EA030087B1 - Способ in vitro для определения стабильности композиций, содержащих растворимый fc-гамма-рецептор(ы) - Google Patents

Abstract

Изобретение фактически относится к способу in vitro для определения стабильности, такой как стабильность при хранении, стабильность с течением времени, срок годности композиции, которая содержит растворимый человеческий Fc-гамма-рецептор IIA, IIB, IIIA и/или IIIB либо фактически состоит из него, причем указанный способ включает этапы приведения в контакт поверхности, содержащей человеческий Fc-гамма-рецептор IIA, IIB, IIIA и/или IIIB, с заданным количеством агрегированного человеческого IgG; приведения в контакт указанной поверхности, содержащей человеческий Fc-гамма-рецептор IIA, IIB, IIIA и/или IIIB, с заданным количеством указанной композиции с растворимым человеческим Fc-гамма-рецептором IIA, IIB, IIIA и/или IIIB; определения количества агрегированного человеческого IgG, который связан с указанной поверхностью, содержащей указанный человеческий Fc-гамма-рецептор IIA, IIB, IIIA и/или IIIB, а также сравнения количества агрегированного человеческого IgG, который связан с указанной поверхностью по результатам определения на этапе (с), с эталонным значением и (таким образом) определения стабильности [стабильности при хранении, стабильности с течением времени, срока годности] указанной композиции, которая содержит растворимый человеческий Fc-гамма-рецептор IIA, IIB, IIIA и/или IIIB либо фактически состоит из него. Настоящее изобретение также относится к агрегированному человеческому IgG, получаемому с помощью приведенного в настоящем документе способа, а также к применению упомянутого агрегированного человеческого IgG в способах по настоящему изобретению.

Description

изобретение относится к способу ίη νίίτο для определения стабильности (такой как стабильность при хранении или период стабильности) композиции, предпочтительно фармацевтической композиции (равносильно лекарственному средству), при этом композиция содержит растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ПВ, ΙΙΙΑ и/или ШВ, либо фактически состоит из него, причем указанный способ включает этапы:

(a) приведение в контакт поверхности, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ИВ, ΙΙΙΑ и/или ШВ, с заданным количеством агрегированного человеческого ШС:

(b) приведение в контакт указанной поверхности, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ИВ, ΙΙΙΑ и/или ШВ, с заданным количеством указанной композиции с растворимым человеческим Рсгамма-рецептором ΙΙΑ, ИВ, ΙΙΙΑ и/или ШВ; и

(c) определение количества агрегированного человеческого ^С, который связан с указанной поверхностью, содержащей указанный человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ИВ, ΙΙΙΑ и/или ШВ,

(б) а также сравнение количества агрегированного человеческого ^С, который связан с указанной поверхностью по результатам определения на этапе (с), с эталонным значением и (таким образом) определения такой стабильности, как стабильность при хранении, стабильность с течением времени, срок годности указанной композиции, которая содержит растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ИВ, ΙΙΙΑ и/или ШВ, либо фактически состоит из него.

Этапы (а) и (Ъ) способов по настоящему изобретению можно осуществлять одновременно или последовательно. Также предусмотрено, что порядок этапов (Ъ) и (а) является обратным.

Предусмотрено, что способы по настоящему изобретению включают этап промывки, который необходимо проводить перед этапом (с) и предпочтительно после этапа (а) и (Ъ)

Предпочтительно, чтобы указанный растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор, который используют в контексте настоящего изобретения, представлял собой растворимый Рс-гамма-рецептор ИВВ. Особенно предпочтительно, чтобы указанный растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ИВ представлял собой δΜ101 (δΕρ ΙΌ № 1), включая препараты данных рецепторов, которые можно получить в результате экспрессии данных рецепторов у клеток-хозяев, таких как, например, клетки млекопитающих или бактериальные клетки, например, Е. οο1ϊ.

Настоящее изобретение также относится к применению агрегированного человеческого ^С, который определен в данном документе, в способах и вариантах осуществления по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения термин "способ ίη νίίτο" относится к способу, который осуще- 2 030087

ствляют вне организма человека или животного, в отличие от способа ίη νΐνο.

Слово "способ" можно заменить на "тест", или "анализ" или другие.

Термин "стабильность" включает "стабильность при хранении", или "срок годности", или "время полужизни". "Стабильность" композиции фактически относится к стабильности основного содержащегося в ней ингредиента, т. е. стабильности растворимого человеческого Ре-гамма-рецептора ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, который определен в данном документе. На указанную стабильность могут оказывать влияние различные параметры, такие как время, т. е. "стабильность с течением времени"; температура, буферные условия, выработка хозяином растворимого человеческого Рс-гамма-рецептора ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ; последовательность человеческого Рс-гамма-рецептора ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ; способ получения человеческого Рс-гамма-рецептора ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ и т. д.

При определении стабильности композиции по настоящему изобретению (которая содержит растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, или же фактически состоит из него) также можно отслеживать/контролировать качество/состояние/связывающую способность указанной композиции (т. е. фактически основного ингредиента указанной композиции, который представляет собой растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ).

"Композиция" в предпочтительном варианте осуществления представляет собой фармацевтическую композицию (что равносильно лекарственному средству) или диагностическую композицию и может дополнительно содержать фармацевтически или диагностически приемлемые носители, буферы, ингредиенты и т. д. Указанная композиция также может содержать дополнительные терапевтически активные ингредиенты.

Термин "агрегированный человеческий Ι§0" (иногда также называемый "человеческим агрегированным Ι§0" или т. п.) относится к агрегированной части препарата человеческого Ι§0. Такие препараты, как ни странно, присутствуют в препаратах на основе крови (таких как препараты объединенного человеческого Ι§0 или ΙνΙΟ), которые можно применять для внутривенного или подкожного, либо внутримышечного введения, при этом такие продукты содержат объединенный (предпочтительно поливалентный) Ι§0. Таким образом, агрегированный человеческий Ι§0 предпочтительно может быть полученным/выделенным или является получаемым из препаратов объединенного человеческого Ι§0. таких как препараты/композиции ΙνΙ0. Подразумевают, что указанный агрегированный человеческий Ι§0 представляет собой агрегированный человеческий Ι§0, который может быть выделен из "человеческого белка", характеризующегося содержанием по меньшей мере 90% человеческого Ι§0. Указанный человеческий белок является полученным/получаемым из человеческой сыворотки или плазмы и, в предпочтительном варианте осуществления, характеризуется или идентифицируется как нормальный человеческий иммуноглобулин (человеческий Ι§0) с АТС-кодом 106ΒΑ01 или 106ΒΑ02, в соответствии с Анатомотерапевтическо-химической классификацией (АТС) Центра сотрудничества АНО по методологии статистики лекарственных средств (АНОСС). Термин "человеческий белок", при применении в данном документе, включает препараты объединенного человеческого Ι§0. В предпочтительном варианте осуществления человеческий Ι§0 содержит по меньшей мере 50% Ι§0 подтипа Ι§01. В более предпочтительном варианте осуществления человеческий Ι§0 (дополнительно) содержит по меньшей мере 20% Ι§0 подтипа Ι§02. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанный агрегированный человеческий Ι§0 является полученным/выделенным или получаемым из ΒοΓίβΙοόίη ®, νηπίιχΐ ® или νοηόφ ®, при этом Βοπβίοόίη является предпочтительным. ΒοΓίβΙοόίη содержит 95% или более, к примеру, 100% Ι§0. Например, ΒοΓίβΙοΟίη, содержащий 100% Ι§0, может содержать 61% Ι§01, 28% Ι§02, 5% Ι§03, 6% Ι§04 и может максимально содержать приблизительно 1% Ι§Α. Процентные значения, указанные для Βοπβίοόίιτ νηπίου и νοηάίβ, относятся к % (вес/вес). Иллюстративным ΒοΓίβΙοόίη является таковой с номером серии 268403 ΙΙΑ или 23840311В. νατΟοΟ содержит 95% или более, к примеру, 100% Ι§0. Например, νηπίου со 100% Ι§0 может содержать 59% Ι§01, 36% Ι§02, 3% Ι§03, 2% Ι§04 и может содержать 5% или менее Ι§Α. νοηόίβ содержит 95% или более, к примеру, 100% Ι§0. Например, νοηύίβ со 100% Ι§0 может содержать 52-80% Ι§01, 26-50% Ι§02, 2,4-5% Ι§03, 0,3-1% Ι§04. Разумеется, в способах и применениях по настоящему изобретению специалист сможет применять ΒοηβΙοΝιτ ναήΐθΟ, νοηύφ или любую другую композицию, похожую на эти три лекарственных средства. Другой предпочтительный агрегированный человеческий Ι§0 является полученным/выделенным или получаемым из 8иЪсш1а ®. Например, 8иЪсш1а со 100% Ι§0 может содержать 45-75% Ι§01, 20-45% Ι§02, 3-10% Ι§03, 2-8% Ι§04. Процентные значения, указанные для §иЪсш1а, относятся к % (вес/вес). Иллюстративным §иЪсш1а является таковой с номером серии ΒνΝ01Μ032Α.

Тем не менее, специалист может применять не только эти три лекарственных средства, но также может самостоятельно получить препарат человеческого Ι§0. Безусловно, специалист легко сможет получить описанный в данном документе препарат Ι§0, например, путем объединения Ι§0 из плазмы по меньшей мере от 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или более, предпочтительно 1000 или более людей-доноров, с получением таким образом препарата (объединенного) человеческого Ι§0. В результате, препарат человеческого Ι§0, применяемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит 95% или более, к примеру, 100% Ι§0. Применяемый в настоящем изобретении препарат Ι§0 предпочти- 3 030087

тельно содержит 1дС следующих подклассов: 52-80% (вес./вес.) 1§С1, 26-50% 1дС2 (вес./вес.), 2-5% 1дС3 (вес./вес.) и/или 0,2-6% (вес./вес.) 1§04 при условии, что общее содержание 1дС не превышает 100% (вес./вес.).

В следующем предпочтительном варианте осуществления указанный человеческий белок состоит из смешанной сыворотки или плазмы, либо содержит ее по меньшей мере от 100, т. е. 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 и т. д. (здоровых или "стандартных") людей-доноров, имеющих все четыре подгруппы 1дС. Предпочтительной является смешанная сыворотка или плазма по меньшей мере от 500 (здоровых или "стандартных") людей-доноров. Термин "здоровый" означает индивидуума, который соответствует действующим в настоящий момент (на момент донорства) стандартным критериям отбора для донорства крови, принимая во внимание, что такие критерии отбора подвергаются непрерывному улучшению и изменению.

В другом варианте осуществления предусмотрено, что указанный агрегированный человеческий 1дС представляет собой агрегированный человеческий 1дС. который является получаемым из указанного человеческого белка с помощью способа выделения, включающего эксклюзионную хроматографию. В предпочтительном варианте осуществления с помощью указанной эксклюзионной хроматографии отделяют мономерные и/или димерные 1дС от указанного агрегированного человеческого 1дС. Средства и способы выделения агрегированного человеческого ΐ§Ο, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, раскрыты в других разделах данного документа (например, в Примерах). Также предусмотрено, что агрегированный человеческий 1дС по настоящему изобретению не является агрегированным под действием тепла человеческим 1§С, наподобие, например, такого, который описан у Епде1Ьатй, е1 а1., (1990), Еиг. 1. 1ттипо1. 20, 1367-1377, БгиЬпв е1 а1. (2009), Βίοοά 1. 113(16), 3716-3725 или И8 2008/008700. Безусловно, агрегированный под действием тепла 1дС будет отличаться от агрегированного ΐ§Ο, который является полученным/является получаемым согласно описанию в данном документе. То есть агрегация под действием тепла является результатом частичной денатурации белков при воздействии на заданный белок температурами, превышающими температуру плавления (Тт). Температура плавления является функциональным показателем белка, и, в случае смеси человеческих 1§С, безусловно будет наблюдаться широкий диапазон Тт. Таким образом, степень агрегации будет варьировать от одной серии к другой, в зависимости от смеси используемых 1дС.

Более того, ряд мономерных 1дС под действием тепла неизбежно станет частью препарата агрегированного 1дС и, таким образом, не позволит получить агрегированный 1дС без варьирующих количеств мономерного ΐ§Ο, которые рассматривались бы в качестве примесей. Тем не менее, с помощью описываемых в данном документе способов получения агрегированного 1дС отделяют мономерные и/или димерные 1дС от агрегированного 1дС и, таким образом, полученный агрегированный 1§С, который является полученным/является получаемым с помощью описываемых в данном документе способов, отличается от известного из уровня техники агрегированного под действием тепла 1дС.

Таким образом, очевидно, что агрегированный под действием тепла 1дС не сравним с раскрытыми с помощью настоящего изобретения препаратами агрегированного ΐ§Ο, которые обладают долгосрочной стабильностью и идеально подходят для тестирования с целью серийного выпуска или любого другого стандартного тестирования.

Предусмотрено, что препараты объединенного человеческого ΐ§Ο, такие как препараты внутривенного иммуноглобулина (ΐνΐΟ), иногда также называемые плазменным иммуноглобулином для внутривенного введения, получены из объединенной плазмы сотен здоровых доноров и содержат как иммунные, так и естественные антитела (ЫЛЬ), отображающие кумулятивное воздействие антигена в группе доноров. Препарат объединенного человеческого 1дС по своей природе является высоко поликлональным и содержит множество разновидностей антител. Так, он содержит большой спектр так называемых "иммунных антител" со специфичностями, направленными против патогенов и "чужих" антигенов, а также ЫЛЬ, вступающих в реакцию с широким диапазоном антигенов, включая собственные/аутоантигены. ЫЛЬ имеют такое определение, поскольку они образуются в отсутствие преднамеренной иммунизации и независимо от воздействия "чужих" антигенов.

В дополнение к внутривенным препаратам существуют препараты для подкожного (8СЮ) и внутримышечного (1МЮ) введения. Применяемый в данном документе термин "ΐνΐΟ" предназначен для охвата ГУЮ, 8СЮ и 1МЮ препаратов. ΐνΐΟ составы хорошо известны и включают ΐΝΤΚΑΟΑΜ ® Р, ΡΚίνίΟΕΝ ®, ΗΙΖΕΝΤΚΛ ®, Сатипех ®, ИеЬодатта ®, Ойадат ® и Сапитипе ®.

Одним признаком, являющимся общим для препаратов объединенного человеческого 1дС, таких как ΐνίΟ препараты, является то, что, поскольку они получены из нормальной плазмы или сыворотки, основной разновидностью иммуноглобулинов, которую они содержат, является ГдС, например, по меньшей мере 98% иммуноглобулина в ΙΝΤΚΑΟΑΜ ® Р и ΡΚίνίΟΕΝ ® представляет собой ГдС. Соответственно, препарат объединенного человеческого 1дО, такой как ΐνΐΟ, можно рассматривать в качестве концентрированного препарата 1дО.

В предпочтительных вариантах осуществления ΐνΐΟ включает по меньшей мере 5% вес/объем, по меньшей мере 10% вес./об., по меньшей мере 20% вес./об. или по меньшей мере 25% иммуноглобулина.

- 4 030087

Примеры 1У1О препаратов приведены в XVО 2005/023867 в табл. 1. Все эти примеры являются предпочтительными ГУЮ препаратами, которые можно применять в контексте настоящего изобретения.

Агрегированный человеческий Ι§Ο, определение которому дано в данном документе, является необязательно меченным, и метка либо непосредственно, либо опосредованно соединена с агрегированным человеческим 1§С. Таким образом, "непосредственно" означает ковалентно соединенную метку (которая также может содержать линкер), в то время как опосредованно включает связывание агрегированного человеческого Ι§Ο второй меченной частицей, которая связывается с агрегированным человеческим Ι§Ο, например, меченный домен связывания, такой как антитело или его фрагменты (например, антитела к антителам человека, такие как меченное вторичное антитело к человеческому Ι§Ο). Вторичное меченное антитело может представлять собой любое доступное антитело к Ι§Ο, в приведенных ниже примерах применяли антитело козы к человеческому Ι§Ο, меченное при помощи К-фикоэритрина (Οίαηονα. кат. № 109-116-088), однако, коммерчески доступны многие другие антитела, которые подошли бы в равной степени. Помимо прочего, в контексте настоящего изобретения предусмотрены "флуоресцентные метки", однако настоящее изобретение не ограничено ними, т.е. также предусмотрены другие метки (например, метки, которые можно использовать в иммунологических способах, таких как способы ЕЫ§А). Флуоресцентные метки предпочтительно выбраны из группы, включающей средства со свойствами квантовых точек, флуоресцентные белки, флуоресцентные красители, рН-чувствительные флуоресцентные красители, потенциал-чувствительные флуоресцентные красители и/или микросферы с флуоресцентной меткой. Предпочтительными являются флуоресцентная метка, возбуждаемая лазерным лучом и испускающая свет с заданной длинной волны, детектируемый посредством РАС8-устройства.

Для экспериментов, которые привели к созданию настоящего изобретения, применяли коммерческий продукт ВепДоЪш ® и агрегированный человеческий 1§С отделяли от мономерного и димерного Ι§Ο с помощью препаративной эксклюзионной хроматографии (§ЕС) (см. подробное описание ниже и пример 2). Тем не менее, для выделения агрегированного человеческого Ι§Ο в качестве отправной точки можно применять любой другой описываемый в данном документе "человеческий белок", например, подходящими продуктами являются Вег1§1оЫп, УагПес! и УеиФд, которые в настоящее время представлены на рынке Германии, или же описываемый в данном документе препарат 1§С, например, полученный в результате объединения 1§С из плазмы по меньшей мере 100, 200, 300, 400, 500 или более, предпочтительно 1000 или более людей-доноров. Любую из данных "отправных точек" (включая описываемый в данном документе человеческий белок, препараты (объединенного) Ι§Ο, такие как 1УЮ) можно применять для выделения агрегированного человеческого Ι§Ο путем, например, препаративной эксклюзионной хроматографии (§ЕС) (смотри подробное описание ниже и пример 2). В настоящее время в ΡΌΑ США есть 10 зарегистрированных продуктов. Особенно предпочтительным является применение в качестве исходного материала "человеческого белка", например, Вепд1оЪт, поскольку это обеспечивает контролируемый источник агрегированного человеческого 1дО-продукта, подлежащего применению в качестве стандарта в вариантах осуществления по настоящему изобретению. Агрегированный человеческий Ι§Ο можно скорректировать так, чтобы он имел содержание белка от 0,35 до 1,40 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 1,35 мг/мл. Специалист поймет, что содержание белка можно скорректировать путем разведения подходящим буфером или сконцентрировать, например, при помощи ультрафильтрации. Дополнительное руководство приведено в примерах 1 и 2 настоящего изобретения.

На последнем этапе способа определения стабильности композиции, которая содержит растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, либо фактически состоит из него, количество агрегированного человеческого Ι§Ο, которое связано с поверхностью и которое определено согласно данному описанию, сравнивают с эталонным значением. Указанный этап сравнения делает возможным определение стабильности указанной композиции как приведено далее.

Например, чем выше стабильность композиции, чью стабильность определяют в сравнении с композицией, также содержащей Рс-гамма-рецепторы, тем меньше агрегированного ΙβΟ будет связываться с поверхностью, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, поскольку он будет связан одним или несколькими растворимыми человеческими Рс-гамма-рецепторами, содержащимися в указанной композиции.

С другой стороны, например, чем больше агрегированного ΙβΟ будет связываться с поверхностью, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, тем менее стабильной является композиция в сравнении с композицией, также содержащей Рс-гамма-рецепторы, наподобие композиции, чью стабильность определяют в соответствии с описанными в данном документе способами. Тем не менее, "менее стабильная" не означает, что композиция, чью стабильность определяют, не является ценной. С другой стороны, для некоторых применений может быть желательной композиция, которая, например, менее стабильна, чем эталонная композиция, поскольку желательной может быть композиция, чьи ингредиенты имеют укороченный период полужизни, меньшую рН-стабильность и т. д.

Как указано ранее, эталонная композиция также содержит один или несколько человеческих Рсгамма-рецепторов наподобие композиции, чью стабильность определяют в соответствии со способами по настоящему изобретению, и ее называют в данном документе эталонной композицией.

Что касается указанной эталонной композиции, значение, отображающее количество агрегирован- 5 030087

ного человеческого 1§С, которое связано с поверхностью, определяли согласно описанию в настоящем документе так, чтобы указанное значение было доступно в качестве эталонного значения. Следовательно, эталонное значение определено и таким образом доступно до определения стабильности композиции в соответствии с идеей настоящего изобретения. Соответственно, указанное эталонное значение затем можно сравнить с количеством агрегированного человеческого 1§С, которое связано с поверхностью по результатам определения согласно описанию в данном документе, чье количество затем преобразуют в значение, которое сравнивают с эталонным значением. Благодаря такому сравнению можно определить стабильность композиции. По сути, как объяснялось ранее, определяли эталонное значение, и указанное эталонное значение отображает определенное количество агрегированного человеческого 1§С, связанного поверхностью. Следовательно, эталонное значение косвенно отображает количество 1§С, связанного одним или несколькими растворимыми человеческими Ре-рецепторами, содержащимися в указанной композиции.

Конечно, эталонная композиция лишь тогда является сравнимой с композицией, чью стабильность определяют в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, когда она содержит такой же один или несколько растворимых Рс-гамма-рецепторов в сравнимом количестве (в идеале, в таком же количестве).

Эталонное значение может отображать стабильность описываемой в данном документе композиции, например, в том, что касается температурной стабильности, рН-стабильности, периода буферной стабильности, стабильности при хранении, срока годности, периода полужизни, стабильности (или устойчивости) к разрушению, стабильности в отношении мономерной формы и т. д. описываемых в данном документе Рс-гамма-рецепторов. Тем не менее, не является очевидным какое свойство стабильности или параметра стабильности композиции определяют, поскольку это может зависеть, например, от требований и/или интересов, и/или цели, для которой могут применять данную композицию.

По сути, способы по настоящему изобретению не ограничены тестированием какого-либо конкретного параметра, который может оказывать влияние на стабильность, поскольку способы по настоящему изобретению предусматривают получение общих показаний стабильности композиции, потому что всегда существует количество агрегированного человеческого 1§С, которое связано с описываемой в данном документе поверхностью и которое подвергают определению, или, в альтернативном случае, количество агрегированного человеческого 1§С, которое связано одним или несколькими растворимыми человеческими Рс-гамма-рецепторами, содержащимися в композиции, чью стабильность определяют в соответствии с идеей настоящего изобретения.

Как объяснялось выше, чем меньше агрегированного 1§С связано с поверхностью, тем более активен или все еще активен один или несколько растворимых человеческих Рс-гамма-рецепторов, содержащихся в указанной композиции. Например, при заинтересованности в рН-стабильности композиции специалист может подвергнуть такую композицию воздействию различных условий рН, а затем протестировать связанный с поверхностью агрегированный человеческий 1§С, сохраняя при этом его контакт с указанной композицией. При условии, что указанная композиция является стабильной, например, по отношению к кислому рН, один или несколько растворимых человеческих Рс-гамма-рецепторов все еще будут способны связывать агрегированный человеческий 1§С и таким образом с поверхностью будет связываться меньше агрегированного 1§С, как описано в данном документе. Разумеется, специалист знает, что ему возможно придется применять подходящий буфер после тестирования рН-стабильности в ходе осуществления способов по настоящему изобретению. Например, слишком кислая или основная среда может нарушить реализацию описываемых в данном документе способов, и таким образом перед их реализацией специалисту возможно придется корректировать или адаптировать буферные условия с помощью средств и способов, которые широко известны из уровня техники.

В качестве еще одного примера, если у специалиста есть заинтересованность в композиции, которая обладает длительным сроком хранения или устойчивостью к разрушению, тогда он применяет такую композицию в качестве эталонной композиции и определяет количество агрегированного 1§С, связанное с поверхностью, как описано в данном документе, после хранения композиции, например, в течение одного, двух, шести или двенадцати месяцев и применяет такое значение в качестве эталонного значения для необходимого свойства композиции. После этого указанное эталонное значение, которое отображает, например, длительный срок хранения или устойчивость к разрушению, будут сравнивать со значением, отображающим количество агрегированного человеческого 1§С, который является связанным с поверхностью, как описано в данном документе, при этом также находящемся в контакте с композицией, чью стабильность определяют с помощью способов по настоящему изобретению.

Эталонное значение, которое определяют, например, спустя двенадцать месяцев хранения и которое рассматривают как удовлетворяющее ожидания практикующего специалиста, можно установить как равное, например, 100, при этом 100 является относительным значением, поскольку оно лишь отображает определенное количество агрегированного человеческого 1§С, связанного с поверхностью.

Эталонное значение рассматривают как приемлемое, если по меньшей мере 50%, предпочтительно 60% или 70%, более предпочтительно 80% или 90% агрегированного человеческого 1§С не связано с поверхностью, но связано одним или несколькими растворимыми человеческими Рс-гамма-рецепторами,

- 6 030087

содержащимися в композиции, чью стабильность определяют. В частности, как объяснялось выше, чем меньше агрегированного человеческого Ι§θ связано с поверхностью, тем больше связано одним или несколькими растворимыми Рс-гамма-рецепторами, и наоборот. Соответственно, чем выше стабильность композиции, тем меньше агрегированного человеческого 1§С будет связано поверхностью, а не одним или несколькими растворимыми человеческими Рс-гамма-рецепторами. И наоборот, чем меньше стабильность композиции, тем больше агрегированного человеческого 1§С будет связано поверхностью и меньше будет связано одним или несколькими растворимыми человеческими Рс-гамма-рецепторами.

Настоящее изобретение также охватывает способ выделения агрегированного человеческого 1§С из смешанной плазмы по меньшей мере от 500 (здоровых или "стандартных") доноров при помощи эксклюзионной хроматографии.

Также предусмотрено, что агрегированный человеческий 1§С по настоящему изобретению дополняют или заменяют соответствующими препаратами 1§С не относящихся к человеку приматов, таких как яванский макак, игрунка, макака, 8ап§шз или подобные им.

"Растворимые человеческие РсКПЛ, РсКПВ, РсКШЛ или РсКШВ’’ по настоящему изобретению являются, например, такими, которые описаны в ЕР 1135486 и ЕР 1642974, а также ЕР 1446139. "Растворимые человеческие РсКПЛ, РсКПВ, РсКШЛ или РсКШВ" по настоящему изобретению в предпочтительных вариантах осуществления характеризуются отсутствием трансмембранных доменов и сигнальных пептидов. Заявляемые растворимые РсК по настоящему изобретению в предпочтительном варианте осуществления содержат, или же состоят из нее, аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности δΕρ ΙΌ №: 1 (8М101, рекомбинантный человеческий РсКПВ), δΕρ ΙΌ №: 3 (РсКПВ), δΕρ ΙΌ №: 5 (РсКПЛ), δΕρ ΙΌ №: 7 (РсКШЛ) или δΕρ ΙΌ №: 9 (РсКШВ), которые кодируются соответствующими последовательностями нуклеиновых кислот δΕρ ΙΌ №: 2, 4, 6, 8 и 10. Настоящее изобретение также охватывает растворимые РсК, которые по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95% идентичны белкам δΕρ ΙΌ №: 1, 3, 5, 7 или 9. Для определения идентичности последовательности сравнение выполняют путем выравнивания последовательностей таким образом, чтобы обеспечить максимальное соответствие аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор представляет собой РсКПВ (δΕρ ΙΌ №: 3). В более предпочтительном варианте осуществления растворимый человеческий рецептор представляет собой δΜ101 (δΕρ ΙΌ №:1), который является растворимым рецептором РсКПВ. В следующем предпочтительном варианте осуществления способов по настоящему изобретению за один раз следует тестировать лишь один растворимый рецептор (или, как упомянуто выше, смесь белков, все из которых по меньшей мере на 90% идентичны представляющему интерес рецептору).

Последовательности, к которым относится настоящая заявка, показаны ниже. δΕΟ ΙΌ №1 (δΜ101)

МАРРКАУГКГ ΕΡΟλΥΙΝVI+)Р Ι)8\'ΊΊ.ТСКСТ ΗδΡΕδϋδΚφΥ ΓΗΝΟΝΓΙΡΤΗ

ΤΟΡδΥΚΓΚΑΝ ΝΝΏδΟΕΥΤΟΟ ΤΟΟΤδΓδϋΡν ΙΙΙ.Τνί.δΡΑΊ.ν ΓΟΤΡΗΓΕΓΟΕ

ίίΡΤΙ \'РКСП8 \νΚΙ)ΚΡΙ,νκντ ΕΕΟΝΟΚδΚΚΕ δΚδϋΡΝΕδΙΡ ΟΑΝΗδΗδΟϋΥ

ПСТСХЮ ΥΊΊ. ΥδδΚΡΥΤΙΤν ΟΑΡδδδΡ

δΕΟ ΙΌ № 2 (δΜ101, кДНК)

1 АТООСАССОС СОАААОСАОТ ООАТТААСОТ ТСТОСАООАА

61 ОАТАОСОТТА СССТОАССТО АААОСОАТАО САТТСАОТОО

121 ТТТСАСААСС ССААТСТСАТ ОСТАТСОТТТ ТАААОСОААС

181 ААСААСОАТА ОСООСОААТА ССАОССТОАО СОАТССООТТ

241 САТСТОАССО ТТСТОАОСОА СОСАТСТООА АТТТСАООАА

301 ООСОАААССА ТТОТТСТОСО ААССОСТООТ ТАААОТТАСС

361 ТТСТТССАОА АСООСААААО АТССОААТТТ ТАОСАТТССО

421 САООСОААТС АТАОССАТАО

ОСААСАТТОО СТАТАСССТО

481 ТАТАОСАОСА ААССООТОАС ОСАОСАОССС СТАЛ

ТСТОАААСТО ОААССОСАОТ

ТСОТООСАСС САТАОСССОО

ТСССАСССАТ АСССАССССА

ТАССТОТСАО АССООТСАОА

АТООСТООТТ СТОСАОАССС

ТТОССАСАОС ТООАААОАТА

СААААААТТС АОССОТАОСО

СООСОАТТАТ САТТОТАССО

САТТАССОТТ САООСОССОА

- 7 030087

8Ε^ ΙΌ № 3 (человеческий ЕеуКДВ)

МОТРААРРКА νΐ.ΚΙΑΡΟΑΊΧ VIVII2Г ΟΚΟΤΗδΡΕδϋ δ^λΥΡΗΝΟΝΙ. ΙΡΤΗΤΟΡδΥΚ

ΡΚΑΝΝΝϋδΟΕ ΥΤί’ΟΤίίΟΤδΕ δΙ.)Ρ\ΊΙΙ.Τ\Ί,δ ΕΑΊΑΕςΠΡΙΙΕ Ρΐς)ΡίίΕΊΊ\Ί. ΚΟΗδλΥΚΌΚΡΓ

νκνΤΡΡΟΝΟΚ δΚΚΡδΚδϋΡΝ ΡδΙΡΟΑΝΗδΗ δΟϋΥΗΟΤΟΝΙ ΟΥΤΕΥδδΚΡν ΤΙΤνΟΑΡδδδ

Ρ

8Ε^ ΙΌ № 4 (человеческий ЕеуКДБ, кДНК)

1 а1§£§§асас с1§са§с1сс сссаа১с! §1§с1§ааас 1с§а§сссса §1§§а1саас

61 §1§с1сс১ ১ас!с1§1 §ас!с!§аса 1§сс§§§§§а с!саса§ссс 1§а§а§с§ас

1211ссайса§1 §§11ссасаа 1§§§аа1с1с айсссассс асас§са§сс са§с!ас১

18111са১сса асаасаа!§а са§с§§§§а§ 1асас§1§сс а§ас!§§сса §асса§сс!с

241 а§с§ассс!§ 1§са1с1§ас 1§1§сШс1 §а§1§§с1§§ 1§с1сса§ас ссс!сасс1§

301 §а§Исс১ ১§а§ааас са!с§1§с1§ ১1§ссаса §с!§§а১а саа§сс!с!§

361 §1са১1са саПсПсса §аа!§§аааа 1ссаа§ааа1 Юссс§Пс §§а!сссаас

421 Ис1сса1сс сасаадсааа ссаса§1сас а§1§§1§а!1 ассас1§сас ১аааса1а

481 £§с1асас£с 1§1ас1са1с саа§сс!§1§ асса!сас!§ 1ссаа§с1сс са§с!с11са

541 сс§

8Ε^ ΙΌ № 5 (человеческий ЕеуКДА)

МОТРААРРКА νΕΚΕΕΡΡλΥΙΝ VI/)14)8411.4 ίφΟΛΕδΡΕδΙ) δΙΟΑΕΙΙΧΟΧΙ. ΙΡΤΙΠ/ΡδΥΚ

ΡΚΑΝΝΝϋδΟΕ ΥΤίφΤΟΟΊδΙ. 81)Р\Н1.Т\4Х РАЧАЕрТРНЕ ΕΡΟΕΟΕΤΙΜΡ ΚΟΗδλΥΚΟΚΡΡ

УКУТРРОХОК δΟΚΡδΗΡΒΡΤ Ε5ΙΡΟΛΧΗ5Η δϋΒΥΗΟΤΟΝΙ ОУТЬР88КРУ ΤΙΤνΟνΡδΜΟ

δδδΡ

8Ε^ ΙΌ № 6 (человеческий ЕеуКДА, кДНК)

1 а!§§§§асас с!§са§с!сс сссаа১с! §1§с1§ааас 11§а§ссссс §1§§а1саас

61 §1§с1сс১ ১ас!с1§1 §ас!с!§аса 1§сс১§§§ с!с§са§ссс 1§а§а§с§ас

1211сса11са§1 §§11ссасаа 1§§§аа1с1с аПсссассс асас§са§сс са§с!ас১

18111саа§£сса асаасаа!§а са§с£§§§а§ 1асас£1§сс а§ас1££сса §асса§сс!с

241 а£с§ассс1§ 1§са1с1§ас 1£1§сШсс §аа!§§с!§§ 1§с1сса§ас ссс1сасс!§

301 §а§Исс১ ১§а§ааас са!са!§с1§ ১1§ссаса §с!§§а১а саа§сс!с1§

361 §1са১1са саИсйсса §аа!§§аааа 1ссса§ааа11с1сссаШ §§а!сссасс

42111с1сса1сс сасаа§сааа ссаса§1сас а§1д§1§а!1 ассас!§сас ১аааса!а

481 ££с1асас§с 1§Ис1са1с саа§сс1§1£ асса1сас!§ 1ссаа§1§сс са§са1££§с

541 а£с1с11сас саа!

- 8 030087

δΕρ ΙΌ № 7 (человеческий ЕсуКШЛ)

МОЬРКАУУРЬ ЕР(фАУРУЕЕК ОЗУТЬКСрОА ΥδΡΕϋΝδΤΟλΥΕ ΗΝΕδΠδδΟΑ δδΥΕΙϋΑΑΤν

ΟΟδΟΕΥΚΟΟ ΤΧΙ.δΊΊ.δΟΡν ОЕНУШСАЧ.Е ЕОЛРРАУЕКЕЕ ОР1ПЕРСП8А КЖАЬНКУТУ

ΕΟΝΟΚΟΚΚΥ ΕΗΗΝδϋΕΥΙΡ ΚΑΊΈΚϋδϋδΥ ΙΕΚϋΕΥϋδΚΝν δδΕΤΥΝΙΤΙΤ ΟΟΕδνδΤΙδδ

Ε

δΕρ ΙΌ № 8 (человеческий ЕсуКШЛ, кДНК)

1 а1§§а!с!сссаа ১с!§1§§1 §Псс1§§а§ сс!саа1§§1 ас১§1§с! с§а§а১ас

61 а§1§1§ас!с 1§аа§1§сса §§§а§сс!ас 1сссс1§а§§ асааКссас аса§1§§111

121 сасаа!§а§а §сс!са1с1с аа§сса§^сс 1с§а§с1ас11сай§ас§с 1§ссаса§11

181 §ас§аса§1§ §а§а§1аса§ §1§сса§аса аасс1с!сса ссс1са§1§а ссс§§1§са§

241 с!а§аа§1сс а!а!с§§с1§ §с!§11§с1с с১сссс!с ββί§§§1§11 са১১аа

301 §ассс1айс асс!§а§§1§ 1саса§с1§§ аа§аасас!§ с!с1§са!аа §§1саса1а1

361 Иаса§аа1§ §саа১са§ §аа§1аШ1 са!са1аа11 с1§ас11с1а саИссаааа

421 §ссасас!са аа§аса§с§§ с1сс1асйс 1§с১§§§с 11§11§§§а§ 1ааааа1§1§

481 1сйса§а§а с1§1§ааса1 сасса!сас1 са১111§1 са§1§1саас са1с1са!са

541 11с

δΕρ ΙΌ № 9 (человеческий ЕсуКШВ)

МОРРКЛУУРРЕ ΙφΑΥδνΐ.ΕΚΙ) ЗУТРКСрСЛУ δΡΕϋΝδΤ(/\¥Ρ ΗΝΕΝΕΙδδΟΑ δδΥΕΙϋΑΑΤν

ΝϋδΟΕΥΚΟΟΤ \ΡΥΠΧΙ)Ρ\\) Ι.ΕνίΙΚίΑΙ.Ι.Ι. ΡΑΡΚΑΥΡΚΕΕ □ΡΙΙΙΙ.Κί'ΠδΑ ΚΝΤΑΕΗΚνΤΥ

ΡρΥΟΚΠΚΚΥΡ ΗΗΝδϋΕΗΙΡΚ ΛΠ.ΚΠδΟδΥΡ ΕΚΟΙ.νΟδΚΧν δδΕΤνΝΙΤΙΤ ΑΚ'π.Ανδίΐδδ

Ε

δΕρ ΙΌ № 10 (человеческий ЕсуКШВ, кДНК)

1 а1§§а1с1сс саа১с!§1 §§1§Псс1§ §а§сс!саа1 §§1аса§с§1 §с!1§а§аа§

61 §аса§1§1§а с1с!§аа§1§ сс১§а§сс 1ас1сссс1§ ১асаа!1с сасаса§1§§

121 Шсасаа1§ а§аасс!са! с!саа§сса§ §сс1с§а§с! асиса11§а с§с1§ссаса

181 §1саас§аса §1§§а§а§1а с১1§сса§ асааасс!с! ссассс!са§ 1§ассс§§1§

241 са§с!а§аа§ 1сса1а1с§§ с!§§с1§11§ с!сс১ссс с!с§§1§§§1 §11са১а§

301 §аа§ассс!а Исасс1§а§ §1§1саса§с 1§§аа§ааса с!§с1с!§са 1а১1саса

3611а'41аса§а а!§§сааа§а с১аа§1а! И1са1са1а аисщаси ссасаисса

421 ааа§ссасас 1сааа§а1а§ с§§с!сс!ас Ис1§с১§ §а§1ааааа!

481 §1§1с11са§ а§ас!§1§аа са!сасса1с ас!саа§§П 1§§са§1§1с аассаОДса

5411са11с

- 9 030087

Несмотря на то, что варианты осуществления по настоящему изобретению относятся к человеческим РсК, их также можно применять к РсК других млекопитающих, особенно к рецепторам мышей или приматов, таких как обезьяны.

"Поверхность, содержащая человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ", в некоторых вариантах осуществления представляет собой или включает в себя клетку или линию клеток, предпочтительно клетку млекопитающего или линию клеток млекопитающего, экспрессирующую один или несколько человеческих Рс-гамма-рецепторов ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ. Эти клетки в некоторых вариантах осуществления экспрессируют человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ или ΙΙΙΒ без какого-либо другого человеческого Рс-гамма-рецептора, т. е. эти клетки/линии клеток экспрессируют только один РсК. Особенно предпочтительно, чтобы указанная поверхность, содержащая человеческий Рс-гаммарецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, содержала фактически или даже исключительно человеческий РсКПЕ. В следующем предпочтительном варианте осуществления подтип человеческого Рс-гамма-рецептора, содержащегося на указанной поверхности, а также подтип человеческого Рс-гамма-рецептора, содержащегося в указанной композиции растворимого человеческого Рс-гамма-рецептора, являются идентичными. При тестировании РсКИЕ клетки предпочтительно экспрессируют только РсКПЕ, например, линия лимфобластоидных клеток Кар (ССЬ-86, АТСС). Для РсКIIΑ можно применять линию эритролейкозных клеток К562 (ССЬ-243, АТСС), а для РсКIIIΑ - линию клеток ΝΚΡ (КоЪейкоп е! а1., Ехр. Наета!о1. 1996, 24(3):406-15). С другой стороны, можно применять клетки СНО, трансфицированные РсК. Способы трансфекции клеток СНО для экспрессии представляющего интерес белка хорошо известны из уровня техники, такой способ описан, например, в Βπιΐιηδ е! а1., Βίοοά 2009, 113:3716-3725.

Также предусмотрено, что "поверхность, содержащая человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ", представляет собой или включает в себя твердую поверхность, на которую можно нанести в виде покрытия человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ. "Твердая поверхность", таким образом, включает либо материал в виде частиц (сфер), которые, например, могут притягиваться под действием магнитного поля, либо плоскую поверхность, такую как планшет ЕЫ8Л или чувствительный элемент Βΐαοοκ. Материал указанной поверхности может представлять собой любой подходящий твердый материал, такой как пластик, полимеры, металл, стекло и т. д., который можно использовать в соответствующих способах. Нанесение покрытия белков, подобных человеческому Рс-гамма-рецептору ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, на твердую поверхность (например, плоскую поверхность или поверхность частиц) проводят с помощью стандартных способов, которые хорошо известны специалисту. Нанесение покрытия на твердую поверхность можно проводить "человеческими ΕΓΒΙΙΒ. РсКIIIΑ или

ΕοΚΙΙΙΒ" и/или с "растворимыми человеческими РсЫ^, РсЫШ, ΕοΚΙΠΑ или РсКИИ" по настоящему изобретению, поскольку нет необходимости в биологической экспрессии на клеточной поверхности (для чего может быть необходим мембранный якорь).

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение основано на применении агрегированного человеческого ΙβΟ в способе ίη νίίτο для определения активности связывания у растворимых человеческих Рс-гамма-рецепторов. Первый этап способа по настоящему изобретению включает приведение в контакт клетки млекопитающего из линии клеток, экспрессирующей только один из человеческих Рс-гамма-рецепторов ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ или ΙΙΙΒ (предпочтительно без какого-либо другого Рсрецептора), с заданным количеством агрегированного человеческого ЦС и заданным количеством соответствующего растворимого человеческого Рс-гамма-рецептора ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ или ШВ. Предпочтительно, чтобы клетки млекопитающих, выбранные для первого этапа способа, экспрессировали только представляющий интерес Рс-гамма-рецептор и, по возможности, никакие другие Рс-гамма-рецепторы, поскольку наличие дополнительных рецепторов, которые связываются с ЦС, может препятствовать активности тестируемого растворимого РсК.

"Определение количества агрегированного человеческого ЦС, которое связано с указанной поверхностью" относится к измерению или определению количества агрегированного человеческого ЦС, связанного с поверхностью, т. е. то, что предпочтительно измеряют в контексте настоящего изобретения, представляет собой количество агрегированного человеческого ЦС, которое связано с поверхностью, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ. Указанный связанный агрегированный человеческий ЦС, например, детектируют посредством опосредованной метки (например, антитела к домену связывания человеческого IдС) или посредством прямой метки (т. е. агрегированный человеческий ЦС метят напрямую - объяснено в других разделах данного документа). Например, низкий уровень меченного вторичного антитела, связавшегося с агрегированным человеческим Ι§Ο, указывает на высокий уровень связывания растворимого РсК с агрегированным человеческим Ι§Ο, и наоборот.

Альтернативно или дополнительно можно также проанализировать, измерить или определить количество агрегированного человеческого Ι^Ο, который был удален при отмывке (до этапа (с) способов по настоящему изобретению) -указанный агрегированный человеческий ЦС связан с представляющим интерес растворимым РсК (который содержался в композиции) и вымывается вместе с ним.

"Этап приведения в контакт" способов по настоящему изобретению включает приведение поверхности, рецептора и агрегированного человеческого ЦС в физический контакт друг с другом так, чтобы они могли связаться друг с другом. Данный этап может включать этап инкубации с тем, чтобы у реаген- 10 030087

тов было время прореагировать.

Термин "заданное количество" просто указывает на то, что количество соответствующих реагентов должно быть фиксированным с тем, чтобы результаты можно было оценить или даже определить количественно. Например, и как можно увидеть из приведенных ниже примеров, стандартное количество агрегированного человеческого 1§О использовали с серийным разведением растворимого рецептора так, чтобы можно было определить количество, при котором растворимый рецептор ингибирует связывание агрегированного человеческого 1§О с поверхностью.

Этап отмывки в способе по настоящему изобретению включает удаление несвязавшегося агрегированного человеческого 1§О и несвязавшегося растворимого человеческого РсК путем "промывки" перед этапом (с). Следует отметить, что данный этап относится к удалению реагентов, которые не связаны с поверхностью, применяемой в данном способе. Этап промывки можно осуществлять с помощью любого стандартного буфера, такого как буфер для РАС8, применяемый в приведенных ниже примерах.

В случае применения серийного разведения растворимого РсК по настоящему изобретению "детектирование" метки делает возможным определение 1С₅₀ растворимого РсК. "Полумаксимальная ингибирующая концентрация (1С₅₀)" представляет собой показатель эффективности соединения в ингибировании биологической или биохимической функции. Данный количественный показатель указывает как много конкретного лекарственного вещества или другого вещества необходимо для ингибирования заданного биологического процесса наполовину. Другими словами, - это полумаксимальная (50%) ингибирующая концентрация (1С) вещества (50% 1С или 1С₅₀). Ее обычно применяют в качестве показателя антагонистической активности лекарственного средства в фармакологическом исследовании. Согласно РЭА. 1С₅₀ представляет собой концентрацию лекарственного средства, которая необходима для 50% ингибирования ίη νίΐτο. Таким образом, в настоящем контексте количество агрегированного 1§О, связавшегося с клетками млекопитающих, по сравнению с количеством агрегированного 1§О, применяемого в способе, делает возможным определение количества РсК, необходимого для ингибирования 50% связывания агрегированного 1§О с клеткой. Аналогично можно измерить 1С₉₅, которая является количеством, необходимым для ингибирования 95% связывания 1§О с клетками. Специалист в данной области может применять любую другую методику оценки для указанных данных, например, четырех-параметрический логистический способ (4РЬ) согласно Европейской фармакопее 5.0; 2005; глава 5.3 ("Статистический анализ результатов биологических анализов и тестов").

В особенно предпочтительном варианте осуществления способа ίη νίΐτο по настоящему изобретению растворимый человеческий рецептор представляет собой РсКПВ (8ЕО ГО №: 3), еще предпочтительнее - 8М101 (8ЕО ГО №: 1), клетки представляют собой клетки КаД, агрегированный человеческий 1дС выделен из препарата человеческого 1§О, например ВепдкЪш®, а вторичное антитело имеет флуоресцентную метку, способную возбуждаться под действием лазерного луча и испускающую свет с заданной длиной волны, которую можно детектировать посредством РАС8-устройства.

Настоящее изобретение также относится к набору, включающему поверхность по настоящему изобретению и/или агрегированный человеческий 1§О по настоящему изобретению. Указанный набор может дополнительно включать средства, которые необходимы для осуществления способов по настоящему изобретению (например, метку, буферы, эталонные значения, контроли, стандарты и т. д.).

Настоящее изобретение также относится к агрегированному человеческому 1§О, который раскрыт в данном документе.

В описанных ниже экспериментах с помощью способа ίη νίΐτο по настоящему изобретению было обнаружено, что 8М101 (растворимый человеческий РсКПВ, 8ЕО ГО №: 1) конкурирует со связанным с клеткой РсКПВ на клетках КаД за связывание с агрегированным 1§О и что повышение концентраций 8М101, добавляемого к постоянным количествам клеток, и агрегированного ВепДоЬт приводит к прогрессивному ингибированию связывания агрегированного 1§О со связанным с мембраной РсКПВ. Этот тест предусматривает определение возможных дозировок 8М101, необходимых для медицинских или диагностических применений. Способ также можно применять при контроле качества 8М101 для того, чтобы убедиться, что различные серии имеют постоянную активность связывания. Аналогично, способ можно применять для любого другого растворимого РсК с целью определения возможных дозировок и в качестве контроля качества для того, чтобы убедиться, что различные серии растворимого РсК имеют одинаковую активность связывания. Таким образом, способ ίη νίΐτο по настоящему изобретению обеспечивает новый тест для активности связывания растворимых РсК на основе полученных данных о том, что агрегированный 1§О можно применять для имитации иммунных комплексов 1§О ίη νίΐτο.

В частности, в приведенном ниже примере 1, способ ίη-νίΐτο по настоящему изобретению, также называемый "Клеточный анализ активности 8М101", предусматривает определение биологической функции/активности 8М101. Применение установленной линии человеческих В-клеток КаД и поликлональных агрегированных человеческих 1§О (ВепдкЪш, агрегированная фракция) представляет собой отличную модель для анализа активности 8М101 посредством клеточного анализа. В примерах 8М101 продемонстрировал ингибирование связывания агрегированных человеческих 1§О со связанным с мембраной РсКПВ на клетках КаД в нескольких раздельных РАС8-экспериментах. Для определения значений 1С₅₀ для 8М101 применяли серийное разведение 8М101. В приведенном ниже примере 1 применяли серийное

- 11 030087

разведение с конечными концентрациями 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01565, 0,0078, 0,0039, 0,00195 мкг/мкл, хотя также можно было применять серии 1,3664, 0,80, 0,40, 0,20, 0,10, 0,06, 0,036, 0,0216, 0,01296, 0,00648, 0,003888, 0,001944 мкг/мкл или любые другие серийные разведения, которые предусматривают линейный график в представляющей интерес области, хотя можно применять также и другие серии концентраций. Измеренная кажущаяся К_с, 0,98х10^-6 М является сравнимой с показателем 1,4х10^-6 М, встречающимся в литературе, полученным с помощью (гликозилированного) растворимого РсКПВ, полученного из клеток насекомых (δοη^πηηηη еί а1., ВюсНетМгу 1999, 38(26):8469-77), или 1,67х10^-6 М, полученным с помощью рекомбинантного кРсКИВ из Εχο1ί (Μаеηака еί а1., ί Вю1 СНет. 2001, 276(48):44898-904). Рассчитанная !С₅₀ δΜ101, 17,7 мкг/мл (пример 1), согласуется со значениями ГС50, определенными в других анализах.

В примере 1.6 авторы настоящего изобретения смогли показать, что биологическая активность исследуемого препарата δΜ101 сравнима с таковой у эталонного стандарта. В частности, что касается заявляемого способа

определения активности связывания, в примере 1 приведен подробный протокол для растворимого человеческого РсКПВ с применением клеток Кар. Специалисту будут хорошо известны корректировки, необходимые для адаптации данного способа для других рецепторов и типов клеток. Иллюстративный протокол, применяемый в примере 1, повторен ниже, однако специалисту хорошо известны возможные варианты данного протокола.

1. Определить концентрацию клеток в культуре клеток Ка_ц.

2. Собрать клетки Ка_р с помощью центрифугирования.

3. Приготовить серии концентраций Рс-гамма-рецептора (например, δΜ101) в луночном планшете.

4. Приготовить буфер для агрегированного ВепдкЪш = "агр. Веп-Μίχ".

5. Ресуспендировать клетки Кар из этапа 2 в "агр. Веп-Μίχ" из этапа 4.

6. Добавить суспензию клеток Вар в каждую лунку, содержащую серию концентрации Рс-гаммарецептора (например, δΜ101).

7. Инкубировать на льду.

8. Добавить "РΑСδ-буфер" в каждую лунку и центрифугировать.

9. Отбросить надосадочную жидкость.

10. Добавить в каждую лунку смесь вторичного антитела.

11. Добавить "РΑСδ-буфер" и центрифугировать.

12. Отбросить надосадочную жидкость.

13. Добавить "РΑСδ-буфер", перенести образец в полистироловые пробирки и анализировать на РΑСδ.

В примере 2 приведен конкретный способ выделения агрегированного !дС из ВепдкЪт. Опять же, в этом случае специалисту будут хорошо известны возможные варианты данного способа, которые могут привести к подобному результату. В частности, способ получения раскрываемого в данном документе агрегированного !дС можно обобщить следующими этапами:

1. Довести ВепдкЪт® 160 мг/мл до 100 мг/мл с помощью ΡΒδ-N.

2. Отделить с помощью препаративной δΕС (эксклюзионной хроматографии) с применением колонки, которая может отделять агрегированный !дС от мономерного или димерного ^С, например, колонки: δире^беx 200 10/300 СЬ, подвижная фаза: 5 мМ Ηίδ, 150 мМ №-1С1 рН 6,5, 0,01% (вес./об.) №N3, поток 0,5 мл/мин при комнатной температуре, инъекция: 100 мкл с 0,4 г/л (см. фиг. 12).

3. Определить содержание белка для фракции агрегированного !дС.

4. Необязательный: если содержание <0,50 мг/мл - концентрировать путем ультрафильтрации, или если содержание >1,40 мг/мл - развести при помощи ΡΒδ-N (фосфатно-солевого буферного раствора с 0,02% азида натрия).

5. Довести до 20% (об./об.) глицерина.

6. Распределить аликвотами по 0,5 мл и подвергнуть мгновенной заморозке в жидком азоте.

Вышеупомянутый способ выделения агрегированного !дС также применим к любому другому препарату человеческого ^С, который, например, доступен в данной области или описан в данном документе.

В примере 3 тестировали содержание и чистоту агрегированного ^С, выделенного согласно примеру 2. Таким образом, примеры 2 и 3 предоставляют специалисту конкретное руководство по применению агрегированного !дС в способе по настоящему изобретению. В частности, с помощью δΕС (эксклюзионной хроматографии) на скорости 1 мл/мин с применением ΡΒδ-N (фосфатно-солевого буферного раствора с 0,02% азида натрия) в качестве буфера было обнаружено, что агрегированный !дС элюируется после примерно 115 мл в случае применения δире^беx 200, НАпаН 26/60, СЕ НеаННсаге, с использованием Ак1а Ехркгег 10 РРЬС или любого другого подходящего устройства для РРЬС. Затем измеряли содержание белка элюата согласно этапу 1 примера 3 и по необходимости доводили значение между 0,30 и 1,4 мг/мл, предпочтительно между 0,50 и 1,35 мг/мл, еще более предпочтительно между. После этого измеряли степень чистоты агрегированного !дС согласно способу из примера 2 этапа 2, и удостоверялись, что относи- 12 030087

тельная площадь пика агрегированного/олигомерного 1д0 составляла по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%.

Робастность способа по настоящему изобретению дополнительно исследовали в предвалидационных экспериментах (примеры 4-10), тестировании в отношении влияния на качество применяемого агрегированного 1дС. эффекта различных количеств мономерного 1д0 в тестируемом образце, стабильности экспрессии связанного с мембраной РсКНВ на культивируемых или только что оттаявших клетках Ка_|1, эффекта блокировки связанного с мембраной РсКНВ на Кар с помощью моноклонального антитела и в отношении стабильности фоновой окраски применяемого антитела к человеческому вторичному антителу на клетках Кар. Меж- и внутрианалитическую стабильность оценивали путем сравнения полученных средних значений кажущейся К_с и 1С₅₀ с п=25 экспериментов. Таким образом, можно сделать заключение, что способ ίη-νίΐτο по настоящему изобретению (клеточный анализ активности) является подходящим инструментом для оценки активности новых серий 8М101 относительно эталонного стандарта.

Вышеупомянутые результаты исследований и конкретные способы и протоколы, описанные в примерах, также можно применять к РсК11А, РсКША или РсШВ в комбинации с подходящими клетками, такими как линия человеческих эритролейкозных клеток К562 для РсКПА или человеческих ΝΚΡ клеток для РсКША. Как альтернатива, клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) можно было бы трансфицировать при помощи представляющего интерес РсК и применять в способе ίη-νίΐτο по настоящему изобретению. Что касается способов получения агрегированного 1д0 из примера 2 и контролен из примера 3, то эти способы в равной степени можно будет применять к другим продуктам препарата человеческого 1§0, присутствующим на рынке, таким как Уагйес! или УепЫд, которые можно будет применять вместо Вепд1оЬйт

Во всем тексте данного описания упомянуты несколько документов. Каждый из документов, упомянутых в данном документе (в том числе все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т. д.), неважно выше или ниже, включены в данное описание посредством ссылки в их полном объеме. В данном документе ничего не следует истолковывать как признание того, что настоящее изобретение не может быть противопоставлено такому раскрытию в качестве предшествующего уровня техники.

Следует отметить, что используемые в данном документе формы единственного числа предусматривают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на "реагент" включает один или несколько таких реагентов, а ссылка на "способ" включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные специалисту в данной области, которые могут быть модифицированы или замещены способами, описанными в данном документе.

Если не указано иное, выражение "по меньшей мере", предшествующее ряду элементов, следует понимать как ссылку на каждый элемент в данных рядах. Специалисты в данной области техники признают или способны установить с помощью не более, чем обычных экспериментов многие эквиваленты для конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в данном документе. Подобные эквиваленты подразумеваются как охватываемые настоящим изобретением.

Во всем данном описании и следующей за ним формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово "содержать" и такие варианты, как "содержит" и "содержащий", следует понимать как подразумевающие включение указанного целого числа или этапа, либо группы целых чисел или этапов, но не исключение какого-либо другого целого числа или этапа, либо группы целых чисел или этапов. В контексте данного описания выражение "включающий" можно заменять выражением "содержащий" или иногда, в контексте данного описания, выражением "имеющий".

В контексте данного описания "состоящий из" исключает какой-либо элемент, этап или ингредиент, не указанный в элементе пункта формулы изобретения. В контексте данного описания "фактически состоящий из" не исключает материалы или этапы, которые существенно не влияют на основные и новые признаки пункта формулы изобретения.

Описываемый в данном документе "предпочтительный вариант осуществления" означает "предпочтительный вариант осуществления по настоящему изобретению". Аналогично, описываемые в настоящем документе "различные варианты осуществления" и "другой вариант осуществления" означают, соответственно, "различные варианты осуществления по настоящему изобретению" и "другой вариант осуществления по настоящему изобретению".

Фигуры

На фигурах показано:

фиг. 1 - стратегия гейтирования для РАС8-анализа, на которой показаны 88С-А/Р8С-А для 1х10⁵ клеток Кар. 01 включает жизнеспособные клетки (94,9% от общего числа клеток). Жизнеспособные клетки проанализированы на связывание вторичного антитела ( айи 1дО(Н+й)-РЕ) со связанным с мембраной агрегированным человеческим 1д0 (агр. Вет1§1оЫп) в отсутствие 8М101. Точечная диаграмма включена лишь для иллюстрации распределения генеральной совокупности, участок гистограммы на крайней справа стороне показывает клетки Кар со связанным человеческим агрегированным 1д0 (агр. Вет1§1оЫп).

- 13 030087

Фиг. 2 - наложение гистограмм образцов, инкубированных с различными концентрациями 8М101 (растворимого человеческого РсКНВ) (наиболее низкая концентрация 0 мкг/мкл, диапазон концентраций образцов 0,0078-0,5 мкг/мкл). Сдвиг соответствующих гистограмм с наложением в направлении отрицательного контроля (окрашивание только вторичным антителом (= зек ΑΚ, заштриховано красным) указывает на ингибирование связывания человеческих агрегированных Ι§Ο (агр. Вепд1оЬт) с клетками. Срединное значение РЕ-А флуоресценции образцов показано справа.

Фиг. 3 - наложение гистограмм контрольного эксперимента с применением куриного сывороточного альбумина (С8Л) в различных концентрациях вместо 8М101 (наиболее низкая концентрация 0 мкг/мкл, диапазон концентраций образцов 0,0078-0,5 мкг/мкл). Отрицательный контроль (δΜ101_8екЛΚ.ίе8; окрашивание клеток только вторичным антителом заштриховано красным).

Фиг. 4 - нормализованные измеренные срединные значения из таблицы 1 примера 1 были согласованы с уравнением Ленгмюра.

Фиг. 5 - данные, согласованные с сигмоидальной логистической функцией, демонстрирующие % ингибирования относительно концентрации по массе 8М101 (мкг/мкл) с применением данных из РΑСδэксперимента 7 (РΑСδ007).

Фиг. 6 - диаграмма Ленгмюра данных, согласованных с нормализованными измеренными срединными значениями эталонного стандарта 8М101 и 8М101 ΙΜΡ, которые рассчитаны в табл. 3 (данные из РΑСδ021).

Фиг. 7 - очистка агрегированного ΙβΟ с помощью препаративной §ЕС. Показаны оптическая плотность элюата на 280 (верхняя кривая), 260 нм (нижняя кривая) и проводимость (линейная кривая). Объединенные фракции агрегированного человеческого ΙβΟ заштрихованы серым.

Фиг. 8 - аналитическая §ЕС различных фракций агрегированного человеческого ΙβΟ. Показаны хроматограммы после холостой инъекции буфера (нижняя кривая, линейная), инъекции 50 мкг мономерного ΙβΟ из Вепд1оЬт® (кривая с самым высоким пиком), соответствующей пику на характеристической функции на примерно 180 мл препаративной §ЕС-хроматографии, инъекции 50 мкг димерного ΙβΟ из Вепд1оЬт® (кривая с самым низким пиком), соответствующей пику на характеристической функции на примерно 145 мл препаративной §ЕС-хроматографии, инъекции 24 мкг агрегированного/олигомерного Ι§Ο из серии 27/10/10 (ниже наложения первого пика) и инъекции 24 мкг агрегированного/олигомерного Ι§Ο из серии 15/07/11 (выше наложения первого пика). Приведены полная хроматограмма (а) и увеличенный сегмент (Ъ).

Фиг. 9а/Ъ - иллюстративное интегрирование хроматограмм аналитической §ЕС-хроматографии из серии 27/10/10 (а) и серии 15/07/11 (Ъ) агрегированного человеческого ΙβΟ.

Фиг. 10 - результаты РΑСδ-анализов различных количеств и разных серий (Вей 1, Вей 2 или Вей 3) агрегированного человеческого ΙβΟ, связавшегося с жизнеспособными клетками Ка_р.

Фиг. 11 - (а) рН-зависимость связывания агрегированного ΙβΟ с клетками Кар (срединное значение МП); (Ъ) срединное значение ΜРI рН-зависимости. График, на котором показано срединное значение ΜРI образца - срединное значение МП вторичного антитела (контроль).

Фиг. 12 - выделение агрегированного ΙβΟ из двух доступных препаратов объединенного ΙβΟ (Вепд1оЪш, серия № 268403 ΙΙΑ и §иЪсиу1а, серия №ΒУNΟ1Μ032Α), колонка: 8ирегйех 200 10/300 ΟΚ; подвижная фаза: 5 мМ Ηίδ, 150 мМ ЫаС1 рН 6,5, 0,01% (вес/объем) ΝαΝ₃; поток: 0,5 мл/мин, при комнатной температуре; инъекция: 100 мкл с 0,4 г/л.

Примеры

Приведенные далее примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Данные примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Данные примеры включены с целью иллюстрации, а настоящее изобретение ограничено только формулой изобретения. В примерах (и в описании) применяются следующие сокращения:

д - гравитационное ускорение Земли,

С - высокоэффективная жидкостная хроматография,

ΜVСО - граница отсечки по молекулярному весу задерживаемых компонентов в кДа,

РВЗ-Ν - фосфатно-солевой буферный раствор с 0,02% азида натрия, об/мин - оборотов в минуту,

§ЕС - эксклюзионная хроматография,

Р8С - передний разлет,

88С - боковой разлет,

Ι§Ο - иммуноглобулин Ο,

РЕ - фикоэритрин,

РΑСδ - клеточная сортировка с активацией флуоресценции,

Э8М2 - ОеШзске §атш1цид уои М1кгоогдаи18теи ций 2е11ки11игеи, ευδΑ - твердофазный иммуноферментный анализ,

ГМР - исследуемый лекарственный препарат,

Αυ - единицы оптической плотности.

- 14 030087

Пример 1 1.1. Краткое описание эксперимента.

В данном примере способ ίη νίίτο по настоящему изобретению (также называемый РАС8-анализ активности) применяли для определения активности связывания 8М101 (растворимых человеческих РсуКПВ, δΡογΚΙΙΒ).

В частности, человеческие клетки клеточной линии Кар (Ό8ΜΖ №АСС319, человеческие клетки лимфомы Беркитта), экспрессирующие РсγКΠΒ, инкубировали с постоянным количеством агрегированного лиганда (человеческого 1дС) и различными количествами 8М101 (т. е. 8РсγКΠΒ 8ЕО ГО №: 1). 8М101 конкурирует со связанным с клетками белком РсγКIIΒ, представляющим собой единственный ЦдО-связывающий) Ρсγ-рецептор, экспрессирующийся на Кар.

Агрегированный 1§С, связываемый клетками, экспрессирующими Рс γΚΙΙΒ, можно детектировать посредством поликлонального вторичного антитела с флуоресцентной меткой, которое распознает как тяжелую, так и легкую цепь человеческого 1дС с последующим РАС8-анализом клеток. Повышение концентраций 8М101, добавляемого к постоянным количествам клеток и агрегированных 1§С, приводило к прогрессивному ингибированию связывания 1§С со связанным с мембраной РсγКΠΒ. Параллельные контрольные образцы с неокрашенными клетками, а также клетками, инкубированными исключительно со вторичным антителом, применяли для определения как автофлуоресценции использованных клеток, так и неспецифического связывания вторичного антитела.

РАС8-анализ осуществляли путем регистрации 1х10⁴ жизнеспособных клеток на устройстве РАС8СаШо-ΙΙ, ВеСоп, Июкшзоп & Сотрапу (ΒΌ) с применением программного обеспечения ΒΌ РАС8ГОКа зойуаге. Данные оценивали с помощью программного обеспечения Р1о\\1о 8оП\уаге (ТгеезШг Шс. О1ДО8А).

1.2. Материалы.

планшеты: И-образные 96-луночные (СейзШг, № 650180);

пробирки: 15 мл пробирки типа Ра1соп; 5 мл полистироловые 12х 75 мм (ΒΌ, № 352054); пипетки: стерильные, снабженные фильтром 10 мл, 5 мл (ТРР № 94010, 94005), градуированные наконечники с фильтром 1-200 мкл, 101-1000 мкл ^агЬаЪ, № 81120-8810 и 81126-7810); клейкая лента для микропланшета (83 мм, 66 м, Регтасе1, № 25082);

8М101 (8РсγКIIΒ), эталонный стандарт: 8,2 мг/мл, 416 мкМ, хранящийся при -80°С;

РАС8-буфер: ΗΒ88 (С&со, № 14175) + 5% РС8 (СНЪсо, № 10270-106); + 0,01% (вес/объем) азида

натрия (Мегск);

среда для культивирования клеток: ТМ-среда: КРΜI (ОШсо, № 31570) + 1% МЕМ ΝΕΛ (ОШсо, №

11140) + 1% пируват натрия (ОШсо, № 11360) + 2 мМ ОШаМАХП (200 мМ стоковый раствор, С|Ъсо, № 35050-061) + 10% РС8 (ОШсо, №10270-106);

ΙβΟ (агрегированный Βе^^д1οЪ^η): Ι§Ο 0,96 мг/мл в ΡΒ8/0,02% (вес/объем) азида натрия с 20% (объем/объем) глицерина, хранили при -80°С. Выделенный с помощью эксклюзионной хроматографии на 8ирегйех-200 (16/60) или 8ирегйех 200 (10/300) ОЬ. Исходный материал: Βе^^д1οЪ^η® (ΖΡΒ ΒеЬ^^ηд СтЪН, номер партии 23840311В или номер партии 26840311А; ампула 5 мл) или 8иЪс^1а®, номер партии ΒVNО1Μ032А;

вторичное антитело: (РаЪ)₂ фрагмент антитела козы к человеческому Ι§Ο (Н+Ь), конъюгированного с К-фикоэритрином, (^^аηονа, кат. № 109-116-088).

1.3. Протокол.

1. Определить концентрацию клеток в клеточной культуре Кар с плотностью 0,2-1,0х10⁶ клеток/мл.

2. Собрать 1,2х10⁶ клеток Кар, центрифугировать 5 мин. при 477хд в 15 мл пробирке типа Ра1соп.

3. С этого момента все этапы необходимо проводить на льду или при 4°С.

4. Приготовить серию концентраций 8М101 в 96-луночном планшете (с И-образным дном), начиная с 1,0 мкг/мкл 8М101 и заканчивая 0,0039 мкг/мкл (разбавитель: "РАС8-буфер"), а также контрольные образцы (0 мкг/мкл 8М101, которые необходимо применять только для вторичного антитела) путем добавления 50 мкл ТМ-Мейшт в соответствующие контрольные лунки.

5. Приготовить 500 мкл агрегированного Βе^^д1οЪ^η 50 мкг/мл в РАС8-буфере (например, путем добавления 26,04 мкл стокового раствора 0,96 мкг/мкл к 473,96 мкл РАС8-буфера) = "агр. Βе^^-Μ^x".

6. Ресуспендировать 1,2х10⁶ клеток Кар из этапа 2 в 500 мкл "агр. Βе^^-Μ^x" из этапа 5 и тщательно перемешать (вортекс, 30 с, средняя скорость).

7. Добавить 50 мкл суспензии клеток Кар в каждую лунку, содержащую 50 мкл серии концентраций 8М101, и контрольные лунки (конечный объем =100 мкл).

8. Инкубировать в течение 30 мин на льду в темноте.

9. Добавить 150 мкл "РАС8-буфера" в каждую лунку, запечатать лунки с помощью клейкой ленты и центрифугировать в течение 5 мин при 513хд.

10. Приготовить 1 мл смеси 1/100 вторичного антитела в "РАС8-буфере".

11. Отбросить надосадочную жидкость и быстро встряхнуть планшет на вортексе с запечатанными лунками во избежание перекрестного загрязнения.

12. Добавить 50 мкл смеси вторичного антитела в каждую лунку, за исключением неокрашенного

- 15 030087

контроля.

13. Инкубировать в течение 30 мин на льду в темноте.

14. Добавить 150 мкл "РΑСδ-буфера" и центрифугировать в течение 10 мин. при 513хд.

15. Отбросить надосадочную жидкость и быстро встряхнуть планшет на вортексе, причем планшет должен быть герметично запечатанным.

16. Добавить 150 мкл "РΑСδ-буфера", перенести образец в 5 мл полистироловые пробирки и проанализировать на ΒΌ РΑСδ-Саηίο ΐΐ (с применением программного обеспечения ΒΌ 1Луа 8о1'1\уаге ν. 6.0).

1.4. Серии концентрации для 8М101 (конечные концентрации) 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01565, 0,0078, 0,0039, 0,00195 мкг/мкл.

Конечный Объем (ν _{конечны}й) =100 мкл.

1.5. Анализ Ι АСА - данных.

БАС8-данные регистрировали на ΒΙ) РΑСδ-Саηίο ΐΐ, данные хранили в файловом формате £с§. Для последующего анализа применяли программное обеспечение Ι·'1ο\ν-.Ιο 8о1'1\уаге (ν. 8.8.4). На фиг. 1 изображена типичная стратегия гейтирования.

Жизнеспособные клетки гейтировали и оценивали в отношении их флуоресценции фикоэритрина. Гистограммы образцов из серии концентраций 8М101 группировали при наложении гистограмм с помощью программного обеспечения Е1о\\До. Срединные значения флуоресценции рассчитывали с помощью данного программного обеспечения для каждого образца (фиг. 2). На фиг. 2 показано сильное зависящее от концентрации ингибирование связывания агрегированных ΐ§Ο со связанным с мембраной ΙΆΚΐΐΒ на клетках КаД. В параллельном эксперименте 8М101 заменяли идентичными количествами куриного сывороточного альбумина с применением таких же, как и вышеупомянутые серий концентраций для подтверждения специфического ингибирования под действием 8М101 (фиг. 3). Способ ΐπ νΐΐΐΌ по настоящему изобретению обеспечивает качественное клеточное средство для оценки активности связывания 8М101, что продемонстрировано с помощью демонстрационного эксперимента, результаты которого изображены на фиг. 2.

1.6. Расчет активности.

Для расчета активности 8М101 в данном клеточном анализе срединное значение интенсивности флуоресцентных сигналов нормализовали с помощью следующей формулы (нормализованные данные показаны в табл. 1):

Таблица 1. Нормализованные значения, рассчитанные для результатов РАСА-измерения, которые

применяли для последующего согласования в виде изотермы Ленгмюра, показаны на фиг. 2 % нормализованного сигнала = (сигнал^ мкг/мкл змюр - сигнал(_Х))/(сигнал(о мкг/мкл

5мю1) - сигнал (_втор. аь)) 5М101

Срединное значение

[мкг/мкл]	Конц-я [М]	нМ	Сигнал	норм. Сигнал
0	0,00Е+00	0,00Е+00	3877	0,00%
0,0078	3,90Е-07	3,90Е+02	3008	23,24%
0,0156	7,80Е-07	7,80Е+02	2270	42,97%
0,03125	1,56Е-06	1,56Е+03	1242	70,45%
0,0625	ЗДЗЕ-06	ЗДЗЕ+ОЗ	466	91,20%
0,125	6,25Е-06	6,25Е+03	329	94,87%
0,25	1,25Е-05	1,25Е+04	197	98,40%
0,5	2,50Е-05	2,50Е+04	238	97,30%
		втор. АЬ	137	100,00%

Последующее согласование данных с формулой изотермы связывания Ленгмюра % ингибирования = (с*макс. ингибирование)/(Ко + с)

с помощью функции 8оКег-аб0-т в Ехсе1 проводили для определения кажущейся К_о и максимального ингибирования и получали в результате кривую ингибирования, которая показана на фиг. 4. Кажущаяся К_о могла отличаться от реальной К_о, поскольку нельзя было учесть неизвестную клеточную поверхностную концентрацию ΡΦΚΐΐΒ на клетках КаД, а также концентрацию свободного 8М101. Для %

- 16 030087

ингибирования использовали % нормализованного сигнала, с = концентрация растворимого РсК (молярная концентрация или массовая концентрация). Формулу согласовывали для макс. ингибирования и К_о с помощью функции Зо1уег-абб-т в Ехсе1 или любой другой компьютерной программе, предусматривающей такой тип расчета.

С помощью стратегии согласования с применением РАСЗ-данных находили кажущуюся К_о, равную 0,99 х10^-6 М, с суммой квадратов остаточных погрешностей остатков, равной 0,0226 (табл. 2).

Таблица 2. Параметры, полученные для согласования данных от РАСЗ007 к уравнению Ленгмюра 8М101

кажущ. Ко [М]

кажущ. Ка [М¹

К-макс

0,99x10'⁶

1,02х10⁶

107,61%

Остаточные

погрешности

0,0226

Аналитическое программное обеспечение Мюгоса1™Оп§т (версия: 6.0) применяли для расчета 1С₅₀

ЗМ101 из данных РАСЗ. Строили график % ингибирования концентрации конкурентного ЗМ101. ДанА1-А2 У-^А2+~—гуу

ные согласовывали с сигмоидальной логистической ^{1 1}14 функцией:

А2: 100% ингибирования (максимальное ингибирование);

А1: 0% ингибирование (минимальное ингибирование);

Х0: 1С50; р: крутизна.

Параметр А1 устанавливали на 0, а параметр А2 - на 100 для расчета 1С₅₀.

С помощью данных из табл. 1 (РАСЗ007) оценивали 1С₅₀ как равную 17,7 мкг/мл с крутизной 1,63 (фиг. 5).

1.7. Сравнение эталонного стандарта и ЗМ101.

В последующем эксперименте исследовали биологическую активность исследуемого лекарственного препарата ЗМ101 (§РсКИВ) и сравнивали с эталонным стандартом в форме лекарственного вещества (РАСЗ021). Анализ активности на основе РАСЗ проводили как описано в приведенном выше пункте 1.4 для 1МР и эталонного стандарта параллельно на одном 96-луночном планшете.

РАСЗ-данные регистрировали и анализировали как описано (приведенный выше пункт 1.5) и осуществляли согласование данных с применением формулы изотермы связывания Ленгмюра, которая приведена выше (табл. 3 ниже и фиг. 6).

Таблица 3. Значения, полученные в результате РАСЗ-измерения, которые применяли для согласования изотермы Ленгмюра (данные от РАСЗ021)

Эт. станд. ЗМ101

ΙΜΡ 5М101

ΙΜΡ ЗМ101/Эт. станд.

Срединное значение Срединное значение

[мкг/мкл]	Конц-я [М]	нМ	Сигнал	норм, сигнал	Сигнал	норм, сигнал
0	0,00Е+00	0,00Е+00	6459	0,00%	6930	0,00%
0,0078	3,90Е-07	3,90Е+02	5234	19,32%	5309	23,81%
0,0156	7,80Е-07	7,80Е+02	2326	65,17%	3811	45,81%
0,03125	Ε56Ε-06	Ε56Ε+03	1644	75,92%	1780	75,65%
0,0625	ЗДЗЕ-06	ЗДЗЕ+ОЗ	921	87,32%	831	89,59%
0,125	6,25Е-06	6,25Е+03	362	96,14%	478	94,77%
0,25	Ρ25Ε-05	1,25Е+04	269	97,60%	281	97,66%
0,5	2,50Е-05	2,50Е+04	182	98,98%	195	98,93%
		втор. АЪ	137	100,00%	122	100,00%

- 17 030087

С помощью данных ΕΑ^ выявляли кажущуюся К_о, равную 0,739 х10^-6 М, для эталонного стандарта 8М101 и кажущуюся К_о, равную 0,904 х10^-6 М, для 8М101 ΙΜΡ (табл. 4).

Таблица 4. Параметры, полученные для согласования с сигмоидальной логистической функцией и уравнением Ленгмюра данных из табл. 3, фиг. 6 (ΓΑ^021)

ЗМ101	Эт. станд.	ΙΜΡ
кажущ. Κϋ [М]	0,74x10'6	0,90x10'6
кажущ. Кд [М1]	1,35х106	1,11x10е
Кмакс	105,64	107,21
Остаточные
погрешности	0,05	0,02
1С5о [мкг/мл]	12,9	16,2

Аналитическое программное обеспечение М1сгоса1™Оп§т (версия: 6.0) применяли для расчета Ю₅₀ для эталонного стандарта 8М101 и ΙΜΡ из данных ΕΛС8-анализа с применением сигмоидальной логистической функции, которая описана выше. Эталонный стандарт 8М101 демонстрировал Ю₀, равную 12,9 мкг/мл, и для ΜΡ 8М101, равную 16,2 мкг/мл (табл. 4).

Принимая во внимание, что отклонение в серии анализов, равное +/-20%, было приемлемым в клеточном анализе, можно было, таким образом, сделать заключение, что биологическая активность, которая определена в анализе активности на основе ΓΑ^, для IΜΡ была сравнимой с эталонным стандартом в форме лекарственного вещества 8М101.

Пример 2.

В данном примере описан способ получения агрегированного ^С из коммерческого ^Ю, Βе^^β1οЫп. Агрегированный ^С представлял собой исходный материал для способа ιη νίίτο определения активности связывания растворимых человеческих Рс-гамма-рецепторов по настоящему изобретению. В данном эксперименте применяли следующие реагенты:__

Наименование	Поставщик	Качество
Веп§1оЫп®, 160 мг/мл СЗЬ ВеЬгт§ предварительно заполненный 5 мл шприц	Ьоса1 РЬагтасу	Разрешение № 176а/92
ИаС1	Κοίΐι или эквивалентный	ч.д.а.
КС1	Мегск или	ч.д.а.

	эквивалентный
ЫазНРОд+НзО	Зщтпа или эквивалентный	ч.д.а.
КН2РО4	Мегск или эквивалентный	ч.д.а.
№Ν3	Мегск или эквивалентный	очищенный
98% глицерин, безводный	Κοίΐι или эквивалентный	Европ. фармакопея

Способ для получения агрегированного ^С можно обобщить следующими этапами:

1. Довести Βе^^β1οЪ^η® 160 мг/мл до 100 мг/мл с помощью ΡΒ8-Ν.

2. Разделить с помощью препаративной 8ЕС.

3. Определить содержание белка.

4. Необязательный: если содержание <0,50 мг/мл - концентрировать путем ультрафильтрации, или если содержание >1,40 мг/мл - развести при помощи ΡΒ8-Ν (фосфатно-солевого буферного раствора с 0,02% азида натрия).

5. Довести до 20% (об./об.) глицерина.

6. Разделить на аликвоты в количестве 0,5 мл и подвергнуть мгновенной заморозке в жидком азоте.

В частности, 5 мл Βе^^β1οЪ^η® 160 мг/мл аккуратно смешивали с 3 мл ΡΒ8-Ν до получения однородного раствора. 3,0 мл разведенного раствора вводили инъекцией со скоростью потока 1 мл/мин (ΑΠία Ехр1огег 10, СЕ Неа11Ьсаге) на колонку 8ирег0ех 200 Н1Ьоа0 26/60 (СЕ Неа11Ьсаге), предварительно урав- 18 030087

новешенную в ΡΒδ-Ν. Белки разделяли на скорости 1 мл/мин с применением ΡΒδ-Ν в качестве буфера. Агрегированный Ι§0 элюировал примерно через 115 мл, и его собирали в 3 мл фракции при достижении элюатом оптической плотности 50 мОЕ на 280 нм. Первые три фракции объединяли и хранили в течение максимум 3 дней при 2-8°С перед их смешиванием с объединенным пулом от дополнительных циклов δΕС. Если содержание белка объединенного пула агрегированного Ι§0 от всех циклов δΕС было ниже 0,50 мг/мл, то объединенный пул необходимо было концентрировать путем ультрафильтрации до 1,001,40 мг/мл ^ш^п ИНга, иНгасе1 100 кДа МАСО, ΜΐΠΐρο^). Если содержание белка объединенного пула агрегированного Ι§0 превышало 1,40 мг/мл, то объединенный пул разбавляли с помощью ΡΒδ-Ν до 1,40 мг/мл. Наконец, по каплям добавляли криопротектор глицерин при постоянном помешивании (500 об/мин) до конечной концентрации 20% (об./об.). Определяли по высвобождению содержание доведенного объединенного пула агрегированного Βе^^д1οЪ^η® и объединенный пул разделяли на аликвоты в количестве 0,5 мл в 1,5 мл реакционных пробирках ^аЕе §еа1 1иЪе§, δа^δίеάί). Аликвоты подвергали быстрой заморозке в жидком азоте и хранили при температуре от -60°С до -80°С. Результаты очистки показаны на фиг. 7, где заштрихованная область представляет собой объединенные фракции агрегированного Ι§0.

Пример 3.

В данном примере описаны способы тестирования качества агрегированного Ι§0, полученного согласно способу из примера 2. На первом этапе измеряли содержание фракций агрегированного Βе^^д1οЫп®. На втором этапе чистоту агрегированного Βе^^д1οЪ^η® тестировали с помощью аналитической δΕС. Второй этап выполняли с замороженными аликвотами агрегированного Βе^^д1οЪ^η®. Замороженным аликвотам необходимо было дать оттаять при комнатной температуре (25±2°С) при легком встряхивании (500 об/мин (оборотов в минуту), Τйе^тοт^xе^ К, Еρρеηάο^ΐ) перед их применением.

Для минимизации попыток тестирования в случае несообразной серии, поэтапно проводили тестирование качества. На каждом этапе тестирования проводили следующие тесты:_

Эта п	Наименовани е	Способ / план №	Целевое значение
1	Содержание	Спектроскопия в улырафиолетовой/видим ой областях спектра	0,3θ МГ/МЛ < Сагр. ВепДоЬт® < 1,35 мг/мл
2	Чистота	аналитическая 8ЕС	относительная площадь пика, агрегированный/олигомерн ый Вегщ1оЫп® >70%

Этап 1. Измерение содержания с помощью спектроскопии в ультрафиолетовой/видимой областях спектра.

Содержание фракций агрегированного Βе^^д1οЪ^η ®, полученных согласно способу из примера 1 впоследствии можно было измерить с помощью спектроскопии в ультрафиолетовой/видимой областях спектра. При необходимости раствор с белком разводили соответствующим буфером до получения оптической плотности при 280 нм между 0,2 и 0,8. В УФ-микрокювету переносили 400 мкл раствора (УФмикрокювета, Β^аηά). Регистрировали поглощение при 280 нм и 320 нМ (Сагу 100 Βίο, Vа^^аη) относительно ΡΒδ-Ν в качестве холостой пробы и рассчитывали концентрацию в мг/мл согласно следующему уравнению:

Сагр. ВегЩоЫп® [мг/мл] ⁼ (О1Э280 “ ООз2о) / 1 ,4θ

Анализ проводили в трех повторностях и полученные результаты усредняли.

Этап 2. Чистота аналитической δΕС.

Количество агрегированного/олигомерного Βе^^д1οЪ^η ® относительно димерных и мономерных форм определяли с помощью аналитической δΕС. Применяли систему серии 1200 НРЕС (Α§ί^ηΐ), оснащенную колонкой δиρе^άеx 200 10/3000Е (0Е НеаНЕсаге), предварительно уравновешенной в ΡΒδ-Ν. Центрифугировали (20000-д, 5 мин) 150 мкл свежеоттаявшей аликвоты агрегированного Βе^^д1οЪ^η ® и вводили инъекцией 50 мкл надосадочной жидкости со скоростью потока 0,5 мл/мин. Белки разделяли со скоростью потока 0,5 мл/мин с применением ΡΒδ-Ν в качестве буфера и отслеживали поглощение у элюата на 280 нм. Общее время циклов было ограничено до 50 мин. Каждому введению инъекцией агрегированного Βе^^д1οЪ^η ® предшествовало введение инъекцией 50 мкл ΡΒδ-Ν, 20% глицерина. Хроматограммы интегрировали вручную и чистоту приводили в виде относительной площади пика агрегированного/олигомерного Βе^^д1οЪ^η ® в сравнении со всеми пиками от 13,0 мин. до 30,0 мин. Результаты аналитической δЕС различных фракций Βе^^д1οЪ^η ® показаны на фиг. 8. На фиг. 9а и 9Ъ показано иллюст- 19 030087

ративное интегрирование хроматограмм аналитической 8ЕС от двух серий агрегированного Βе^^§1οЬ^η®.

Пример 4.

В данном примере проводили эксперименты для определения предполагаемого влияния количества и качества агрегированного Βе^^§1οЬ^η® на связывание с клетками Кац. Эксперименты проводили с применением различных количеств агрегированного Βе^^§1οЬ^η® и различных серий Βе^^§1οЬ^η.

Тестируемые концентрации агр. Βе^^§1οЬ^η® содержал 20, 10, 5, 3 и 2,5 мкг/1 х10⁵ клеток. В последующих экспериментах одновременно изменяли вторичное антитело ( айи Ι§Ο(Η+Ε)-ΡΕ для определения того, было ли вторичное антитело избыточно доступным по сравнению с агр. Βе^^§1οЬ^η ® (фиг. 10).

Как можно видеть на фиг. 10, связывание с клетками Кац не было ограничено количеством агрегированного Βе^^§1οЬ^η® даже в наиболее низкой концентрации. Количество 2,5 мкг на 1х10⁵ клеток (V _{конечный} = 100 мкл) было достаточным для количественного связывания с доступными рецепторами на

клетках.

В табл. 5 показано срединное значение МИ различных серий агр. Βе^^§1οЬ^η ® (№ 1, 2, 3), расчетное среднее и δϋ.

Пример 5.

В данном эксперименте исследовали рН-зависимость связывания агрегированного Βе^^§1οЬ^η ® с клетками Кац. Среда, применяемая для способа по настоящему изобретению, как описано в примере 1 (РΑСδ-анализ активности), содержала ΕΡΜΙ, МЕМ, Ка-пируват, 10% РδС и источник Е-глутамина (О1иίатаx-I, ОЛсо). Е-глутамин со временем разлагается на ΡСΑ и ΝΗ₃, что приводит к щелочному рН. Даже если ОГСитахЛ обладает сниженной склонностью к разложению, рН культуральной среды со временем становится более щелочным. Для тестирования рН-зависимости связывания агрегированного Βе^^§1οЬ^η ® с клетками Кац, 0,1Е6 клеток Кац инкубировали с 2,5 мкг агр. Βе^^§1οЬ^η® при различных условиях рН (рН 6,5, 6,7, 7,0, 7,2, 7,8, 8,0, 8,5, 9,0, 10,0) и связывание агр. Βе^^§1οЬ^η® с клетками в РΑСδ-анализе оценивали с применением 1/200 вторичного антитела айи Ι§Ο(Η+Ε)-ΡΕ. Как можно видеть на фиг. 11(а) и 11(й), имела место зависимость связывания агрегированного Βе^^§1οЬ^η® с клетками Кац с кажущимся оптимумом при рН 6,5 в тестируемых рН условиях. Условия с более низким рН не тестировали, поскольку ожидали негативного влияния на клетки. Таким образом, необходимо было удостовериться, что для тестов применяли только свежую среду с рН на уровне 7,0 ± 0,25. В качестве разбавителя в анализе было предпочтительно применение РΑСδ-буфера (ΗΒδδ + 5% РСδ+ 0,01 % (вес./об.) азида натрия, рН 6,5-6,8) вместо ТМ среды.

Пример 6.

В дополнительных экспериментах тестировали эффект мономерного человеческого Ι§Ο на конкурентное ингибирование ГС связывания с Рс уКТО-положительными клетками посредством δΜ101. С этой целью клетки Кац инкубировали либо с заданным количеством агрегированного Βе^^§1οЬ^η ® (2,5 мкг/1 х10⁵ клеток) вместе с заданным количеством мономерного Βе^^§1οЬ^η ® и различными количествами δΜ101 (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39 мкМ), либо с заданным количеством агрегированного Βе^^§1οЬ^η ® и δΜ101, а также различными количествами мономерного Βе^^§1οЬ^η ® (3,3, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0 мкМ). В избытке добавляли вторичное антитело (разведение стокового раствора 1/100, 20 мкл, добавленные к 1980 мкл, концентрация белка втор. ΑΡ: 0,5 мкг/мкл, равная 0,25 мкг/1х10⁵). Было обнаружено, что мономерный Βе^^§1οЬ^η ® конкурентно ингибировал связывание иммунных комплексов с клетками Кац в нМ диапазоне концентраций. δΜ101 демонстрировал сходный эффект, хотя и в мкМ диапазоне концентраций. Было сделано заключение, что мономерный Βе^^§1οЬ^η ® связывался со связанным с мембраной РсуМО, таким образом ингибируя связывание агрегированного Βе^^§1οЬ^η. Количество молекул агрегированного и активного Βе^^§1οЬ^η ® в системе не было известно, поэтому неясно, был ли наблюдаемый эффект вызван преимущественным связыванием мономерного Ι§Ο со связанным с мембраной Рс γΕΙΙΒ или же вызван численным превосходством агрегированного Βе^^§1οЬ^η® над добавляемым мономерным Ι§Ο. Самая высокая концентрация мономерного Ι§Ο (3,3 мкМ) соответствовала 0,5 мкг/1 х10⁵ клеток, что делало маловероятным тот факт, что мономерный Ι§Ο связывал все доступное вторичное антитело.

Пример 7.

- 20 030087

В данном эксперименте тестировали меж-/внутрианалитическую воспроизводимость касательно МИ фона вторичного антитела. В ретроспективном анализе анализировали данные η = 25 тестов в отношении изменчивости фоновой окраски вторичным антителом на клетках Кар. В табл. 7 ниже МИ клеток Кар, окрашенных вторичным антителом к человеческому 1дО(Н+Ь)-РЕ (разведение 1/100), среднее значение образцов и стандартное отклонение. Цветами показаны эксперименты, которые были проведены параллельно (межаналитическая стабильность). _

	ΜΡΙ
РАС8005	172
РАС8006	162
РАС3007	137
РАС8017	186
РАС8018	153
РАС8020	130
РАС8021	117
РАС8022	170
РАС80231	118
РАС8023П	130
РАС80241	98,5
РАС8024П	113
РАС8024Ш	109
РАС80241У	114
РАС80251	101
РАС8025П	97,7
РАС80261	114
РАС8026П	131
РАС80271	133
РАС8027П	114
РАС8027Ш	121
РАС80271У	127
РАС8028	208

РАС8029	178
РАС8031	139
	Среднее	134,9
	δϋ	29

Как можно видеть из табл. 6, МИ клеток Кар, окрашенных вторичным антителом (без добавления агрегированного Вепд1оЫп), оставалось более или менее постоянным при сравнении либо отдельных экспериментов (межаналитическая стабильность), либо параллельных экспериментов (внутрианалитическая стабильность) со стандартным отклонением (3Ό), равным 21% (8Ό МИ 29, среднее МИ 134,9).

Пример 8.

- 21 030087

В данном примере тестировали меж-/внутрианалитическую воспроизводимость в отношении кажущейся К_о и Ю₀. Для оценки внутри- и межаналитической стабильности анализов активности на основе РΑСδ, совокупности данных от 25 экспериментов анализировали в отношении согласованной кажущейся К_о и Ι€Ρ₀. В табл. 7 ниже показаны К_о, Ι€Ρ₀ и плотность клеток для клеток Ка|1 перед сбором в 25 РΑСδ-экспериментах. Эксперименты 12-15 и 16-17 представляли внутрианалитическую стабильность, поскольку К_о и Ι€Ρ₀ оценивали в разделенных тестах на отдельном планшете. Тест № 4 и 6 (выделен серым) был исключен из последующего анализа, поскольку измеренные данные демонстрировали явные выпадающие значения.

Тест	Ко[10-6	плотность клеток
№	ЕАС5	М]	1С50
1	ЕАС5005	0,75	13,40	3,0Е+05
2	ЕАС5006	0,46	7,54	3,6Е+05
3	ЕАС5007	0,98	17,77	2,4Е+05
4	РАС3017	2,24	41,63	7,4Е+05
5	РАС5018	0,82	14,68	2,2Е+05
6	РАС5019	3,26	25,33	3,4Е+05
7	РАС5020	0,66	12,96	2,2Е+05
8	РАС5021	0,74	13,96	1,8Е+05
9	РАС5022	0,18	4,03	5,0Е+05
10	РАС5023	0,64	12,03	1,0Е+06
11	РАС5023	0,60	10,76	1,0Е+06
12	РАС30241	0,66	15,99	5,4Е+05
13	РАС3024П	0,66	13,84	5,4Е+05
14	РАС8024П1	0,79	15,05	5,4Е+05
15	РАС80241У	0,89	16,72	5,4Е+05
16	РАС80251	0,45	12,196	5,0Е+05
17	РАС8025П	0,90	14,05 нет	5,0Е+05
18	РАС8026	0,22	данных	2,6Е+05
19	РАС3027	0,34	6,84	5,2Е+05
20	РАС3028	0,15	2,61	6,6Е+05
21	РАС8029	0,20	3,82	2,4Е+05
22	РАС8031	0,29	7,72	6,0Е+05
23	РАС8032	0,32	6,75	3,0Е+05
24	РАС3034	0,32	6,42	3,4Е+05
25	РАС8039	0,24	4,85	4,0Е+05

Как можно заключить из данных, показанных в табл. 7, межаналитическая и внутрианалитическая

- 22

030087

стабильность была высокой. Тем не менее, следует отметить, что начиная с теста № 18 определяли намного более низкие значения К_о и 1С₅₀. Это коррелировало с новыми исходными установками для устройства ТЛСЗ-Сап!о II.

Таблица 8. Среднее значение, стандартное отклонение и среднее отклонение для К_о и 1С₅₀ в 25 экспериментах из табл. 8 ___

	Ко [НТ6 М]	1С50 [мкг/мл]
Среднее	0,53	10,6
δϋ	0,26	4,7
Среднее ϋ	0,25	4,1

В табл. 8 приведено среднее значение для К_о (0,53 х10^-6 М) и 1С50 (10,6 мкг/мл) всех 25 экспериментов, показанных в табл. 7. Это приводило к 3Ό, равному примерно 50% (3Ό = 0,26). При отдельном расчете среднего для тестов № 1-17 (за исключением явных выпадающих значений № 4 и 6) и № 18-25, 3Ό было значительно ниже на уровне 29% для тестов № 1-17 (со средней Ко, равной 0,68х10^-6 М) и на уровне 26% для тестов № 18-25 (со средней Ко, равной 0,26 х10^-6 М) (табл. 9).

Таблица 9. Средние К_о и 1С₅₀ для тестов № 1-17 и № 18-25.

<110> Зирргето1 ОтЬН

<120> Способ ΐη νΐύΓΟ для определения стабильности композиций,

которые содержат растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор(ы)

<130> ЗИР14702РСТ

<150> ЕР 13003835,9

<151> 2013-08-01

<160> 10

<170> РабепЫп версия 3.5

<210> 1

<211> 177

<212> РРТ

<213> искусственный

<220>

<223> растворимый Рс-гамма-рецептор ΙΙΒ

<400> 1

Меб А1а Рго Рго Ьуз А1а Уа1 Ьеи Ьуз Ьеи О1и	Рго О1п Тгр 11е Азп
1	5	10	15

Уа1 Ьеи О1п О1и Азр Зег Уа1 ТЬг Ьеи ТЬг Суз Агд О1у ТЬг Нгз Зег
20	25	30

- 23 030087

Рго

О1и

Зег Азр 35

Зег

11е

О1п

Тгр 40

РЬе

Н1з

Азп

О1у

Азп 45

Ьеи

11е

Рго

ТЬг

Ηΐ3

ТЬг

О1п

Рго

Зег

Туг

Агд

РЬе

Ьуз

А1а

Азп

Азп

Азп

Азр

Зег

50

55

60

О1у

О1и

Туг

ТЬг

Суз

О1п

ТЬг

О1у

О1п

ТЬг

Зег

Ьеи

Зег

Азр

Рго

Уа1

65

70

75

80

Ηΐ3

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Зег

О1и

Тгр

Ьеи

Уа1

Ьеи

О1п

ТЬг

Рго

Н1з

Ьеи

85

90

95

О1и

РЬе

О1п

О1и

О1у

О1и

ТЬг

11е

Уа1

Ьеи

Агд

Суз

Н1з

Зег

Тгр

Ьуз

100

105

110

Азр

Ьуз

Рго

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

ТЬг

РЬе

РЬе

О1п

Азп

О1у

Ьуз

Зег

Ьуз

115

120

125

Ьуз

РЬе

Зег

Агд

Зег

Азр

Рго

Азп

РЬе

Зег

11е

Рго

О1п

А1а

Азп

Н1з

130

135

140

Зег

Ηΐ3

Зег

О1у

Азр

Туг

Н1з

Суз

ТЬг

О1у

Азп

11е

О1у

Туг

ТЬг

Ьеи

145

150

155

160

Туг

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Уа1

О1п

А1а

Рго

Зег

Зег

Зег

165 170 175

Рго

<210> 2

<211> 534

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> растворимый Рс-гамма-рецептор ΙΙΒ

<400> 2

аЬддсассдс	сдааадсадЬ	ЬсЬдааасЬд	даассдсадЬ	ддаЬЬаасдЬ	ЬсЬдсаддаа	60
даЬадсдЬЬа	сссЬдассЬд	ЬсдЬддсасс	саЬадсссдд	ааадсдаЬад	саЬЬсадЬдд	120
ЬЬЬсасаасд	дсааЬсЬдаЬ	ЬссдасссаЬ	асссадссда	дсЬаЬсдЬЬЬ	Ьааадсдаас	180
аасаасдаЬа	дсддсдааЬа	ЬассЬдЬсад	ассддЬсада	ссадссЬдад	сдаЬссддЬЬ	240
саЬсЬдассд	ЬЬсЬдадсда	аЬддсЬддЬЬ	сЬдсадассс	сдсаЬсЬдда	аЬЬЬсаддаа	300
ддсдааасса	ЬЬдЬЬсЬдсд	ЬЬдссасадс	ЬддааадаЬа	аассдсЬддЬ	ЬааадЬЬасс	360
ЬЬсЬЬссада	асддсаааад	сааааааЬЬс	адссдЬадсд	аЬссдааЬЬЬ	ЬадсаЬЬссд	420

- 24 030087

саддсдаасс асадссасад сддсдассас сассдсассд дсаасассдд ссасассссд

СаСадсадса аассддСдас саССассдСС саддсдссда дсадсадссс дСаа

480

534

<210> 3

<211> 181

<212> РКТ

<213> человеческий

<220>

<221> отличительная особенность <222> (1)..(181)

<223> человеческий Кс-гамма ΚΙΙΒ

<400> 3

МеС 1	О1у	ТЬг	Рго	А1а 5	А1а	Рго	Рго
О1п	Тгр	11е	Азп 20	Уа1	Ьеи	О1п	О1и
О1у	ТЬг	Нчз 35	Зег	Рго	О1и	Зег	Азр 40
Азп	Ьеи 50	11е	Рго	ТЬг	Нчз	ТЬг 55	О1п
Азп 65	Азп	Азр	Зег	О1у	О1и 70	Туг	ТЬг
Зег	Азр	Рго	Уа1	Нчз 85	Ьеи	ТЬг	Уа1
ТЬг	Рго	Нчз	Ьеи 100	О1и	РЬе	О1п	О1и
Нчз	Зег	Тгр 115	Ьуз	Азр	Ьуз	Рго	Ьеи 120
О1у	Ьуз 130	Зег	Ьуз	Ьуз	РЬе	Зег 135	Агд
О1п 145	А1а	Азп	Нчз	Зег	Нчз 150	Зег	О1у
О1у	Туг	ТЬг	Ьеи	Туг 165	Зег	Зег	Ьуз

Ьуз	А1а 10	Уа1	Ьеи	Ьуз	Ьеи	О1и 15	Рго
Азр 25	Зег	Уа1	ТЬг	Ьеи	ТЬг 30	Суз	Агд
Зег	11е	О1п	Тгр	РЬе 45	Нчз	Азп	О1у
Рго	Зег	Туг	Агд 60	РЬе	Ьуз	А1а	Азп
Суз	О1п	ТЬг 75	О1у	О1п	ТЬг	Зег	Ьеи 80
Ьеи	Зег 90	О1и	Тгр	Ьеи	Уа1	Ьеи 95	О1п
О1у 105	О1и	ТЬг	11е	Уа1	Ьеи 110	Агд	Суз
Уа1	Ьуз	Уа1	ТЬг	РЬе 125	РЬе	О1п	Азп
Зег	Азр	Рго	Азп 140	РЬе	Зег	11е	Рго
Азр	Туг	Нчз 155	Суз	ТЬг	О1у	Азп	11е 160
Рго	Уа1 170	ТЬг	11е	ТЬг	Уа1	О1п 175	А1а

- 25 030087

Рго Зег Зег Зег Рго 180

<210> 4

<211> 543

<212> ДНК

<213> человеческая

<220>

<221> отличительная особенность <222> (1)..(5443)

<223> человеческий Рс-гамма ΚΙΙΒ

<400> 4

абддддасас	сбдсадсбсс	сссаааддсб	дбдсбдааас	бсдадсссса	дбддабсаас
дбдсбссадд	аддасбсбдб	дасбсбдаса	бдссддддда	сбсасадссс	бдададсдас
бссаббсадб	ддббссасаа	бдддаабсбс	аббсссассс	асасдсадсс	садсбасадд
ббсааддсса	асаасаабда	садсддддад	басасдбдсс	адасбддсса	дассадссбс
адсдасссбд	бдсабсбдас	бдбдсбббсб	дадбддсбдд	бдсбссадас	сссбсассбд
дадббссадд	адддадааас	сабсдбдсбд	аддбдссаса	дсбддаадда	саадссбсбд
дбсааддбса	саббсббсса	даабддаааа	бссаадаааб	бббсссдббс	ддабсссаас
ббсбссабсс	сасаадсааа	ссасадбсас	адбддбдабб	ассасбдсас	аддааасаба
ддсбасасдс	бдбасбсабс	саадссбдбд	ассабсасбд	бссаадсбсс	садсбсббса

ссд

60

120

180

240

300

360

420

480

540

543

<210>	5
<211>	184
<212>	РКТ
<213>	человеческий

<220> <221> <222> <223>	отличительная особенность
(1)..(184) человеческий	Рс-гамма ΚΙΙΑ
<400>	5
Меб О1у	Тйг Рго А1а	А1а Рго Рго Ьуз	А1а Уа1	Ьеи Ьуз Ьеи О1и Рго
1	5		10	15

Рго

Тгр

11е Азп Уа1 20

Ьеи О1п О1и

Азр 25

Зег Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг 30

Суз

О1п

О1у

А1а

Агд

Зег

Рго

О1и

Зег

Азр

Зег

11е

О1п

Тгр

РЬе

Няз

Азп

О1у

35

40

45

Азп

Ьеи

11е

Рго

ТЬг

Нтз

ТЬг

С1п

Рго

Зег

Туг

Агд

РЬе

Ьуз

А1а

Азп

- 26 030087

50 55 60

Азп Азп 65

Азр

Зег

О1у

О1и 70

Туг

ТЬг

Суз

О1п

ТЬг 75

О1у

О1п

ТЬг

Зег

Ьеи 80

Зег

Азр

Рго

Уа1

Ηί.5

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Зег

О1и

Тгр

Ьеи

Уа1

Ьеи

О1п

85

90

95

ТЬг

Рго

Ηί3

Ьеи

О1и

РЬе

О1п

О1и

О1у

О1и

ТЬг

11е

Меб

Ьеи

Агд

Суз

100

105

110

Ηί3

Зег

Тгр

Ьуз

Азр

Ьуз

Рго

Ьеи

Уа1

Ьуз

Уа1

ТЬг

РЬе

РЬе

О1п

Азп

115

120

125

О1у

Ьуз

Зег

О1п

Ьуз

РЬе

Зег

Ηί8

Ьеи

Азр

Рго

ТЬг

РЬе

Зег

11е

Рго

130

135

140

О1п

А1а

Азп

Ηίδ

Зег

Ηί.5

Зег

О1у

Азр

Туг

Ηί8

Суз

ТЬг

О1у

Азп

11е

145

150

155

160

О1у

Туг

ТЬг

Ьеи

РЬе

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Уа1

О1п

Уа1

165

170

175

Рго

Зег

Меб

О1у

Зег

Зег

Зег

Рго

180

<210> 6

<211> 554

<212> ДНК

<213> человеческая

<220>

<221> отличительная особенность <222> (1)..(554)

<223> человеческий Рс-гамма ΚΙΙΑ

<400> 6

абддддасас	сбдсадсбсс	сссаааддсб	дбдсбдааас	ббдадссссс	дбддабсаас	60
дбдсбссадд	аддасбсбдб	дасбсбдаса	бдссаддддд	сбсдсадссс	бдададсдас	120
бссаббсадб	ддббссасаа	бдддаабсбс	аббсссассс	асасдсадсс	садсбасадд	180
ббсааддсса	асаасаабда	садсддддад	басасдбдсс	адасбддсса	дассадссбс	240
адсдасссбд	бдсабсбдас	бдбдсбббсс	даабддсбдд	бдсбссадас	сссбсассбд	300
дадббссадд	адддадааас	сабсабдсбд	аддбдссаса	дсбддаадда	саадссбсбд	360
дбсааддбса	саббсббсса	даабддаааа	бсссадаааб	бсбсссаббб	ддабсссасс	420
ббсбссабсс	сасаадсааа	ссасадбсас	адбддбдабб	ассасбдсас	аддааасаба	480

- 27 030087

ддсбасасдс бдббсбсабс саадссбдбд ассабсасбд бссаадбдсс садсабдддс

адсбсббсас сааб

540

554

<210> 7

<211> 182

<212> РКТ

<213> человеческий

<220>

<221> отличительная особенность <222> (1)..(182)

<223> человеческий Кс-гамма ΚΙΙΙΑ

<400> 7

Меб 1

Азр

Ьеи

Рго

Ьуз 5

А1а

Уа1

Уа1

РЬе

Ьеи 10

О1и

Рго

О1п

Тгр

Туг 15

Агд

Уа1

Ьеи

О1и

Ьуз

Азр

Зег

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Суз

О1п

О1у

А1а

Туг

Зег

20

25

30

Рго

О1и

Азр

Азп

Зег

ТЬг

О1п

Тгр

РЬе

Нчз

Азп

О1и

Зег

Ьеи

11е

Зег

35

40

45

Зег

О1п

А1а

Зег

Зег

Туг

РЬе

11е

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

Азр

Зег

50

55

60

О1у

О1и

Туг

Агд

Суз

О1п

ТЬг

Азп

Ьеи

Зег

ТЬг

Ьеи

Зег

Азр

Рго

Уа1

65

70

75

80

О1п

Ьеи

О1и

Уа1

Нчз

11е

О1у

Тгр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

О1п

А1а

Рго

Агд

Тгр

85

90

95

Уа1

РЬе

Ьуз

О1и

О1и

Азр

Рго

11е

Нчз

Ьеи

Агд

Суз

Нчз

Зег

Тгр

Ьуз

100

105

110

Азп

ТЬг

А1а

Ьеи

Нчз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Туг

Ьеи

О1п

Азп

О1у

Ьуз

О1у

Агд

115

120

125

Ьуз

Туг

РЬе

Нчз

Нчз

Азп

Зег

Азр

РЬе

Туг

11е

Рго

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

130

135

140

Ьуз

Азр

Зег

О1у

Зег

Туг

РЬе

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

Зег

Ьуз

Азп

145

150

155

160

Уа1

Зег

Зег

О1и

ТЬг

Уа1

Азп

11е

ТЬг

11е

ТЬг

О1п

О1у

Ьеи

Зег

Уа1

165

170

175

Зег

ТЬг

11е

Зег

Зег

РЬе

- 28 180

030087

<210> 8

<211> 546

<212> ДНК

<213> человеческая

<220>

<221> человеческая

<222> (1)..(546)

<223> человеческий Рс-гамма ΕΙΙΙΆ

<400> 8

аЕддаЕсЕсс

дасадЕдЕда

ЕЕЕсасааЕд

дЕЕдасдаса

садсЕадаад

даадасссЕа

ЕаЕЕЕасада

ааадссасас

дЕдЕсЕЕсад

саааддсЕдЕ

сЕсЕдаадЕд

ададссЕсаЕ

дЕддададЕа

ЕссаЕаЕсдд

ЕЕсассЕдад

аЕддсааадд

Есааадасад

адасЕдЕдаа

ддЕдЕЕссЕд

ссадддадсс

сЕсаадссад

саддЕдссад

сЕддсЕдЕЕд

дЕдЕсасадс

саддаадЕаЕ

сддсЕссЕас

саЕсассаЕс

дадссЕсааЕ

ЕасЕссссЕд

дссЕсдадсЕ

асааассЕсЕ

сЕссаддссс

Еддаадааса

ЕЕЕсаЕсаЕа

ЕЕсЕдсаддд

асЕсааддЕЕ

ддЕасадддЕ

аддасааЕЕс

асЕЕсаЕЕда

ссасссЕсад

сЕсддЕдддЕ

сЕдсЕсЕдса

аЕЕсЕдасЕЕ

ддсЕЕдЕЕдд

ЕдЕсадЕдЕс

дсЕсдадаад

сасасадЕдд

сдсЕдссаса

ЕдасссддЕд

дЕЕсааддад

ЕааддЕсаса

сЕасаЕЕсса

дадЕаааааЕ

аассаЕсЕса

ЕсаЕЕс

60

120

180

240

300

360

420

480

540

546

<210> 9

<211> 182

<212> РКТ

<213> человеческий

<220>

<221>	отличительная особенность
<222>	(1)..(182)
<223>	человеческий	Рс-гамма ΚΙΙΙΒ
<400>	9
МеЕ Азр	Ьеи Рго Ьуз	А1а Уа1 Уа1 РЬе	Ьеи О1и	Рго Ο1η Тгр Туг Зег
1	5		10	15

Уа1

Ьеи О1и

Ьуз 20

Азр

Зег

Уа1

ТЬг

Ьеи 25

Ьуз

Суз

Ο1η

О1у

А1а 30

Туг

Зег

Рго

О1и

Азр

Азп

Зег

ТЬг

Ο1η

Тгр

РЬе

Нтз

Азп

О1и

Азп

Ьеи

Не

Зег

35

40

45

Зег Οίη А1а Зег Зег Туг 50

РЬе

55

11е

Азр

А1а А1а

ТЬг Уа1 Азп Азр Зег

60

- 29 030087

О1у 65

О1и

Туг

Агд

Суз

О1п 70

ТЬг Азп

Ьеи

Зег

ТЬг 75

Ьеи

Зег

Азр

Рго

Уа1 80

О1п

Ьеи

О1и

Уа1

Нчз

11е

О1у

Тгр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

О1п

А1а

Рго

Агд

Тгр

85

90

95

Уа1

РЬе

Ьуз

О1и

О1и

Азр

Рго

11е

Нчз

Ьеи

Агд

Суз

Нчз

Зег

Тгр

Ьуз

100

105

110

Азп

ТЬг

А1а

Ьеи

Нчз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Туг

Ьеи

О1п

Азп

О1у

Ьуз

Азр

Агд

115

120

125

Ьуз

Туг

РЬе

Нчз

Нчз

Азп

Зег

Азр

РЬе

Нчз

11е

Рго

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

130

135

140

Ьуз

Азр

Зег

О1у

Зег

Туг

РЬе

Суз

Агд

О1у

Ьеи

Уа1

О1у

Зег

Ьуз

Азп

145

150

155

160

Уа1

Зег

Зег

О1и

ТЬг

Уа1

Азп

11е

ТЬг

11е

ТЬг

О1п

О1у

Ьеи

А1а

Уа1

165

170

175

Зег

ТЬг

11е

Зег

Зег

РЬе

180

<210> 10

<211> 486

<212> ДНК

<213> человеческая

<220>

<221> отличительная особенность <222> (1)..(486)

<223> человеческий Рс-гамма ΚΙΙΙΒ

<400> 10

дасадбдбда	сбсбдаадбд	ссадддадсс	басбссссбд	аддасааббс	сасасадбдд	60
бббсасаабд	адаассбсаб	сбсаадссад	дссбсдадсб	асббсаббда	сдсбдссаса	120
дбсаасдаса	дбддададба	саддбдссад	асааассбсб	ссасссбсад	бдасссддбд	180
садсбадаад	бссабабсдд	сбддсбдббд	сбссаддссс	сбсддбдддб	дббсааддад	240
даадасссба	ббсассбдад	дбдбсасадс	бддаадааса	сбдсбсбдса	бааддбсаса	300
бабббасада	абддсааада	саддаадбаб	бббсабсаба	аббсбдасбб	ссасаббсса	360
ааадссасас	бсааадабад	сддсбссбас	ббсбдсаддд	ддсббдббдд	дадбаааааб	420
дбдбсббсад	адасбдбдаа	сабсассабс	асбсааддбб	бддсадбдбс	аассабсбса	480
бсаббс						486

- 30 030087

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ ίη νίίτο для определения стабильности композиции, которая содержит растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ША и/или ΙΙΙΒ либо фактически состоит из него, причем указанный способ включает этапы:

   (a) приведения в контакт поверхности, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, с заданным количеством агрегированного человеческого /С:

   (b) приведения в контакт указанной поверхности, содержащей человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, с заданным количеством указанной композиции на основе растворимого человеческого Рс-гамма-рецептора ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ: и

   (c) определения количества агрегированного человеческого /С. который связан с указанной поверхностью, содержащей указанный человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ:

   (б) сравнения количества агрегированного человеческого /С, который связан с указанной поверхностью, которое определено на этапе (с), с эталонным значением и, таким образом, определения стабильности указанной композиции, которая содержит растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ либо фактически состоит из него.
2. 2. Способ по п.1, где этапы (а) и (Ъ) осуществляют одновременно или последовательно.
3. 3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная поверхность, содержащая человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ, представляет собой или содержит клетку, или линию клеток (млекопитающего), и/или твердую поверхность, на которую может быть нанесен в виде покрытия человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙΑ и/или ΙΙΙΒ.
4. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный агрегированный человеческий /С представляет собой агрегированный человеческий ЦС, который может быть выделен из человеческого белка, характеризующегося по меньшей мере 90% содержанием человеческого /С.
5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный агрегированный человеческий /С может быть выделен из Βοπ§1οΝη.
6. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный агрегированный человеческий Ι§0 представляет собой агрегированный человеческий Ι§0, который является получаемым из человеческого белка с помощью способа выделения, включающего эксклюзионную хроматографию.
7. 7. Способ по п.6, где с помощью указанной эксклюзионной хроматографии отделяют мономерный и/или димерный Ι§0 от указанного агрегированного /С.
8. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный агрегированный человеческий /С является меченым.
9. 9. Способ по п.8, где указанная метка входит в состав вторичного меченого антитела к /С человека.
10. 10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный растворимый человеческий Рсгамма-рецептор представляет собой растворимый Рс-гамма-рецептор ΙΙΒ.
11. 11. Способ по п.10, где указанный растворимый человеческий Рс-гамма-рецептор ΙΙΒ представляет собой 8М101 (8ЕО ГО № 1).
12. 12. Способ по любому из пп.3-11, где указанная клетка млекопитающего представляет клетку Кар, которая депонирована в АТСС под № ССЬ-86.
13. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где подтип человеческого Рс-гамма-рецептора, содержащегося на указанной поверхности, и подтип человеческого Рс-гамма-рецептора, содержащегося в указанном препарате растворимого человеческого Рс-гамма-рецептора, являются идентичными.

    - 31 030087