 = lisado de PC-3; Carril 3 = PSMA purificado por inmunoafinidad.

Figura 11. Análisis de transferencia Western de PSMA expresado en baculovirus de longitud completa. El PSMA recombinante se sometió a electroforesis sobre gel de SDS-PAGE, se electrotransfirió y se sondeó con diversas preparaciones de anticuerpo.

Carril 1 = blanco;

Carril 2 = medio de control (FCSin al 20% en RPMI 1640);

Carril 3 = anticuerpo monoclonal 3D7-1.1;

Carril 4 = anticuerpo monoclonal 3D7-1.2;

Carril 5 = anticuerpo monoclonal 3D7-1.3;

Carril 6 = anticuerpo monoclonal 3D7-1.7;

Carril 7 = anticuerpo monoclonal 3D7-2.7;

Carril 8 = anticuerpo monoclonal 4E10 (originario);

Carril 9 = anticuerpo monoclonal 4E10-1.3;

Carril 10 = anticuerpo monoclonal 4E10-1.14;

Carril 11 = blanco;

Carril 12 = blanco;

Carril 13 = anticuerpo monoclonal 7E11-C5.

Figura 12 A-D. Demostración mediante análisis por FACS de reconocimiento por anticuerpos monoclonales 3D7-1.1 y 4E10-1.14 de células LNCaP vivas, que ilustra anticuerpo que se une al dominio extracelular de PSMA. La Figura 12A representa células LNCaP incubadas con 4E10-1.14. La Figura 12D representa células PC-3 incubadas con 4E10-1.14. La Figura 12C representa células LNCaP incubadas con 3D7-1.1. La Figura 12D representa células PC-3 incubadas con 3D7-1.1. Los diferentes patrones en el desplazamiento hacia la derecha en la Figura 12A y 12C sugieren que los dos anticuerpos pueden reconocer diferentes epítopos de PSMA.

Figura 13. Detección de PSMA mediante un ELISA de captura bilocal usando dos anticuerpos monoclonales para distintos epítopos de PSMA. PSMA purificado por inmunoafinidad diluido en serie se añadió a placas de 96 pocillos revestidas con 7E11-C5 y se detectó incubando con sobrenadantes de 3D7-1.1 o 4E10-1.14. La absorbancia a 405 nm se midió en un lector de microplacas. -\medbullet- = -3D7-1.1; -\blacksquare- = 4E10-1.14.

Figura 14. Detección de PSMA en una variedad de muestras biológicas mediante un ELISA de captura bilocal usando anticuerpos monoclonales 3D7-1.1 y 4E10-1.14.

Figura 15. Detección de PSMA purificado por inmunoafinidad diluido en serie en suero humano normal mediante un ELISA de captura bilocal usando anticuerpos monoclonales 3D7-1.1 y 4E10-1.14.

Figura 16. Detección de PSMA mediante un ELISA de captura bilocal alternativo. PSMA purificado por inmunoafinidad diluido en serie se añadió a placas de 96 pocillos revestidas con 3D7-1.1 y se detectó incubando con 7E11-C5 biotinilado (40 \mug/ml) seguido por estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante. La absorbancia a 405 nm se midió en un lector de microplacas. 7E11-C5 se biotiniló usando E-Z link Biotinylation kits (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Figura 17. Análisis por transferencia Western de lisado de células LNCaP y diversas fracciones de un fragmento de PSMA semipurificado (correspondiente a los aminoácidos 134 a 750 de PSMA de longitud completa expresado como un inserto de 1,9 kb en un sistema de expresión de baculovirus) sondeado con sobrenadante de cultivo tisular procedente del hibridoma 4E10-1.14. La identificación del producto proteínico a partir del constructo de 1,9 kb (aminoácidos 134-750 de PSMA) se apunta mediante la flecha.

Carril 1 = marcadores; Carril 2 = lisado en bruto de células LNCaP; Carril 3 = nódulo viral, es decir, nódulo de 100.000 x g de células SF9 sometidas a lisis infectadas con baculovirus que expresa el fragmento de PSMA de 1,9 kb; Carril 4 = fracción de sobrenadante de 100.000 x g procedente de células SF9 sometidas a lisis infectadas con baculovirus que expresa fragmento de PSMA de 1,9 kb; Carril 5 = flujo a través de la fracción mostrada en el Carril 4 después del paso a través de una matriz de Ni-NTA; Carril 6 = elución con NaCl 0,5M de la matriz de Ni-NTA; Carril 7 = elución con imidazol 1M, pH 7,6, de la matriz de Ni-NTA; Carril 8 = flujo a través de la fracción mostrada en el Carril 4 después del paso a través de una matriz de Ni-NTA; Carril 9 = elución con NaCl 0,5M de la matriz de Ni-NTA; y Carril 10 = elución con imidazol 1M, pH 7,6, de la matriz de Ni-NTA. Nótese además en el Carril 2 la reactividad del anticuerpo monoclonal 4E10-1.14 con PSMA de longitud completa natural expresado en células
LNCaP.

Figura 18. Transferencia Western de lisados en bruto de células SF9 infectadas con un baculovirus que contiene un inserto irrelevante o un inserto de 1,9 kb que codifica una porción de PSMA (aminoácidos 134-1750 de PSMA de longitud completa) sondeado con el anticuerpo 7E11-C5. Carriles 1,2 = marcadores del PM; Carril 3 = lisado de células SF9 infectado con virus irrelevante; Carril 4 = lisado de células SF9; y Carril 5 = inserto de PSMA de 1,9 kb que contiene lisado de SF9 infectado con virus. Nótese que se observaban bandas no positivas a 7E11-C5 con cualesquiera productos proteínicos presentados en células SF9 o aquellos infectados con cualquier virus.

Figura 19. Transferencia Western de PSMA y PSM' obtenidos de células LNCaP, fluido seminal humano y suero humano sondeado con anticuerpo monoclonal 3D7-1.1. Carril 1 = lisado de células LNCaP; Carril 2 = PSMA purificado por inmunoafinidad con 7E11-C5 procedente de células LNCaP; Carril 3 = fluido seminal humano; y Carril 4 = suero de varón humano. Se indican las posiciones de PSMA y PSM'.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de PSMA, a métodos para usar tales anticuerpos y a una variante proteínica truncada, PSM', identificada por tales anticuerpos. Aunque los procedimientos y métodos específicos descritos aquí se ejemplifican usando un péptido C-terminal o una preparación de membranas de tumores que expresan PSMA para inmunizar ratones, son meramente ilustrativos para la práctica de la invención. Procedimientos y técnicas análogos son igualmente aplicables a una variedad de huéspedes animales inmunizados contra PSMA en forma de proteína, péptidos, antígeno de la superficie celular y preparaciones de membranas en bruto.

5.1 Líneas celulares de hibridoma y producción de anticuerpos

En una modalidad específica a modo de ejemplo en la Sección 6, posteriormente, un péptido sintético derivado de la región C-terminal de PSAM se usó como un inmunógeno. Los resultados muestran que un anticuerpo denominado 3F5.4G6 se une al dominio extracelular de PSMA, que se expone a la superficie celular de células de cáncer de próstata vivas y en los sueros de pacientes con cáncer de próstata. Adicionalmente, un segundo ejemplo de trabajo en la Sección 7, posteriormente, demuestra la producción de dos anticuerpos monoclonales dirigidos al dominio extracelular de PSMA después de la inmunización de animales con una preparación de membranas de tumor que expresa PSMA. En relación con esto, células cancerosas tales como LNCaP, que expresan PSMA, células huésped transfectadas con la secuencia de codificación de PSMA, PSMA purificado, PSM' o péptidos del dominio extracelular de PSMA pueden usarse como inmunógeno para provocar una respuesta inmunitaria en huéspedes animales para la generación de anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de PSMA.

Células somáticas con el potencial para producir anticuerpo y, en particular, los linfocitos B, son adecuadas para la fusión con una línea de mieloma de células B. Esas células que producen anticuerpos que están en la fase de plasmablasto en división se fusionan preferentemente. Las células somáticas pueden obtenerse de los nódulos linfáticos, los bazos y la sangre periférica de animales cebados con antígeno, y las células linfáticas de elección dependen en una gran extensión de su utilidad empírica en el sistema de fusión particular. Animales cebados una vez o hiperinmunizados pueden usarse como una fuente de linfocitos productores de anticuerpos. Los linfocitos de ratón dan un porcentaje mayor de fusiones estables con las líneas de mieloma de ratón descritas posteriormente. De estas, se prefiere el ratón BALB/c. Sin embargo, pueden usarse otras cepas de ratón, conejos, hámsteres, ovejas y ranas como huéspedes para preparar células productoras de anticuerpos. Según se revisa por Coding (en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
2ª ed., pp. 60-61, Orlando, Fla., Academic Press, 1986), el uso de linfocitos de rata puede proporcionar varias ventajas.

Alternativamente, células somáticas humanas capaces de producir anticuerpo, específicamente linfocitos B, son adecuadas para la fusión con líneas celulares de mieloma. Aunque pueden usarse linfocitos B de bazos, lenguas o nódulos linfáticos sometidos a biopsia de individuos, se prefieren los linfocitos B de sangre periférica más fácilmente accesibles. Los linfocitos pueden derivarse de pacientes con carcinomas de próstata diagnosticados. Además, células B humanas pueden inmortalizarse directamente mediante el virus de Epstein-Barr (Cole y otros, 1995, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Líneas celulares de mieloma adecuadas para usar en procedimientos de fusión productores de hibridoma preferiblemente no son productoras de anticuerpo, tienen alta eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que apoyan el crecimiento de los hibridomas deseados. Ejemplos de tales líneas celulares de mieloma que pueden usarse para la producción de híbridos celulares fusionados de la invención incluyen P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4.1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul, todas derivadas de ratones; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210 derivadas de ratas y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, todas derivadas de seres humanos (Goding en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., pp. 65-66, Orlando, Fla., Academic Press, 1986; Campbell, en Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden y Von Knippenberg, eds. pp. 75-83, Ámsterdam, Elseview, 1984).

Métodos para generar híbridos de células de bazo o nódulo linfático y células de mieloma productoras de anticuerpo comprenden habitualmente mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción de 2:1 (aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1), respectivamente, en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que promueven la fusión de membranas celulares. A menudo se prefiere que la misma especie de animal sirva como la fuente de las células somáticas y de mieloma usadas en el procedimiento de fusión. Métodos de fusión han sido descritos por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519) y por Gefter y otros, (1977, Somatic Cell Genet. 3:231-236). Los agentes de promoción de la fusión usados por esos investigadores eran virus de Sendai y polietilenglicol (PEG), respectivamente. Métodos de fusión revisados por Goding (1986, en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., pp. 71-74, Orlando, Fla., Academic Press), incluyendo el anterior así como la fusión inducida eléctricamente, también son adecuados para generar anticuerpos monoclonales de la invención.

Los procedimientos de fusión producen habitualmente híbridos viables a frecuencia muy baja, aproximadamente 1 x 10^{-6} a 1 x 10^{-8} células somáticas. Debido a la baja frecuencia para obtener híbridos viables, es esencial tener un medio para seleccionar híbridos celulares fusionados de las células no fusionadas restantes, particularmente las células de mieloma no fusionadas. También es necesario un medio para detectar los hibridomas productores de anticuerpo deseados entre los otros híbridos celulares fusionados resultantes.

Generalmente las células fusionadas se cultivan en medios selectivos, por ejemplo medio HAT que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. El medio HAT permite la proliferación de células híbridas y evita el crecimiento de células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente. La aminopterina bloquea la síntesis de novo de purina y pirimidina inhibiendo la producción de tetrahidrofolato. La adición de timidina evita el bloqueo en la síntesis de pirimidina, mientras que la hipoxantina se incluye en el medio de modo que las células inhibidas sinteticen purina usando la ruta de recuperación de nucleótidos. Las células de mieloma empleadas son mutantes que carecen de hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) y así no pueden utilizar la ruta de recuperación. En el híbrido superviviente, el linfocito B suministra información genética para la producción de esta enzima. Puesto que los propios linfocitos B tienen una duración de vida limitada en cultivo (aproximadamente dos semanas), las únicas células que pueden proliferar en medios HAT son híbridos formados a partir de células de mieloma y bazo.

Para facilitar el rastreo de anticuerpo secretado por los híbridos y para evitar que los híbridos individuales hagan sobrecrecer otros, la mezcla de mieloma fusionado y linfocitos B se diluye en medio HAT y se cultiva en múltiples pocillos de placas de microvaloración. En de dos a tres semanas, cuando los clones híbridos se hacen visibles microscópicamente, el fluido sobrenadante de los pocillos individuales que contienen clones híbridos se ensaya con respecto al anticuerpo específico. El ensayo debe ser sensible, simple y rápido. Técnicas de ensayo incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos citotóxicos, ensayos en placas, ensayos de inmunounión con gotas, y similares.

Una vez que los híbridos celulares fusionados deseados se han seleccionado y clonado en líneas celulares productoras de anticuerpos individuales, cada línea celular puede propagarse de cualquiera de dos modos estándar. Una muestra del hibridoma puede inyectarse en un animal histocompatible del tipo que se usaba para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido celular fusionado. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis, pueden extraerse para proporcionar anticuerpos monoclonales con alta concentración. Alternativamente, las líneas celulares individuales pueden propagarse in vitro en recipientes de cultivo de laboratorio; el medio de cultivo, que también contiene altas concentraciones de un solo anticuerpo monoclonal específico, puede recogerse mediante decantación, filtración o centrifugación.

Anticuerpos monoclonales o fragmentos purificados de los anticuerpos monoclonales que tienen al menos una porción de la región que se une a antígeno, incluyendo fragmentos tales como Fv, F(ab')_{2}, Fab (Harlow y Lane, 1988, Antibody, Cold Spring Harbor), anticuerpos monocatenarios (Patente de EE.UU. 4.946.778), anticuerpos quiméricos o humanizados (Morrison y otros, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Newuberger y otros, 1984 Nature 81:6851) y regiones determinantes complementariamente (CDR), pueden prepararse mediante un procedimiento convencional. La purificación de los anticuerpos o fragmentos puede efectuarse mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos, incluyendo precipitación mediante sulfato amónico o sulfato sódico seguida por diálisis contra solución salina, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o inmunoafinidad, así como filtración en gel, electroforesis zonal, etc. (véase Coding en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., pp 104-126, Orlando, Fla., Academic Press).

5.2 Caracterización de anticuerpos monoclonales y PSM'

Usando técnicas descritas generalmente en la Sección 5.1 anteriormente e ilustradas en las Secciones 6 y 7, posteriormente, tres líneas celulares de hibridoma se seleccionaron debido a su producción de anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de PSMA. La presente invención abarca los anticuerpos 3F5.4G6, 3D7-1.1 y 4E10-1.14 así como otros anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al dominio extracelular de PSMA y PSM', incluyendo particularmente cualesquiera anticuerpos que inhiban competitivamente la unión de uno cualquiera o más de los tres anticuerpos mencionados anteriormente a PSMA según se determina en un imunoensayo enzimático, un radioinmunoensayo o cualquier otro inmunoensayo de unión competitiva.

El anticuerpo 3F5.4G6 es un anticuerpo de isotipo IgM que se une específicamente a PSMA expresado en lisados de células de cáncer de próstata y sobre la superficie celular de células de cáncer de próstata, así como en sueros obtenidos de pacientes con carcinoma de próstata. Además, 3F5.4G6 también se une específicamente a PSM'. El epítopo de PSMA reactivo con 3F5.4G6 es extracelular, C-terminal y distinto al reconocido por 7E11-C5 (Horoszewicz y otros, Anticáncer Res. 7:927-936) que está asociado con la membrana en el citoplasma de la célula. Los anticuerpos 3D7-1.1 y 4E10-1.14 también son anticuerpos de IgM y se unen a PSMA expresado en lisados de células de cáncer de próstata y sobre la superficie celular. Estos anticuerpos pueden usarse para detectar tanto cáncer de próstata primario como tumores metastáticos tales como metástasis óseas de cáncer de próstata.

Durante el desarrollo de una respuesta de anticuerpo, las células productoras de anticuerpo secretan en primer lugar el isotipo IgM que finalmente cambia hasta IgG. Tales episodios de cambio de clase se producen mediante transposición de DNA de genes de la región constante de modo que se retiene la especificidad para el mismo antígeno. Los diferentes isotipos de anticuerpo poseen diferentes funciones efectoras. Por ejemplo, IgM y todas las subclases IgG excepto IgG4 pueden fijar el complemento al unirse al antígeno. En contraste, IgE se une a células cebadas en una reacción alérgica para activar la liberación de histamina.

Las líneas celulares de hibridoma también producen variantes de cambio de clase durante el cultivo a largo plazo. En particular, anticuerpos monoclonales que cambian de IgM en IgG o IgG_{1} en IgG_{2a} se han seleccionado por su afinidad superior para la proteína A, lo que facilita su purificación. Cualquier variante de cambio de clase puede seleccionarse para una función efectora deseable particular (Spira y otros, 1985, En Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine, ed. springer, pp. 77-88, Plenum Press, NY; Harlow y Lane, 1988 Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory). En el caso de los anticuerpos ejemplificados, puesto que son de isotipo IgM, también es deseable seleccionar con respecto a variantes de IgG que posean la misma especificidad para antígeno, que pueden ser más útiles para ciertos propósitos in vitro o in vivo. La presente invención abarca variantes de IgG de los anticuerpos monoclonales de la invención, incluyendo 3F5.4G6, 3D7-1.1 y 4E10-1.14.

Las Secciones 6 y 7, posteriormente, muestran que los anticuerpos ejemplificados reconocen una proteína de 120 kDa de peso molecular. En particular, 3F5.4G6 también reconoce una proteína de 105-110 kDa de peso molecular en lisados de células de tumor de próstata. Aunque la proteína de 120 kDa también es reconocida por el anticuerpo 7E11-C5, la proteína de peso molecular inferior es detectada solo por los anticuerpos 3F5.4G6, 3D7-1.1 y 4E10-1.14. Por lo tanto, la proteína de 105-110 kDa representa el producto de un mRNA conocido como PSM'. Sin embargo, antes de la presente invención, nunca se presentó una proteína de PSM', y se creía que era un mRNA no traducido. Puesto que se supone que la secuencia de aminoácidos de PSM' carece de regiones citoplásmicas de transmembrana de PSMA según se deduce a partir de su secuencia de RNA, es razonable que 7E11-C5 no reaccionara con este producto debido a su especificidad para un epítopo intracelular. En contraste, los anticuerpos 3F5.4G6, 3D7-1.1 y 4E10-1.14 específicos para el dominio extracelular de PSMA también reconocen PSM'.

5.3 Secuencias de codificación de anticuerpos monoclonales específicos para PSMA

En otra modalidad de la invención, las líneas celulares de hibridoma ejemplificadas pueden usarse para producir composiciones que comprenden un sitio de unión a antígeno o variantes de anticuerpo que combinan las regiones variables o hipervariables múridas con la región constante o las regiones estructurales constantes y variables humanas, es decir, anticuerpos quiméricos o humanizados así como anticuerpos humanizados que retienen solo las CDRs que se unen a antígeno procedentes del anticuerpo originario en asociación con regiones estructurales humanas (véanse, Waldmann, 1991, Science 252:1657, 1662, particularmente 1658-59 y las referencias citadas allí). Se espera que tales anticuerpos quiméricos o humanizados que retienen la especificidad de unión del anticuerpo múrido tengan inmunogenicidad reducida cuando se administran in vivo para aplicaciones diagnósticas, profilácticas o terapéuticas de acuerdo con la invención.

En otras modalidades más, la invención abarca el uso de las líneas celulares de hibridoma como una fuente de DNA o mRNA que codifica para los genes de inmunoglobulina activados transpuestos, que pueden aislarse, clonarse mediante técnicas de DNA recombinante conocidas y transferirse a otras células para la producción de fragmentos que se unen a antígeno específicos para el dominio extracelular de PSMA. Aislando DNA transpuesto o preparando cDNA a partir del RNA mensajero de la línea celular de hibridoma de la invención, puede obtenerse una secuencia libre de intrones.

Para ilustrar, y no a modo de limitación, una biblioteca de inmunoexpresión puede prepararse y rastrearse con respecto a fragmentos que se unen a anticuerpo para PSMA y PSM' como sigue (véase, Huse y otros, 1989, Sci. 246:1275-1281; Mullinax y otros, 1990, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:8045-8099). RNA total pueden purificarse (por ejemplo, usando estuches disponibles comercialmente) y convertirse en cDNA usando un oligo(dT) cebador para la cadena ligera (L) y un cebador específico para la cadena pesada (H) usando transcriptasa inversa. La amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuencias de cadenas H y L de inmunoglobulina puede realizarse separadamente con grupos de pares de cebadores. Los cebadores aguas arriba pueden diseñarse para hibridarse a secuencias parcialmente conservadas en las regiones líder y/o estructural de V_{H} o V_{L} y cebadores aguas abajo pueden diseñarse para hibridarse a secuencias dominiales constantes. Tales cebadores conservarían la cadena L de longitud completa y proporcionarían cadenas H correspondientes al Fd de IgG y que conservan las uniones de disulfuro H-L. Los fragmentos de DNA L y H amplificados por PCR se digieren a continuación y se ligan separadamente en vectores de cadena H y L. Tales vectores contienen una secuencia líder pelB, un sitio de unión a ribosomas y codones de parada. Vectores del fago \lambda adecuados para la expresión en E. coli pueden prepararse a partir de vectores disponibles comercialmente (ImmunoZAp L, ImmunoZAP H; Stratacyte, La Jolla, CA). El DNA fágico recombinante ligado se incorpora en el bacteriófago con extracto de empaquetamiento in vitro y se usa para infectar E. coli. La biblioteca de inmunoexpresión así creada se rastrea con respecto a fragmentos de unión a antígeno usando PSMA, PSM' o un péptido específico de los mismos. Los clones positivos pueden rastrearse e identificarse según se describe por Mullinax y otros, (anteriormente).

5.4 Usos de anticuerpos y composiciones de anticuerpos específicos para el dominio extracelular de PSMA

Aunque los procedimientos y métodos específicos descritos aquí se ejemplifican usando los anticuerpos monoclonales de la invención, son meramente ilustrativos para la práctica de la invención. Fragmentos purificados de los anticuerpos monoclonales que tienen al menos una porción de la región que se une a antígeno, incluyendo fragmentos Fv, F(ab')_{2}, Fab, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos o humanizados o CDRs, pueden usarse en los procedimientos y métodos descritos posteriormente de acuerdo con la presente invención.

5.4.1 Aplicaciones inmunohistológicas e inmunocitológicas

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden usarse para detectar células de carcinoma de próstata en especímenes histológicos y citológicos y, en particular, para distinguir tumores malignos de tejidos normales y tumores no malignos. Los especímenes tisulares pueden teñirse mediante los anticuerpos y su unión detectarse mediante un segundo anticuerpo conjugado a una etiqueta tal como peroxidasa, fluoresceína, fosfata alcalina y similares.

Además, las técnicas de inmunofluorescencia pueden usar los anticuerpos monoclonales de la presente invención para examinar especímenes de tejido, células y fluido corporal humano. En un protocolo típico, rodajas que contienen secciones criostáticas de muestras de biopsia tisular no fijadas congeladas o frotis citológicos se secan al aire, se fijan con formalina o acetona y se incuban con la preparación de anticuerpo monoclonal en una cámara humidificada a temperatura ambiente.

Las rodajas se lavan a continuación y se incuban adicionalmente con una preparación de anticuerpo dirigido contra el anticuerpo monoclonal, habitualmente algún tipo de anti-inmunoglobulina de ratón si los anticuerpos monoclonales usados se derivan de la fusión de un linfocito de bazo de ratón y una línea celular de mieloma de ratón. Esta anti-inmunoglobulina de ratón se etiqueta con un compuesto, por ejemplo rodamina o isotiocianato de fluoresceína, que emite fluorescencia a una longitud de onda particular. El patrón y las intensidades de tinción dentro de la muestra se determinan a continuación mediante microscopia óptica fluorescente y opcionalmente se registran fotográficamente.

Como otra alternativa más, puede usarse análisis de imágenes de fluorescencia mejorado informáticamente o citometría de flujo para examinar especímenes tisulares o células exfoliadas, es decir, preparaciones de células simples procedentes de biopsias de aspiración de tumores de próstata, usando los anticuerpos monoclonales de la invención. Los anticuerpos monoclonales de la invención son particularmente útiles en la cuantificación de células tumorales vivas, es decir, preparaciones de células procedentes de biopsias de aspiración de tumores de próstata, mediante un analizador de imágenes de fluorescencia mejorado informáticamente o con un citómetro de flujo. El uso de los anticuerpos 3F5-4G6, 3D7-1.1 y E10-1.14 en tales ensayos es valioso para diferenciar tumores de próstata benignos de malignos ya que el PSMA al que se unen los anticuerpos monoclonales es expresado en cantidades incrementadas por tumores malignos. El porcentaje de población de células positivas a PSMA, solo o junto con la determinación de la ploidía de DNA de estas células, puede, adicionalmente, proporcionar una información de pronóstico muy útil proporcionando un indicador primario del avance de la enfermedad.

En otra modalidad alternativa más, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden usarse en combinación con otros anticuerpos de próstata conocidos para proporcionar información adicional relativa al fenotipo maligno de un carcinoma de próstata.

5.4.2 Aplicaciones inmunoserológicas

El uso de los anticuerpos monoclonales de la invención puede extenderse al rastreo de fluidos biológicos humanos con respecto a la presencia de los determinantes antigénicos específicos reconocidos. La evaluación inmunoserológica in vitro de fluidos biológicos extraídos de pacientes permite de ese modo el diagnóstico no invasivo de cánceres. A modo de ilustración, fluidos corporales humanos tales como fluido prostático, fluido seminal, sangre entera, suero u orina pueden tomarse de un paciente y ensayarse con respecto al epítopo específico, como antígeno liberado o unido a la membrana sobre células del fluido de muestra, usando anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de PSMA y PSM' en radioinmunoensayos estándar o inmunoensayos con enzimas ligadas, inmunoensayos con enzimas ligadas de unión competitiva, transferencia por gotas o transferencia Western u otros ensayos conocidos en la técnica.

Además, un ensayo diagnóstico más sensible para proteína de PSMA o PSM' puede desarrollarse a través del uso de anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos no solapados sobre PSMA y PSM'. Anticuerpos específicos para extremos opuestos de PSMA tales como 7E11-C5 y 3F5.4G6, 3D7-1.1 o 4E10-1.14 son particularmente adecuados para usar en tal ensayo. A este respecto, un anticuerpo puede anclarse a un substrato para capturar PSMA o PSM' en un fluido biológico, mientras que el otro anticuerpo se usa para detectar el antígeno unido a anticuerpo. Además, puesto que la expresión de PSMA y PSM' se incrementa en tejidos de cáncer de próstata y de próstata normal, respectivamente, los anticuerpos que distinguen estas dos formas pueden usarse para proporcionar un modo más exacto de verificar la regresión frente a la progresión del tumor, después del tratamiento. Puesto que 3F5.4G6, 3D7-1.1 y 4E10-1.14 reconocen ambas formas, pero 7E11-C5 solo se une a PSMA, estos anticuerpos pueden usarse juntos para determinar los niveles precisos de cada forma en un paciente, correlacionando de ese modo sus cantidades con la carga tumoral. Por ejemplo, 7E11-C5 puede usarse como un anticuerpo anclado en un ensayo de captura bilocal, y uno cualquiera de los otros tres anticuerpos puede usarse como un anticuerpo de detección para cuantificar PSMA. Por otra parte, cualquier combinación de dos de los tres anticuerpos específicos para el dominio extracelular de PSMA puede usarse en un ensayo de captura bilocal similar para medir específicamente concentraciones totales de PSM' más PSMA. Una substracción simple de PSMA de PSMA y PSM' totales cuantifica específicamente
PSM'.

Además de la detección de PSMA y PSM' de dominio extracelular mediante un anticuerpo monoclonal en tejidos y fluidos corporales, las medidas de la actividad de la enzima NAALADasa pueden utilizarse para cuantificar PSMA y/o PSM' de dominio extracelular en tejidos y/o fluidos corporales.

Por ejemplo, los niveles tisulares pueden determinarse solubilizando con detergente tejidos que se homogeneízan, nodulizando el material insoluble mediante centrifugación y medida de la actividad de NAALADasa en el sobrenadante restante. Asimismo, la actividad de NAALADasa en fluidos corporales también puede medirse nodulizando en primer lugar el material celular mediante centrifugación y realizando un ensayo enzimático típico con respecto a la actividad de NAALADasa sobre el sobrenadante.

También pueden aplicarse protocolos de ensayo de NAALADasa que se benefician de las especificidades de unión de los anticuerpos. Por ejemplo, superficies sólidas revestidas con anticuerpos 7E11-C5, 3F5.4G6, 3D7-1.1 o 4E10-1.14 podrían usarse para capturar la proteína de PSMA o PSM' para la detección usando un ensayo enzimático de NAALADasa. Así, este puede usarse para detectar y cuantificar diferencialmente proteína de PSMA de longitud completa y PSM' en un espécimen, dado que un anticuerpo específico para el dominio extracelular se une tanto a PSMA como a PSM', mientras que 7E11-C5 solo se uniría a PSMA.

También pueden aplicarse ensayos enzimáticos de NAALADasa más convenientes, que se benefician de las propiedades de reacción de la glutamato deshidrogenasa (Frieden, 1959, J. Biol. Chem., 234:2891). En este ensayo, el producto de reacción de la enzima NAALADasa es ácido glutámico. Este se deriva de la segmentación catalizada por enzima de glutamato de N-acetilaspartilo para dar ácido N-acetilaspártaico y ácido glutámico. El ácido glutámico, en una etapa que requiere NAD(P)^{+}, da 2-oxoglutarato más NAD(P)H en una reacción catalizada por glutamato deshidrogenasa. El avance de la reacción puede medirse fácilmente y convenientemente mediante el cambio en la absorbancia a 340 nm debido a la conversión de NAD(P^{)+} en NAD(P)H. Así, pueden alcanzarse mejoras en el ensayo de actividad de NAALADasa aplicable a un formato en fase sólida con anticuerpos de captura inmovolizados. De este modo, pueden efectuarse múltiples ensayos simultáneamente en un lector de microplacas basándose en el cambio de absorbancia a 340 nm antes y después de la adición de NAD^{+} o NADP^{+}. No se restringiría a ensayos en fase sólida, ya que también serían posibles ensayos en solución de, por ejemplo, suero, con este tipo de ensayo de NAALADasa.

Pueden prepararse estuches que contienen los anticuerpos monoclonales de la invención o fragmentos de los mismos para diagnóstico, pronóstico y/o verificación in vitro de carcinoma de próstata mediante los métodos inmunohistológicos, inmunocitológicos e inmunoserológicos descritos anteriormente. Los componentes de estos estuches pueden envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada. Cuando los anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos) se usan en los estuches en forma de conjugados en los que está enlazado un resto de etiquetaje, tal como una enzima o un ion metálico radiactivo, los componentes de tales conjugados pueden suministrarse en forma completamente conjugada, en forma de productos intermedios o como restos separados que han de ser conjugados por el usuario del estuche.

Un estuche puede comprender un portador que está compartimentalizado para recibir en confinamiento cerrado en el mismo uno o más medios de contención o una serie de medios de contención tales como tubos de ensayo, viales, matraces, botellas, jeringas o similares. Un primero de dichos medios de contención o serie de medios de contención puede contener el anticuerpo monoclonal (o un fragmento del mismo) o PSMA o PSM'. Un segundo medio de contención o serie de medios de contención puede contener una etiqueta o un producto intermedio conector-etiqueta capaz de unirse al anticuerpo primario (o fragmento del mismo), PSMA o PSM'.

5.4.3 Usos diagnósticos, profilácticos y terapéuticos in vivo

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos de esta invención son particularmente útiles para dirigirse a células de cáncer de próstata in vivo. Pueden usarse para la localización de tumores para detección y verificación así como para la terapia de carcinoma de próstata primario y metástasis. Para estas aplicaciones in vivo, es preferible usar anticuerpos monoclonales purificados o fragmentos purificados de los anticuerpos monoclonales que tengan al menos una porción de una región de unión a antígeno, incluyendo fragmentos tales como Fv, F(ab')_{2}, Fab (Harlow y Lane, 1988, Antibody Cold Spring Harbor), anticuerpos monocatenarios (Patente de EE.UU. 4.946.778), anticuerpos quiméricos o humanizados (Morrison y otros, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Newuberger y otros, 1984 Nature 81:6851), regiones determinantes complementariamente (CDR) y similares. La purificación de los anticuerpos o fragmentos puede efectuarse mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos, incluyendo precipitación mediante sulfato amónico o sulfato sódico seguida por diálisis frente a solución salina, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o inmunoafinidad, así como filtración en gel, electroforesis zonal, etc. (véase Goding en, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., pp 104-126, Orlando, Fla., Academic Press).

Para usar en la detección y/o la verificación in vivo de carcinoma de próstata, los anticuerpos monoclonales purificados pueden ligarse covalentemente, directamente o a través de un conector, a un compuesto que sirve como un grupo informador para permitir la obtención de imágenes de tejidos u órganos específicos después de la administración y la localización de los conjugados o complejos. Una variedad de diferentes tipos de substancias puede servir como el grupo informador, incluyendo tales como colorantes radioopacos, isótopos metálicos y no metálicos radiactivos, compuestos fluorogénicos, compuestos fluorescentes, isótopos emisores de positrones, metales no paramagnéticos, etc.

Para usar en la terapia in vivo del carcinoma de próstata, los anticuerpos monoclonales purificados pueden usarse solos o ligados covalentemente, directamente o a través de un conector, a un compuesto que destruye y/o inhibe la proliferación de las células o tejidos malignos después de la administración y la localización de los conjugados. Cuando el anticuerpo se usa por sí mismo, puede mediar en la destrucción del tumor mediante fijación del complemento o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse en combinación con un fármaco quimioterapéutico para dar como resultado efectos terapéuticos sinérgicos (Baslya y Mendelsohn, 1994 Breast Cáncer Res. and Treatment 29:127-138). Una variedad de diferentes tipos de substancias puede conjugarse directamente al anticuerpo para usos terapéuticos, incluyendo isótopos radiactivos metálicos y no metálicos, fármacos quimioterapéuticos, toxinas, etc. (Vitetta y Uhr, 1985, Annu. Rev. Immunol. 3:197).

De acuerdo con una modalidad alternativa, para la terapia in vivo de carcinoma de próstata, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden modificarse para estar en la forma de un anticuerpo bifuncional o biespecífico, es decir, un anticuerpo que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de antígeno de membrana específico para la próstata y una región de unión a antígeno específica para una célula efectora que tiene actividad tumoricida o inhibidora de tumores. Las dos regiones de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico están típicamente conectadas o pueden ser expresadas por una célula genéticamente manipulada para producir el compuesto biespecífico. (Véase Fanger y otros, 1995 Drug News & Perspec. 8(3):133-137). Células efectoras adecuadas que tienen actividad tumoricida incluyen, pero no se limitan a, células T citotóxicas (principalmente células CD8^{+}), células asesinas naturales, etc. Una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se administra a un paciente de cáncer de próstata y el anticuerpo biespecífico destruye y/o inhibe la proliferación de las células malignas después de la localización en sitios de tumores primarios o metastáticos que tienen PSMA.

Métodos para la preparación de conjugados de anticuerpo de los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de la invención útiles para la detección, la verificación y/o la terapia se describen en las Patentes de EE.UU. Nº 4.671.958, 4.741.900 y 4.867.973.

Pueden prepararse estuches para usar con tales métodos de localización y terapia de tumores in vivo que contienen los anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos) conjugados a cualquiera de los tipos anteriores de substancias. Los componentes de los estuches pueden envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada. Cuando los anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos) se usan en los estuches en forma de conjugados en los que está ligada una etiqueta o un resto terapéutico, tales como un ion metálico radiactivo o un resto de fármaco terapéutico, los componentes de tales conjugados pueden suministrarse en forma completamente conjugada, en forma de productos intermedios o como restos separados que han de ser conjugados por el usuario del estuche.

6. Ejemplo Producción de un anticuerpo monoclonal contra un péptido de PSMA 6.1 Materiales y métodos 6.1.1 Preparación de péptido inmunizante

Péptido de PSMA Nº 716-723 (NH_{2}-ESKVDPSK-) se acopló a hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) como un portador usando el método EDC de Pierce (Rockford, IL). El complejo péptido-KLH se emulsificó en adyuvante incompleto de Freund (Sigma, St. Louis, MO) que contenía 1 mg/ml de dipéptido muramílico (MDP, Pierce, Rockford, IL) a una concentración final de 250 mg/ml. La preparación de antígeno emulsificada se almacenó a 4ºC.

6.1.2 Inmunización

Ratones hembra BALB/c se inmunizaron subcutáneamente con 0,1 ml del complejo de péptido-portador emulsificado cada catorce días durante un período de seis semanas. Los ratones se sangraron y sus sueros se probaron en un radioinmunoensayo (RIA) específico para el péptido con respecto a la presencia de anticuerpos anti-péptido. Los ratones que resultaban positivos para anticuerpos anti-péptido con una valoración de 1:1.000 o más se usaron como donantes en un protocolo de fusión. Tres días antes de la fusión, los ratones se inmunizaron intraperitonealmente con 50 \mug de complejo péptido-KLH disuelto en solución salina.

6.1.3 Fusión celular

Tres días después de la estimulación final con el mismo complejo péptido-KLH, el bazo de un ratón BALB/c se extirpó asépticamente y se preparó una suspensión de células individuales. Los glóbulos rojos se sometieron a lisis mediante el choque osmótico y los linfocitos restantes se suspendieron en medio RPMI-1640. Los esplenocitos se mezclaron con células de mieloma P3X63Ag8U.1 (X63) (CRL 1597 de ATCC, Rockville, MD) a una relación de 10:1 (100 x 10^{6} esplenocitos:10 x 10^{6} células de mieloma X63). La fusión de los esplenocitos a las células X63 se realizó mediante el método de Galfre y Milstein (1981, Methods in Enzymology, Vol.73, Immunochemical Techniques, Parte B). Se seleccionaron células de hibridoma mediante la inclusión de aminopterina en el medio de cultivo celular (RPMI-1640-suero de ternero fetal al 20%).

6.1.4 Rastreo de hibridomas primarios

Cincuenta microlitros (\mul) de sobrenadante de cultivo celular se retiraron de cultivos de hibridoma individuales y se probaron en un RIA específico para el péptido con respecto a la presencia de anticuerpos específicos para el péptido. Brevemente, los sobrenadantes se añadieron a pocillos de una placa Pro-Bind de 96 pocillos (Falcon) que previamente se había revestido con péptido acoplado a alúmina de suero bovino (BSA) a 50 \mug/ml. Después de una incubación nocturna a 4ºC, las placas se lavaron cuatro veces con PBS-BSA al 0,1%. Cincuenta microlitros de una dilución 1:500 de anti-(IgM e IgG de conejo) de ratón (ICN) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces como anteriormente y se añadieron a cada pocillo 50 \mul de ^{125}I-Proteína A. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron cuatro veces como anteriormente. Las placas se expusieron a película autorradiográfica (Kodak, X-OMAT) durante la noche y se revelaron. Los pocillos positivos se seleccionaron y las células se expandieron en medio de cultivo celular para pruebas adicionales.

6.1.5 Rastreo por transferencia Western

Sobrenadantes de los pocillos positivos y expandidos se probaron en un ensayo de transferencia Western con respecto a anticuerpos anti-PSMA. Lisados de la línea de células tumorales LNCaP (CRL 1740 de ATCC, Rockville, MD), un tumor de próstata que expresa PSMA, se trasladaron por un gel de SDS-poliacrilamida durante 90 minutos a 175 voltios. Las proteínas sometidas a electroforesis se electrotransfirieron a una membrana Immobilon-P™ y la membrana se bloqueó mediante una incubación nocturna con BLOTTO al 5% en solución salina tamponada con Tris. La membrana se puso en un aparato de multirrastreo Bio-Rad (Bio-Rad) y aproximadamente 650 \mul de sobrenadante de hibridoma se pipetearon en carriles individuales. La membrana se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente y la transferencia se lavó 5 veces con solución salina tamponada con Tris-Tween-20 al 0,5% (TBS-T). La transferencia lavada se incubó con una dilución 1:5.000 de anti-(IgG de ratón) caprino etiquetada con peroxidasa (Kirkegaard y Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se lavó 5 veces como anteriormente y se incubó durante 1 minuto con 2 ml de substrato quimioluminiscente LumiGLO™ (KPL, Gaithersburg, MD). La transferencia se expuso a película autorradiográfica y se reveló. Los pocillos de hibridoma positivos (reactividad anti-PSMA) se identificaron y se seleccionaron para el revelado adicional.

6.1.6 Clonación por dilución limitativa

Los pocillos de hibridoma primario positivos se identificaron mediante su reactividad con PSMA en el ensayo de transferencia Western descrito anteriormente y se clonaron mediante dilución limitativa. Las células se ajustaron a 1 célula/ml en medio de cultivo celular completo que contenía timocitos singeneicos como una población de células alimentadoras. La suspensión de células se aportó en partes alícuotas de 200 \mul a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Después de 7-10 días de cultivo, eran visibles colonias de células. Los pocillos que contenían colonias individuales se recogieron y las células se expandieron en placas de 24 pocillos (cultivos de 1,5 ml). Los sobrenadantes procedentes de las células clonales se recogieron y se probaron con respecto a anticuerpos anti-PSMA en el ensayo de transferencia Western descrito anteriormente. Los clones positivos se expandieron y se congelaron en nitrógeno líquido.

6.1.7 Generación de fluido de ascitis y purificación de anticuerpos

Ratones BALB/c se cebaron con 0,4 ml de pristano intraperitonealmente 7-10 días antes de la inyección de 10 x 10^{6} células de hibridoma. El fluido de ascitis que contenía anticuerpo monoclonal se drenó a intervalos periódicos y se almacenó a 4ºC. El anticuerpo monoclonal se purificó de fluido de ascitis usando el estuche de purificación de IgM ImmunoPure™ de Pierce (Rockford, IL).

6.1.8 Inmunoprecipitación de PSMA

Aproximadamente 10 x 10^{6} células tumorales LNCaP se incubaron con 1 ml de tampón de lisis NP-40 (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%-Tris 50 mM) durante 30 minutos a 4ºC. El lisado se centrifugó a 12.000 rpm y el sobrenadante resultante se preclarificó incubando con 50 \mul de suero de ratón normal durante 30 minutos seguido por la adición de 60 \mul de una suspensión al 20% de cuentas de agarosa anti-(IgM de ratón). Después de la incubación durante 1 hora a 4ºC, la preparación se centrifugó para retirar las cuentas y el sobrenadante resultante se hizo reaccionar con anticuerpo monoclonal 3F5.4G6. Se añadieron cantidades variables de anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 (2,5, 5 y 10 \mug) a tres lisados de réplica y se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Se añadieron 100 microlitros de una suspensión al 10% de cuentas de agarosa anti-(IgM de ratón) (Sigma) y los lisados se incubaron durante 1 hora adicional a 4ºC. Los lisados se centrifugaron a 12.000 rpm y las cuentas de agarosa se lavaron tres veces con tampón de lisis NP-40. Treinta microlitros de tampón de muestra de electroforesis se añadieron a las cuentas y se calentaron durante 10 minutos a 95ºC. Las cuentas se centrifugaron brevemente a 12.000 rpm y el tampón de muestra se cargó sobre un gel de SDS-poliacrilamida. Después de la electroforesis, las muestras se electrotransfirieron como se describe anteriormente y se realizó una transferencia Western usando el anticuerpo monoclonal específico para PSMA 7E11-C5 como el anticuerpo de información.

6.1.9 Análisis citométrico de flujo

Las células se enjuagaron en primer lugar con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadió solución de Versene (0,2 g de EDTA.4Na/L) (2 ml para un matraz de 75 cm^{2}). La mayoría de la solución de Versene se retiró mediante aspiración antes de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió PBS y las células se desalojaron pipeteando. Las células se lavaron dos veces con PBS y se contaron. De cinco mil a un millón de células se incubaron sobre hielo con 50 \mul de anticuerpo primario durante 30 minutos, seguido por dos lavados con PBS. Las células se incubaron subsiguientemente sobre hielo con 50 \mul de anticuerpo secundario (anti-(IgG de ratón) caprino para 7E11-C5 o anti-(IgM de ratón) caprino para 4G6) etiquetado con FITC durante 30 minutos. El anticuerpo secundario en exceso se separó por lavado de las células con PBS. La fluorescencia se analizó usando un citómetro de flujo (FACScan, Becton Dickinson, San José, CA). Los residuos celulares se excluyeron de las poblaciones celulares que se analizaron basándose en sus perfiles de dispersión directos y laterales.

6.1.10 Ensayos de suero mediante transferencia Western

Las muestras se diluyeron 1:7 en tampón de lisis (Tritón X-100 al 1%, HEPES 50 mM, glicerol al 10%, MgCl_{2} 15 mM, AEBSF 1 mM, EGTA 1 mM). El lisado de LNCaP se diluyó 1:35 en tampón de lisis. Las muestras diluidas se combinaron a continuación a una relación de 2:3 con tampón de muestra (tampón reductor de SDS). Las muestras (20 \mul) se desplazaron sobre SDS-PAGE al 8,5% (concentración de proteína final de 93 mg por muestra, según se determinaba usando el ensayo de proteínas de Bio-Rad) y las proteínas separadas se transfirieron sobre membrana de PVDF durante una hora a 90 voltios. Las membranas se bloquearon a continuación durante la noche en leche al 5%-TBS. Al día siguiente, las membranas se sondearon con 3 \mug/ml de anticuerpo 7E11-C5 en TBS-T durante una hora, se lavaron 5 veces durante cinco minutos en TBS-T y se sondearon con 167 ng/ml de anticuerpo secundario etiquetado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón de oveja en TBS-T durante 30 minutos. De nuevo, las membranas se lavaron 5 veces durante cinco minutos cada una en TBS-T y las membranas se revelaron usando el Chemiluminescent Substrate Kit (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.) (Rochon y otros, 1994, The Prostate 25:
219-223).

Las transferencias se visualizaron exponiendo la película de rayos X, que revelaba una banda de proteína de aproximadamente 120 kD. La imagen transferida se escaneó con un escáner Microtek ScanMaker IIHR y las intensidades de la banda se midieron mediante "análisis realizado en un ordenador Macintosh Quadra 605 usando el programa para imágenes NIH de dominio público (creado por Wayne Rasband en the U.S. National Institutes of Health y disponible de Internet mediante ftp anónima de zippy.nimh.nih.gov o en disco flexible de NTIS, 5285 Port Royal Rd., Springfield, VA 22161, parte número PB93-504868)". Todas las muestras de pacientes se determinaron frente a una muestra de donante normal sano y una muestra de paciente con cáncer de próstata con un PSMA alto, de la misma transferencia Western, como controles estándar.

6.1.11 Detección de la actividad enzimática de PSM'

Se recogieron 100 ml de semen humano de donantes pagados bajo las directrices de WHO para probar la fertilidad. El material celular se nodulizó mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos y el sobrenadante se retiró cuidadosamente y se dializó durante la noche frente a dos cambios de tampón de Tris 20 mM, pH 7,6. El dializado se centrifugó de nuevo a 10.000 rpm y se cargó sobre una columna de DEAE-Sephacryl que se lavaba previamente con tampón de Tris 20 mM, pH 7,6. La columna cargada se lavó a continuación de nuevo con 500 ml del mismo tampón y las proteínas se separaron aplicando un gradiente de tampón de Tris de 20 mM a 200 mM a pH 7,6. Se recogieron fracciones de 5 ml. La presencia de PSMA en cada fracción se determinó mediante transferencia de gotas Western usando el anticuerpo monoclonal 7E11-C5. Las fracciones que contenían bandas de proteína reactivas con 7E11-C5 se reunieron y se precipitaron usando sulfato amónico al 70%. Las proteínas precipitadas se nodulizaron mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos y a continuación se resuspendieron en 1 litro de tampón de Tris 200 mM, pH 7,6. Las proteínas solubilizadas se dializaron a continuación durante la noche frente a dos cambios de tampón de Tris 20 mM, pH 7,6. El material dializado se cargó a continuación sobre una columna de Sephacryl prelavada y las proteínas se eluyeron, se recogieron fracciones de 3 ml. Se realizó una transferencia de gotas Western sobre la proteína eluida usando el anticuerpo monoclonal 3F5-4G6. Las fracciones 88-96 eran positivas y cada una de estas fracciones se probó con respecto a la pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.

6.2 Resultados

Para generar anticuerpos monoclonales para el dominio extracelular de PSMA, varias regiones de la proteína se analizaron con respecto a su hidrofilia relativa basándose en el método de Hopp y Woods (1983, Mol. Immunol. 20:483-489).

La Tabla 1, posteriormente, ilustra la hidrofilia relativa de varios péptidos examinados. En particular, se sintetizó un péptido que tenía la secuencia ESKVDPSK (Glu-Ser-Lys-Val-Asp-Pro-Ser-Lys) (Nº IDS SEC: 1) correspondiente a los residuos de aminoácido número 716-723 en la región C-terminal de PSMA. Adicionalmente, otras porciones del dominio extracelular que se muestran en la Tabla 1 o el propio dominio extracelular entero podrían usarse para producir anticuerpos para el dominio extracelular. En contraste, dos péptidos de aminoácido correspondientes a los residuos número 44-58 y los residuos número 196-213 inducían respuestas de anticuerpo anti-péptido que no se unían a PSMA natural.

TABLA 1 Hidrofilia relativa de péptidos de PSMA

Péptido (aminoácidos Nº)	Hidrofilia relativa
63-69	1,41
183-191	1,24
404-414	1,45
479-486	1,5
716-723	1,39

Antes de la inmunización, el péptido ESKVDPSK (Nº ID SEC: 1) se conjugó en primer lugar a KLH como un portador. Los ratones se inmunizaron a continuación y se estimularon con el mismo material conjugado a intervalos semanales. Los bazos de animales con una concentración de suero anti-péptido detectable se aislaron y se fusionaron con células de mieloma.

Se realizaron rastreos iniciales mediante ensayos de unión usando BSA unida a péptido como antígeno. Cincuenta \mul de sobrenadante de cultivo celular se retiraron de cultivos de hibridoma individuales y se probaron en un radioinmunoensayo específico para el péptido con respecto a la presencia de anticuerpos específicos para el péptido. Brevemente, los sobrenadantes se añadieron a pocillos de una placa Pro-Blind de 96 pocillos que se habían revestido previamente con péptido acoplado a albúmina de suero bovino (BSA). Después de una incubación nocturna a 4ºC, las placas se lavaron con PBS. Cincuenta \mul de una dilución 1:500 de anti-(IgM e IgG de ratón) de conejo se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron a continuación cuatro veces y se añadieron a cada pocillo 50 \mul de ^{125}I-Proteína A. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron cuatro veces como anteriormente. Las placas se expusieron a película autorradiográfica durante la noche y se revelaron. Los pocillos positivos se seleccionaron y las células se expandieron en medio de cultivo tisular para pruebas adicionales. Entre los pocillos positivos identificados, un hibridoma denominado 3F5 se probó adicionalmente en un ensayo de transferencia Western y se observó que su anticuerpo secretado reaccionaba con PSMA contenido en lisados de LNCaP. Las células LNCaP se cultivaron como se describe por Horoszewicz y otros, (1983, Cáncer Res. 43:1809-1818), y los lisados se prepararon como se describe por Rochon y otros, (1994, Prostate 25:219-223). Las células de hibridoma 3F5 se clonaron mediante dilución limitativa, se expandieron en números y se volvieron a probar en un ensayo de transferencia Western. Un subclón del anticuerpo denominado 3F5.4G6 reaccionaba con una proteína de 120 kDa de peso molecular en los lisados de LNCaP (Figura 2). Este anticuerpo se aisló como una IgM. Se usó ISOStrip obtenido de Boehringer Mannheim para isotipificar anticuerpos monoclonales de ratón para determinar el isotipo de 3F5.4G6. El anticuerpo monoclonal se diluyó 1:100 en PBS y la muestra diluida (150 \mul) se añadió a un tubo de revelado suministrado con el estuche y se incubó durante 30 segundos a temperatura ambiente y a continuación se agitó brevemente. La tira de isotipificación se insertó a continuación en el tubo y se reveló durante 5 minutos. Una banda azul aparecía en la sección lambda o kappa de la tira así como en una de las secciones de clase o subclase. El anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 se identificó como un isotipo IgM.

El anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 se probó adicionalmente frente a sueros tomados de pacientes con cáncer de próstata en fase D2 en progresión, usando anticuerpo monoclonal 7E11-C5 como un control (Figura 3). Ambos anticuerpos identificaban una banda de aproximadamente 120 kDa de peso molecular (Figura 3). Se realizó un ensayo de transferencia Western adicional de células LNCaP usando el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 usando un anticuerpo secundario específico para IgM (Figura 4). Mientras que el anticuerpo moncolonal 7E11-C5 reconocía una sola banda de aproximadamente 120 kDa, es decir, PSMA, 3F5.4G6 reconocía una banda de peso molecular similar así como una banda de aproximadamente 105-110 kDa. Esta banda corresponde a la forma proteínica predicha de PSM' y demuestra la utilidad de un anticuerpo que reconozca específicamente el dominio extracelular tanto de PSMA como de PSM'.

La reactividad de 7E11-C5 con una proteína de 120 kDa en los sueros de pacientes con cáncer de próstata era específica para el anticuerpo y no se debía a la reactividad no específica del anticuerpo secundario con proteínas séricas en general. En un ensayo de transferencia Western, papel Immobilon P que contenía proteínas separadas derivadas de muestras de suero se hizo reaccionar con anticuerpo monoclonal 7E11-C5 más anticuerpo secundario acoplado a HRP o con anticuerpo secundario acoplado a HRP solamente. La película se expuso durante un minuto o se sobreexpuso durante 45 minutos para demostrar la falta de reactividad del anticuerpo secundario con cualquier proteína de 120 kDa en suero. El mismo anticuerpo secundario también se usó con 3F5.4G6 para detectar el mismo antígeno. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 era específico para PSMA y PSM'.

La Figura 5 confirma que la proteína identificada por 7E11-C5 también era reconocida por el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6. Además, el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 también reconocía una proteína de 105-110 kDa no detectada por el anticuerpo monoclonal 7E11-C5. Esta proteína que migra más rápidamente correspondía a PSM'. Cuando el lisado se precipitaba en primer lugar con 7E11-C5, y las proteínas restantes se sondeaban con 7E11-C5, el anticuerpo no detectaba ninguna proteína (Carril 4). En contraste, cuando el lisado pretratado con 7E11-C5 se sondeaba con 3F5.4G6, detectaba una proteína de aproximadamente 110 kDa. La Figura 6 muestra que la proteína de 120 kDa, es decir PSMA, inmunoprecipitada por 3F5.4G6 también era reconocida por 7E11-C5.

La Figura 7A y B demuestra que el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 reconocía células LNCaP vivas mediante análisis por FACS, confirmando que 3F5.4G6 reconocía el dominio extracelular de PSMA. Tal anticuerpo que reconocía el dominio extracelular de PSMA es particularmente útil como una herramienta diagnóstica y/o terapéutica en el cáncer de próstata.

Fluido seminal humano se hizo reaccionar con un anticuerpo específico para PSMA y se ensayó con respecto a la actividad enzimática. La Figura 8 ilustra que la proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 en el Carril 2 es de un peso molecular aproximado de 90 kDa. Aunque se observaba que el PSM' tenía un peso molecular de 105-110 kDa en lisados de LNCaP, era probable que la proteína de 90 kDa en fluidos seminales fuera un producto no glicosilado o parcialmente glicosilado de PSM'. Puesto que PSM' contiene varios sitios de glicosilación, este peso molecular inferior era el resultado de actividades mediante glicosidasas en el fluido seminal. Que el PSMA no estaba presente en esta preparación purificada se ilustra por el hecho de que 3F5.4G6 reconocía una proteína de peso molecular 120 kDa (Carril 1) presente en un lisado de células LNCaP que es PSMA, pero no reconocía una proteína de este peso molecular en el Carril 2. Además, el anticuerpo 7E11-C5 no reconocía la banda de 90 kDa en fluidos seminales. Esta preparación purificada de PSM' reconocida por el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 se ensayó a continuación con respecto a la actividad de NAALADasa. El sobrenadante de alta velocidad preparado a partir de un lisado de LNCaP se usó como un control positivo. La proteína que reacciona positivamente con el anticuerpo monoclonal 3F5.4G6 y que es consecuente con que sea PSM' contenía actividad de NAALADasa inherente de 16,9 nmol/min/mg de proteína usando el ensayo descrito en Robinson y otros, (1987, J. Biol. Chem. 262:14498-14506).

7. Ejemplo Producción de anticuerpos monoclonales frente a una preparación de membranas celulares de tumor que contiene PSMA 7.1 Materiales y métodos 7.1.1 Inmunización

Se prepararon membranas de LNCaP a partir de dos placas de 150 mm retirando las células en una solución de Versene seguido por centrifugación para nodulizar las células. Se añadió agua destilada al nódulo celular y las células se homogeneizaron usando un homogeneizador Dounce. La suspensión homogeneizada se centrifugó a 30.000 x g y la fracción de membranas nodulizada se usó para la inmunización.

Ratones BABL/c hembra adultos se inmunizaron intraperitonealmente cuatro veces (intervalos de 2-3 semanas) con una preparación de membranas celulares de carcinoma prostático LNCaP emulsificada en adyuvante completo de Freund. Cinco días antes de la fusión celular, los ratones se estimularon con 50 \mug de PSMA purificado por inmunoafinidad en PBS. La fusión celular se realizó como se describe en la Sección 6.1.3 anteriormente.

7.1.2 Rastreo de hibridomas primarios

Un ensayo basado en un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) en fase sólida se empleó para la detección de anticuerpos específicos para PSMA. PSMA purificado por inmunoafinidad, PSMA de longitud completa expresado por baculovirus o fragmentos de PSMA expresados bacterianamente se revistieron sobre placas de 96 pocillos Maxi-Sorp (Nunc Immuno) con una incubación nocturna a 4ºC. Las placas se lavaron con PBS-Tween-20 al 0,2% y los sitios restantes se bloqueraon con una solución al 5% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Cincuenta microlitros de sobrenadante procedente de los cultivos de hibridoma se añadieron a los pocillos revestidos con PSMA y las placas se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron como anteriormente y se añadieron a cada pocillo 50 \mul de dilución 1:600 de anti-(IgG de ratón) de conejo y anti-(IgM de ratón) de conejo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron como anteriormente y se añadieron a cada pocillo 50 \mul de una dilución 1:400 de Proteína A conjugada a HRP. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron como anteriormente y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de solución de cromógeno/substrato ABTS (150 mg de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico en 500 ml de ácido cítrico 0,1 M, pH 4,35)/H_{2}O_{2} (10 \mul de H_{2}O_{2} al 30% por 10 ml de solución de ABTS). Las placas se leyeron en un lector de microplacas y se midió la DO405. Las células de hibridoma que producían sobrenadantes con valores de DO 0,05 por encima del fondo se clonaron mediante dilución limitativa y se sometieron a análisis adicional.

Para la captura en fase sólida de PSMA, el ensayo mencionado anteriormente se modificó como sigue: 50 microlitros de una solución de 40 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-PSMA 7E11-C5 en tampón de unión de NaHCO_{2} 0,1 M, pH 8,2, se añadieron a pocillos de una placa Maxi-Sorp y se dejaron adherirse durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron y se bloquearon como antes. Cincuenta microlitros de PSMA purificado por inmunoafinidad diluido en serie se añadieron a los pocillos revestidos con 7E11-C5 y las placas se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Después de un lavado intensivo, 50 \mul de sobrenadante de cultivo tisular no diluido procedente de clones de hibridoma 3D7-1.1 o 4E10-1.14 se añadieron a los pocillos y las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar como anteriormente, los pocillos se sondearon con 50 \mul de una dilución 1:1000 de anti-(IgM de ratón) de cabra conjugada a peroxidasa y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado intensivo, se añadieron 100 \mul de ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo y las placas se leyeron en un lector de microplacas según se describe anteriormente.

7.1.3 Purificación por inmunoafinidad de PSMA

Dieciséis litros de células LNCaP empaquetadas se homogeneizaron en 5 volúmenes de Tris 25 mM-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, NP-40 al 1% mediante dos pasadas de un homogeneizador Potter-Elvehjem seguido por agitación durante la noche a 4ºC. El extracto se centrifugó a 10.000 x g durante 1 hora y el nódulo se reextrajo como antes. Los sobrenadantes combinados se mezclaron en frío durante la noche con inmunocuentas de 7E11-C5 (Pierce) (3-5 ml de volumen del lecho de resina). Las cuentas se centrifugaron, se lavaron intensivamente con tampón de homogeneización y se vertieron en una columna. Las cuentas se lavaron de nuevo con tampón de homogeneización adicional que contenía NP-40 al 1% seguido por un lavado adicional con tampón que contenía Tritón X-100R al 1%. Las cuentas lavadas se eluyeron con tampón de glicina 100 mM, pH 2,5, NaCl 150 mM, Tritón X-100R al 1% en fracciones de 2 ml. La elución de la proteína se verificó a DO280.

Las fracciones que contenían proteína se analizaron mediante geles de SDS-PAGE usando tinción con plata y transferencia Western. En preparaciones típicas, la banda de proteína de 120 kDa correspondiente a reactividad con 7E11-C5 en una transferencia Western era pura al 60-80%. Un rendimiento aproximado de 16 ml de células empaquetadas era 1 miligramo de proteína de PSMA. El detergente en la preparación de PSMA se retiró haciendo pasar la solución sobre una columna Extractigel (Pierce).

7.1.4 Análisis citométrico de flujo

La capacidad de los anticuerpos monoclonales para reconocer epítopos externos o extracelulares de PSMA se determinó mediante citometría de flujo. Células LNCaP (que expresan PSMA) y PC-3 (que no expresan PSMA) se recogieron recientemente de matraces de cultivo tisular y se preparó una suspensión de células individuales. Aproximadamente un millón de células se resuspendieron en 1 ml de sobrenadante de cultivo tisular no diluido procedente de clones de hibridoma 3D7-1.1 o 4E10-1.14 y se incubaron en hielo durante 2 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS-BSA al 0,1%, azida Na al 0,01%, se resuspendieron en 100 \mul de una dilución 1:100 de anti-(IgM de ratón) de conejo conjugada a FITC y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos adicionales. Las células se lavaron dos veces como anteriormente, se resuspendieron en 500 \mul de tampón de lavado y se analizaron con respecto a la tinción fluorescente mediante FACSCalibur (Becton-Dickinson) con el software de adquisición CellQuest.

7.1.5 Análisis por transferencia Western

Sobrenadantes de cultivo tisular procedentes de clones de hibridoma 3D7-1.1 y 4E10-1.14 se probaron en un ensayo de transferencia Western con respecto a la reactividad con PSMA. El análisis de transferencia Western se realizó siguiendo el protocolo de Pelletier y Boynton (1994, J. Cell. Physiol. 158:427-434). Brevemente, lisados de células LNCaP y PC-3, PSMA purificado por inmunoafinidad o PSMA de longitud completa expresado por baculovirus se sometieron a electroforesis sobre un gel de SDS-PAGE al 8,5% y las proteínas separadas se electrotransfirieron a una membrana de PVDF durante una hora a 90 voltios. Las membranas se bloquearon durante la noche en BLOTTO al 5% y se incubaron durante 5 minutos con 20 ml de sobrenadante de cultivo tisular no diluido procedente del clon apropiado. El sobrenadante se retiró, las transferencias se lavaron 5 veces con TBS-Tween-20 al 0,5% (TBS-T) y se sondearon con una dilución 1:5.000 de anticuerpo secundario anti-(IgM de ratón) caprina conjugada a peroxidasa (Jackson) durante una hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó cinco veces con TBS-T, se reveló usando el Chemiluminescent Substrate Kit (KPL) y se visualizó exponiendo a película de rayos X (Kodak).

7.1.6 Preparación de PSMA recombinante mediante un sistema de expresión de baculovirus

Un inserto que contenía la secuencia de codificación de longitud completa de PSMA (Israelí y otros, 1993, Cancer Res. 53:227-230) se clonó a partir de una biblioteca humana lambda pDR2 (Clonetech) usando sondas específicas para la secuencia génica. El inserto se cortó de su vector mediante digestión con SmaI y SspI y se clonó en el vector de transferencia pAcHLT-C (Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cotransfección del vector de transferencia con DNA viral linealizado con BacPAK6 (Clonetech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante daba virus que codificaba proteína de PSMA de longitud completa que contenía una cola de polihistidina en el extremo N de la proteína que había de usarse para el aislamiento de la proteína uniéndose a una columna de Ni-NTA. La proteína de PSMA se produjo aislando partículas de baculovirus recombinante purificadas por calvas, amplificando e infectando células Sf9 con una multiplicidad de infección de aproximadamente 1:2 en presencia de medio SFM II (Gibco-BRI) complementado con FBS (Hyclone) al 5%. Después de 48 h de incubación, se añadió medio SFM II (Gibco-BRI) complementado con FBS al 5% (Hyclone). Después de una incubación de 48 h, las células infectadas se recogieron y se sometieron a lisis en CHAPS al 1% y se recuperaron a través de Ni-NTA-Agarose (Quiagen) con elución con imidazol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto final se dializó tres veces frente a un 1 litro de PBS.

7.2 Resultados

Se generaron anticuerpos monoclonales contra membranas de carcinoma prostático que contenían PSMA. Dos clones de hibridoma, 3D7-1.1 y 4E10-1.14, se seleccionaron mediante un inmunoensayo en fase sólida usando PSMA natural purificado por inmunoafinidad procedente de células LNCaP y fragmentos expresados bacterianamente de PSMA correspondientes a las regiones de aminoácidos 1-75, 134-437 y 438-750. Los sobrenadantes procedentes de los clones de hibridoma 3D7-1.1 y 4E10-1.14 demostraban una unión comparable a PSMA natural en comparación con el anticuerpo 7E11-C5 (Figura 9). La unión no específica de fondo a BSA era esencialmente comparable para las tres preparaciones de anticuerpo.

Cuando se probaba la especificidad de unión al epítopo, el anticuerpo monoclonal 7E11-C5 se unía al fragmento de aminoácido 1-75 que corresponde al dominio intracelular N-terminal de PSMA. Aunque 3D7-1.1 y 4E10-1.14 presentaban una unión moderada a este fragmento, estos dos anticuerpos monoclonales demostraban la unión más fuerte al fragmento de aminoácidos 134-437 de PSMA, que es parte del dominio extracelular de PSMA (Figura 9). Puesto que este fragmento es una parte de PSM', estos anticuerpos también reaccionan con PSM'.

El sobrenadante procedente del clon de hibridoma 3D7-1.1 se probó adicionalmente en un ensayo de transferencia Western frente a lisados de células LNCaP y PC-3 y PSMA purificado por inmunoafinidad. La Figura 10 muestra que 3D7-1.1 reacciona con una banda de 120 kDa presente en células LNCaP (Carril 1) pero no en células PC-3 (Carril 2). Tanto los Carriles 1 y como 2 presentan reactividad que se debía lo más probablemente a unión específica del reactivo de anticuerpo secundario. El Carril 3 que contiene PSMA modificado por inmunoafinidad muestra una banda principal a 120 kDa cuando se sondea con anticuerpo monoclonal 3D7-1.1. También se obtuvieron datos de transferencia Western similares con sobrenadante procedente del clon 4E10-1.14, aunque el fondo no específico de la transferencia era mucho mayor que con 3D7-1.1. Así, tanto 3D7-1.1 como 4E10-1.14 reaccionan con una banda de 120 kDa presente en células LNCaP y con PSMA purificado por inmunoafinidad.

PSMA expresado por baculovirus de longitud completa se sometió a electroforesis en un gel de SDS-PAGE y se electrotransfirió a una membrana de PVDF. La transferencia se insertó en un aparato Mini-Protean II Multi-Screen (Bio-Rad), se sondeó con una variedad de preparaciones de anticuerpo y se reveló como una transferencia Western. La Figura 11 muestra que los anticuerpos monoclonales 3D7-1.1 y 4E10-1.14 reaccionaban con una banda de proteína que correspondía a la misma banda unida por el anticuerpo monoclonal 7E11-C5.

Las células LNCaP y las células PC-3 se tiñeron con sobrenadantes procedentes de clones de hibridoma 3D7-1.1 y 4E10-1.14 y se analizaron mediante citometría de flujo. Ambos anticuerpos tenían células LNCaP no fijadas vivas pero no tenían células PC-3 (Figura 12A-D). Estos resultados confirmaban que estos dos anticuerpos reaccionan con epítopos en el dominio extracelular de la molécula de PSMA. Por otra parte, el desplazamiento claro en la tinción de LNCaP observado con el anticuerpo monoclonal 4E10-1.14 en comparación con el hombro observado con 3D7-1.1 sugiere que estos dos anticuerpos reconocen diferentes epítopos en esta región particular de la molécula de PSMA.

Se desarrolló un ELISA de captura bilocal para PSMA utilizando el anticuerpo monoclonal 7E11-C5 como un reactivo de captura de PSMA y anticuerpos monoclonales 3D7-1.1 y 4E10-1.14 como anticuerpos informadores o de detección. Puesto que estos anticuerpos reconocen diferentes epítopos sobre la molécula de PSMA (7E11-C5 reactivo con los 6 aminoácidos N-terminales; 3D7-1.1 y 4E10-1.14 reactivos con una secuencia en la región de los aminoácidos 134-475), se aparean eficazmente en el ensayo de captura bilocal. Usando PSMA purificado por inmunoafinidad diluido en serie como un antígeno de prueba, los sobrenadantes procedentes tanto de 3D7-1.1 como 4E10-1.14 eran capaces de detectar PSMA después de la captura sobre placas de 96 pocillos revestidas con 7E11-C5 (Figura 13). Adicionalmente, se probó PSMA purificado procedente de células LNCaP y fluido seminal, así como una preparación en bruto de PSMA de longitud completa expresado por baculovirus (Figura 14). Se observaron lecturas de DO_{405} significativas para el antígeno de control de PSMA, el fluido seminal y la preparación de PSMA de baculovirus. Cuando PSMA purificado se diluía en suero humano femenino normal y las muestras se ensayaban usando el ensayo de captura bilocal, los mismos anticuerpos también detectaban PSMA (Figura 15). De ahí que el ensayo de captura bilocal se desarrollara con anticuerpos monoclonales dirigidos a diferentes porciones de PSMA detectado por PSMA procedente de una variedad de fuentes de una manera específica para el antígeno.

Un ELISA de captura bilocal alternativo para PSMA se desarrolló usando anticuerpo monoclonal 3D7-1.1 como un reactivo de captura para PSMA y anticuerpo monoclonal 7E11-C5 como un anticuerpo informador o de detección. Se usó PSMA purificado por inmunoafinidad diluido en serie como antígeno de prueba, se capturó sobre placas revestidas con 3D7-1.1 y se detectó usando anticuerpo monoclonal 7E11-C5 biotinilado. Los resultados se muestran en la
Figura 16.

La Figura 16 demuestra que anticuerpos monoclonales tales como 3D7-1.1 o 4E10-1.14 que se unen específicamente al dominio extracelular de PSMA son útiles en un ELISA de captura bilocal para PSMA.

La utilidad de 3D7-1.1 para la captura de PSMA indica que serán útiles otros inmunoensayos alternativos que se basan exclusivamente en el dominio extracelular de la proteína de PSMA. Tal ensayo que utiliza dos anticuerpos específicos para el dominio extracelular para la captura y la detección sería capaz de detectar PSM' debido a la localización en la proteína de su epítopo. Así, cualquier ensayo que utilice 7E11-C5 para la captura o detección excluiría específicamente PSM'. Un ejemplo de un ensayo específico para PSM' incluiría la captura de PSMA y PSM' por un anticuerpo tal como 3D7-1.1 o uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de PSMA en pruebas paralelas. La detección subsiguiente usando tanto 4E10-1.14 para PSMA y PSM' totales como 7E11-C5 solo para PSMA daría la cantidad de PSM' mediante simple substracción. A partir de estos datos se deriva una relación de PSM' a PSMA que tendrá relevancia diagnóstica en vista de la referencia de Su y otros, Cancer Res., 55:1441-1443 (1995).

Su muestra que el transcrito que codifica PSMA es detectado preferentemente en pacientes con cáncer de próstata (en comparación con valores normales) aunque Su no presenta una demostración de que el transcrito de PSMA se traduzca de hecho en proteína en estos pacientes. Adicionalmente, Su muestra que el transcrito que codifica PSM' es detectado preferentemente en varones normales (en comparación con pacientes con cáncer de próstata), aunque Su nunca detectó ninguna proteína de PSM'. Los presentes inventores, en esta solicitud, demuestran que la proteína de PSMA está elevada en tejidos y/o fluidos corporales de pacientes con cáncer de próstata (en comparación con varones normales) y que la proteína de PSM' está elevada en tejidos y/o fluidos corporales de varones normales (en comparación con pacientes con cáncer de próstata). Así, de acuerdo con la presente invención, la relación de PSM' a PSMA tendrá utilidad de diagnóstico y/o pronóstico para la determinación clínica de pacientes con cáncer de próstata.

Un fragmento de PSMA que corresponde a los aminoácidos 34 a 750 de PSMA de longitud completa se expresó en un sistema de expresión de baculovirus como un inserto de 1,9 kb en un sistema de expresión de baculovirus. El fragmento de PSMA expresado por baculovirus es muy similar a PSM' (que corresponde a los residuos 58-750 de PSMA de longitud completa), excepto que 76 aminoácidos adicionales del dominio extracelular de PSMA se pierden del extremo N del fragmento. El análisis por transferencia Western de diversos fragmentos de PSMA semipurificados expresados por baculovirus y el lisado de células LNCaP se desarrollaron con anticuerpo monoclonal 4E10-1.14 como sonda. Los resultados se muestran en la Figura 17.

El análisis por transferencia Western de lisados en bruto de células Sf9 infectadas con baculovirus que contienen un inserto irrelevante o el inserto de 1,9 kb que codifica el fragmento de PSMA, es decir los aminoácidos 134-750 de PSMA de longitud completa, se desarrolló con anticuerpo monoclonal 7E11-C5 como sonda. Los resultados se muestran en la Figura 18.

La Figura 17 indica que anticuerpos tales como 4E10-1.14 que son específicos para el dominio extracelular de PSMA también son capaces de unirse a un producto proteínico expresado por baculovirus muy similar a PSM'. En contraste, la Figura 18 indica que esta no es una propiedad del anticuerpo monoclonal 7E11-C5 debido a su especificidad epitópica (véase la reactividad negativa de 7E11-C5 con el fragmento de PSMA expresado por baculovirus en la Figura 18). El fragmento de proteína de PSM expresado por baculovirus es idéntico a PSM' (lo que corresponde a los residuos 58-750 de PSMA de longitud completa), excepto que se pierden 76 aminoácidos adicionales del extremo N, todos los cuales están en el dominio extracelular. Debido a la especificidad epitópica tanto de 3D7-1.1 como de 4E10-1.14 mapeados hasta una región del dominio extracelular contenido tanto en PSM' como en el fragmento de PSMA de los aminoácidos 134-750 (véase la Figura 9), ambos anticuerpos tendrían la propiedad inherente de unirse a PSM' natural, una propiedad no compartida por 7E11-C5.

El anticuerpo monoclonal 3D7-1.1 se usó como una sonda en una transferencia Western con PSMA derivado de células LNCaP así como suero humano y fluido seminal que también se sabe que contiene PSMA. Los resultados se muestran en la Figura 19.

Una banda correspondiente a PSMA que migra a aproximadamente 120 Kd está presente en todas las fracciones. Además, una segunda banda que migra más rápidamente de peso molecular de 90 a 100 Kd se observó en el suero y el fluido seminal según se revelaba por el anticuerpo 3D7-1.1. Esta banda que migra más rápidamente no se observa en transferencias Western con suero usando el anticuerpo 7E11-C5 (véase Holmes y otros, The Prostate, Supl. 7:25-29 (1996)). Esta banda proteínica reactiva con 3D7-1.1 que migra más rápidamente es lo más probablemente PSM' presente en fluidos biológicos.

8. Depósito de líneas celulares

Las siguientes líneas celulares de hibridoma se depositaron el 12 de Marzo de 1996 y el 11 de Marzo de 1997 en the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y se les asignó el siguiente número de registro:

Hibridoma \hskip3cm Número de Registro del ATCC
3F5.4G6	HB12060
3D7-1.1	HB12309
4E10-1.14	HB12310

La presente invención no ha de limitarse en el alcance por las modalidades ejemplificadas que se consideran ilustraciones de aspectos simples de la invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas aquí se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y los dibujos adjuntos.

1

2

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\vskip0.400000\baselineskip

<110> Pacific Northwest Cáncer Foundation

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<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECÍFICOS PARA EL DOMINIO EXTRACELULAR DE ANTÍGENO DE MEMBRANA ESPECÍFICO PARA LA PRÓSTATA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P08504EP

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US97/05214

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<141> 1997-03-25

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/621.399

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<151> 1997-03-25

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser Lys}

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<210> 2

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<211> 750

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

3

4

5

Claims (36)

1. Un anticuerpo monoclonal que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de antígeno de membrana específico para la próstata (PSMA) y en donde dicho anticuerpo se une a la superficie de células vivas que expresan PSMA.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio extracelular de PSMA comprende la secuencia de aminoácidos del residuo Nº 44 a 750 según se representa en la Figura 1 (Nº ID SEC: 2).

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que se une a la secuencia de aminoácidos ESKVDPSK (Nº ID SEC: 1).

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, cuya región de unión a antígeno inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3F5.4G6 que tiene el número de registro del ATCC HB 12060.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, cuya región de unión a antígeno inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3D7-1.1 que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o por el hibridoma 4E10-1.14 que tiene el número de registro del ATCC HB 12310 a su epítopo diana.

6. Una línea celular de hibridoma que tiene los números de registro del ATCC HB 12060, HB 12309 o HB 12310.

7. Uso de un anticuerpo monoclonal que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de PSMA y en donde dicho anticuerpo monoclonal se une a la superficie de células vivas que expresan PSMA para detectar la presencia de PSMA en un espécimen biológico in vitro.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3F5.4G6 que tiene el número de registro del ATCC HB 12060, el hibridoma 3D7-1.1 que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o el hibridoma 4E10-1.14 que tiene el número de registro del ATCC 12310 a su epítopo diana.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el espécimen es un espécimen de biopsia o fluido
corporal.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el fluido corporal es sangre entera, suero, fluido seminal, orina o células de la orina.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la detección de PSMA unido a anticuerpo es mediante un segundo anticuerpo específico para PSMA.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la detección de PSMA unido a anticuerpo es mediante la actividad de NAALADasa.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la actividad de NAALADasa se detecta mediante un incremento de NAD(P)H.

14. Uso de un anticuerpo monoclonal que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de PSMA y que se une a la superficie de células vivas que expresan PSMA para detectar la presencia de PSMA expresado por células de cáncer in vitro.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3F5.4G6 que tiene el número de registro del ATCC HB 12060, el hibridoma 3D7-1.1 que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o el hibridoma 4E10-1.14 que tiene el número de registro del ATCC HB 12310 a su epítopo diana.

16. Uso de un anticuerpo monoclonal que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de PSMA y que se une a la superficie de células vivas que expresan PSMA, para la fabricación de un medicamento para tratar un tumor que comprende células de cáncer de próstata que expresan PSMA.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que el anticuerpo está conjugado a un radioisótopo.

18. Una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal, que inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3F5.4G6 que tiene el número de registro del ATCC HB 12060, el hibridoma 3D7-1.1 que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o el hibridoma 4E10-1.14 que tiene el número de registro del ATCC HB 12310 a su epítopo diana.

19. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de registro del ATCC HB 12060, el hibridoma que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o el hibridoma que tiene el número de registro del ATCC HB 12310.

20. Uso de un anticuerpo monoclonal que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de PSMA, para detectar la presencia de proteína de PSM' en un espécimen biológico in vitro.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3F5.4G6 que tiene el número de registro del ATCC HB 12060, el hibridoma 3D7-1.1 que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o el hibridoma 4E10-1.14 que tiene el número de registro del ATCC HB 12310 a su epítopo diana.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el espécimen es un espécimen de biopsia, fluido corporal, orina o células de la orina.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el fluido corporal es sangre entera, suero o fluido seminal.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la detección de PSM' unido a anticuerpo es mediante un segundo anticuerpo específico para PSM'.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la detección de PSM' unido a anticuerpo es mediante la actividad de NAALADasa.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la actividad de NAALADasa se detecta mediante un incremento de NAD(P)H.

27. Uso de un anticuerpo monoclonal que tiene una región de unión a antígeno específica para el dominio extracelular de antígeno de membrana específico de la próstata y que se une a la superficie de células vivas que expresan PSMA, para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer de próstata.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 3F5.4G6 que tiene el número de registro del ATCC HB 12060, el hibridoma 3D7-1.1 que tiene el número de registro del ATCC HB 12309 o el hibridoma 4E10-1.14 que tiene el número de registro del ATCC HB 12310 a su epítopo diana.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el anticuerpo está conjugado a un fármaco, una toxina o un radioisótopo.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo biespecífico, que comprende además una región de unión a antígeno específica para una célula efectora que tiene actividad tumoricida o inhibidora de tumores.

31. Un estuche para el diagnóstico, el pronóstico o la verificación del cáncer de próstata, que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento de unión del mismo.

32. Un estuche para el diagnóstico, el pronóstico o la verificación del cáncer de próstata, que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de unión del mismo.

33. Un estuche para el diagnóstico, el pronóstico o la verificación del cáncer de próstata, que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 3 o un fragmento de unión del mismo.

34. Un estuche para el diagnóstico, el pronóstico o la verificación del cáncer de próstata, que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o un fragmento de unión del mismo.

35. El estuche de acuerdo con la reivindicación 31, 32, 33 ó 34, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está envasado en un medio acuoso o en forma liofilizada.

36. El estuche de acuerdo con la reivindicación 31, 32, 33 ó 34, que comprende además un segundo anticuerpo específico para PSMA, o glutamato deshidrogenasa.