CN109069624A - 癌症的免疫治疗 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了通过免疫化学治疗剂和消融技术的组合来治疗癌症的新的组合物、方法和装置。这些组合物可包含有助于引发免疫应答以治疗肿瘤的免疫检查点抑制剂、细胞因子和核酸药物。除了多种消融技术之外还施用这些组合物提供向免疫系统的癌细胞抗原呈递和对癌症的免疫靶向。

Description

癌症的免疫治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年1月15日提交的美国临时申请序列号62/279,579的权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于癌症的免疫治疗的方法、组合物和装置。更特别地，本发明涉及肿瘤内施用免疫学癌症剂(immunologic cancer agent)和治疗以提供最佳的癌症免疫应答。
背景技术
在美国，癌症是第二常见死亡原因，声称每年有580,000美国人，每天多于1,500人。国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)估计癌症护理的年度总成本多于2270亿美元(2007年)；包括890亿美元的直接医疗成本。治疗癌症的总体医疗保健成本中的大部分来自对放射和常规化学治疗的有害副作用的管理。免疫学癌症治疗有望彻底改变肿瘤治疗的状况。检查点抑制剂(例如CTLA-4和PD-1)已经在转移性黑素瘤和非小细胞肺癌的治疗中产生重大影响。这些药物现今正被组合使用以试图改善其效力。这些药物的递送最常见的是静脉内进行，其由于这些杀细胞剂在体内非特异性地分布杀伤癌细胞和正常细胞二者并且可对治疗方案和患者结局产生不利影响而可具有严重且有时致命的全身毒性。
消融是用于破坏细胞、器官或异常生长物(例如癌症)的外科手术技术。已知冷冻消融通过向患者的抗原呈递细胞和树突细胞呈递一系列独特的肿瘤相关抗原来在患者中引发免疫应答。然而，已知这种“冷冻免疫效应”是可变的，并且在一些情况下甚至是有害的。本公开内容提供了新的方法，其降低与传统全身性癌症治疗相关的毒性，并且提供针对癌症的免疫系统刺激，从而导致肿瘤靶向的免疫应答。
发明概述
本公开内容至少部分地基于开发通过肿瘤定向免疫学癌症治疗和消融技术的组合来引发癌症免疫应答的新的组合物和方法。与传统全身递送抗癌药物相比，肿瘤内施用这些治疗和操作可具有显著的优势。本文中公开的组合物和方法可允许以小于传统剂量向对象施用(例如，在将组合物直接施用到肿瘤中的一些实施方案中)，针对肿瘤抗原刺激免疫系统，并且通过将药物放置成直接接近肿瘤抗原和免疫炎性过程来改善结果。
在一个方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：各自以治疗有效量存在于组合物中的至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合、以及可药用载体。所述至少两种检查点抑制剂可包含抑制剂，例如CD137、CD134、PD-1、KIR、LAG-3、PD-L1、CTLA-4、B7.1、B7H3、CCRY、OX-40和/或CD40的抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含两种检查点抑制剂并且这两种检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂。例如，CTLA-4抑制剂可以是伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)或其组合，并且PD-1抑制剂可选自派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、MK-3475、MED 14736、及其组合。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗，并且PD-1抑制剂是派姆单抗。在一些实施方案中，所述至少两种免疫检查点抑制剂和所述至少一种细胞因子配制成用于肿瘤内施用。与两种检查点抑制剂的组合(不具有细胞因子)相比，两种检查点抑制剂和细胞因子的组合产生更少的不良副作用和/或免疫相关不良事件。
所述至少一种细胞因子可选自GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、和/或其组合。在一些实施方案中，细胞因子可以是重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)(例如，沙格司亭(sargramostim))。在一些实施方案中，所述组合物可包含第一细胞因子和第二细胞因子。在一些情况下，第一和第二细胞因子是相同的，而在另一些情况下其是不同的。
在一些情况下，所述组合物包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：浓度为约0.5至10mg/ml的CTLA-4抑制剂、浓度为约0.5至20mg/ml的PD-1抑制剂和浓度为约10至500μg/ml的细胞因子。在一些情况下，所述组合物包含浓度为约1至2mg/ml的CTLA-4抑制剂、浓度为约1至10mg/ml的PD-1抑制剂和浓度为约250μg/ml的细胞因子。例如，所述组合物可包含浓度为约3.3mg/ml的CTLA-4抑制剂、浓度为约6.6mg/ml的PD-1抑制剂和浓度为约16.6μg/ml的细胞因子。在一些情况下，所述组合物的体积为至少或约15ml。在一些情况下，所述组合物的体积小于约15ml。在一些情况下，基于100kg的对象，所述组合物包含约10至300mg的CTLA-4抑制剂、约10至200mg的PD-1抑制剂和约250至500μg的细胞因子。例如，所述组合物可包含约50mg的CTLA-4抑制剂、约100mg的PD-1抑制剂和约250μg的细胞因子。
在一些情况下，药物组合物包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：各自以治疗有效量存在于组合物中的至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合、可药用载体；以及治疗有效量的核酸药物。核酸药物可以是例如DNA、DNA质粒、nDNA、mtDNA、gDNA、RNA、siRNA、miRNA、mRNA、piRNA、反义RNA、snRNA、snoRNA、vRNA等。例如，核酸药物可以是DNA质粒。在一些情况下，DNA质粒可包含编码选自GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、和/或其组合的基因的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成，或由所述核苷酸序列组成。核酸药物可具有临床可用性，例如在增强细胞的治疗作用或向患者提供治疗剂中具有临床可用性。在另一种情况下，核酸药物可用作标记或抗性基因。核苷酸序列可编码可从细胞分泌或不可从细胞分泌的基因。核酸药物可编码基因和提高该基因之表达的启动子序列。
在另一方面，本说明书提供了在患者中治疗肿瘤的方法。例如，该方法可包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：向患者肿瘤内施用足以治疗肿瘤之量的组合物，所述组合物包含：各自以治疗有效量存在于组合物中的至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合、以及可药用载体。例如，施用的组合物可以是本文中所述的组合物。在一些情况下，该方法包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：向患者肿瘤内施用足以治疗肿瘤之量的组合物，所述组合物包含CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和至少一种细胞因子的组合。在一些情况下，细胞因子是GM-CSF。在一些情况下，该方法还包括向肿瘤或向损伤(lesion)施用治疗有效量的核酸药物。与施用两种检查点抑制剂的组合(例如，不具有细胞因子)相比，施用两种检查点抑制剂和细胞因子的组合产生更少的副作用和/或免疫相关不良事件。当与常规IV施用相比时，肿瘤内施用本文中所述的组合产生更少的副作用和/或免疫相关不良事件。
在一些情况下，施用包括使用包含多个齿(tine)的注射装置来将组合物施用于患者的肿瘤。在一些情况下，施用包括使用包含单个齿的注射装置来将组合物施用于患者的肿瘤。所述组合物可以以单剂量施用或者可以以多于一个剂量施用。可使用本文中所述的探头(probe)来施用组合物。所述组合物可包含本文中所述的浓度。在一些实施方案中，所述组合物包含浓度为约0.5至10mg/ml的CTLA-4抑制剂、浓度为约0.5至20mg/ml的PD-1抑制剂和浓度为约10至500μg/ml的细胞因子。在一些实施方案中，所述组合物的体积小于约15ml。在一些实施方案中，所述组合物的体积为约15ml。在一些实施方案中，所述至少两种免疫检查点抑制剂和所述至少一种细胞因子配制成用于肿瘤内施用。
在本文中所述方法的一些实施方案中，当与组合物的常规IV施用相比时，组合物的肿瘤内施用产生更少的不良副作用和/或免疫相关不良事件。常规IV施用的不良副作用和免疫相关不良事件包括胃肠、呼吸、神经、内分泌、皮肤、疲劳、肾和肝影响。在本文中所述方法的一些情况下，当与施用包含至少两种免疫检查点抑制剂且不含细胞因子的组合物相比时，施用包含至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合物在体内产生更少的不良副作用和/或免疫相关不良事件。在一些情况下，当与包含至少两种检查点抑制剂而不含至少一种细胞因子的组合物相比时，包含至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合物在体内产生更少的不良副作用和/或免疫相关不良事件。在一些情况下，所述方法包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：对肿瘤的至少一部分进行消融，从而产生损伤区。消融可例如在施用本文中所述的组合物之前、与其同时和/或之后进行。消融可例如使用本领域中已知的消融方法的一种或更多种组合来进行，所述消融方法包括例如冷冻消融，热消融，IRE，射频电膜击穿(radiofrequency electrical membrane breakdown，RF-EMB)，RF-EMB型消融，超声消融，高强度聚焦超声消融，使用光动力学治疗进行的消融，使用非热激波(non-thermal shock wave)、空化、其他机械物理细胞破坏进行的消融、或其任意组合。
在一些情况下，本文中所述的方法还包括对肿瘤的至少一部分进行消融，从而产生损伤区。在一些情况下，使用第一消融方法对肿瘤的第一部分或全部进行消融，并且使用第二消融方法对肿瘤的第二部分或全部进行消融。第一和第二消融方法可以是不同的。肿瘤的第一和第二部分可以是肿瘤的相同或不同部分。在一些情况下，消融在施用组合物之前进行。在一些情况下，消融与施用组合物同时进行或在施用组合物之后进行。在一些情况下，消融与施用组合物同时和在其之后进行。在一些情况下，消融使用以下来进行：冷冻消融，热消融，IRE，RF-EMB，RF-EMB型消融，超声消融，高强度聚焦超声消融，使用光动力学治疗进行的消融，使用非热激波、空化、其他机械物理细胞破坏进行的消融、或其任意组合。在一些实施方案中，至少一部分的消融使用RF-EMB和冷冻消融二者来进行。
在一些情况下，消融至少部分地使用冷冻消融，例如使用冷冻探头(cryoprobe)来进行。冷冻消融可以使用多于一个冷冻探头来进行。冷冻消融也可以使用本文中所述的任何探头来进行。在一些情况下，消融使用冷冻消融和RF-EMB二者来进行。
在一些情况下，冷冻消融步骤可包括至少1个冷冻-解冻循环，基本上由其组成，或由其组成。例如，冷冻消融可包含1至4个冷冻-解冻循环。冷冻-解冻循环的冷冻部分可以是例如至少或约30秒长。冷冻-解冻循环的冷冻部分可以是例如约30秒至15分钟长。冷冻-解冻循环的冷冻部分可在例如约-30℃至-196℃的温度下进行。冷冻-解冻循环的解冻部分可以是主动解冻过程(即添加热)，和/或是被动解冻过程(即不添加热)。
在一些情况下，所述方法还包括施用一系列电脉冲从而将与损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔，基本上由其组成，或由其组成。在一些情况下，电脉冲的施用与消融同时进行。在一些情况下，电脉冲的施用在消融之前进行。在一些情况下，电脉冲的施用在消融之后进行。电脉冲可通过冷冻探头来施用。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲和/或其频率为100至500kHz。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲和/或其频率为100至500kHz。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲。在一些情况下，该一系列电脉冲的频率为100至500kHz。电脉冲可以是例如双极性的和/或具有即时电荷反转(instant charge reversal)。
在一些情况下，所述方法还包括向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物，基本上由其组成，或由其组成。在一些情况下，所述方法还包括向损伤施用治疗有效量的核酸药物，基本上由其组成，或由其组成。核酸药物的施用可例如在施用电脉冲之前和/或与施用电脉冲同时进行。在一些情况下，核酸药物是本文中公开的治疗性核酸。在一些情况下，核酸药物是DNA质粒。例如，DNA质粒可包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、和/或其组合。
至少一部分的消融可使用RF-EMB(例如使用探头)来进行。探头可以是本文中公开的任何探头。在一些情况下，探头施用一系列电脉冲，从而产生与探头紧邻或相关的损伤区并且将与该损伤区相邻或相关的细胞可逆地电穿孔。
在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲。在一些情况下，电脉冲的频率为100至500kHz。电脉冲可以是双极性的。电脉冲也可具有即时电荷反转。
在一些情况下，所述方法还包括向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。核酸药物可以是本文中所述的任何治疗性核酸。在一些情况下，核酸药物是DNA质粒。例如，DNA质粒可包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、和/或其组合。
在本文中所述方法的一些情况下，肿瘤的所述部分包含癌细胞，并且其中消融在破坏细胞的细胞膜且使细胞的细胞内组分和膜抗原暴露的条件下进行。
在一些情况下，RF-EMB消融方法产生以细胞膜破坏为特征的独特组织坏死。在破坏细胞膜后，细胞内组分和细胞膜的组成部分分散到细胞外空间中，由此增强免疫识别和应答。对肝组织上通过RF-EMB消融产生的损伤成像显示出细胞膜破坏和内部细胞器(例如线粒体)损失的独特细胞损伤形式。这不同于例如IRE的其他类型的消融方法，其中细胞膜保持完整，细胞死于凋亡性死亡，并且细胞不暴露细胞抗原。在一些情况下，细胞膜破坏的程度随着与消融点的距离增大而降低。
如本文中所用，术语“RF-EMB型消融”是指在进行时与RF-EMB消融产生基本相同的结果的任何消融技术或技术组合。如本文中所述，RF-EMB消融和RF-EMB型消融形成具有以下特征中任意一个或更多个的损伤：细胞膜被破坏，细胞蛋白未变性，膜抗原未变性，抗原呈递增强，能够共刺激免疫系统，以及该损伤的紧靠的周围环境(immediatesurroundings)能够引导具有免疫能力的细胞和信号分子。
在一些情况下，被消融的肿瘤部分包含癌细胞，并且消融在破坏细胞的细胞膜且使细胞的细胞内组分和膜抗原例如暴露于机体免疫系统的条件下进行。可进行消融例如使得细胞的细胞内组分和膜抗原不被消融变性和/或使得经消融的肿瘤部分的紧靠的周围环境能够引导具有免疫能力的细胞和信号分子进出经消融组织。在一些情况下，进行消融使得抗原刺激免疫系统。例如，可进行消融例如使得细胞的暴露的细胞内组分和膜抗原的量足以刺激免疫系统和/或使得细胞的暴露的细胞内组分和膜抗原的量不产生免疫耐受。
在一些情况下，本文中公开的方法还包括向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。核酸药物可以是本文中所述的治疗性核酸。在一些情况下，核酸药物是DNA质粒。在一些情况下，DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、及其任意组合。在一些情况下，本文中公开的方法还包括将紧密围绕经消融肿瘤部分的细胞可逆地电穿孔。
在另一方面，本公开内容提供了在患者中治疗肿瘤的方法，其中所述方法包括对肿瘤的至少一部分进行消融并向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物，基本上由其组成，或由其组成。消融可例如使用RF-EMB(例如使用探头)来进行。RF-EMB可包括施用一系列电脉冲，从而产生与探头紧邻的损伤区并且将与该损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔。
在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲。在一些情况下，电脉冲的频率为100至500kHz。在一些情况下，电脉冲是双极性的和/或具有即时电荷反转。
在一些情况下，核酸药物是DNA质粒。DNA质粒可包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
在一些情况下，消融例如使用冷冻消融(例如使用探头)进行。在一些情况下，所述方法还包括施用一系列电脉冲，从而产生与探头紧邻的损伤区并且将与该损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲和/或其频率为100至500kHz。在一些情况下，该一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲和/或其频率为100至500kHz。在一些情况下，电脉冲是双极性的和/或具有即时电荷反转。在一些情况下，核酸是DNA，并且在一些情况下，DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
在一些情况下，本公开内容提供了其中施用组合物包括使用包含注射装置的消融探头来施用组合物的方法。在一些实例中，消融探头还可包含用于控制施用组合物之速度的泵。
在一些情况下，本公开内容提供了其中至少一种细胞因子是第一细胞因子并且还包括施用治疗有效量的第二细胞因子的方法。在一些实例中，第二细胞因子可与第一细胞因子相同或不同。第二细胞因子可被注射到肿瘤中。例如，第二细胞因子可在对肿瘤进行消融之后注射到肿瘤中。第二细胞因子可如下施用：静脉内、肌内、皮下和/或其组合。
在一些情况下，本公开内容提供了还包括在施用组合物之前测试探头位置的步骤的方法。探头位置的测试可包括通过探头肿瘤内施用测试注射并测量施用测试注射期间的肿瘤内压力。在一些情况下，该方法包括当与周围肿瘤组织的压力相比在测试注射期间检测到提高或降低的肿瘤内压力时重新定位探头。例如，提高的压力可指示探头在瘢痕组织内，并且降低的压力可指示探头在脉管内。
在另一方面，本公开内容提供了在患者中治疗转移性癌症的方法，其中所述方法包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：向患者肿瘤内施用足以治疗肿瘤之量的包含至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子之组合的组合物；以及对肿瘤的至少一部分进行消融从而产生损伤区；其中消融在如下条件下进行：破坏细胞的细胞膜且使细胞的细胞内组分和膜抗原暴露从而使得抗原刺激免疫系统。在一些情况下，进行消融使得细胞的细胞内组分和膜抗原不被消融变性。在一些情况下，进行消融使得经消融肿瘤部分的紧靠的周围环境能够引导具有免疫能力的细胞和信号分子进出经消融组织。
在一些情况下，该方法还可包括向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物；以及施用一系列电脉冲，从而将与损伤区相邻的细胞电穿孔。核酸药物可以是DNA质粒。例如，DNA质粒可包含编码选自GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合的基因的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成，或由所述核苷酸序列组成。
在治疗期间，技术人员可使用例如计算机系统、计算单元、软件和/或算法的系统来计划、靶向、定位、递送、监测、调整、成像、和/或测试治疗方案。技术人员将理解，RF-EMB涉及大量参数和变量，包括例如电场强度、频率、极性、形状持续时间、数目和间隔等。在一些实施方案中，技术人员可使用算法来控制和设计消融。本领域已知的任何算法均可用于本文中所述的方法。用于消融技术的计算机系统、计算单元、软件和/或算法的一些实例在本领域中是已知的。消融技术和系统在本领域中是已知的，包括例如至少美国专利申请US20150150618、PCT申请PCT/US14/68774、PCT申请PCT/US2016/015944、PCT申请PCT/US16/16955、PCT申请PCT/US16/16501、PCT申请PCT/US16/16300和PCT申请PCT/US2016/016352中，其整体并入本文。
在另一方面，提供了探头。在另一方面，提供了冷冻探头工具。探头包括工具主体(tool body)、可插入到肿瘤中的第一端、可与气体源和与电源连接的第二端、附接至第一端的冷却头(cooling head)，和附接至第一端的至少一个电极，其中所述至少一个电极配置成对肿瘤的第一部分进行消融，并且冷却头配置成当工具的第一端插入肿瘤中时冷冻肿瘤的第二部分。在另一些方面，至少一个电极是与电源和与探头的第一端连接的导线。至少一个电极可从工具主体伸出。至少一个电极是探头的主体。探头还包括至少一个针，其可从工具的第一端伸出并且与附接至该工具的第二端的流体储器流体地相连。所述至少一个针配置成将流体从流体储器递送至肿瘤的部分。流体储器是质粒。所述至少一个针终止于多个齿。冷却头可从工具主体伸出。至少一个电极可从工具主体伸出。探头具有覆盖工具主体的热绝缘物。探头具有覆盖工具主体的电绝缘物。肿瘤的第一部分与肿瘤的第二部分重叠。
在另一些方面，探头具有中心工具主体；与中心工具主体连接的第一端，第一端可插入到肿瘤中并且具有冷却头；与工具主体连接的第二端，第二端可与气体源连接；以及配置成包封中心工具主体的一部分的护套(sheath)。可移除护套具有电绝缘主体、配置成附接至电源的连接器和配置成与中心工具主体的导电部分连接的电触件，其中可移除护套配置成通过将来自电源的电脉冲沿中心工具主体传输并传输到第一端来对肿瘤的第一部分进行消融，并且其中冷却头配置成当工具的第一端插入肿瘤中时冷冻肿瘤的第二部分。
在另一些方面，护套可从中心工具主体移除。探头可附接至惰性电极(indifferent electrode)。
另一些实施方案包括用于与电脉冲组合地施用冷冻治疗的系统，该系统包括工具，该工具包括工具主体、可插入到肿瘤中的第一端以及第二端、附接至第一端的冷却头和附接至第一端的至少一个电极，其中所述至少一个电极配置成对肿瘤的第一部分进行消融，并且冷却头配置成当工具的第一端插入肿瘤中时冷冻肿瘤的第二部分；用于通过工具的第二端向工具供应气体的冷冻机(cryomachine)；以及用于通过工具的第二端向工具供应电脉冲的电脉冲发生器。
在另一些方面，该系统具有第二工具，该第二工具具有第二工具主体，可插入到肿瘤中的第二工具的第一端、可与冷冻机和电脉冲发生器连接的第二工具的第二端、附接至第二工具的第一端的冷却头和附接至第二工具的第一端的第二电极。在该系统中，所述第二电极和所述至少一个电极配置成消融在所述第二电极与所述至少一个电极之间延伸的肿瘤的第一部分，并且第二工具的冷却头配置成当工具的第一端和第二工具的第一端插入肿瘤中时冷冻肿瘤的第三部分。该系统可具有第二工具，该第二工具具有工具主体、可插入到肿瘤中的第一端，可与电源连接的第二端、附接至第一端的第二电极，其中肿瘤的第一部分在所述至少一个电极与所述第二电极之间延伸。该系统可具有与电源电连接的惰性电极。
如本文所用，术语“核酸药物”或“治疗性核酸”是指用于实现期望治疗作用的核苷酸、核苷、寡核苷酸或多核苷酸。示例性核酸药物包括，例如DNA、nDNA、mtDNA、gDNA、RNA、siRNA、miRNA、mRNA、piRNA、反义RNA、snRNA、snoRNA、vRNA等。例如，核酸药物可以是DNA质粒。
在本说明书通篇，使用术语“对象”来描述向其提供根据本发明方法的治疗的动物、人或非人。本发明清楚地预期了兽医应用。该术语包括但不限于鸟类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物(例如，人、其他灵长类、猪、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、兔、豚鼠、仓鼠、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊)。优选的对象是人、农场动物和家养宠物(例如猫和狗)。术语“治疗”在本文中用于表示延迟病症(例如，癌症)的发生，抑制、减轻其影响或延长其患者的寿命。
“有效量”是足以产生有益或期望结果的量。例如，治疗有效量是实现期望治疗效果的量。本文中所述用于本发明的组合物的有效量包括例如增强针对肿瘤和/或肿瘤细胞之免疫应答、改善患有癌症或处于癌症风险中患者之结局，以及改善其他癌症治疗之结局的量。有效量可以以一次或更多次施用、施加或剂量来施用。药物组合物的治疗有效量(即，有效剂量)取决于所选的药物组合物。药物组合物的治疗有效量取决于所选择的施用方法。在一些情况下，当与静脉内施用(例如，常规IV施用)相比时，组合物的肿瘤内施用降低组合物的治疗有效量。技术人员将认识到，某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文中所述药物组合物治疗对象可包括单次治疗或一系列治疗。
在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或更多个实施方案的细节。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文中描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域中已知的其他合适方法和材料。材料、方法和实例仅是举例说明性的而并非旨在限制。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
通过说明书和附图以及通过权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将变得明显。
附图说明
图1A至1B是除RF-EMB型消融之外还用CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和细胞因子治疗之前和之后患者A的骨盆区的CT扫描图像。箭头指向治疗前(图1A)和治疗后(图1B)初始肿瘤结构的位置。图1A是治疗前患者A的骨盆区的CT扫描。图1B是治疗后患者A的骨盆区的CT扫描。
图2是举例说明在实施例1中描述的治疗之后前列腺特异性抗原(prostrate-specific antigen，PSA)血液水平下降的图。
图3A至3B是除消融之外还用CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和细胞因子治疗之前和之后患者B的骨盆区的CT扫描图像。箭头指向治疗前(图3A)和治疗后(图3B)初始肿瘤结构的位置。图3A是治疗前患者B的骨盆区的CT扫描。图3B是治疗后患者B的骨盆区的CT扫描。
图4是举例说明治疗后患者B中PSA血液水平下降的图。
图5是具有两个冷冻探头电极并且具有递送电脉冲和产生可逆电穿孔之能力的装置。
图6是具有一个冷冻探头电极和一个非冷冻探头电极的装置的一个实施方案。
图7是具有一个冷冻探头和两个可伸缩电极针的装置的一个实施方案。
图8A是具有一个冷冻探头和两个配置成注射质粒的可伸缩电极针的装置的一个实施方案。
图8B是具有一个冷冻探头和配置成注射质粒的可伸缩电极针的装置的一个实施方案。
图9是具有一个冷冻探头并且在这单个冷冻探头上具有两个电极的装置的一个实施方案。
图10是具有一个冷冻探头电极和一个惰性电极的装置的一个实施方案。
图11是具有可从电治疗递送部分拆卸的冷冻探头治疗部分的装置的一个实施方案。
不同附图中的相同附图标记表示相同元件。
发明详述
本公开内容至少部分地基于用于癌症治疗的新组合物，其包含各自以治疗有效量存在于组合中并且在可药用载体中的至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子。在一些情况下，该组合还可包含核酸药物。本公开内容还至少部分地基于用于治疗癌症的新方法的开发，该新方法包括向患者肿瘤内施用如本文中公开的组合物。还描述了配置成用于进行本文中所述的某些方法的装置。
本文中所述的组合物、方法和装置特别地可用于在对象中治疗癌症。术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞。此类细胞的实例包括具有以迅速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。该术语意在包括癌性生长物，例如肿瘤；转移性组织和恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理学类型或侵袭阶段如何。还包括多种器官系统(例如呼吸系统、心血管系统、肾系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝系统、胃肠系统和内分泌系统)的恶性病(malignancy)；以及腺癌，其包括恶性病，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食管癌。
本文中所述的组合物、方法和装置可用于在对象中治疗天然产生的癌症。“天然产生”的癌症包括不是通过将癌细胞植入对象中实验诱导的任何癌症，并且包括例如自发产生的癌症、由患者暴露于致癌原引起的癌症、由插入转基因癌基因或敲除肿瘤抑制基因引起的癌症、以及由感染例如病毒感染引起的癌症。
癌(carcinoma)、腺癌和肉瘤的治疗在本发明之内。术语“癌”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性病。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺体组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的并且是指间充质来源的恶性肿瘤。
可使用本发明的方法、组合物和装置进行治疗的癌症包括例如胃、结肠、直肠、口/咽、食管、喉、肝、胰、肺、乳房、子宫颈、子宫体、卵巢、前列腺、睾丸、膀胱、皮肤、骨、肾、脑/中枢神经系统、头、颈和咽喉的癌症，例如肿瘤；肉瘤、绒毛膜癌和淋巴瘤，等。
可使用本文中所述的方法治疗转移性肿瘤。例如，对位于对象体内一个部位的肿瘤(例如，原发性肿瘤)进行本文中所述的治疗方法可刺激对象针对肿瘤的免疫防御并且引起对在对象体内其他部位的相同或甚至不同类型的肿瘤(例如，转移性肿瘤)进行免疫攻击。转移性肿瘤可由多种原发性肿瘤类型(包括但不限于前列腺、结肠、肺、乳房、骨和肝来源的那些)引起。转移发生在例如从原发性肿瘤脱落的肿瘤细胞黏附于脉管内皮，渗透到周围组织中，并且在与原发性肿瘤分离的部位生长以形成独立的肿瘤。
技术人员将认识到，本文中所述的组合物、方法和装置也可用于治疗非癌性生长物，例如非癌性肿瘤。示例性的非癌性生长物包括例如良性肿瘤、腺瘤、腺肌上皮瘤(adenomyoepthelioma)、导管或小叶增生、纤维腺瘤、纤维瘤、纤维化和单纯性囊肿、腺病性肿瘤、血肿、错构瘤、导管内乳头状瘤、乳头状瘤、颗粒细胞肿瘤、血管瘤、脂肪瘤、脑脊膜瘤、肌瘤、痣、骨软骨瘤、叶状肿瘤、神经瘤(例如，听神经瘤、神经纤维瘤和化脓性肉芽肿)，或疣(例如，跖疣、生殖器疣、扁平疣、甲周疣和丝状疣)。
技术人员将认识到，对象可由医师(或兽医，视被诊断对象而定)通过本领域中已知的任何方法例如通过评估患者的病史、进行诊断测试和/或通过采用成像技术被诊断为患有本文中所述病症(例如，癌症)或处于其风险中。
如本文中所述，在患者中治疗肿瘤的一种示例性方法包括以下步骤：(i)任选地，在进行该方法之前，确定患者中肿瘤的位置；(ii)向肿瘤肿瘤内施用本文中所述的药物组合物(例如，包含至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的药物组合物)；(iii)任选地对肿瘤的至少一部分进行消融；(iv)任选地向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物；以及(v)任选地向肿瘤施用一系列电脉冲，使得将损伤周围的区域可逆地电穿孔。确定肿瘤的位置可通过本领域中已知的技术(例如，X射线放射照相术；磁共振成像；医学超声检查或超声；内窥镜检查；弹性成像(elastography)；触觉成像(tactile imaging)；热成像；医学摄影；核医学成像技术，包括正电子发射断层显像和单光子发射计算机断层显像；光声成像；温度记录法(thermography)；断层显像，包括计算机辅助断层显像；超声心动图显像和功能性近红外光谱术等)来进行。任选的对肿瘤进行消融的步骤(iii)可在施用药物组合物(ii)之前、同时或之后进行，并且消融可产生使肿瘤的细胞内组分和膜抗原暴露的损伤区。消融可使用本文中所述的技术对肿瘤的一部分或全部进行。任选地向肿瘤施用治疗有效量的核酸药物(iv)可在步骤(ii)和(iii)之前、同时或之后进行。任选地向肿瘤施用一系列电脉冲(v)可在施用核酸药物(iv)的同时或之后进行；或者在步骤(ii)和(iii)之前、同时和/或之后进行。
因此，本文中提供了包含检查点抑制剂和细胞因子之混合物的药物组合物。检查点抑制剂用于激活免疫系统以攻击肿瘤，从而抑制负责下调免疫系统的免疫应答蛋白质。检查点抑制剂可以是例如CD137、CD134、PD-1、KIR、LAG-3、PD-L1、CTLA-4、B7.1、B7H3、CCRY、OX-40和/或CD40的抑制剂。药物组合物可包含检查点抑制剂的任意组合。例如，特别可用的是PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂的组合。技术人员将认识到许多其他组合也是可用的。组合的非限制性列表包括CD137抑制剂和CD134抑制剂；PD-1抑制剂和KIR抑制剂；LAD-3抑制剂和PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂和CD40抑制剂；CD134抑制剂和PD-1抑制剂；KIR抑制剂和LAG-3抑制剂；PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂；CD40抑制剂和CD137抑制剂；CTLA-4抑制剂和PD-L1抑制剂；PD-1抑制剂和CD40抑制剂，或本领域中已知的两种或更多种检查点抑制剂的任意组合。药物组合物还可包含至少细胞因子。至少一种细胞因子可包含GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、和/或其组合。该组合物可包含第一细胞因子和第二细胞因子。技术人员将认识到，在一些情况下，第一和第二细胞因子可以是不同的。
传统上，检查点抑制剂静脉内施用，其由于这些杀细胞剂在体内非特异性分布而可导致严重且有时致命的全身毒性。这些药剂的非特异性分布杀伤癌细胞和正常细胞二者，并且可对治疗方案和患者结局产生不利影响。本发明的肿瘤内方法可通过将药物隔离在肿瘤微环境中并且使正常细胞和组织免受药物的毒性而降低全身毒性并且产生更少的副作用(Intratumoral Immunization：A New Paradigm for Cancer Therapy.ClinCancer Res.2014年4月1日；20(7)：1747-1756.doi：10.1158/1078-0432.CCR-13-2116)。本发明的肿瘤内方法可通过还降低治疗有效所必需的施用组合物的量来降低全身毒性和产生更少的副作用。此外，通过组合靶向癌细胞和免疫系统二者的技术，药物组合物不仅可更有效地抑制癌症，而且还可更有效地触发有效的抗肿瘤免疫应答。然后，该抗肿瘤免疫应答可靶向转移部位并且在对象全身消除癌症。
该组合物还可包含以下一种或更多种治疗剂和/或生物剂，其在本领域中已知有效地治疗癌症(即，抗癌剂)，或者在本领域中已知有效地刺激免疫系统(即，免疫刺激剂或免疫调节剂)。如上所述，这样的药物组合物可用于治疗癌症。
在一些情况下，药物组合物还包含治疗有效量的核酸药物。核酸药物可以是例如DNA、nDNA、mtDNA、gDNA、RNA、siRNA、miRNA、mRNA、piRNA、反义RNA、snRNA、snoRNA、vRNA等。例如，核酸药物可以是DNA质粒。这样的DNA质粒可包含编码选自GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、和/或其组合的基因的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成，或由所述核苷酸序列组成。核酸药物可具有临床可用性，例如增强细胞的治疗作用或向患者提供治疗剂。在另一些情况下，核酸药物可用作标记基因或抗性基因。核苷酸序列可编码可从细胞分泌或不可从细胞分泌的基因。核酸药物可编码基因和提高该基因的表达的启动子序列。
本领域技术人员将认识到，可根据癌症和/或对象的各个方面(例如肿瘤的大小、肿瘤的位置、对象、药物响应的临床证据等)调整本发明描述的组合物。
本文中提供的药物组合物可包含递送剂或可药用载体。如本文中所用的术语“可药用载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。还可向包含如本文中所述的抗体或其抗原结合片段的药物制剂中并入补充活性化合物。
配制合适药物组合物的方法是本领域中已知的，参见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，2005；以及Drugs and the PharmaceuticalSciences：a Series of Textbooks and Monographs(Dekker，NY)系列丛书。例如，用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或混悬剂可包含以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张度的物质，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量瓶(multiple dose vial)中。
本文中所述的药物组合物(例如，检查点抑制剂、细胞因子、核酸药物、和/或其组合)可通过注射装置肿瘤内递送，其中注射装置可以是探头的一部分。如本文中所述的探头可配置成用于多种消融方法。此外，探头还可以配置成组合本文中所述的方法，例如冷冻探头可配置成施用电脉冲、冷冻剂和/或药物组合物。
适于注射的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)、分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且在存在易注射性(easy syringability)的程度上应是流体。其应在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
防止微生物作用可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，可优选地在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)，以及氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与以上列举的成分中的一种或组合(根据需要)一起并入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常来说，分散体通过将活性化合物并入到无菌载剂中来制备，所述无菌载剂包含基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其由经预先无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的期望成分的粉末。
在一些实施方案中，治疗性化合物可用载体制备，所述载体将保护治疗性化合物免于从体内迅速消除，例如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。
药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装、药筒或分配器中。
治疗剂和/或生物剂可以以实现期望结果所必需的有效量、剂量和时间施用。有效量可以以一次或更多次施用、施加或剂量来施用。药物组合物的治疗有效量(即，有效剂量)取决于所选的药物组合物。该组合物可以以每天一次或更多次至每周一次或更多次(包括每隔一天一次)施用。技术人员将认识到，某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文中所述药物组合物治疗对象可包括单次治疗或一系列治疗。
在本文中所述方法的一些实施方案中，本文中所述的组合物可以以一次或更多次施用来施用。这一次或更多次施用可以是相同或不同的施用方法，包括例如静脉内、肌内、皮下、肿瘤内或其任意组合。在一些情况下，例如，第一组合物肿瘤内施用并且第二组合物皮下施用。在一些情况下，第一组合物和第二组合物同时、依次或在一系列治疗中施用。在一些情况下，第一组合物和第二组合物是相同的、不同的或部分相同的。在一些情况下，本文中所述的方法包括两次或更多次施用。在一些情况下，第一施用是至少两种检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂)和至少一种细胞因子(例如，GM-CSF)的肿瘤内施用。
可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可每天施用数个分开的剂量，或者可如治疗情况的紧急性(exigency)所指示的按比例降低剂量。本领域技术人员将知晓适合于向对象施用本文中公开的新单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量和给药方案。参见例如，Physicians’Desk Reference，第63版，Thomson Reuters，2008年11月30日。例如，治疗性化合物的剂量、毒性和治疗效力可通过在细胞培养物或实验动物中通过标准药物操作来确定，例如以确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比值是治疗指数，并且其可表示为比值LD50/ED50。显示出高治疗指数的化合物是优选的。虽然可使用表现出毒性副作用的化合物，但应注意设计将这样的化合物靶向至受影响组织的部位的递送系统以使对未感染细胞的潜在损害最小化并且从而降低副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制多种用于人的剂量。此类化合物的剂量优选地位于包括ED50且几乎没有毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可根据使用的剂型和利用的施用途径在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何化合物，可通过细胞培养测定初始地评估治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以实现包括如在细胞培养物中确定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定人中的可用剂量。可例如通过高效液相色谱来测量血浆中的水平。
本文中公开的治疗癌症的方法任选地使用肿瘤的至少一部分的消融。与外科手术移除相比，消融的一个独特方面是肿瘤留在原位以使机体的防御和治愈机制将其移除。这创造了利用机体的免疫防御机制来识别死肿瘤并且基本上使患者对其自身癌症自身免疫的机会。此外，通过针对癌细胞抗原刺激免疫系统，本文中公开的方法可(i)治疗原发性肿瘤；(ii)激活针对癌细胞抗原的免疫应答；以及(iii)诱导转移性病变的免疫系统靶向。
如本文中所述，消融方法影响已知影响针对经消融肿瘤之免疫应答的至少两个因素。一个是消融过程对蛋白质结构并且因此肿瘤蛋白质之抗原性的影响。第二个因素是与消融模式相关的细胞死亡机制。在某些条件下，坏死使细胞破裂并且将广泛多种细胞内内容物溢出到细胞外环境中，这引起树突细胞的共刺激，从而导致T细胞增殖和激活。使细胞保持完整的凋亡限制细胞内容物并且防止共刺激。这种细胞内暴露和共刺激的缺乏通过阻止T细胞激活和增殖而减弱免疫作用。
本领域有许多已知的消融方法，包括冷冻消融，热消融，IRE，RF-EMB，RF-EMB型消融，超声消融，高强度聚焦超声消融，使用光动力学治疗进行的消融，使用非热激波、空化、其他机械物理细胞破坏进行的消融、或其任意组合。这些不同类型的消融方法可对蛋白质结构和细胞死亡机制具有不同的结果。例如，热消融由于使蛋白质变性而破坏结构，并且其还破坏组织下面的胶原基质。蛋白质和组织的这种破坏不太可能产生稳健的免疫应答。冷(例如冷冻消融)可使蛋白质变性并且可破坏蛋白质结构和组织结构二者。不可逆电穿孔(irreversible electroporation，IRE)和非热消融模式(例如RF-EMB等)是结构保留的，并且因此可用于治疗胰、中心肝(central liver)和其他区域(例如头和颈)中的癌症。IRE是其中对细胞施用电场以提高细胞膜通透性的技术。IRE的高电压破坏靶细胞，同时使相邻细胞不受影响。然而，IRE引起凋亡性细胞死亡，并且如上所述，这对于免疫反应不是最佳的。射频电膜击穿(radiofrequency electrical membrane breakdown，RF-EMB)是另一种非热模式，其通过用电完全击穿细胞膜而产生坏死(参见，Onik PCT/US2014/068774，其整体并入本文)。在某些条件下，RF-EMB也可用于递送DNA质粒。可逆电穿孔(reversibleelectroporation，RE)也可用于递送DNA质粒。RE类似于IRE，但施加至靶细胞的电低于靶细胞的电场阈值。因此，当电场被移除时细胞可恢复，并重建其细胞膜并且继续细胞功能。RE可用作用于基因治疗的工具，因为可逆元件允许核酸(例如DNA质粒)进入活细胞中。
本文中所述的消融方法可单独使用或与其他消融方法组合使用。两种或更多种消融方法可组合使用。这些方法可依次或同时应用。在一些情况下，消融方法的组合对组织具有协同作用。组合的非限制性列表包括例如热消融和RF-EMB，冷冻消融和RF-EMB，IRE和RF-EMB，RE和RF-EMB，IRE和冷冻消融，热消融和冷冻消融，热消融和IRE，RE和IRE，热消融与RE，以及其中使用两种或更多种方法的任意组合。两种或更多种消融方法可同时或依次使用。
在一些情况下，本文中所述的方法使用RF-EMB和冷冻消融技术的组合产生RF-EMB型损伤。消融方法的这种组合可对组织产生协同作用。协同作用可以是与其他方式相比在需要更少能量输入下产生RF-EMB型损伤。例如在肝组织中的结果包括：在与无菌非炎性凝固性坏死相邻的区域中，肝结构改变，包括胆管小管扩张；以及细胞质细胞器的独特弥散性改变，包括线粒体嵴的扭曲和内质网的空泡形成。
本领域技术人员将认识到，如本文中方法中公开的组合物或治疗的施用可根据癌症的各个方面(例如肿瘤的大小、肿瘤的位置、对象)进行调整。本领域技术人员将认识到，多种消融方法各自的变量是本领域中已知且已有描述的(包括例如PercutaneousProstate Cryoablation.Gary Onik，Boris Rubinsky，Graham Watson，和Richard Ablin编辑.Quality Medical Publishing，St Louis，MO.1995，其整体并入本文)。
作为可变且多样性的消融参数的一些实例，如本文中所述，冷冻消融方法包括以下可调节以影响消融结果的变量：例如冷冻-解冻循环的数目、冷冻的速度、循环的解冻部分等，所述消融结果例如损伤的尺寸、对周围组织的损害、以及针对损伤的免疫应答。类似地，RF-EMB方法包括可类似地影响消融结果的变量，例如电场强度、频率、极性、形状持续时间、数目和间隔等。肿瘤细胞与电脉冲的临近度将决定RF-EMB对任何特定细胞的强度和结果。例如，随着电场强度从施用点(例如探头)减弱，离施用点最远的细胞被较低强度的电场处理，并且因此可不被消融而是被可逆地电穿孔。
另外，可调节可逆电穿孔(RE)用于递送基因治疗的应用以确定损伤周围的电穿孔的范围、可逆性和递送。本领域技术人员将认识到，电穿孔的变量是本领域中已知且已有描述的(Kee Stephen T，Gehl Julie，Lee Edward W.Clinical aspects ofelectroporation.New York：Springer；2011.ISBN 978-1-4419-8362-6#256页，其整体并入本文)。这些变量包括但不限于改变电脉冲的强度、电脉冲的时机、脉冲的数目、脉冲的极性等。如本文中所述，肿瘤的消融可发生在施用药物混合物的同时、之前或之后。核酸药物可在消融过程之前、之后或期间施用。核酸药物可在施用药物混合物之前、之后或期间施用。核酸药物也可在电穿孔过程之前或期间施用。
所述方法可单独使用或与用于在患者中治疗癌症的其他方法组合使用。因此，在一些情况下，本文中所述的方法还可包括使用外科手术(例如，以移除肿瘤的一部分)、化学治疗、免疫治疗、基因治疗和/或放射治疗来治疗患者。本文中所述的组合物和方法可在任何点(例如，在外科手术、化学治疗、免疫治疗、基因治疗和/或放射治疗之前、期间和/或之后)施用于患者。
还提供了包含本文中所述的一种或更多种药物组合物的药盒(kit)。药盒通常包含以下主要元件：包装、包含如上所述的结合组合物的试剂、任选地对照、以及说明书。包装可以是盒状结构，其用于容纳包含所述结合组合物的小瓶(或多个小瓶)、包含对照的小瓶(或多个小瓶)，和/或用于本文中所述方法的使用说明书。在一些情况下，包装包含可由数字装置根据系统指令控制的药筒。本领域技术人员可容易地改变包装以适应个体需要。
在一些实施方案中，本文中提供的药盒可包含至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、或更多种)组合物，其包含本文中所述的至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、或更多种)组合物，以及在单独小瓶中含有本领域中已知在治疗癌症中有效的治疗剂和/或生物剂的至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、或更多种)其他组合物。
本文中提供的组合物和药盒可根据上述任何方法(例如，治疗方法)使用。例如，组合物和药盒可以用于治疗癌症。本领域技术人员将知晓本文中提供的组合物和药盒的其他合适用途，并且将能够将组合物和药盒用于这样的用途。
装置
在一些实施方案中，注射装置是可发射电脉冲并且还递送质粒的冷冻探头。
参照图5，注射装置100是系统101的一部分，其能够向组织和/或肿瘤施用极冷以及电脉冲二者。注射装置100具有两个电极冷冻探头，其包括带正电荷的冷冻探头110和带负电荷的冷冻探头130。冷冻探头110，130各自通常是圆柱形探头，其在第一端111，131插入到靶组织102中，并且在第二端112，132由使用者抓握。冷冻探头110，130各自可由使用者单独操纵。或者，冷冻探头110，130二者可容置在较大的壳体(为清楚起见未示出)内，该壳体允许使用者将冷冻探头110，130二者同时以已知的彼此距离插入到靶组织102中。在一些实施方案中，容置在壳体内的两个冷冻探头110，130可被布置成使得使用者可增大或减小两个冷冻探头电极110，130相隔的距离。
冷冻探头110，130各自具有从冷冻探头110，130的第一端111，131延伸至第二端112，132的中心气体供应套管114，134。中心气体供应套管114，134各自在每个探头的第二端112，132附接至冷冻机190。冷冻机190用作冷却气体源，所述冷却气体通过气体供应管线192泵送以在冷冻探头的第二端112，132进入中心气体供应套管114，134并且被递送至在冷冻探头的第一端111，131的冷却头116，136，并从而递送至组织102。如本领域中已知的，冷却头116，136配置成刺穿并且插入到组织102中，并且其形状可以是平的或尖的。冷却头116，136通常由金属或具有高传导性的其他材料制成，以允许通过中心气体供应套管114，134进入冷却头116，136的冷气体与组织102热相互作用。
气体返回通道118，138同心地围绕中心气体供应套管114，134并且与套管流体地相连，使得冷却气体进入冷却头116，136并随后通过气体返回通道118，138流回以通过气体返回管线194返回到冷冻机190。热绝缘层120，140保护抓握冷冻探头110，130的使用者免受行经气体返回通道118，138的冷气体。电绝缘层122，142和热绝缘层120，140同心地围绕气体返回通道118，138的外表面。电绝缘层122，142保护使用者和使冷冻探头110，130各自的主体与由电脉冲发生器180产生的电脉冲电隔离。电绝缘层122，142，热绝缘层120，140和气体返回通道118，138的外表面的顺序可以以不同的顺序放置。
电脉冲发生器180通过导线182与冷冻探头110，130的第二端112，132连接，使得电脉冲被传输至冷却头116，136并且进而施用于组织102。因此，冷却头116，136发挥向靶组织102施用冷和电脉冲的双重功能。电脉冲可通过层置于电绝缘层122，142与热绝缘层120，140之间的导线沿冷冻探头110，130的长度传输。在一些实施方案中，气体返回通道118，138的至少一部分是导电的，并且还发挥通过冷却头116，136将电脉冲传输至组织102的功能。
电脉冲发生器180布置成通过带正电荷的冷冻探头110产生正电荷，并且通过带负电荷的冷冻探头130产生负电荷。因此，注射装置100能够向靶组织102递送电脉冲以及低温。为简单起见，带正电荷的冷冻探头110和带负电荷的冷冻探头130在结构上可相同。
两个冷冻探头110，130以期望的彼此间隔距离(例如，2mm、5mm、10mm)插入到靶组织102中，从而产生围绕冷冻探头110，130的尖端并且在其之间延伸的冷冻损伤区104。两个冷冻探头110，130的这种布置还产生与冷冻损伤区104相关的RE(可逆电穿孔)区106。
使用者可改变冷冻损伤区104的构造。在一些情况下，冷却头116，136可缩回到冷冻探头110，130的主体中，例如可通过将冷却头116，136缩回使得其更多或全部的表面区域被热绝缘层120，140覆盖来减小从热绝缘层120，140的端部伸出的冷却头116，136的长度。类似地，可通过将冷却头116，136伸出使得其较少的表面区域被热绝缘层120，140覆盖来增大从热绝缘层120，140的端部伸出的冷却头116，136的长度。在使用注射装置100期间，绝缘层120，140和122，144可重新定位。使用者还可调节离开冷冻机190并进入组织102的气体的温度。使用者可通过调节离开电脉冲发生器180的电脉冲来改变RE区106的构造。可改变变量使得冷冻损伤区104小于RE区106、与RE区106尺寸相同或大于RE区106。
参照图6，示出了另一个实施方案，注射装置200，其能够将冷和电脉冲二者递送至靶组织202。电极冷冻探头200的许多元件与图5中示出的那些相同。带正电荷的冷冻探头210具有第一端211和第二端212，以及从第一端211延伸至第二端212的中心气体供应套管214。中心气体供应套管214在第二端212附接至作为冷却气体源的冷冻机290，冷却气体通过气体供应管线292泵送以进入中心气体供应套管214并且被递送至在冷冻探头的第一端211的冷却头216并因此被递送至组织202。冷却头216如本领域中已知的配置成刺穿并且插入到组织202中，且在形状上可以是平的或尖的，并且通常由金属或具有高传导性的其他材料制成。
气体返回通道218同心地围绕中心气体供应套管214并且与套管214流体地相连，使得冷却气体进入冷却头216并随后通过气体返回通道218流回，以通过气体返回管线294返回至冷冻机290。热绝缘层220保护抓握冷冻探头210的使用者免受行经气体返回通道218的冷气体。电绝缘层222同心地层置于气体返回通道218的外表面，其也被热绝缘层220同心地围绕。
电脉冲发生器280通过导线282与冷冻探头210的第二端212连接并且还与电探头230的第二端232连接。电探头230类似于冷冻探头210，其具有可插入组织202中的第一端231和与电脉冲发生器280连接的第二端232。然而，电探头230不与冷冻机290连接并且不具有向组织202施用冷冻治疗的结构(例如，中心气体供应套管、气体返回通道、气体供应管线和气体返回管线)。电探头230具有不是使组织202冷却而是施用电治疗的组织插入头236。电脉冲发生器280将电脉冲传输至冷却头216和组织插入头236，并且进而传输至组织202。因此，冷却头216发挥向靶组织202施用冷和电脉冲的双重功能，而组织插入头236仅施用电脉冲。电脉冲可通过附接至电绝缘层222，242的导线沿冷冻探头210和电探头230的长度传输。在一些实施方案中，冷冻探头210和电探头230的主体的至少一部分是导电的并且还发挥将电脉冲传输至组织202的功能。电脉冲发生器280布置成通过带正电荷的冷冻探头210产生正电荷并且通过带负电荷的电探头230产生负电荷。
冷冻探头210和电探头230以期望的彼此间隔距离(例如，2mm、5mm、10mm)插入到靶组织202中，从而产生围绕冷冻探头210和电探头230并且在其之间延伸的RE区206。由于只有冷冻探头210向组织202施用冷，产生的冷冻损伤区204小于用两个冷冻探头产生的冷冻损伤区104，并且围绕冷冻探头210的第一端211。
对于冷冻探头注射装置200，使用者可通过将冷却头216布置成可缩回到冷冻探头210的主体中来改变冷冻损伤区204的构造。使用者还可调节离开冷冻机并进入组织202的气体的温度。通过调节离开电脉冲发生器180的电脉冲可改变RE区206的尺寸。
图7中示出的是具有单个冷冻探头310的注射装置300的一个实施方案。该注射装置的元件类似于前面的一些实施方案，然而注射装置300具有单个冷冻探头310。冷冻探头310能够将冷和电脉冲二者递送至靶组织302，并且具有第一端311、第二端312、在它们之间延伸并且附接至作为冷却气体源的冷冻机390(未示出)的中心气体供应套管314，冷却气体通过气体供应管线392泵送至冷冻探头310并被递送至冷却头316，并且通过气体返回通道318移除，气体返回通道318同心地围绕中心气体供应套管314且与其流体地相连。还存在热绝缘层320和电绝缘层322。
一个或两个电脉冲发生器380(如图7中所示)通过导线382与冷冻探头310的第二端312连接。导线382附接至以电极356，358终止的一对导线350，352，电极356，358离开冷冻探头的主体并且在冷却头316旁边进入组织302。导线350，352例如通过刺穿电绝缘层322或通过插入到沿电绝缘层322的长度延伸的通道中而嵌入到电绝缘层322中。导线350，352和电极356，358可分别彼此附接，或者在一些实施方案中，正导线350和正电极356是同一连续导线，负导线352和负电极358是同一连续导线。
电极356，358成形为使得当延伸到组织302中时，电极呈曲线离开冷冻探头310的主体。当缩回时，电极356，358保持线形形状以更好地与冷冻探头的主体对齐。电极356，358可由例如镍钛(也称为镍钛诺(nitinol))形成。电极356，358的曲率允许使用者将得到的RE区306延伸超出冷冻损伤区304。使用者可在冷冻治疗性治疗之前、期间或之后伸出电极356，358并传输电脉冲。
图8A示出了类似于图7的注射装置的注射装置400(其中附图标记指代与图7中相同的元件，但是提高100)。然而，注射装置400能够将质粒注射到组织402中以及施用电治疗和冷冻治疗。冷冻探头410具有针460，462，其大致平行于电极456，458延伸并且插入到组织402中。在冷冻探头的第二端412，针460，462与从流体储器470接收流体的管472流体地相连。例如，流体储器470可以是注射器。因此，可将在流体储器470内的流体(例如，质粒)施用于组织402。针460，462与电极456，458一样可完全或部分地缩回到冷冻探头410的主体中。针460，462和电极456，458可同时或彼此独立地缩回。针460，462也可在组织402中重新定位。在一些实施方案中，如图8B中所示，针460，462可具有多个齿466。多个齿466可允许使用者以更快速且精确可控的模式并且以与中心探头的特定距离更好地控制所注射材料或药物的扩散和分布。
图9示出了具有两个电绝缘层522，524的冷冻探头500。导线或电导管(electricalconduit)550，552夹在两个电绝缘层522，524之间，并且从电脉冲发生器580运送正电荷。冷冻探头500的主体以冷却头516终止并且用作由电脉冲发生器580产生的负电荷的电导管。两个电绝缘层522，524可各自独立地定位和伸缩。
图10中所示的是具有单个冷冻探头610的注射装置600的一个实施方案。注射装置的元件类似于前面的实施方案，然而注射装置600具有与惰性电极696一起工作的单个冷冻探头610，惰性电极696是放置在单个分支上或与中央终端连接并且与冷冻探头610的探测电极配对的远程电极。冷冻探头610能够将冷和电脉冲二者递送至靶组织602，并且具有第一端611、第二端612、以及在它们之间延伸并且附接至作为冷却气体源的冷冻机690(未示出)的中心气体供应套管614，冷却气体通过气体供应管线692泵送至冷冻探头610并递送至冷却头616，并且通过气体返回通道618移除，返回通道618同心地围绕中心气体供应套管614且与其流体地相连。还存在热绝缘层620和电绝缘层622。一个或两个电脉冲发生器680(如图10中所示)通过导线682与冷冻探头610的第二端612连接，并且还与惰性电极696连接。
参照图11，描述了注射装置700的另一个实施方案。注射装置700的元件类似于前面的实施方案。注射装置700具有可配置成与惰性电极796一起工作的单个探头710。在一些实施方案中，注射装置700包括能够将冷和电脉冲二者递送至靶组织702并且具有第一端711和第二端712的冷冻探头。
探头710由两个不同的部分：中心部分770和同心部分772制成。中心部分具有在探头710的第一端与第二端之间延伸并且附接至冷却气体源的中心气体供应套管714，冷却气体通过气体供应管线692泵送至中心部分770并递送至冷却头716，并且通过气体返回通道718移除，气体返回通道718同心地围绕中心气体供应套管714且与其流体地相连。热绝缘层720围绕气体通道。
同心部分772围绕中心部分770，并且被电绝缘层722围绕。一个或两个电脉冲发生器780(图11中示出了两个)通过导线782与探头710的第二端712连接，具体地连接在同心部分772，并且还与惰性电极796连接。同心部分772可附接至中心部分770并且可从中心部分770移除。同心部分772具有围绕内部中心部分772的护套的形式，并且通过相对于中心部分770的轴向长度重新定位同心部分772，同心部分772可滑动到中心部分770上和滑动离开中心部分770。
在同心部分772上(例如，在其内表面上)包括电触件774。电触件774使附接至电脉冲发生器780和惰性电极796的导线782与中心部分770的导电部分电接触。如果中心部分770由金属或其他传导材料制成，电脉冲由此沿中心部分的主体传输至冷却头716以向组织702施用电治疗。或者，中心部分770可具有配置成沿中心部分770的长度从脉冲发生器传输电流的导线。
图11中所示的实施方案是特别有利的。同心部分772可与中心部分770分开制造。例如，中心部分770可以是传统上用于此类治疗的完整冷冻探头。将同心部分772附接至中心部分770的外部提高探头的功能性，允许先前的单用途冷冻探头另外提供电RF-EMB治疗能力。
图11的实施方案允许使用者以高度精确的方式和提高的灵活性进行组合的电RF-EMB治疗和冷冻治疗。可如所期望地将探头710插入到肿瘤或靶组织702中。可如所期望地仅定位同心部分722，仅定位中心部分772或定位这两个部分。在一个实施方案中，使用者插入具有内部部分和外部部分的探头710，并且进行期望的治疗方案。然后，使用者可通过将中心部分770滑动离开同心部分772同时使同心部分772保持在原位而将中心部分770从组织702移除。然后，使用者可用不同的中心部分(例如，如上所述用于递送质粒的针、既不具有冷冻能力也不具有电递送能力的工具例如测量工具、酸度传感或生物活性装置、组织收集工具、活检工具、或低温探头)替换移除的中心部分。保持在原位的同心部分772允许使用者以高准确度插入新的中心部分，精确地放回至在中心部分772从组织702移除之前其第一端的先前位置。
在一些实施方案中，探头710的同心部分772可与插入在同心部分772内除探头之外的工具联合使用。一旦就位，同心部分772充当引导装置，使得在下一个工具与在前工具放置在相同位置的益处下，不同的工具插入到精确的相同位置。替换内部工具可以是配合在同心部分772内的任何工具(例如测量工具)。替换工具可通过同心部分772上的电触件774通电。
在一些实施方案中，替换内部部分以与同心部分772一起工作的工具可以是这样的工具：在该工具的主体上具有与同心探头部分772上的电触件774配合的对应电触件。这样的内部工具可以是被改进以具有这样的电触件的先前存在工具，或设计成包括此类触件的工具。另外，每个工具功能可用于在组织702中产生期望的作用，并且根据替换内部工具的特征和所使用的参数，每个工具可仅在组织702的一部分中产生作用。
在一些实施方案中，探头710在同心部分772与中心部分770之间具有锁定机构或对齐机构(例如，杆、弹簧、夹子或鲁尔型锁(luer-type lock)。一旦中心部分770插入到同心部分772中，锁定机构使内部部分和外部部分相对于彼此保持对齐和固定。在一些实施方案中，探头710将仅在内部部分与外部部分之间的锁定机构接合时才发挥作用。例如，使用者必须将中心部分770扭转成与同心机构上的脊部接合，并且完成移动将使中心部分上的电触件与同心部分的电触件774接触。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行多种修改。例如，虽然图5和图6中示出了两个冷冻探头，但是也可使用另外的冷冻探头对。另外，虽然图7中示出了一对导线，但是也可使用另外的导线对。在一些实施方案中，针或齿466配置成测量靶组织内的局部压力。因此，其他实施方案在所附权利要求书的范围之内。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例1：使用药物和消融的组合在患者A中治疗前列腺癌
一位72岁男性被诊断患有前列腺癌(15年前)。已在进行根治性前列腺切除术之后进行二次放射治疗。在骨盆中可见复发性团块(图1A)，并且结节转移使两个输尿管都封闭，这导致肾衰竭并且膀胱中需要有管用于正常功能。
随后使用基础的和先进的二线癌症药物用激素治疗对患者进行治疗。该治疗不成功，并且癌症被分类为去势抵抗性前列腺癌(Castrate resistant prostate cancer)CRPC。施用了另外两种可用的化学治疗(泰索帝(Taxotere)和卡巴他赛(Carbezetaxal))并且其不成功，导致患者A被安排进行临终关怀。
向患者A肿瘤内施用包含CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和细胞因子的组合物。另外，对肿瘤进行消融以产生RF-EMB型损伤。在该药物和消融治疗之前，患者A的前列腺特异性抗原(PSA)为约28(图2)。在治疗之后9个月，PSA保持为0，其中通过放射照相术其疾病完全消退(图1B)。
该区域的活检未显示出癌症，但先前肿瘤的该区域中的炎性细胞浸润物指示免疫应答。
实施例2：使用药物和消融的组合在患者B中治疗前列腺癌
一位65岁男性被诊断患有前列腺癌。在患者B的骨盆中可见团块(图3A)，并且其PSA水平为130且Gleason评分为8。在淋巴结中鉴定出转移。
向患者B肿瘤内施用包含CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和细胞因子的组合物；并且对肿瘤进行消融以产生RF-EMB型损伤。在进行两轮该治疗之后，患者B的PSA水平为1.8，并且骨盆团块明显减小(图3B)。在第二次治疗之后8周，报道患者B除了淋巴结恢复至正常尺寸之外还具有正常的泌尿和性功能(图4)。
其他实施方案
应理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (134)

1.药物组合物，其包含：各自以治疗有效量存在于所述组合物中的至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合、以及可药用载体。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少两种检查点抑制剂包含针对选自以下的至少两种不同的抑制剂：CD137、CD134、PD-1、KIR、LAG-3、PD-L1、CTLA-4、B7.1、B7H3、CCRY、OX-40和CD40的抑制剂。
3.权利要求2所述的药物组合物，其中所述至少两种检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述CTLA-4抑制剂是伊匹单抗或曲美木单抗。
5.权利要求3所述的药物组合物，其中所述PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、皮地利珠单抗、MK-3475和MED 14736。
6.权利要求3所述的药物组合物，其中所述CTLA-4抑制剂是伊匹单抗，并且所述PD-1抑制剂是派姆单抗。
7.权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种细胞因子选自GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ和IFNα。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中所述至少一种细胞因子是GM-CSF。
9.权利要求3所述的药物组合物，其包含浓度为约0.5至10mg/ml的所述CTLA-4抑制剂、浓度为约0.5至20mg/ml的所述PD-1抑制剂和浓度为约10至500μg/ml的所述细胞因子。
10.权利要求1所述的药物组合物，其还包含治疗有效量的核酸药物。
11.权利要求10所述的药物组合物，其中所述核酸药物是DNA质粒。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、及其任意组合。
13.权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物的体积小于约15ml。
14.权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少两种免疫检查点抑制剂和所述至少一种细胞因子配制成用于肿瘤内施用。
15.在患者中治疗肿瘤的方法，其包括向所述患者肿瘤内施用足以治疗所述肿瘤之量的组合物，所述组合物包含：各自以治疗有效量存在于所述组合物中的至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合、以及可药用载体。
16.权利要求15所述的方法，其中所述至少两种检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂。
17.权利要求16所述的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF。
18.权利要求15所述的方法，其还包括向所述肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。
19.权利要求16所述的方法，其中施用包括使用包含多个齿的注射装置向所述患者的肿瘤施用所述组合物。
20.权利要求16所述的方法，其中施用包括使用包含单个齿的注射装置向所述患者的肿瘤施用所述组合物。
21.权利要求16所述的方法，其中所述组合物以单剂量注射。
22.权利要求16所述的方法，其中所述组合物以多于一个剂量注射。
23.权利要求16所述的方法，其中混合物包含浓度为约0.5至10mg/ml的所述CTLA-4抑制剂、浓度为约0.5至20mg/ml的所述PD-1抑制剂和浓度为约10至500μg/ml的所述细胞因子。
24.权利要求16所述的方法，其中所述组合物的体积为约15ml。
25.权利要求16所述的方法，其中所述组合物的体积小于约15ml。
26.权利要求15所述的方法，其还包括对所述肿瘤的至少一部分进行消融，从而产生损伤区。
27.权利要求26所述的方法，其中消融在施用所述组合物之前进行。
28.权利要求26所述的方法，其中消融与施用所述组合物同时进行。
29.权利要求26所述的方法，其中消融在施用所述组合物之后进行。
30.权利要求26所述的方法，其中消融与施用所述组合物同时和在其之后进行。
31.权利要求26所述的方法，其中消融使用以下进行：冷冻消融，热消融，IRE，RF-EMB，RF-EMB型消融，超声消融，高强度聚焦超声消融，使用光动力学治疗进行的消融，使用非热激波、空化、其他机械物理细胞破坏进行的消融、或其任意组合。
32.权利要求31所述的方法，其中至少一部分的消融使用RF-EMB和冷冻消融二者进行。
33.权利要求31所述的方法，其中至少一部分的消融使用冷冻消融进行。
34.权利要求33所述的方法，其中所述冷冻消融是用至少一个冷冻探头进行。
35.权利要求33所述的方法，其中所述冷冻消融包含至少1个冷冻-解冻循环。
36.权利要求33所述的方法，其中所述冷冻消融包含1至4个冷冻-解冻循环。
37.权利要求35所述的方法，其中所述冷冻-解冻循环的冷冻部分为至少30秒长。
38.权利要求35所述的方法，其中所述冷冻-解冻循环的冷冻部分为约30秒至15分钟长。
39.权利要求35所述的方法，其中所述冷冻-解冻循环的冷冻部分在约-30℃至-196℃的温度下进行。
40.权利要求35所述的方法，其中所述冷冻-解冻循环的解冻部分是主动解冻过程。
41.权利要求35所述的方法，其中所述冷冻-解冻循环的解冻部分是被动解冻过程。
42.权利要求32所述的方法，其还包括向所述损伤施用一系列电脉冲，从而将与所述损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔。
43.权利要求42所述的方法，其中电脉冲的所述施用与所述消融同时进行。
44.权利要求42所述的方法，其中电脉冲的所述施用在所述消融之前进行。
45.权利要求42所述的方法，其中电脉冲的所述施用在所述消融之后进行。
46.权利要求42所述的方法，其中所述电脉冲通过冷冻探头施用。
47.权利要求42所述的方法，其中所述一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲。
48.权利要求42所述的方法，其中所述一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲。
49.权利要求42所述的方法，其中所述电脉冲的频率为100至500kHz。
50.权利要求42所述的方法，其中所述电脉冲是双极性的。
51.权利要求42所述的方法，其中所述电脉冲具有即时电荷反转。
52.权利要求42所述的方法，其还包括向所述肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。
53.权利要求42所述的方法，其还包括向所述损伤施用治疗有效量的核酸药物。
54.权利要求52所述的方法，其中所述核酸药物的所述施用在电脉冲的所述施用之前进行。
55.权利要求52所述的方法，其中所述核酸药物的所述施用与电脉冲的所述施用同时进行。
56.权利要求52所述的方法，其中所述核酸药物是DNA质粒。
57.权利要求56所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
58.权利要求31所述的方法，其中至少一部分的消融使用RF-EMB进行。
59.权利要求58所述的方法，其中所述RF-EMB使用探头进行。
60.权利要求59所述的方法，其中所述探头施用一系列电脉冲，从而产生与所述探头紧邻或相关的损伤区并且将与所述损伤区相邻或相关的细胞可逆地电穿孔。
61.权利要求60所述的方法，其中所述一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲。
62.权利要求61所述的方法，其中所述一系列电脉冲包含约1至4000个脉冲。
63.权利要求60所述的方法，其中所述电脉冲的频率为100至500kHz。
64.权利要求60所述的方法，其中所述电脉冲是双极性的。
65.权利要求60所述的方法，其中所述电脉冲具有即时电荷反转。
66.权利要求60所述的方法，其还包括向所述肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。
67.权利要求66所述的方法，其中所述核酸药物是DNA质粒。
68.权利要求67所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
69.权利要求26所述的方法，其中所述肿瘤的所述部分包含癌细胞，并且其中所述消融在破坏所述细胞的细胞膜且使所述细胞的细胞内组分和膜抗原暴露的条件下进行。
70.权利要求69所述的方法，其中进行所述消融使得所述细胞的细胞内组分和膜抗原不被所述消融变性。
71.权利要求69所述的方法，其中进行所述消融使得在所述肿瘤的经消融部分周围的组织能够引导具有免疫能力的细胞和信号分子进出经消融组织。
72.权利要求70所述的方法，其中进行所述消融使得所述细胞的暴露的细胞内组分和膜抗原的量足以刺激免疫系统。
73.权利要求70所述的方法，其中进行所述消融使得所述细胞的暴露的细胞内组分和膜抗原的量不产生免疫耐受。
74.权利要求26所述的方法，其还包括向所述肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。
75.权利要求74所述的方法，其中所述核酸药物是DNA质粒。
76.权利要求74所述的方法，其还包括将紧密围绕所述肿瘤的经消融部分的细胞可逆地电穿孔。
77.权利要求75所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、及其任意组合。
78.在患者中治疗肿瘤的方法，其包括对所述肿瘤的至少一部分进行消融，以及向所述肿瘤施用治疗有效量的核酸药物。
79.权利要求78所述的方法，其中消融使用RF-EMB和冷冻消融进行。
80.权利要求78所述的方法，其中消融使用RF-EMB进行。
81.权利要求79所述的方法，其中所述RF-EMB使用探头进行。
82.权利要求81所述的方法，其中所述RF-EMB包括施用一系列电脉冲，从而产生与所述探头紧邻的损伤区并且将与所述损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔。
83.权利要求82所述的方法，其中所述一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲。
84.权利要求82所述的方法，其中所述电脉冲的频率为100至500kHz。
85.权利要求82所述的方法，其中所述电脉冲是双极性的。
86.权利要求82所述的方法，其中所述电脉冲具有即时电荷反转。
87.权利要求80所述的方法，其中所述核酸药物是DNA质粒。
88.权利要求87所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
89.权利要求78所述的方法，其中消融使用冷冻消融进行。
90.权利要求89所述的方法，其中所述冷冻消融使用探头进行。
91.权利要求90所述的方法，其还包括施用一系列电脉冲，从而产生与所述探头紧邻的损伤区并且将与所述损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔。
92.权利要求91所述的方法，其中所述一系列电脉冲包含约1至1000个脉冲。
93.权利要求91所述的方法，其中所述电脉冲的频率为100至500kHz。
94.权利要求91所述的方法，其中所述电脉冲是双极性的。
95.权利要求91所述的方法，其中所述电脉冲具有即时电荷反转。
96.权利要求89所述的方法，其中所述核酸药物是DNA质粒。
97.权利要求96所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
98.权利要求1至77中任一项所述的方法，其中施用所述组合物包括使用包含注射装置的消融探头施用所述组合物。
99.权利要求98所述的方法，其中所述消融探头还包含用于控制施用所述组合物之速度的泵。
100.权利要求1至77中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞因子是第一细胞因子，并且所述方法还包括施用治疗有效量的第二细胞因子。
101.权利要求100所述的方法，其中所述第二细胞因子可与所述第一细胞因子相同或不同。
102.权利要求100所述的方法，其中所述第二细胞因子注射到所述肿瘤中。
103.权利要求102所述的方法，其中所述第二细胞因子在对所述肿瘤进行消融之后注射到所述肿瘤中。
104.权利要求101所述的方法，其中所述第二细胞因子如下施用：静脉内、肌内、皮下、或其任意组合。
105.权利要求1至77中任一项所述的方法，其还包括在施用所述组合物之前测试所述探头之位置的步骤。
106.权利要求105所述的方法，其中测试所述探头之位置包括通过所述探头肿瘤内施用测试注射并测量施用所述测试注射期间的肿瘤内压力。
107.权利要求106所述的方法，其还包括：当在施用所述测试注射期间测量到与周围肿瘤组织相比提高或降低的肿瘤内压力时重新定位所述探头，或者当肿瘤内压力与所述周围肿瘤组织的压力一致时施用所述组合物。
108.治疗转移性癌症的方法，其包括：
向患者肿瘤内施用足以治疗所述肿瘤之量的组合物，所述组合物包含至少两种免疫检查点抑制剂和至少一种细胞因子的组合；以及
对所述肿瘤的至少一部分进行消融，从而产生损伤区；
其中所述消融在如下条件下进行：破坏细胞的细胞膜且使所述细胞的细胞内组分和膜抗原暴露从而使得所述抗原刺激免疫系统。
109.权利要求108所述的方法，其中进行所述消融使得所述细胞的细胞内组分和膜抗原不被所述消融变性。
110.权利要求108所述的方法，其中进行所述消融使得所述肿瘤的经消融部分的紧靠的周围环境能够引导具有免疫能力的细胞和信号分子进出经消融组织。
111.权利要求108所述的方法，其还包括向所述肿瘤施用治疗有效量的核酸药物；以及施用一系列电脉冲，从而将与所述损伤区相邻的细胞可逆地电穿孔。
112.权利要求111所述的方法，其中所述核酸药物是DNA质粒。
113.权利要求112所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码选自以下的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNγ、IFNα、或其任意组合。
114.探头，其包含：
工具主体；
可插入到肿瘤中的第一端；
可与气体源和与电源连接的第二端；
附接至所述第一端的冷却头；以及
附接至所述第一端的至少一个电极，其中所述至少一个电极配置成对所述肿瘤的第一部分进行消融，并且所述冷却头配置成当所述工具的所述第一端插入所述肿瘤中时冷冻所述肿瘤的第二部分。
115.权利要求114所述的探头，其中所述至少一个电极是与所述电源和与所述探头的所述第一端连接的导线。
116.权利要求114所述的探头，其中所述至少一个电极可从所述工具主体伸出。
117.权利要求114所述的探头，其中所述至少一个电极是所述探头的主体。
118.权利要求114所述的探头，其还包含至少一个针，所述至少一个针可从所述工具的所述第一端伸出并且与附接至所述工具的所述第二端的流体储器流体地相连。
119.权利要求118所述的探头，其中所述至少一个针配置成将流体从所述流体储器递送至所述肿瘤的所述部分。
120.权利要求119所述的探头，其中所述流体储器包含质粒。
121.权利要求119所述的探头，其中所述至少一个针终止于多个齿。
122.权利要求114所述的探头，其中所述冷却头可从所述工具主体伸出。
123.权利要求114所述的探头，其中所述至少一个电极可从所述工具主体伸出。
124.权利要求114所述的探头，其包含覆盖所述工具的所述主体的热绝缘物。
125.权利要求114所述的探头，其包含覆盖所述工具的所述主体的电绝缘物。
126.权利要求114所述的探头，其中所述肿瘤的所述第一部分与所述肿瘤的所述第二部分重叠。
127.探头，其包含：
中心工具主体；
与所述中心工具主体连接的第一端，所述第一端可插入到肿瘤中并且具有冷却头；
与所述工具主体连接的第二端，所述第二端可与气体源连接；以及
配置成包封所述中心工具主体的一部分的护套，该可移除护套包含：
电绝缘主体，
配置成附接至电源的连接器，以及
配置成与所述中心工具主体的导电部分连接的电触件，
其中所述可移除护套配置成通过将来自所述电源的电脉冲沿所述中心工具主体传输并传输至所述第一端来对所述肿瘤的第一部分进行消融，
并且其中所述冷却头配置成当所述工具的所述第一端插入所述肿瘤中时冷冻所述肿瘤的第二部分。
128.权利要求127所述的探头，其中所述护套可从所述中心工具主体移除。
129.权利要求127所述的探头，其中所述探头可附接至惰性电极。
130.用于与电脉冲组合地施用冷冻治疗的系统，所述系统包含：
工具，其包含：
工具主体，
可插入到肿瘤中的第一端、以及第二端，
附接至所述第一端的冷却头，以及
附接至所述第一端的至少一个电极，其中所述至少一个电极配置成对所述肿瘤的第一部分进行消融，并且所述冷却头配置成当所述工具的第一端插入所述肿瘤中时冷冻所述肿瘤的第二部分；
用于通过所述工具的第二端向所述工具供应气体的冷冻机；以及
用于通过所述工具的第二端向所述工具供应电脉冲的电脉冲发生器。
131.权利要求130所述的系统，其包含第二工具，所述第二工具包含：
第二工具主体；
可插入到肿瘤中的所述第二工具的第一端；
可与所述冷冻机和电脉冲发生器连接的所述第二工具的第二端；
附接至所述第二工具的第一端的冷却头；以及
附接至所述第二工具的第一端的第二电极。
132.权利要求131所述的系统，其中所述第二电极和所述至少一个电极配置成对在所述第二电极与所述至少一个电极之间延伸的所述肿瘤的第一部分进行消融，并且所述第二工具的冷却头配置成当所述工具的第一端和所述第二工具的第一端插入所述肿瘤中时冷冻所述肿瘤的第三部分。
133.权利要求130所述的系统，其包含第二工具，所述第二工具包含：
工具主体；
可插入到肿瘤中的第一端；
可与电源连接的第二端；以及
附接至所述第一端的第二电极，其中所述肿瘤的第一部分在所述至少一个电极与所述第二电极之间延伸。
134.权利要求130所述的系统，其包含与电源电连接的惰性电极。
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