CN101066991A - 人肿瘤－睾丸抗原hca587的抗原决定簇多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人肿瘤－睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽。该人肿瘤－睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，是如下(a)或(b)的多肽：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸残基序列组成的多肽；(b)由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的多肽。该多肽及其衍生物能与人类HLA分子结合，并能通过杀伤性T淋巴细胞导致靶细胞裂解。该多肽及其衍生物可用于肝癌及其它肿瘤的治疗、诊断和预防。

Description

人肿瘤-睾丸抗原HCA587的抗原决定簇多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗原决定簇多肽，尤其涉及人的肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，并进一步涉及这些抗原肽及其衍生物在肝癌及其它肿瘤的治疗、诊断和预防中的应用。

背景技术

肿瘤的发生是一个多阶段、多步骤的过程，这一过程中伴随着机体许多的细胞学、遗传学的改变，出现多种基因表达异常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因灭活，激发异常的信号传导通路，导致细胞周期及细胞凋亡异常，从而使得细胞恶性转化，并随着各种分子异常的累积，肿瘤出现进展、转移。因此，了解这些在肿瘤发生过程中、在肿瘤组织中特异表达的基因对于肿瘤发生发展机制的阐明、临床的诊断和治疗都具有重要意义。

原发性肝细胞癌是人类原发性肝癌中最常见的一种类型，也是全世界最常发生的恶性肿瘤之一，尤其在东南亚及非洲，它的发病率更高。除了极高的发病率外，肝细胞癌还以高恶性度和高死亡率著称，如果不进行治疗，从诊断到死亡的预期寿命约是6个月，5年存活率小于3％；若单纯行手术治疗，小肝癌的五年存活率为62.7％，大肝癌的仅为37.1％。就中国而言，每年约有110,000人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人数的四分之一。这种高死亡率，主要是由于早期肝癌缺乏特异临床症状，导致大部分患者就诊迟，而又缺乏有效治疗手段及术后易复发所致。发病率高、恶性度高、诊断迟、治疗方法少、预后差，是肝癌的几大特点。尽管国内外科研人员都对肝癌进行了多方面的研究，但目前肝癌发生发展的分子机理还不太清楚，对肝癌的治疗也主要是采取手术治疗及局部或全身化疗，但术后生存期仍不尽人意。因此，寻求针对肝癌及其它肿瘤的新的免疫治疗手段已成为科研工作者义不容辞的责任。

要进行肿瘤的免疫治疗，首先需要得到肿瘤抗原。在二十世纪的最后十年，随着免疫学理论方法和分子生物学方法的飞速发展，克隆肿瘤抗原已成为肿瘤免疫研究及治疗的重要方面。大量可以诱导机体免疫应答的肿瘤抗原的发现，为肿瘤的免疫治疗开辟了新的纪元。

迄今为止，为了寻找肿瘤特异性或相关性抗原用于肿瘤的免疫治疗，人们已经建立了多种方法来分离肿瘤抗原。利用CTL筛选cDNA文库转染的细胞，人们从黑色素瘤中鉴定了第一个肿瘤抗原MZ2-E(由MAGE-A1基因编码)(van der Bruggen P，et al.Science.1991 Dec 13；254(5038)：1643-7)。十多年来，CTL方法虽然有了许多改进，但其烦琐的步骤及较长筛选周期，制约了它的广泛使用。

寻找肿瘤特异组织特异表达的肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CT)进行肿瘤的免疫治疗已成为肿瘤免疫学的研究热点。近年来由Pfreundschuh和他的同事们创建的一种新的筛选策略称为SEREX(Serological Identification ofRecombinant Expression Cloing)(Sahin U，et al.Natl Acad Sci U S A.1995 Dec5；92(25)：11810-3)。利用它可以直接鉴定在肿瘤病人体内诱导产生IgG抗体应答的肿瘤抗原。SEREX方法已经在一系列组织类型肿瘤中得到应用，包括：乳腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、食管癌、小细胞肺癌、结肠癌、恶性间皮瘤、胃癌、胰腺癌和淋巴瘤(Minenkova O，et al.Int J Cancer.2003，106(4)：534-44；Koroleva EP，et al.Russ J Immunol.2002，7(3)：229-38；Jager D，et al.CancerImmun.2002，28：2-5；Diesinger I，et al.Int J Cancer.2002，102(4)：372-8；Line A，et al.Cancer Immunol Immunother.2002，51(10)：574-82)。通过SEREX方法已鉴定了一些非常有价值的抗原如MAGE-1、HOM-MEL-40、NY-ESO-1、SSX2、SCP-1、CT7、NY-ESO-1和SCP-1。利用NY-ESO-1多肽疫苗进行的晚期黑色素癌病人的临床治疗实验证实了以上理论。在接受治疗的12位病人中，7位为NY-ESO-1血清抗体阴性，5位为阳性；前者经疫苗免疫后，4/7的病人发生了NY-ESO-1多肽疫苗特异性的CTL和CD4+的DTH应答，后者虽未检测到NY-ESO-1特异性T细胞应答的变化，但3/5例病人的病情得到了控制。这些临床实验的初步结果，为肿瘤多肽疫苗的免疫治疗提供了希望。

发明内容

本发明提供了一种来源于人肿瘤-睾丸抗原HCA587的抗原决定簇多肽及其应用。

本发明进一步提供了编码上述多肽序列的DNA片段及其应用。

本发明所提供的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，是如下(a)或(b)的多肽：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸残基序列组成的多肽；

(b)由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的多肽。

序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的多肽是具有如下氨基酸序列的十肽：TLDEKVAELV。序列表中序列1所示的氨基酸残基序列组成的多肽是具有如下氨基酸序列的九肽：KVAELVEFL。

该人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽能与人类HLA分子结合，并能通过杀伤性T淋巴细胞导致靶细胞裂解。

本发明的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，还可为包含两个或两个以上重复单元的的多肽；所述重复单元为上述(a)或(b)的多肽。

本发明的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，还可包含一个或一个以上上述(a)的多肽，和一个或一个以上上述(b)的多肽。

本发明还保护编码上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的DNA序列。

含有上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的编码DNA的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明还进一步提供了上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的应用。

该多肽可诱导肿瘤患者体内特异性细胞免疫应答，使得患者自身的T细胞识别并杀伤肿瘤细胞，从而达到使肿瘤消退或减小的目的。上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽和佐剂联合后制成的治疗和/或预防肿瘤的多肽疫苗能在肿瘤，如肝癌、黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤等患者临床治疗和/或预防中使用。

本发明更进一步提供了编码上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽序列的DNA的应用。

作为本发明的另一部分，即编码上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的核苷酸序列(亦被称“mini-genes”)，它们可构建在适当的表达载体中，在启动子的作用下进行表达，从而可制备成特异性的基因疫苗，用于肿瘤患者的基因治疗。需要指出的是，这些表达序列不仅可包含同一编码多肽序列的多拷贝重复，亦可是不同多肽编码序列的组合。其它任何包含这些编码多肽序列的重组表达载体、或重组细胞(如真核或原核细胞)都可作为治疗和/或预防肿瘤的基因疫苗产品的组成部分，因此都是本发明需要保护的内容。

上述多肽疫苗和基因疫苗可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

上述多肽疫苗的用量一般为100-500μg活性成分/人/次，每7-15天给药一次，一般共需8-12次。

上述基因疫苗的用量一般为100-500μg活性成分/人/次，每7-15天给药一次，一般共需4-10次。

上述任何一种或多种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽能制备成肿瘤的诊断和预防试剂。该多肽与人类HLA分子的聚合物、化合物或复合物(如二聚体、四聚体及八聚体等)聚合，制备成HLA-多肽复合物试剂，能用于检测肿瘤病人体内针对肿瘤细胞的特异性应答T细胞，从而评估肿瘤患者的免疫功能状态、判断肿瘤患者的预后及肿瘤高危人群中的预防。

附图说明

图1为HCA587蛋白序列

图2为肝癌患者CD8⁺T细胞免疫应答分析

图3为肝癌患者CD8+T细胞对肿瘤细胞系细胞的杀伤

具体实施方式

实施例1、CT抗原HCA587的基因发现过程

为了筛选原发性肝细胞癌中异常表达的CT抗原，利用Stratagene公司的cDNAsynthesis Kit、Uni-ZAP XR载体和Gigapack III GOLD packaging extract试剂盒，选取了肝细胞癌患者的组织标示进行SEREX方法的筛选。

首先按TRIzol试剂盒(Gibco公司)的操作说明提取肝癌及癌旁组织总RNA，步骤共包括：组织匀浆、抽提、RNA沉淀、洗涤和溶解，提取好的RNA以适量的DEPC处理过的超纯水溶解沉淀。紫外分光光度计测定样品的OD260和OD280值，甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量(28S和18S rRNA的比例)。

采用Promega公司PolyATract mRNA分离试剂盒(Promega，Madison，WI)分离mRNA，其基本原理是用带有亲和素的磁珠在磁场的作用下贴壁于管壁的同时，可与生物素化的oligo(dT)结合，通过ologo(dT)与mRNA3’端的PolyA尾互补杂交使mRNA得到分离纯化。操作流程主要包括探针退火、洗涤链亲和素结合的磁珠、Oligo(dT)-mRNA杂交体的捕获、洗涤及mRNA的洗脱，最后用紫外分光光度检测mRNA的浓度和纯度。

肝癌组织cDNA表达文库的构建使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆试剂盒(Stratagene公司)。简言之，模板mRNA为5ug，以GAGA序列+XhoI识别位点序列(CTCGAG)+Poly(dT)₁₈为引物，在MMLV逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链。再以第一条cDNA链为模板，以经RNaseH酶切的RNA片段为引物，在DNA聚合酶I的作用下合成第二条cDNA链。双链cDNA在pfu DNA聚合酶的作用下末端补平，经T4连接酶平端连接EcoR I接头、再经Xho I酶切，使双链cDNA的两端分别形成XhoI和EcoR I的互补序列。经SizeSep400 Spun Columns分子筛层析，将酶切的小片段(小于400bp)除去后，将cDNA定向连接在Uni-ZAP XR噬菌体载体上。带有插入片段的连接载体经包装抽提物包装成为噬菌体颗粒，最后转化宿主菌XL1-Blue MRF’细胞，形成初级文库。

包装形成的初级文库经滴度和重组效率测定后，以约5×10⁴集落/板的密度接种噬菌体于宿主菌XL1-Blue MRF’，经37℃6-8小时生长后，加适量的SM缓冲液4℃孵育过夜，最后收获形成的噬菌体即为扩增的cDNA文库。

扩增的文库加氯仿至终浓度为0.3％(v/v)可于4℃短期储存；加DMSO至终浓度为7％(v/v)可于-70℃长期保存。

筛选肝癌组织cDNA表达文库采用的抗体筛选法。同体或异体肝癌病人的血清作为自然抗体的来源。将文库以SM进行稀释后与宿主菌XL1-Blue MRF’细胞混匀铺板，约10⁴/133cm平板。42℃孵育3.5小时后，盖上经IPTG浸泡后晾干的NC膜，37℃孵育5小时。作好标记后将膜取出，TNT漂洗，在封闭液中过夜。加1∶15000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(H+L)二抗，室温摇动1小时，TNT洗三次，TBS洗两次，加入BCIP/NBT显色液显色。此时显色的克隆为二抗阳性克隆，用细针头在阳性位置扎孔作为标记。在此过程中保持NC膜的湿润。标记好的NC膜用大量TBS室温洗三次，每次15分钟。加入1∶500稀释的病人血清，室温摇动1小时，TNT洗三遍；再加入1∶15000稀释的二抗，室温摇动1小时，TNT洗三次，TBS洗两次，加入BCIP/NBT显色液显色。没有针孔标记的阳性噬斑为对病人血清反应的阳性克隆。根据NC膜的定位标记挑取琼脂板上相应位置的噬菌斑，加入1ml SM/氯仿噬菌体保存液中。

第一轮挑取的阳性克隆按一定稀释度稀释后重新与宿主菌混合铺板，重复上述方法进行第二轮筛选。一般经过3-4轮筛选，可得到分离良好的单克隆阳性噬菌斑。

取适量的保存在SM缓冲液中的阳性克隆与宿主菌XL1-Blue MRF’及辅助剪切噬菌体混合，加入3ml LB液，37℃孵育2.5～3小时，65～70℃孵育20分钟，离心后所得上清含有切割后形成的pBluescript噬菌粒。取适量此上清加入到新鲜制备的SOLR菌中，接种LB/AMP板，37℃过夜培养后，取单一菌落，用QIAprep Miniprep试剂盒提取质粒，经EcoR I和Xho I酶切，确定插入片段的大小。有相同酶切图谱的克隆判定为同一基因，不同大小插入片段的克隆由赛百盛公司和上海基康公司用T3、T7或M13引物，在ABI Prism全自动序列测定仪(Perkin Elmer)上进行核酸序列测定。结果发现，通过数据库相似性搜索，HCA587在核苷酸水平上没有相似性较高的基因(全序列对比＜85％)，因此它们是一种新的抗原编码基因。通过RACE方法获得全长后，经Sequenin软件向DDBJ/EMBL/GenBank申请登录全长新的cDNA序列，获取的查询号为AF151378。

实施例2、HCA587重组蛋白的表达及在肿瘤组织中的分布

(1)重组pQE30-HCA587蛋白的表达

根据HCA587的核苷酸序列设计特异性引物，在上下游引物的5’端分别合成BamHI、HindIII酶切位点，P1：5’ATC GGATCCCCTCCCG TTCCAGGCGT 3’，P2：5’ACT AAGCTTTCACTCAGAAAAGGAGAC3’，以正常睾丸组织的cDNA为模板，PCR扩增出HCA587全长ORF，PCR产物和pGEM-Teasy载体连结后，转化DH5a，挑取含正确插入HCA587(GenBank Accession Number AF151378的自5′端第349位至1470位脱氧核糖核苷酸)的重组载体pGEM-HCA587的阳性克隆，分别用BamHI和HindIII双酶切pGEM-HCA587质粒和pQE-30载体(Qiagen公司)，电泳后凝胶回收HCA587和pQE-30载体大片段，T₄ DNA连结酶过夜连结后，转化XL-Blue感受态细胞，提取重组质粒(pQE-30/HCA587)，酶切鉴定重组载体。取构建正确的重组载体转化M15感受态细胞，氨苄青霉素和卡那霉素抗性筛选为阳性的克隆接种于5ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素)，37℃过夜培养，然后以1∶100稀释于200mL LB培养基中，于37℃振荡培养至OD＝0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养4.5h，离心收集细菌。用细菌裂解缓冲液悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1mg/ml，室温放置30min后，超声破碎，13000rpm离心30min(4℃)，分别收集上清和沉淀。参照Qiagen公司说明书，利用自该公司购买的镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)进行亲和层析。

纯化蛋白经SDS-PAGE电泳的纯化蛋白按上述方法电转移至经甲醇浸泡后的PVDF膜上，考马斯亮蓝染色后，50％甲醇脱色至满意为止，在PE/ABI491测序仪上进行重组蛋白的氨基酸序列测定(HCA587蛋白序列见图1)。结果证明，已成功获取重组的HCA587蛋白。Western实验进一步证实，该重组蛋白能与抗体阳性患者的血清反应，说明其具有与天然蛋白相似的结构。

(2)HCA587在肿瘤组织中的分布

HCA587重组蛋白100ug和福氏完全佐剂混匀后，皮内多点免疫家兔，共进行四次免疫(1次/2周)后，取血后分离免疫血清进行抗体滴度测定，ELISA结果显示，抗体滴度达1∶25600，经Poly A柱纯化IgG后，用免疫组化的方法分析HCA587蛋白在各种正常和肿瘤组织中的蛋白分布。

收集正常组织标本和各种肿瘤组织的石蜡和冰冻切片，使用1∶4000稀释抗体用ABC方法进行组化染色，后经DAB显色，苏木素复染后观察HCA587在组织中的表达情况，结果可见，HCA587在正常组织中除睾丸和小脑的Pukenji细胞有表达外，其它组织均为阴性；而在肿瘤组织中HCA587呈不同组织的、不同比例的异源性表达，见表1。

       表1.HCA587在肿瘤组织中的表达

组织类型	组化染色(阳性数/总数)
		黑色素瘤肺癌乳腺癌胰腺癌淋巴瘤头颈部癌卵巢癌精原细胞癌前列腺癌肾细胞癌脂肪肉瘤结肠癌尿道膀胱癌血管瘤	3/62/111/52/112/101/41/21/20/100/30/30/30/30/1

由该表可以看出，HCA587在不同的肿瘤组织中的表达比例不同，这对HCA587多肽免疫应用具有一定的指导作用。

实施例3.T2结合试验

分析HCA587要诱发机体产生免疫应答，首先要求该蛋白被APC细胞处理后，相应多肽和其HLA分子结合，提呈到细胞表面。因此，首先用Dr.Kenneth Parker发明的模型(Parker，K.C.，et al.1994.J.Immunol.152：163)预测HCA587蛋白序列中能和HLA-A2结合的多肽(网址：http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)，结合其它HLA-A2预测结合多肽软件筛选出4个较为可能的HCA587和HLA-A2结合的抗原多肽，体外用多肽合成仪合成所有的预测多肽(表2中序列编号是1至4)，用HPLC进行纯化，纯度达80％，然后用细胞系CEMX721.174.T2(简称T2)(American Type Culture Collection)进行HLA-A2结合试验。因为，T2细胞只表达HLA-A2分子，而不能将内源性多肽提呈到细胞表面，因此其是一个理想的细胞免疫应答研究的细胞系。1×10⁶个T2细胞经无血清1640培养基37℃培养36小时后，加入2μg人β₂-微球蛋白(Sigma，美国)5μg，同时加入各种合成的能和预测HLA-A2结合的HCA587多肽(表2中序列编号是1至4)50μg，其中设立来源于流感病毒已知和HLA-A2结合的九肽(表2中序列编号是5)为阳性对照和不加多肽的阴性对照(空白管)，37℃培养18小时后，用平衡缓冲液(BSS)+2％NCS(简称BSS-2％NCS)的缓冲液洗涤2遍后，加入B77.2单抗(抗人HLA-A2分子，BDpharmingen)100μl，冰上染色40分钟后，用BSS-2％NCS的缓冲液再洗2遍后，加入FITC标记的二抗(SIGMA)进行间接染色，冰上40分钟后，BSS-2％NCS的缓冲液洗涤后，加入FACS保存液保存，流式分析结果。每种处理重复2次。用荧光指数衡量多肽和T2结合的情况。荧光指数＝(肽结合管平均荧光指数-二抗对照管平均荧光指数)/(空白管平均荧光指数-二抗对照管平均荧光指数)。二抗对照管是在空白管中加入B77.2单抗和FITC标记的二抗得到的对照管。

同时，在本实验条件下，测定了TLDEKVAEL与T2结合的情况，结果表明TLDEKVAEL的FI＝1.05。

       表2.HCA587抗原编码肽的T2结合试验

编号	位置	序列	荧光指数#
				12345	14014462228Flu 68	TLDEKVAELVKVAELVEFLILGGPEEEEVSLLIIILSVIGILGFVFTL	1.441.390.2400.88

由T2结合试验可以看出，其中能和T2结合的HCA587九肽为KVAELVEFL(序列表中的序列1)，十肽为TLDEKVAELV(序列表中的序列2)，我们知道，抗原肽引起机体免疫应答的前提是其首先能和机体的HLA分子形成复合体，而上述2种多肽能和T2细胞表面表达的HLA分子呈现一定的亲和结合能力，说明其可能是HCA587蛋白中能引起特异性免疫应答的抗原决定簇。而其余合成肽不能与T2的HLA-A2分子结合，说明其可能很难诱导特异性的细胞免疫应答。

实施例4、HCA587多肽在正常人中免疫应答的分析

能和T2的HLA-A2分子结合的多肽不一定都能引起机体产生特异性的细胞免疫应答，下面这一试验将用ELISPOT分析能引起特异性γ-干扰素产生的CTL的细胞免疫应答。

取10例HLA-A2阳性的正常人PBMCs的单核细胞(按照文献Hua-Gang Zhang，etal.Tissue Antigens 2003；62：285-95中描述的方法制备)在含GM-CSF 1000μg/ml，IL-4500μg/ml及10％FCS的RPMI-1640培养基中培养8天，第8天收获悬浮的树突状细胞(DC)，DC用10μg/ml的T2结合试验阳性的HCA587合成十肽(序列表中的序列2)或九肽(序列表中的序列1)及2.5μg/ml β2微球蛋白在无血清RPMI-1640中进行加载，37℃，5％ CO₂ 2小时，经⁶⁰Coγ射线3000Gy照射，洗去多余的抗原肽后，DC以1×10⁵个/孔，加入和阳性磁珠分离的CD8⁺T细胞孔，混匀后，在含IL-210μg/ml和500μg/ml IL-6的10％AB血清1640进行培养，每隔2天换液，一周后，用同样的方法培养DC后，加载抗原肽，反复刺激CD8⁺T细胞，经4次刺激后，收获CD8⁺T细胞作为效应细胞，进行ELIPOT试验。

ELISPOT方法检测CD8⁺T细胞被HCA587抗原肽刺激后分泌IFNγ的能力。简述如下，96孔平底硝酸纤维素板(Millititer，Millipore)用抗人IFNγ单抗(1-D1k；2μg/ml于PH 9.6碳酸盐缓冲液中；MABTECH，德国)包被，4℃过夜；第二天经0.05％Tween PBS洗涤后，该板用10％AB血清的1640培养液室温避光封闭1小时，经0.05％Tween PBS洗涤后，每孔加入5×10⁴个上述效应细胞(Effector Cells，E)并分为两组，即效应细胞与T2细胞组(E+T2)、效应细胞与T2细胞加载抗原肽组(E+T2(肽))，每组各做两复孔；T2细胞在含10μg/ml抗原肽的无血清RPMI-1640中，37℃，5％CO2孵育2小时，经1000Gy照射，洗去多余的抗原肽后作为刺激细胞，以1×10⁵个/孔加入(E+T2(肽))的各效应细胞孔；同时，T2细胞以1×10⁵个/孔加入(E+T2)的各效应细胞中。这两个反应体系在不含细胞因子及血清的1640培养液中，37℃，5％CO2孵育18-20小时后，用0.05％Tween PBS充分冲洗培养板以去除残留细胞；随后加入生物素标记的抗人IFN-γ二抗(0.2μg/ml，7-B6-1-biotin；MABTECH)，在37℃孵育2小时后，洗板，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(1μg/ml；MABTECH)在室温避光孵育1小时；洗板后，加入底物BCIP-NBT显色液(NCBI，Sigma产品)避光显色5分钟，用自来水冲洗，终止反应；待反应板晾干后，于解剖显微镜下计数每孔呈黑紫色的斑点数；每组斑点数均由两复孔的平均值得出；抗原特异的CD8⁺T细胞频数＝(E+T2(肽))组斑点数-(E+T2)组斑点数。2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞加载抗原肽组的斑点数是116±4.95个，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞加载抗原肽组的斑点数是74±5.65个，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞组的斑点数是26±2.82个，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞组的斑点数是26±1.41个。

结果表明在2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8⁺T细胞中，产生IFN-γ的细胞数为90个细胞；在2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞中，产生IFN-γ的细胞数为48个细胞。

本试验说明，正常人在氨基酸序列是序列表中序列2的十肽或序列表中序列1的九肽的HCA587多肽的反复刺激下，能在体外成功诱导针对氨基酸序列是序列表中序列2的十肽或序列表中序列1的九肽的特异性细胞免疫。

本实验条件下，经CN200310116838.9中的TLDEKVAEL刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞加载抗原肽组的斑点数是39±4.24个。

实施例5、HCA587多肽在肝癌患者外周血中免疫应答的分析

在本实验中，将进一步证实，在肝癌病人体内存在针对HCA587多肽的特异性免疫应答细胞。

收集6例HCA587蛋白表达阳性、血清抗体阳性的肝癌患者外周血PBMC(具体方法参见Bing Li et al.World J Gastroenterology，2003，9：678-682)，经贴壁分离培养DC后，用氨基酸序列是序列表中序列2的十肽或序列表中序列1的九肽加载后，刺激经阳性磁珠分离的CD8⁺T细胞，实验步骤同实施例4，唯一不同的是，正常人一般需4轮刺激，而肝癌病人只刺激2次，目的是扩增已对氨基酸序列是序列表中序列2的十肽或序列表中序列1的九肽产生特异应答的CTL细胞。结果如图2所示，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞加载抗原肽组(图2中以1表示)的斑点数是96±7.78个，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞加载抗原肽组(图2中以3表示)的斑点数是121±5.65个，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞组(图2中以2表示)的斑点数是18±1.41个，2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞组(图2中以4表示)的斑点数是36±4.42个。图2是从6例HCA587蛋白表达阳性、血清抗体阳性的肝癌患者外周血PBMC中分离的DC作为抗原呈递细胞的结果。

结果表明在2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8⁺T细胞中，产生IFN-γ的细胞数为78个细胞；在2.5×10⁴个经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞中，产生IFN-γ的细胞数为85个细胞。

可见，在肝癌患者体内确实存在针对氨基酸序列是序列表中序列2的十肽或序列表中序列1的九肽的特异性CTL细胞。

本实验条件下，经CN200310116838.9中的TLDEKVAEL刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞加载抗原肽组的斑点数是40±4.78个(图2中以5表示)，经CN200310116838.9中的TLDEKVAEL刺激的CD8⁺T细胞与T2细胞组(图2中以6表示)的斑点数是25±2.41个。

实施例6、肿瘤细胞系的杀伤试验

在本实验中，用7-AAD/CFSE流式细胞术杀伤试验证实CD8⁺T细胞(见实施例5)对于表达或不表达HCA587蛋白的HLA-A2的肿瘤细胞系的杀伤能力。

经体外刺激的1例肝癌患者CD8+T细胞作为效应细胞(按照实施例5的方法制备)用2μM CFSE进行标记，PBS洗涤2次，然后与靶细胞肝癌细胞系HLE(HLA-A2⁺，HCA87^-)(中国科学院上海细胞库)，HepG2(HLA-A2⁺，HCA587⁺)(中国科学院上海细胞库)分别以20∶1的比例在96孔圆底板中共孵育5小时，单独HLE和HepG2细胞作为对照。收集细胞，每组用10μL 7-AAD染色，15分钟后用流式细胞仪加以检测分析。其中，特异杀伤比例是以(效靶细胞混合组7-AAD阳性率-单独靶细胞组7-AAD阳性率)/(1-单独靶细胞组7-AAD阳性率)。结果如图3所示，HepG2细胞系能被氨基酸序列是序列表中序列2的十肽或序列表中序列1的九肽刺激的CD8⁺T细胞特异性杀伤，而HLE却不能被杀伤。这说明经氨基酸序列是序列表中序列1的九肽或序列表中序列2的十肽刺激的CD8+T细胞不仅能杀伤外源加载于T2细胞上的抗原肽，而且能杀伤肿瘤细胞内源提呈的HCA587抗原肽。图3中的1是氨基酸序列是序列表中序列2的十肽刺激的CD8+T细胞杀伤HepG2的结果，图3中的2是杀伤HLE的结果；图3中的3是氨基酸序列是序列表中序列1的九肽刺激的CD8+T细胞杀伤HepG2的结果，图3中的4是杀伤HLE的结果；图3中的5是氨基酸序列是CN200310116838.9中的TLDEKVAEL九肽刺激的CD8+T细胞杀伤HepG2的结果，图3中的6是杀伤HLE的结果。

                           序列表

<160>2

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

Lys Val Ala Glu Leu Val Glu Phe Leu

1               5

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Glu Leu Val

1               5                   10

Claims (10)

1、一种人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，是如下(a)或(b)的多肽：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸残基序列组成的多肽；

(b)由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的多肽。

2、权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的编码DNA。

3、含有权利要求2所述的编码DNA的重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

4、一种预防和/或治疗肿瘤的疫苗，它的活性成分是权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽，或权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽中的(a)和(b)的多肽。

5、一种预防和/或治疗肿瘤的疫苗，它的活性成分是含有权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的编码DNA的重组表达载体或重组细胞，或含有权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽中的(a)和(b)的多肽的编码DNA的重组表达载体或重组细胞。

6、根据权利要求4或5所述的疫苗，其特征在于：所述肿瘤为肝癌或黑色素瘤或膀胱癌或乳腺癌或肺癌或胰腺癌或淋巴瘤。

7、权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽及其衍生物在制备肿瘤的诊断和预防试剂中的应用；所述多肽衍生物由所述人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽与人类HLA分子的聚合物、化合物或复合物聚合而成。

8、权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽在制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗中的应用。

9、权利要求1所述的人肿瘤-睾丸抗原HCA587上的抗原决定簇多肽的编码DNA在制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗中的应用。

10、根据权利要求7、8或9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌或黑色素瘤或膀胱癌或乳腺癌或肺癌或胰腺癌或淋巴瘤。

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