CN102219835B - 基于hca587抗原的长肽及其在制备抗肿瘤药物方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于医学肿瘤学技术领域的一种基于HCA587抗原的长肽及其在制备抗肿瘤药物方面的应用。该长肽可诱导分泌IFN-γ的Th1型细胞免疫应答和体液免疫应答。本发明进一步公开了这些长肽在制备长肽疫苗及在制备抗肿瘤药物方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于医学肿瘤学技术领域，具体涉及一种基于HCA587抗原的长肽及其在制备抗肿瘤药物方面的应用。
背景技术
肿瘤发病率、死亡率呈逐年上升趋势，目前癌症已经成为严重威胁人类健康的头号杀手。尽管肿瘤的手术治疗、化疗和放射治疗不断取得进展，但仍然有相当比例的患者不治。近年来，随着人们对肿瘤的分子机理和免疫机制的不断揭示，肿瘤特异的免疫治疗日益受到重视。要进行肿瘤的免疫治疗，首先需要得到肿瘤抗原。在二十世纪的最后十年，随着免疫学理论方法和分子生物学方法的飞速发展，克隆肿瘤抗原已成为肿瘤免疫研究及治疗的重要方面。大量可以诱导机体免疫应答的肿瘤抗原的发现，为肿瘤的免疫治疗开辟了新的纪元。
目前鉴定的大部分肿瘤抗原既表达于肿瘤组织，也表达于正常组织，属于肿瘤相关抗原。只有极少部分的肿瘤抗原属于肿瘤特异性抗原，这类肿瘤抗原是免疫治疗的理想候选抗原。近年发现的肿瘤组织特异表达的肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CT抗原)是一类新的肿瘤特异抗原，它在肿瘤组织广泛表达，在正常组织只表达于睾丸，而睾丸属于免疫豁免区，所以此类肿瘤抗原具有潜在的临床应用价值，已成为当前肿瘤免疫学的研究热点。
常用的疫苗种类包括蛋白疫苗、表位疫苗、DC疫苗等。新近兴起的长肽疫苗备受瞩目，已有动物实验证实长肽疫苗具有良好的抗肿瘤作用，临床试验也显示长肽疫苗用于肿瘤患者治疗，无严重毒性作用，且能诱导患者产生很好的免疫应答。在HPV16诱导的宫颈癌临床前研究中，分别给予小鼠HPV16 E743-77长肽疫苗和HPV16 E7 49-57Tc表位肽治疗，E7 43-77长肽疫苗治疗可清除HPV16阳性的肿瘤细胞，而使用表位肽疫苗治疗并不能使肿瘤消退。在长肽疫苗的临床I/II期试验中，给予术后晚期宫颈癌患者13条长肽(每条长肽为27-35个氨基酸，覆盖HPV16 E6和E7全长)与ISA51的乳化物，全部患者均可检测到HPV16 E6和/或HPV16 E7特异的CD4和CD8T细胞免疫应答，这些特异的细胞免疫应答可在体内维持较长时间，在末次免疫后的第12个月仍能检测到细胞免疫应答的存在。在应用p53长肽疫苗治疗转移性结直肠癌的临床I/II期试验中，在治疗的9/10个患者中均可检测到p53特异的细胞免疫应答。以上临床试验中所有受试患者均未出现明显的毒性反应。
长肽疫苗中的多肽片段一般是由大于20个氨基酸的肽段组成，较表位肽长(I类分子表位肽通常为9-10个氨基酸，Ⅱ类分子表位肽一般为13-15个氨基酸)，所以长肽进入体内后必须经活化的专职APC加工提呈使T细胞有效活化，而不能像表位肽那样可直接结合在表达MHC分子的细胞上，这样可以减少免疫耐受的发生。长肽片段中存在多个表位，同时含有Tc和Th表位，有利于CD4、CD8T细胞和树突状细胞(DC)之间的相互作用，更有效的产生特异、持久的细胞免疫应答。此外，长肽疫苗能克服表位肽疫苗应用受人群MHC型别限制的不足，扩大了长肽疫苗在人群中的应用范围。由于长肽疫苗具有表位肽疫苗无法比拟的优势，将有可能取代表位疫苗用于肿瘤患者的免疫治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于HCA587抗原的长肽。
本发明的目的还在于提供一种基于HCA587抗原的长肽疫苗。
本发明的目的还在于提供一种基于HCA587抗原的长肽在制备抗肿瘤药物方面的应用。
一种基于HCA587抗原的长肽，其特征在于，所述长肽诱导分泌IFN-γ的Th1型细胞免疫应答和体液免疫应答。
所述长肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示。
一种基于HCA587抗原的长肽疫苗，其特征在于，由权利要求1-2所述任一长肽与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、ISCOM佐剂、CpG ODN-1826中的一种或多种混合乳化构成。
所述长肽疫苗的总体积为100-200μl，其中，长肽的用量为20-50μg，ISCOM佐剂的用量为12μg，CpG ODN-1826的用量为12μg、20μg或50μg。
一种基于HCA587抗原的长肽在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的有益效果：本发明的长肽在CFA和CpG1826的共同作用下能诱导产生HCA587特异的CD4T细胞应答，并且能够对C57BL/6荷瘤小鼠产生抗肿瘤效果，抑制肿瘤的生长和延长小鼠的生存期，HCA587长肽免疫诱导产生的特异性CD4T细胞分泌的IFN-γ在其抗肿瘤的保护作用中发挥了极其重要的作用，本发明为HCA587长肽疫苗的临床应用奠定了科学基础。
附图说明
图1免疫后小鼠脾细胞产生IFN-γ的细胞频数；
图中，HIV-对照肽、OVA-对照蛋白、HCA587-HCA587蛋白、SLP-HCA587长肽、SLP+CFA+CpG-HCA587长肽加弗氏完全佐剂加CpG免疫组、SLP+IFA+CpG-HCA587长肽加不完全弗氏佐剂加CpG免疫组、SLP+ISCOM+CpG-HCA587长肽加ISCOM加CpG免疫组、SLP+CpG-HCA587长肽加CpG免疫组、SLP+CFA-HCA587长肽加弗氏完全佐剂免疫组、SLP+IFA-HCA587长肽加不完全弗氏佐剂免疫组。
图2免疫后小鼠脾细胞分泌IFN-γ的CD4细胞频率；
图中，HIV-对照肽、OVA-对照蛋白、HCA587-HCA587蛋白、SLP-HCA587长肽。
图3免疫后小鼠脾细胞分泌IFN-γ的CD8细胞频率；
图中，HIV-对照肽、OVA-对照蛋白、HCA587-HCA587蛋白、SLP-HCA587长肽。
图4接受不同免疫方案的小鼠血清中抗HCA587抗体的检测；
图中，SLP+CFA+CpG-HCA587长肽加弗氏完全佐剂加CpG免疫组、SLP+IFA+CpG-HCA587长肽加不完全弗氏佐剂加CpG免疫组、SLP+ISCOM+CpG-HCA587长肽加ISCOM加CpG免疫组、SLP+CpG-HCA587长肽加CpG免疫组、SLP+CFA-HCA587长肽加弗氏完全佐剂免疫组、SLP+IFA-HCA587长肽加不完全弗氏佐剂免疫组。
图5荷瘤小鼠给予长肽疫苗治疗后生存期的监测；
图中，untreated-未治疗组，control-佐剂对照组，SLP-HCA587长肽组。
图6荷瘤小鼠给予长肽疫苗治疗后肿瘤生长速度的监测；
图中，untreated-未治疗组，control-佐剂对照组，SLP-HCA587长肽组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例所用的C57BL/6小鼠由北京大学医学部动物中心饲养繁育；小鼠黑色素瘤细胞系B16的稳定表达HCA587的D12细胞培养传代于10％FBSDMEM；长肽(SLP)由杭州中肽公司和上海吉尔公司合成；完全(CFA)弗式佐剂和不完全弗式佐剂(IFA)购自Sigma-Aldrich公司；具有免疫刺激活性的CpG ODN-1826(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)由上海生工技术公司合成；免疫刺激复合物ISCOM
购自瑞典的ISCONOVAAB公司；荧光标记的抗小鼠的CD8抗体和CD4抗体购自美国的BD公司；PE标记的抗小鼠IFN-γ抗体来自Biolegend公司；胞内染色所需的固定通透试剂Fixationbuffer和10×permeabilization buffer购自Biolegend公司；ELISpot实验中所用的抗小鼠γ-干扰素(IFNγ)抗体、生物素标记的抗小鼠IFNγ二抗、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素购自MABTECH公司；HR标记的抗小鼠IgG购自Promega公司。
实施例1基于HCA587抗原的长肽疫苗免疫方案
1、长肽(SLP)的合成、溶解与配制
根据HCA587蛋白的序列信息(AF239802)，设计覆盖HCA587第136至373位氨基酸的14条长肽，每条长肽为25-35个氨基酸，人工合成这些序列，合成序列为SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，SEQ ID No.5，SEQ ID No.7，SEQ IDNo.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.14的长肽用DMSO溶解为20μg/ml，序列为SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，SEQ ID No.13的长肽用无菌PBS溶解为10μg/ml，序列为SEQ ID No.2的长肽用无菌PBS溶解为2.5μg/ml，序列为SEQ ID No.4，SEQ ID No.6的长肽用无菌PBS溶解为5μg/ml。
2、长肽疫苗的制备及免疫方案
方案一：
将SLP配成100μl体积(每条长肽为20或50μg)，与100μl的CFA或IFA乳化，制成长肽疫苗。首先给予6-8周的C57BL/6小鼠背部皮下注射20或50μg的CpG，同时皮下免疫200μl的SLP与CFA/IFA的乳化物。21天后，小鼠再次皮下注射20或50μg的CpG，同时皮下免疫200μl的SLP与IFA的乳化物。在不含CpG的免疫方案中，仅给予SLP与FA的乳化物，配制及免疫程序同上。二次免疫后第10天取小鼠脾脏检测免疫应答情况。
方案二：
将SLP配成50μl体积(每条长肽为20μg)，ISCOM为12μg，CpG为12μg，总体积为100μl的混合物，制成长肽疫苗，于小鼠尾根部皮下注射该长肽疫苗。21天后再次给予小鼠同样的免疫。二次免疫后第10天检测小鼠的免疫应答情况。
方案三
将SLP配成50μl体积(每条长肽为20μg)，CFA、IFA或ISCOM为12μg，总体积为100μl的混合物，制成长肽疫苗，于小鼠尾根部皮下注射该长肽疫苗。21天后再次给予小鼠相同的免疫。二次免疫后第10天检测小鼠的免疫应答情况。
3、检测IFN-γ分泌的酶联免疫斑点实验(ELISpot)
包被：96孔硝酸纤维素板先经70％乙醇处理(15μl/孔)，无菌水(100μl/孔)洗两遍，再加入已稀释好的包被抗体。将抗小鼠IFNγ单克隆抗体AN18以1∶200稀释至包被液，75μl/孔，即0.375μg/孔的包被抗体。4℃包被过夜，避光。
封闭：将包被抗体甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗3遍，加入250μl10％FBS RPMI1640/孔，37℃孵育2小时。
样品制备：
i细胞：对照及肽免疫后小鼠处死，取脾，研磨，裂解红细胞，10％FBSRPMI1640重悬，计数。每组小鼠的脾细胞按等比例混合，制备成5×105全脾细胞/100μl 10％FBS RPMI1640/孔的细胞悬液。
ii长肽(SLP)及HCA587的稀释：来源于HCA587的长肽按照方法1溶解后，用无血清RPMI1640将其稀释至每个长肽2.5μg/ml，100μl/孔，终浓度为1.25μg/ml；对照肽HIV用无血清RPMI1640配成20μg/ml，100μl/孔，终浓度为10μg/ml；HCA587和对照蛋白OVA用无血清RPMI1640配成20μg/ml，100μl/孔，终浓度为10μg/ml。
将封闭好的板子中的培基甩掉，按照实验设计，分别加入制备好的细胞悬液和稀释好的肽溶液。置37℃孵箱孵育20小时。
检测IFNγ分泌：
i生物素标记IFNγ检测抗体：将板中的样品甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗6遍，将生物素标记的抗小鼠IFNγ检测抗体R4-6A2-Biotin以1∶1000稀释至PBS，100μl/孔，即0.1μg/孔。37℃孵育2小时。
ii链霉亲和素标记的碱性磷酸酶：将板中的抗体甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗6遍，将链霉亲和素标记的碱性磷酸酶以1∶1000稀释至PBS，100μl/孔，室温孵育1小时。
iii显色：将板中的液体甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗8遍，将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP-NBT)底物显色药片溶于10ml双蒸水中，100μl/孔，室温孵育5min，看到蓝色的点后，甩掉板中的显色液，流水洗板，终止显色。
将板子置于干燥通风避光处，待干透后使用ELISpot斑点计数仪分析结果。
4、胞内细胞因子染色检测IFN-γ的分泌
体外肽刺激：肽免疫的小鼠取脾，研磨，裂解红细胞，10％FBS RPMI1640重悬，计数。每组小鼠的脾细胞按等比例混合，制备成5×106全脾细胞/ml。24孔板培养细胞，每孔加入5×106细胞，再以每个长肽1.25μg/ml的浓度加入细胞，6小时后，以1∶1000的浓度加入BFA以封闭细胞因子的分泌。18小时后收获细胞，进行下一步的染色步骤。
表面染色：收获细胞，PBS洗一遍，离心弃上清，100μl PBS重悬细胞，1∶300稀释加入CD4-PercP，CD8-FITC，4℃孵育20min。
固定：表面染色结束后，PBS洗一遍，离心弃上清，500μl fixation buffer重悬细胞，室温固定20min。
通透：固定结束后，离心弃上清，500μl 1×permeabilization buffer重悬细胞，室温通透10min。
胞内IFN-γ染色：通透结束后，离心弃上清，PE标记的抗小鼠IFN-γ抗体以1∶800稀释加入样品，100μl/样品，4℃孵育30min。染色结束后，PBS洗一遍，离心弃上清，PBS重悬，流式检测。
5、ELISA检测免疫小鼠HCA587抗体的水平
包被：将HCA587蛋白稀释至包被液，1μg/ml，100μl/孔，即0.1μg/孔，4℃包被过夜，避光。
封闭：将包被液体甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗3遍，加入含1％BSA的PBS 200μl/孔，37℃孵育2小时。
血清样本的稀释及加样：将各小鼠血清按1∶1000，1∶5000，1∶25000的比例稀释至PBS中。将稀释好的血清样本按100μl/孔加入板中。37℃孵育2小时。
加入抗小鼠IgG-HRP：将样本甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗6遍，HR标记的抗小鼠IgG以1∶2500稀释至PBS，200μl/孔，37℃孵育1.5小时。
显色：将二抗甩掉，200μl 0.05％PBST/孔洗板，洗6遍，TMB显色液100μl/孔，孵育1-2分钟，阳性对照明显可见，阴性对照未见时，加入2M H2SO4100μl/孔终止显色。
不同佐剂辅助SLP免疫应答的效果在小鼠二次接受长肽免疫后第10天检测，收获免疫小鼠的脾细胞，按照方法3的酶联免疫斑点实验(ELISpot)操作，结果见图1，SLP在CpG1826和CFA两种佐剂的共同辅助下产生较强的SLP特异性的细胞免疫应答，同时也可检测到较强的针对HCA587蛋白的特异细胞反应，免疫反应强度显著高于HCA587SLP与CFA联合使用或HCA587SLP与CpG1826联用组；SLP在单独的IFA的辅助下产生的分泌SLP特异性IFN-γ的细胞频数较低，即使SLP在IFA及CpG1826的联合作用下，也很难提高SLP特异性反应细胞的频数，这就表明在我们的实验体系中IFA对HCA587长肽的免疫应答的辅助作用较弱；对HCA587蛋白免疫应答有极佳作用的ISCOM佐剂对诱导长肽的免疫应答的效果亦不如CFA和CpG1826联用效果好。这些结果表明HCA587长肽与CFA和CpG1826的联合应用是最佳组合，能在体内诱导产生强烈的免疫应答。
小鼠在接受SLP与FA和CpG1826二次免疫后第10天，取脾，胞内细胞因子染色检测CD4和CD8细胞分泌IFN-γ的情况。结果见图2和图3，免疫后小鼠的CD4细胞中有约3％的细胞在HCA587SLP刺激下分泌IFN-γ，0.79％的细胞在HCA587蛋白的刺激下产生IFN-γ。而CD8细胞中几乎没有检测到IFN-γ的分泌。这个结果表明HCA587的长肽在CFA和CpG1826的辅助作用下，诱导产生分泌IFN-γ的Th1型细胞免疫应答。
对接受不同免疫方案的C57B6小鼠的血清抗HCA587抗体进行了检测。结果见图4，HCA587SLP与CFA和CpG1826联用、HCA587SLP与CFA组合、HCA587SLP与IFA组合及HCA587SLP与ISCOM和CpG1826联用均可诱导较强的HCA587蛋白特异的体液免疫应答；HCA587SLP仅与CPG组合或HCA587SLP仅与IFA组合诱导产生的抗体应答均较弱。
实施例2基于HCA587抗原的长肽在制备抗肿瘤药物方面的应用
1、SLP+CFA+CpG免疫方案的肿瘤治疗模型
6-8周的C57BL/6小鼠接种1.5×104D12细胞，于第2天皮下给予20μg或50μg的CpG及20μg SLP和CFA的乳化物，即第一次长肽免疫；第一次免疫后的21天，再次皮下给予20μg或50μg的CpG，20μg SLP和IFA的乳化物。每隔一天观测各组小鼠，测量肿瘤时记录最长径和最短径。
2、SLP+ISCOM+CpG免疫方案的肿瘤治疗模型
6-8周的C57BL/6小鼠接种1.5×104D12，于第7天尾根部皮下给予20μgSLP，12μg ISCOM和12μg CpG的混合物，即第一次长肽免疫；第一次免疫后的21天，即28天，再次尾根部皮下给予同第一次肽免疫的混合物。每隔一天观测各组小鼠，测量肿瘤时记录最长径和最短径。
统计学分析
采用log-rank检验方法分析不同治疗的小鼠生存期；两组小鼠肿瘤大小的比较采用非配对t检验。
在接种肿瘤后第2天和22天给予SLP+CFA+CpG治疗可降低小鼠的成瘤率且能显著延长小鼠的生存期(如图5所示)，SLP治疗除了能改善小鼠的生存期，还可以控制肿瘤的大小，见图6。实验结果表明HCA587SLP在CFA和CpG1826两种佐剂的辅助下，可以产生明显的抗肿瘤作用。
Claims (4)
1.一种基于HCA587抗原的长肽组合，其特征在于，所述长肽组合诱导分泌IFN-γ的Th1型细胞免疫应答和体液免疫应答；，所述长肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 6、SEQ IDNo. 7、 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、 SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示。
2.一种基于HCA587抗原的长肽疫苗，其特征在于，由权利要求1所述长肽组合与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、ISCOM佐剂、CpG ODN-1826中的一种或多种混合乳化构成。
3.根据权利要求2所述一种基于HCA587抗原的长肽疫苗，其特征在于，所述长肽疫苗的总体积为100-200μl，其中，长肽组合的用量为20-50μg，ISCOM佐剂的用量为12μg，CpG ODN-1826的用量为12μg、20μg或50μg。
4.权利要求1所述一种基于HCA587抗原的长肽组合在制备抗肿瘤药物方面的应用。
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