CN105593685A

CN105593685A - 用于测定包含可溶性Fcγ受体的组合物的稳定性的体外方法

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Publication number: CN105593685A
Application number: CN201480054299.7A
Authority: CN
Inventors: P·松德尔曼; T·波尔; D·特米尔
Original assignee: Suppremol GmbH
Current assignee: Suppremol GmbH
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-08-01
Also published as: IL243861A0; JP2016525364A; CA2919997C; MX2016001288A; JP2020000244A; EA030087B1; JP6697385B2; KR102282823B1; BR112016001898A2; IL243861B; MX370732B; EP2833139A1; CN105593685B; ES2687716T3; US20160195541A1; EP3028041A1; US10866247B2; EP3028041B1; AU2014298371A1; CA2919997A1

Abstract

本发明实质上涉及一种用于测定包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成的组合物的稳定性例如放置稳定性、时间稳定性、保质期的体外方法，所述方法包括以下步骤：使包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面与设置量的聚集人IgG接触；使包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面与设置量的所述可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的组合物接触；测定结合至包含所述人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面的聚集人IgG的量，和将如在步骤(c)测得的结合至所述表面的聚集人IgG的量与参考值比较，并且(由此)测定所述包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成的组合物的稳定性(放置稳定性、时间稳定性、保质期)。本发明还涉及可通过如本文限定的方法获得的聚集人IgG，以及在本发明的方法中提到的聚集人IgG的用途。

Description

用于测定包含可溶性Fcγ受体的组合物的稳定性的体外方法

技术领域

本发明实质上涉及一种用于测定组合物的稳定性的体外方法，所述组合物包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成，所述方法包括以下步骤：使包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面与设置量的聚集人IgG接触；使包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面与设置量的所述可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的组合物接触；测定结合至包含所述人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面的聚集人IgG的量，和将如在步骤(c)中测得的结合至所述表面的聚集人IgG的量与参考值比较，并且(由此)测定所述包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成的组合物的稳定性。本发明还涉及可通过如本文限定的方法获得的聚集人IgG，以及在本发明的方法中提到的聚集人IgG的用途。

背景技术

Fc受体(FcR)在免疫系统中具有重要作用，在免疫系统中它们控制免疫应答的程度和强度。在病原体进入血液循环后，它们被免疫球蛋白(Ig)调理。产生的免疫复合物(IC)由于它们的多价性以高亲合力结合至带有FcR的细胞，从而导致FcR的簇集，所述簇集触发若干效应功能(Metzger,H.,J.Immunol.1992,149:1477-1487)。取决于表达的FcR类型及相关蛋白，所述效应功能包括后续为病原体中和和抗原递呈的内吞、抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、介质分泌或抗体产生的调节(Fridman等人，ImmunolRev.1992,125:49-76；vandeWinkel和Capel,Immunol.Today1993,14:215-221)。

免疫复合物作为适应性免疫的一部分源自抗体、抗原、补体和各种受体之间的复杂的相互作用。在免疫复合物中结合至抗体的抗原一般会被多种细胞机制清除，所述细胞机制在生理上甚至能够消除少量的来自循环的“外源抗原”。免疫复合物能够在人暴露于外源物质如蛋白质(感染、疫苗、药物等)或者需要蛋白质载体来激活级联反应的非蛋白物质(半抗原)时形成。当(致病的)免疫复合物病理性沉积于不同器官时形成自身免疫性障碍，从而引发导致器官损伤/疾病的炎症性级联反应。当调节障碍在一个或多个这些部件中发生时，免疫复合物疾病能够以各种各样的方式出现。

特异性FcγR存在于所有免疫球蛋白(Ig)类别中。由于IgG是在人体循环中发现的丰度最大的抗体同种型，可见对于IgG的FcR，Fcγ受体(FcγR)，是丰度最大的并具有广泛的多样性。在其它哺乳动物物种中发现了与人FcγR相对应的正源蛋白质，所述其它哺乳动物物种包括其它灵长类动物例如猴子和小鼠。如同人，其它物种也拥有若干种与其相应IgG亚类有不同亲和力的FcγR。FcγR包含激活性和抑制性受体二者，这种阳性和阴性信号的整合对于高效的免疫应答是必要的。

人中存在三种类型的FcγR：高亲和力受体FcγRI和低亲和力受体FcγRII与FcγRIII。FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIIIA(CD16)作为I型跨膜蛋白或者以可溶形式(sFcγR)存在，但是还存在FcγRIII(FcγRIIIB)的糖基化磷脂酰肌醇锚定形式。此外，FcγR以多种同工型(FcγRIA、B1、B2、C；FcγRIIA1-2、B1-3、C)和等位基因(FcγRIIa1-HR、-LR；FcγRIIIb-NA1、-NA2)(vandeWinkel和Capel,Immunol.Today1993,14:215-221)存在。如上所述，这些FcγR对于IgG具有不同的亲和力，尤其对于不同IgG亚类具有不同的结合亲和力。人中存在4种IgG亚类，按照它们在血清中的丰度命名(IgG1(66％)、2(23％)、3(7％)、和4(4％)；Hashira等人,Pediatr.Int.1993,42(4):337-221)。

FcγRII是免疫活性细胞上分布最为广泛的受体，并与FcγRIIIA一起主要参与免疫复合物内吞作用。FcγRII存在三种同工型FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC，然而，FcγRIIB和FcγRIIC的胞外区相同，而FcγRIIA在其胞外区中只有7％的氨基酸残基不同。虽然如此，两种形式均能够通过它们与人和小鼠IgG亚类的结合特点(vandeWinkel和Capel,Immunol.Today1993,14:215-221)以及它们对于人IgGs不同的亲和力(Bruhns等人,Blood2009,113:3716-3725)被区分开。FcγRIIIA是诱导ADCC的关键受体，而抑制性FcγRIIB代表唯一的FcR在B细胞上表达。就这一点上，FcγRIIB的表达对于B细胞向下调节而导致抗体产生减少是必不可少的。

以sFcγRIIB为基础，本发明人正在开发用于治疗自身免疫性疾病的新型手段和方法。最先进的产品是SM101，它与在免疫细胞上表达的FcγR竞争致病性免疫复合物的结合。SM101目前正在参与美国和欧洲用于治疗自身免疫性障碍例如红斑狼疮和免疫性血小板减少症的临床试验。

假定蛋白质性药物，例如包含SM101的药剂或药物组合物，可能在储存过程中降解，因而特别想要开发可再现的体外测试，所述测试反映此类蛋白质或包含此类蛋白质的组合物的剩余活力。

发明内容

因此本发明的技术问题是开发一种用于测定包含可溶性人FcγR的组合物的稳定性的体外方法。

本发明的发明人观察到从“正常”或“健康”人群获得的人IgG制备物(例如市售静脉内免疫球蛋白(IVIG)制备物)包含迄今为止未鉴定的聚集人IgG级分，该级分可以以标准化且可靠的方式提供。这是让人惊奇的，因为之前并不清楚这样的致病性免疫复合物的类似物能够来源于其它“正常”或“健康”的人群。所述聚集人IgG结合至FcγR受体，由此模仿体内情形(即，其模仿前面提及的致病性免疫复合物)并因此可以被用于旨在检测、测定或验证包含水溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的组合物的稳定性的方法中。尤其是，聚集人IgG是非热聚集的，例如如Engelhard,等人,(1990),Eur.J.Immunol.20,1367-1377、Bruhns等人.(2009),BloodJ.113(16),3716-3725或者US2008/008700中所描述的。Bruhns等人描述了通过人IgG在pH8.0和63℃下在硼酸盐缓冲盐水溶液中孵育30分钟且不经任何后续处理产生的热聚集人IgG(第3718页，免疫球蛋白结合测定)，以及源自与抗NIPmAb复合的化学改性BSA(NIP12-BSA-生物素)的人工免疫复合物，所述抗NIPmAb从细胞培养上清液纯化获得(第3717页，抗体和试剂)。同样地，US2008/008700在第8页第[0093]段公开了HAGG(热聚集IgG)的用途。

本发明因此涉及一种用于测定组合物、优选药物组合物(与药剂等同)的稳定性(例如放置稳定性或贮存稳定性)的体外方法，所述组合物包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或基本上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成，所述方法包括以下步骤：

(a)使包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面与设置量的聚集人IgG接触；

(b)使包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面与设置量的所述可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的组合物接触；和

(c)测定结合至包含所述人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面的聚集人IgG的量，

(d)以及将如在步骤(c)中测得的结合至所述表面的聚集人IgG的量与参考值比较，并且(由此)测定所述包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成的组合物的稳定性，例如放置稳定性、时间稳定性、保质期。

本发明方法中的步骤(a)和(b)能够同时或相继进行。还设想步骤(b)和(a)的顺序颠倒。

设想本发明的方法包括洗涤步骤，该步骤在步骤(c)之前进行，优选在步骤(a)和(b)之后进行。

优选地，本发明上下文中采用的所述可溶性Fcγ受体为可溶性FcγIIB受体。特别优选地，所述可溶性人FcγIIB受体为SM101(SEQIDNo.1)，包括经由这些受体在宿主细胞中表达而获得的制备物，所述宿主细胞例如哺乳动物细胞或细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)。

本发明同样涉及本文定义的聚集人IgG在本发明的方法和实施方案中的用途。

在本发明的上下文中，术语“体外方法”指的是一种在人体或动物体外进行的方法，与体内方法相对。

词语“方法”可以被“测试”或“测定”或类似的词语所替代。

术语“稳定性”包括“放置稳定性”或“保质期”或“半衰期”。组合物的“稳定性”实质上涉及包含在其中的主要成分的稳定性，即本文定义的可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的稳定性。所述稳定性可能会受到不同参数的影响，例如时间，即“时间稳定性”；温度，缓冲条件，可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的生产宿主；人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的序列；人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的制造方法，等等。

通过测定本发明(包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或基本上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成)的组合物的稳定性，同样可以监测/控制所述组合物(即实质上所述组合物的主要成分，即可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB)的质量/条件/结合能力。

在一个优选的实施方案中，“组合物”是药物组合物(与药剂等同)或者诊断组合物，可以另外包含药学上或诊断学上可接受的载体、缓冲剂、成分等等。所述组合物还可以进一步包含治疗活性成分。

术语“聚集人IgG”(有时也表示为“人聚集IgG”或类似的名字)指的是人IgG制备物的聚集部分。这种制备物出人意料地存在于可以用于静脉内或皮下或肌肉给药的基于血液的产品(例如合并的人IgG制备物或IVIG)中，所述产品含有合并的(优选多价的)IgG。因此，聚集人IgG优选可以从合并的人IgG制备物中获得/分离，或是可从合并的人IgG制备物中获得的，所述合并的人IgG制备物例如IVIG制备物/组合物。设想所述聚集人IgG是可以从“人蛋白”中分离的聚集人IgG，所述人蛋白以至少90％人IgG的含量为特征。所述人蛋白源自/可源自人血清或血浆，并且在一个优选的实施方案中被表征为或被鉴定为是正常的人免疫球蛋白(人IgG)，具有根据世界卫生组织(WHO)药物统计方法整合中心(WHOCC)的解剖学、治疗学及化学(ATC)分类系统的ATC代码J06BA01或者J06BA02。当用于本文时，术语“人蛋白”包括合并的人IgG制备物。在一个优选的实施方案中，人IgG包含为亚型IgG1的至少50％IgG。在一个更优选的实施方案中，人IgG(进一步)包含为亚型IgG2的至少20％IgG。在一个特别优选的实施方案中，所述聚集人IgG是从或中，优选Beriglobin中获得/分离的，或是可从或中，优选Beriglobin中获得的。Beriglobin包含95％或者更多的、例如100％IgG。举例而言，含有100％IgG的Beriglobin能够包含61％IgG1、28％IgG2、5％IgG3、6％IgG4，并可至多包含约1％IgA。为Beriglobin、Varitect和Vendig指示的百分值指的是％(w/w)。示例性的Beriglobin是批号为26840311A或23840311B的那种。Varitect包含95％或更多的、例如100％IgG。举例而言，100％IgGVaritect能够包含59％IgG1、36％IgG2、3％IgG3、2％IgG4，并可至多包含5％或更少的IgA。Venbig包含95％或更多的、例如100％IgG。举例而言，100％IgGVendig能够包含52-80％IgG1、26-50％IgG2、2.4-5％IgG3、0.3-1％IgG4。当然，技术人员能够在本发明的方法和用途中应用Beriglobin、Varitect、Vendig或者任何其它类似这三种药物的组合物。另一种优选的聚集人IgG是从中获得/分离的，或可从中获得的。举例而言，100％IgGSubcuvia能够包含45-75％IgG1、20-45％IgG2、3-10％IgG3、2-8％IgG4。为Subcuvia标示的百分值指的是％(w/w)。示例性的Subcuvia是批号为BVNG1M032A的那种。

然而，技术人员不仅能够使用这三种药物，而且也能够自己制备人IgG制备物。事实上，技术人员能够很容易地制备如本文所述的IgG制备物，例如，通过合并来自至少100、200、300、400、500、600、700、800、900或更多个、优选1000或更多个人捐献者的血浆中的IgG，由此获得(合并的)人IgG制备物。所以，如本发明中采用的人IgG制备物优选包含95％或更多的、例如100％IgG。如本文采用的IgG制备物优选包含如下所述的IgG亚类：52-80％(w/w)IgG1、26-50％IgG2(w/w)、2-5％IgG3(w/w)和/或0.2-6％(w/w)IgG4，前提是IgG总含量不超过100％(w/w)。

在一个进一步优选的实施方案中，所述人蛋白包含来自至少100个，即100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个等人(健康的或“标准的”)捐献者的混合的血清或血浆或由来自至少100个，即100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个等人(健康的或“标准的”)捐献者的混合的血清或血浆组成，由此包含全部四种IgG亚群。优选来自至少500个人(健康的或“标准的”)捐献者的混合的血清或血浆。术语“健康的”意为个体满足现行的(献血时)对于献血的标准资格标准，需谨记的是，此处的资格标准是经受不断的改进和变化的。

在另一个实施方案中，设想所述聚集人IgG是可通过包括尺寸排阻色谱的分离方法从所述人蛋白中获得的聚集人IgG。在一个优选的实施方案中，所述尺寸排阻色谱将单体和/或二聚体IgG与所述聚集人IgG相分离。可用于本发明上下文中的分离聚集人IgG的手段和方法在本文其它地方公开(例如在实施例中)。还设想，本发明的聚集人IgG不是热聚集人IgG，如在Engelhard,等人,(1990),Eur.J.Immunol.20,1367-1377、Bruhns等人(2009),BloodJ.113(16),3716-3725或US2008/008700中所描述的例子。事实上，热聚集IgG将不同于如本文所述的获得的/可获得的聚集IgG。也就是说，热聚集是当将解链温度(Tm)以上的温度应用于给定蛋白质时蛋白质部分变性的结果。解链温度是蛋白质的参数(function)，在人IgG的混合物的情况下，将必定观察到宽范围的Tm。因此取决于所使用的IgG的混合物，聚集程度随着批次的变化会有所不同。

此外，许多单体IgG将不可避免地成为通过加热的聚集IgG制备物的一部分，因而将使得无法制备不含有不同量的被认为是杂质的单体IgG的聚集IgG。然而，如本文所述的制备聚集IgG的方法将单体和/或二聚体IgG与聚集IgG相分离，因此，如通过本文所述方法获得的/可通过本文所述方法获得的聚集IgG不同于来自现有技术的热聚集IgG。

因此显而易见的是，热聚集IgG无法与如本发明公开的聚集IgG制备物相比，如本发明公开的聚集IgG制备物具有长期稳定性并且完美适合于批放行测试或者其它常规测试。

设想合并的人IgG制备物例如静脉内免疫球蛋白(IVIG)制备物，有时也被称作用于静脉内给药的血浆免疫球蛋白，源自数百健康捐献者的合并的血浆并含有反映捐献者人群的累计抗原经验的免疫抗体和天然抗体(NAb)。合并的人IgG制备物在其性质上是高度多克隆性的并含有许多抗体种类。其因此含有大范围的具有针对病原体和外源抗原的特异性的所谓“免疫抗体”以及与包括自体/自身抗原在内的广泛抗原反应的NAb。NAb也因此定义为它们在不存在有意免疫的情况下且不依赖于对外源抗原的暴露而产生的。

除了静脉内制备物，还存在被设计用于皮下(SCIG)和肌内(IMIG)给药的制备物。如本文使用的术语“IVIG”有意涵盖IVIG、SCIG和IMIG制备物。IVIG制剂是熟知的，包括P、和

合并的人IgG制备物如IVIG制备物所共有的一个特点是它们都源自正常血浆或血清，它们含有的主要免疫球蛋白种类是IgG，例如在P和中至少98％的免疫球蛋白是IgG。相应地，合并的人IgG制备物如IVIG可以被看作IgG的浓缩制备物。

在一个优选的实施方案中，IVIG含有至少5％w/v、至少10％w/v、至少20％w/v或至少25％的免疫球蛋白。

在WO2005/023867的表1中给出了IVIG制备物的实例。所有这些实例中优选IVIG制备物，其可以应用于本发明的上下文中。

本文定义的聚集人IgG被选择性标记，并且所述标记可以直接或间接地与聚集人IgG连接。“直接地”由此意为共价连接标记(其也可以包含连接子)，而间接地则包括通过结合至聚集人IgG的标记的第二实体的聚集人IgG的结合，所述标记的第二实体例如标记的结合结构域，如抗体或其片段(例如抗人抗体，如标记的第二抗人IgG抗体)。所述标记的第二抗体可以是任意可得到的抗IgG抗体，在下文实施例中，使用了藻红蛋白标记的山羊抗人IgG(Dianova,货号109-116-088)，然而许多其它市场上可购得的抗体将同样适用。尤其本发明的上下本中设想了“荧光标记”，但本发明并不限于此，即其它标记也同样被设想到(例如可以被用于免疫学方法如ELISA方法中的标记)。所述荧光标记优选选自量子点试剂、荧光蛋白、荧光染料、pH敏感型荧光染料、电压敏感型荧光染料和/或荧光标记微球。优选可被激光束激发且发射在规定的波长下的光的荧光标记，所述规定的波长可通过FACS仪器检测。

对于得到本发明的实验，使用商品并通过制备用尺寸排阻色谱(SEC)将聚集人IgG与单体和二聚体IgG相分离(详见下文详述和实施例2)。然而，任何其它如本文所述的“人蛋白”都可以被用作分离聚集人IgG的起点，例如目前德国市面上的Beriglobin、Varitect和Vendig是适合的产品，或者如本文所述的IgG制备物，其例如通过合并来自至少100、200、300、400、500或更多个、优选1000或更多个人供体的血浆的IgG制备。任何这些“起点”(包括如本文所述的人蛋白、(合并的)IgG制备物，例如IVIG)可以通过例如制备用尺寸排阻色谱(SEC)(详见下文详述和实施例2)被用于聚集人IgG的分离。美国食品和药品管理局(FDA)目前有10个已登记的产品。“人蛋白”例如Beriglobin作为原材料的使用是特别优选的，因为这为要在本发明的实施方案中用作标准的聚集人IgG产品提供了可控来源。聚集人IgG可以调整为具有0.35mg/mL-1.40mg/mL、优选0.5-1.35mg/ML的蛋白含量。技术人员可以想到，可以通过用适当的缓冲剂稀释或者例如通过超滤浓缩来调整蛋白含量。本发明的实施例1和2中提供了进一步的指导。

在用于测定含有可溶性人Fcγ受体IIa、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIa、IIB、IIIA和/或IIIB组成的组合物的稳定性的方法的最后一步中，结合至所述表面的且如本文所述测定的聚集人IgG的量与参考值进行比较。所述比较步骤允许所述组合物的稳定性按如下所述测定。

例如，其稳定性与也含有Fcγ受体的组合物相比较而测定的组合物的稳定性越高，则将结合至包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面的聚集IgG越少，因为聚集IgG将会被所述组合物包含的一个或多个可溶性人Fcγ受体结合。

另一方面，例如，将结合至包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面的聚集IgG越多，相较于如同其稳定性根据本文所述方法测定的组合物也包含Fcγ受体的组合物，所述组合物就越不稳定。然而，“较不稳定”并不意味着其稳定性进行测定的组合物没有价值。正相反，对于某些应用，可能希望具有例如与参考组合物相比较不稳定的组合物，因为可能希望具有其成分有较短的半衰期、较低的pH稳定性等等的组合物。

如所述，如同其稳定性根据本发明的方法测定的组合物也包含一个或多个人Fcγ受体的参考组合物，在本文被称为参考组合物。

对于所述参考组合物，反映被结合至表面的聚集人IgG的量的值如本文所述测定，使得所述值可作为参考值得到。因此，测定参考值并因此可在根据本发明的教导测定组合物的稳定性之前得到。相应地，继而可以将所述参考值与如本文所述测定的结合至表面的聚集人IgG的量相比较，所述量然后被转化成与参考值比较的值。通过该比较，可以测定组合物的稳定性。事实上，如所解释的，测定参考值并且所述参考值反映被表面结合的聚集人IgG的某个量。因此，参考值间接地反映了被所述组合物包含的一个或多个可溶性人Fc受体结合的IgG的量。

当然，只有当参考组合物以相当的量(理想情况下为相同的量)包含相同的一个或多个水溶性Fcγ受体时，所述参考组合物才可与其稳定性根据本发明的实施方案测定的组合物相当。

参考值可以反映如本文所述的组合物的稳定性，例如，关于如本文所述的Fcγ受体的温度稳定性、pH稳定性、贮存缓冲稳定性、放置稳定性、保质期、半衰期、抗降解稳定性(或降解抗性)、关于单体形式的稳定性等等。然而，测定组合物的哪种稳定性能或稳定性参数并不是决定性的，因为这可取决于例如需要和/或利益和/或组合物可能用于的目的。

事实上，本发明的方法并不限于测试任何可能影响稳定性的特定参数，原因是本发明的方法允许组合物的稳定性的一般读出(generalread-out)，因为其总是测定的被结合至如本文所述表面的聚集人IgG的量，或者替代地，其稳定性根据本发明的教导测定的组合物包含的一个或多个可溶性人Fcγ受体结合的聚集人IgG的量。

如上所述，结合至表面的聚集IgG越少，则组合物包含的一个或多个可溶性人Fcγ受体越有效力或仍然有效力。例如，当对组合物的pH稳定性感兴趣时，技术人员可以使这样的组合物经受各种pH条件，然后在表面与所述组合物接触的同时测试结合至表面的聚集人IgG。假设所述组合物是稳定的，例如针对酸性pH稳定，一个或多个可溶性人Fcγ受体将仍然能够结合聚集人IgG，因此结合至如本文所述表面的聚集IgG较少。当然，技术人员知道在执行本发明的方法时，可能需要在已测试pH稳定性后应用适合的缓冲剂。例如，过酸或过碱的环境可能干扰本文所述的方法，因而在应用所述方法之前，技术人员可能需要通过本领域公知的手段和方法调节或调整缓冲条件。

另外例如，如果技术人员对具有长的保质期或降解抗性的组合物感兴趣，他会将该组合物用作参考组合物，并在已贮存所述组合物例如1个月、2个月、6个月或12个月测定结合至如本文所述表面的聚集IgG的量，并将该值用作用于组合物所需性能的参考值。此后，将反映例如长的保质期或降解抗性的所述参考值与反映如本文所述表面也与其稳定性通过本发明的方法测定的组合物接触时结合至所述表面的聚集人IgG的量的值相比较。

例如在贮存12个月后测定的并且被视为满足从业者预期的参考值可以被设置为例如100，将100作为相对值，因为它仅反映结合至表面的聚集人IgG的某个量。

如果至少50％、优选60％或70％、更优选80％或90％的聚集人IgG未结合至表面，而是被测定稳定性的组合物包含的一个或多个可溶性人Fcγ受体结合，则参考值被视为是可接受的。具体地，如上所述，结合至表面的聚集人IgG越少，被一个或多个可溶性Fcγ受体结合的聚集人IgG越多，反之亦然。相应地，组合物的稳定性越高，被表面结合、而不是被一个或多个可溶性人Fcγ受体结合的聚集人IgG越少。相反地，组合物的稳定性越低，被表面结合的聚集人IgG越多，而被一个或多个可溶性人Fcγ受体结合的聚集人IgG越少。

本发明还涵盖用于通过尺寸排阻色谱从至少500个(健康的或“标准的”)捐赠者的混合血浆中分离聚集人IgG的方法。

还设想，本发明的聚集人IgG通过相应的非人灵长类动物的IgG制备物补充或替换，所述非人灵长类动物例如食蟹猴、绒属、猕猴、sanguis或类似的动物。

本发明的“可溶性人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB”为例如在EP1135486和EP1642974及EP1446139中所描述的那些。在一个优选的实施方案中，本发明的“可溶性人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB”以跨膜结构域和信号肽缺失为特征。一个优选的实施方案中，本发明要求保护的可溶性FcγR包括对应于由各自的核酸序列SEQIDNO.:2、4、6、8和10编码的SEQIDNO.:1(SM101，重组人FcγRIIB)、SEQIDNO.:3(FcγRIIB)、SEQIDNO.:5(FcγRIIA)、SEQIDNO.:7(FcγRIIIA)或SEQIDNO.:9(FcγRIIIB)的氨基酸序列的氨基酸序列，或由对应于由各自的核酸序列SEQIDNO.:2、4、6、8和10编码的SEQIDNO.:1(SM101，重组人FcγRIIB)、SEQIDNO.:3(FcγRIIB)、SEQIDNO.:5(FcγRIIA)、SEQIDNO.:7(FcγRIIIA)或SEQIDNO.:9(FcγRIIIB)的氨基酸序列的氨基酸序列组成。本发明还涵盖与SEQIDNo.:1、3、5、7或9的蛋白质具有至少90％、优选95％同一性的可溶性FcγR。为了测定序列同一性，通过以提供氨基酸的最大对应性的方式比对序列来进行比较。在本发明一个优选的实施方案中，所述可溶性人Fcγ受体为FcγRIIB(SEQIDNO.:3)。在一个更优选的实施方案中，所述可溶性人受体为SM101(SEQIDNO.:1)，它是一种可溶性FcγRIIB受体。在本发明方法中一个进一步优选的实施方案中，一次应当只有一种可溶性受体(或者如上所述与感兴趣的受体都具有至少90％同一性的蛋白质的混合物)被测试。

本发明引用的序列如下所述。

SEQIDNo.1(SM101)

SEQIDNo.2(SM101,cDNA)

SEQIDNo.3(人FcγRIIB)

SEQIDNo.4(人FcγRIIB,cDNA)

SEQIDNo.5(人FcγRIIA)

SEQIDNo.6(人FcγRIIA,cDNA)

SEQIDNo.7(人FcγRIIIA)

SEQIDNo.8(人FcγRIIIA,cDNA)

SEQIDNo.9(人FcγRIIIB)

SEQIDNo.10(人FcγRIIIB,cDNA)

虽然本发明的实施方案是针对人Fcγ，但是它们也可以应用于其它哺乳动物的Fcγ，尤其对于来自小鼠或灵长类动物例如猴子的那些FcγR。

“包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面”在一些实施方案中是或者包含细胞或细胞系，优选表达一个或多个人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的哺乳动物细胞或者哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，这些细胞在缺乏任何其它人Fcγ受体时，即这些细胞/细胞系仅表达一种FcγR时表达人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA或IIIB。特别优选地，所述包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面，实质上包含或者甚至排他地包含人FcγRIIB。在一个进一步优选的实施方案中，所述表面包含的人Fcγ受体的亚型和所述可溶性人Fcγ受体的组合物包含的人Fcγ受体的亚型是相同的。当FcγRIIB正在被测试时，细胞优选只表达FcγRIIB，例如Raji类淋巴母细胞系(CCL-86，ATCC)。对于FcγRIIA，可以使用红白血病细胞系K562(CCL-243，ATCC)，并且对于FcγRIIIA，可以使用NKL细胞系(Robertson等人,Exp.Haematol.1996,24(3):406-15)。作为替代地，可以使用由感兴趣的FcR转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。用于转染CHO细胞以表达感兴趣的蛋白的方法是本领域熟知的，这个方法例如在Bruhns等人,Blood2009,113:3716-3725中有所描述。

还设想“包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面”是或者包括可以被涂布人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的固体表面。由此“固体表面”包括例如可被磁性吸引的颗粒物(珠子)或者例如ELISA板或Biacore检测单元的平坦表面。所述表面的材料可以是任意适宜的固体材料，例如可应用于各自的方法的塑料、聚合物、金属、玻璃等等。通过技术人员熟知的标准方法将蛋白质如人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB涂布至固体表面(例如，平坦表面或微粒表面)。由于无需在细胞表面上生物表达(这将需要膜锚定点)，固体表面的涂布可以用本发明的“人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB”和/或“可溶性人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB”进行。

在一个优选的实施方案中，本发明依赖于聚集人IgG在用于测定可溶性人Fcγ受体的结合活性的体外方法中的用途。本发明方法的第一步包括使来自仅表达人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA或IIIB中的一种的细胞系的哺乳动物细胞(优选在不存在任何其它Fcγ受体的情况下)与设置量的聚集人IgG和设置量的相应的可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA或IIIB接触。优选地，所述方法的第一步中选择的哺乳动物细胞仅表达感兴趣的Fcγ受体，并且如果可能，不存在其它的Fcγ受体，因为其他结合至IgG的受体的存在可干扰正在被测试的可溶性FcγR的活性。

“测定结合至所述表面的聚集人IgG的量”指的是结合至表面的聚集人IgG的量的量度或定量，即在本发明上下文中优选测量的是结合至包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面的聚集人IgG的量。所述结合的聚集人IgG例如通过间接标记(例如，抗人IgG结合结构域)的方式或者通过直接标记(即，如本文其它地方所说明的，聚集人IgG是直接标记的)的方式测定。例如，结合至聚集人IgG的低水平的被标记的第二抗体表明了可溶性FcγR与聚集人IgG的高水平的结合，反之亦然。

可替代地或者另外地，同样可以分析、测量或定量通过洗涤(在本发明方法的步骤(c)之前)而移除的聚集人IgG的量——所述聚集人IgG被结合至感兴趣的可溶性FcγR(其包含在组合物中)并被与其一同洗掉。

本发明方法中的“接触步骤”涉及使表面、受体和聚集人IgG与彼此物理接触，使得它们可以结合至彼此。这一步可涉及孵育步骤，使得试剂有时间反应。

术语“设置量”仅指出相应试剂的量应该是固定的，以使得可以估计或甚至定量结果。例如并且可以从下文实施例中看出，标准量的聚集人IgG在可溶性受体的一系列稀释下使用，使得可以测定可溶性受体抑制聚集人IgG与表面的结合时的量。

本发明方法中的洗涤步骤涉及在步骤(c)之前通过“洗涤”移除未结合的聚集人IgG和未结合的可溶性人FcγR。应当注意的是，这个步骤是指移除未结合至本方法所用表面的试剂。洗涤步骤可以用任何标准缓冲剂进行，例如下文实施例中使用的FACS缓冲剂。

当应用于一系列稀释的本发明的可溶性FcγR时，标记的“检测”允许测定可溶性FcγR的IC₅₀。“半数最大抑制浓度(IC₅₀)”是对组合物抑制生物学或生物化学功能的有效性的量度。这种定量量度指示了半数抑制给定生物学过程需要多少特定药物或其它物质。换言之，这就是物质的半数最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC或IC₅₀)。它通常被用作药理学研究中拮抗剂药物效力的量度。根据FDA，IC₅₀代表体外50％抑制所需的药物浓度。因此在本发明的上下文中，与所述方法中使用的聚集IgG的量相比较，结合至哺乳动物细胞的聚集IgG的量允许测定抑制50％的与细胞的聚集IgG结合所需的FcγR的量。同样地，可以测量IC₉₅，IC₉₅是抑制95％的与细胞的IgG结合所需的量。本领域技术人员可以使用任何其它用于该数据的评价技术，例如根据欧洲药典5.0，2005年版，第5.3章(“生物测定与测试的结果的统计学分析”)中的四参数逻辑方法(4PL)。

在本发明体外方法的一个特别优选的实施方案中，所述可溶性人受体为FcγRIIB(SEQIDNO.:3)，甚至更优选为SM101(SEQIDNO.:1)，所述细胞为Raji细胞，所述聚集人IgG分离自人IgG制备物如并且第二抗体具有荧光标记，所述荧光标记可被激光束激发且发射在规定的波长下的光，所述规定的波长可通过FACS仪器检测。

本发明还涉及一种包括本发明的表面和/或本发明的聚集人IgG的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包括进行本发明的方法所需的工具(例如，标记、缓冲剂、参考值、对照品、标准品等等)。

本发明还涉及本文所公开的聚集人IgG。

在下文所述的实验中，使用本发明的体外方法发现，SM101(可溶性人FcγRIIB，SEQIDNO.:1)在Raji细胞上与细胞结合的FcγRIIB竞争与聚集IgG的结合，并且提高加入到恒定量的细胞和聚集Beriglobin中的SM101的浓度，导致与膜结合FcγRIIB的聚集IgG结合的渐进抑制。这个测试允许测定医学或诊断学应用所需的SM101的可能剂量。所述方法也能够被用于SM101的质量控制以确保不同批次具有恒定的结合活性。同样地，所述方法也可被应用于任何其它可溶性FcγR，以便测定可能的剂量及作为质量控制以确保不同批次的可溶性FcγR具有相同的结合活性。因此，本发明的体外方法提供了一种用于可溶性FcγR的结合活性的新的测试，所述测试基于聚集IgG能够在体外被用于模拟IgG免疫复合物的这一发现。

具体地，在下文的实施例1中，本发明的体外方法(也被称为“SM101的基于细胞的效力测定”)允许测定SM101的生物学功能/活性。建立的人B细胞系Raji和多克隆聚集人IgG(Beriglobin，聚集级分)的使用代表了用于通过基于细胞的测定分析SM101活性的优异的设定(set-up)。在这些实施例中，在几个独立的FACS实验中，SM101已显示出对聚集人IgG与Raji细胞上的膜结合FcγRIIB的结合的抑制。一系列稀释的SM101被用于测定其IC₅₀值。在下文的实施例1中，使用终浓度为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01565、0.0078、0.0039、0.00195μg/μl的一系列稀释，虽然也可以使用系列1.3664、0.80、0.40、0.20、0.10、0.06、0.036、0.0216、0.01296、0.00648、0.003888、0.001944μg/μL或者任何其它允许在感兴趣的区域中的线性曲线的稀释系列。测得的表观K_D值0.98x10^-6M是与在文献中使用源自昆虫细胞的(糖基化的)可溶性FcγRIIB发现的数据1.4x10^-6M(Sondermann等人,Biochemistry1999,38(26):8469-77)或者使用来自大肠杆菌的重组sFcγRIIB发现的数据1.67x10^-6M(Maenaka等人,JBiolChem.2001,276(48):44898-904)相当的。计算出的SM101的IC₅₀值17.7μg/mL(实施例1)与如在其它测定测得的IC₅₀值相符。

在实施例1.6中，发明人能够证明研究型医疗产品SM101的生物学活性与参考标准相当。具体地，关于要求保护的测定结合活性的方法，实施例1提供了用于使用Raji细胞的可溶性人FcγRIIB的详细操作方案。技术人员可以清楚地意识到使这种方法适应于其它受体和细胞类型的必需调整。实施例1中使用的示例性操作方案在下文复述，但是技术人员可以清楚地意识到在此操作方案上的可能变化：

1、测定Raji细胞培养物的细胞浓度；

2、通过离心收获Raji细胞；

3、在孔板上制备Fcγ受体(例如SM101)浓度系列；

4、制备聚集Beriglobin缓冲液，即“聚集Beri-Mix”；

5、将来自步骤2的Raji细胞在来自步骤4的“聚集Beri-Mix”中重悬；

6、将Raji细胞悬浮液加至含有Fcγ受体(例如SM101)浓度系列的每个孔中；

7、在冰上孵育；

8、将“FACS-缓冲剂”加至每个孔，并离心；

9、弃去上清液；

10、将第二抗体-mix加至每个孔；

11、加入“FACS-缓冲剂”并离心；

12、弃去上清液；

13、加入“FACS-缓冲剂”并转移样品至聚苯乙烯管，以及在FACS上分析。

实施例2提供了一种用于从Beriglobin中分离聚集IgG的具体方法。再次，技术人员能够清楚地意识到将带来相似结果的此方法的可能变化。具体地，用于产生本文所公开的聚集IgG的方法可以总结为以下步骤：

1、用PBS-N将160mg/mL调整为100mg/mL；

2、通过制备用SEC(尺寸排阻色谱)使用能够将聚集IgG与单体或二聚体IgG相分离的柱子，例如柱子：Superdex20010/300GL，流动相：5mMHis、150mMNaClpH6.5、0.01％(w/v)NaN₃，在室温下流速0.5ml/min，注射：以0.4g/l的100μl(见图12)，进行分离；

3、测定聚集IgG级分的蛋白含量；

4、任选地：如果含量<0.50mg/mL，通过超滤进行浓缩，或者如果含量>1.40mg/mL，用PBS-N(含0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水)进行稀释；

5、调整至20％(v/v)甘油；

6、以0.5mL进行分装并在液氮中速冻。

前文提及的用于分离聚集IgG的方法也适用于任何其它人IgG制备物，例如，如在本领域中可得到的或在本文中所描述的。

在实施例3中，测试根据实施例2分离得到的聚集IgG的含量和纯度。因此，实施例2和3就要被用于本发明方法中的聚集IgG为技术人员提供了具体指导。具体地，以1mL/min使用SEC(尺寸排阻色谱)，使用PBS-N(含0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水)作为缓冲液，在使用Superdex200,HiLoad26/60,GEHealthcare、使用Explorer10FPLC或任何其它适合的FPLC时，在大约115mL后发现聚集IgG洗脱。然后根据实施例3的步骤1测量洗脱液的蛋白含量，如有必要，将蛋白含量调整为0.30-1.4mg/mL、优选0.50-1.35mg/ml、甚至更优选的值。此后，根据实施例2的方法步骤2测量聚集IgG的纯度含量，确定聚集/低聚体IgG的相对峰面积为至少70％，优选至少80％、90％以及更优选至少95％。

本发明方法的稳健性在预验证实验(实施例4-10)中进一步研究，测试所用聚集IgG的质量的影响、在测试样品中不同量的单体IgG的效果、膜结合FcγRIIB在培育的或新鲜解冻的Raji细胞上表达的稳定性、在Raji上通过单克隆抗体阻滞膜结合FcγRIIB的效果以及在Raji细胞上所用抗人第二抗体背景染色的稳定性。通过比较获得的n＝25个实验的表观K_D和IC₅₀的平均值，评价测定间和测定内的稳定性。因此可以得出结论，本发明的体外方法(基于细胞的效力测定)是适于评价与参考标准相比较新批次的SM101的效力的工具。

在实施例中描述的上述结果和具体方法与操作方案也可以适用于FcγRIIA、FcγRIIIA或FcγIIIB与适合的细胞例如对于FcγRIIA的人红白血病细胞系K562或者对于FcγRIIIA的人NKL细胞的组合。可替代地，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)可以用感兴趣的FcγR转染并用于本发明的体外方法中。关于制备实施例2的聚集IgG和实施例3的对照品的方法，这些方法同样适用于其它市场上的人IgG配制物产品，例如Varitect或Venbig，其可被用于代替Beriglobin。

在本说明书的文本各处引用了若干文件。本文在上文或下文所引用的每份文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明、使用说明等等)在此以其全文并入本文作为参考。本文的任何内容不得解释为承认本发明无权先于凭借在先发明的这些公开内容。

应当特别注意的是，如本文所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数指代，除非上下文另有清楚说明。因此，例如，提到的“试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，而提到的“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的可以改进或替代本文所述方法的那些的等同步骤和方法。

除非另有说明，用在一系列要素前面的术语“至少”应当理解为是指系列中的每个要素。本领域技术人员将会意识到或者能够使用不超过例行试验而确定，许多与本文描述的发明的具体实施方案的等同物。预期这类等同物被本发明涵盖。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包含/包括”及其变形应当理解为是指包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其它的整数或步骤或者整数或步骤的组。本文使用的术语“包含/包括”可以被术语“含有”或有时在本文使用的术语“具有/有”替代。

本文使用的“由……组成”排除任何未在要求保护的要素中具体规定的元素、步骤或成分。本文使用的“实质上由……组成”并不排除不实质影响权利要求的基础和新颖性特征的材料或步骤。

如本文所描述的，“优选的实施方案”意为“本发明的优选的实施方案”。同样地，如本文所描述的，“多种实施方案”和“另一个实施方案”分别意为“本发明的多种实施方案”和“本发明的另一个实施方案”。

附图说明

附图展示了：

图1：FACS分析的门控策略，其显示了1x105Raji细胞的SSC-A/FSC-A。G1包含活细胞(总细胞的94.9％)。在不存在SM101的情况下，将活细胞用于分析第二抗体(αhuIgG(H+L)-PE)与膜结合的聚集人IgG(聚集Beriglobin)的结合。包括的点图仅用于说明群体分布，最右边的直方图描绘了具有结合的人聚集IgG(聚集Beriglobin)的Raji细胞。

图2：与不同浓度SM101(可溶性人FcγRIIB)(最低浓度为0μg/μL，样品的浓度范围为0.0078-0.5μg/μl)孵育的样品的叠加直方图。在叠加处，相应的直方图在阴性对照(仅用第二抗体染色(＝sekAK，暗红色)的方向上移动指示了人聚集IgG(聚集Beriglobin)与细胞结合的抑制。样品PE-A荧光的中值显示在右边。

图3：以不同浓度的鸡血清白蛋白(CSA)代替SM101(最低浓度为0μg/μL，样品的浓度范围为0.0078-0.5μg/μl)的对照实验的叠加直方图。阴性对照(SM101_sekAK.fcs；仅用第二抗体给细胞染色，暗红色)。

图4：将标准化的测得的来自实施例1表1的中值用Langmuir等式拟合。

图5：用sigmoidlogistic函数拟合的数据，其使用来自FACS实验7(FACS007)的数据显示了相对于SM101质量浓度(μg/μL)的％抑制。

图6：数据的Langmuir-图，其与标准化的测得的如在表3中计算的SM101参考标准和SM101IMP的中值(数据来自FACS021)拟合。

图7：通过制备用SEC纯化聚集IgG。显示了洗脱液在280(上部示踪)、260nm(下部示踪)的光密度和传导率(conductivity)(线性示踪)。合并的聚集人IgG级分以灰色阴影显示。

图8：多种聚集人IgG级分的分析用SEC。示出了以下的色谱图：注入空白缓冲剂后(底部示踪，线性)；注入50μg来自的单体IgG(对应于在参考(c.f.)的制备用SEC色谱中在约180mL处的峰)后(最高峰示踪)；注入50μg来自的二聚体IgG(对应于在参考(c.f.)的制备用SEC色谱中在约145mL处的峰)后(最低峰示踪)；注入24μg来自批次27/10/10的聚集/低聚体IgG后(较低的重叠第一峰)；和注入24μg来自批次15/07/11的聚集/低聚体IgG后(较高的重叠第一峰)。呈现了完整的色谱图(a)和局部放大的色谱图(b)。

图9a/b：来自批次27/10/10(a)和批次15/07/11(b)的聚集人IgG的分析用SEC色谱的示例性整合。

图10：各种量的和不同批次的(Beri1、Beri2或者Beri3)的结合至活Raji细胞的聚集人IgG的FACS分析。

图11：

(a)聚集IgG与Raji细胞的结合的pH依赖性(中值MFI)。

(b)pH依赖性的中值MFI。图示出样品的中值MFI-第二抗体(对照)的中值MFI。

图12：从两种可得到的合并的IgG制备物(Beriglobin，批号26840311A，和Subcuvia，批号BVNG1M032A)中分离聚集IgG，柱子：Superdex20010/300GK；流动相：5mMHis、150mMNaClpH6.5、0.01％(w/v)NaN₃；流速：室温下0.5ml/min；注入：以0.4g/l的100μl。

具体实施方式

以下实施例示例本发明。这些实施例不应被理解为限制本发明的范围。所包括的实施例是为了说明，而本发明仅受权利要求的限制。以下缩写被用于实施例中(和说明书中)：

g地球重力加速度

C高效液相色谱

MWCO以kDa计的截留分子量

PBS-N含0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水

rpm转/分钟

SEC尺寸排阻色谱

FSC前向散射

SSC侧向散射

IgG免疫球蛋白G

PE藻红蛋白

FACS荧光激活细胞分选

DSMZ德国微生物菌种保藏中心

ELISA酶联免疫吸附测定

IMP研究型医疗产品

AU吸光度单位

实施例1

1.1实验概述

在这个实施例中，本发明的体外方法(也被称为FACS效力测定)被用于测定SM101(可溶性人FcγRIIB，sFcγRIIB)的结合活性。

具体地，表达FcγRIIB的细胞系Raji的人细胞(DSMZ#ACC319，人伯基特氏淋巴瘤)与恒定量的聚集配体(人IgG)和不同量的SM101(即sFcγRIIBSEQIDNO.:1)一起孵育。SM101与细胞结合的FcγRIIB蛋白竞争，细胞结合的FcγRIIB蛋白代表唯一在Raji上表达的(与IgG结合的)Fcγ受体。

被表达FcγRIIB的细胞结合的聚集IgG能够通过荧光标记多克隆第二抗体的方法检测，所述方法识别人IgG的重链和轻链，继而通过FACS分析细胞。提高加入到恒定量的细胞和聚集IgG中的SM101的浓度，导致与膜结合FcγRIIB的IgG结合的渐进抑制。具有未染色细胞以及只与第二抗体孵育的细胞的平行对照样品被用于测定所用细胞和非特异性结合的第二抗体的自发荧光。

FACS分析通过在Becton,Dickinson&Company(BD)FACS-Canto-II仪器上使用BDFACS-Diva软件记录1x10⁴活细胞进行。使用FlowJo软件(TreestarInc.OR/USA)评估数据。

1.2材料：

-培养板：U型96孔(Cellstar,#650180)

-管：15mLFalcon管

5mL聚苯乙烯12x75mm(BD,#352054)

-移液管：无菌，过滤10mL、5mL(TPP#94010、94005)，有刻度的过滤枪头1-200μL、101-1000μL(StarLab,#S1120-8810和S1126-7810)

-微孔板胶带(83mm、66m、Permacel,#25082)

-SM101(sFcγRIIB)参考标准：

8.2mg/mL，416μM，贮存于-80℃下

-FACS-缓冲液：

HBSS(Gibco,#14175)+5％FCS(Gibco,#10270-106)+0.01％(w/v)叠氮化钠(Merck)

-细胞培养基：

TM培养基：

RPMI(Gibco,#31570)+1％MEMNEA(Gibco,#11140)+1％丙酮酸钠(Gibco,#11360)+2mMGlutaMAX-I(200mM原液,Gibco,#35050-061)+10％FCS(Gibco,#10270-106)

-IgG(聚集Beriglobin)：

IgG0.96mg/mL，在PBS/0.02％(w/v)叠氮化钠及20％(v/v)甘油中，贮存于-80℃下。通过尺寸排阻色谱在Superdex-200(16/60)或Superdex200(10/300)GL上分离。起始原料：(ZLBBehringGmbH,Ch.-B.23840311B或者Ch.-B.26840311A；5mL安瓿)或者Ch.-B.BVNG1M032A

-第二抗体：

山羊抗人IgG(H+L)藻红蛋白缀合(Fab)₂片段(Dianova,Cat.No109-116-088)。

1.3操作方案：

1、测定具有0.2-1.0x10⁶细胞/mL密度的Raji细胞培养物的细胞浓度；

2、收集1.2x10⁶Raji细胞，在15mLFalcon管中以477xg离心5分钟；

3、此后，所有步骤应在冰上或4℃下进行；

4、在96孔板(U型底)中制备开始于1.0μg/μLSM101、结束于0.0039μg/μL(稀释剂：“FACS-缓冲剂”)的SM101浓度系列，以及通过将50μLTM培养基加入到相应的对照孔中制备对照样品(0μg/μLSM101仅用于第二抗体)；

5、在FACS-缓冲剂中制备500μL的50μg/mL聚集Beriglobin(例如，通过将26.04μL的0.96μg/μL原液加到473.96μLFACS-缓冲剂中)，即“聚集Beri-Mix”；

6、在来自步骤5的500μL“聚集Beri-Mix”中重悬来自步骤2的1.2x10⁶Raji细胞并彻底混合(涡旋、30s、中速)；

7、将50μLRaji细胞混悬液加到含有50μLSM101浓度系列的每个孔及对照孔中(终体积为100μL)；

8、在冰上于黑暗中孵育30分钟；

9、将150μL“FACS-缓冲剂”加至每个孔，用胶带将孔密封并以513xg离心5分钟；

10、在“FACS-缓冲剂”中制备1mL1/100的第二抗体混合物；

11、弃去上清液，并将板短暂涡旋，同时孔上密封以避免交叉污染；

12、将50μL第二抗体-mix加至每个孔，未染色的对照孔除外；

13、在冰上于黑暗处孵育30分钟；

14、加入150μL“FACS-缓冲剂”并以513xg离心10分钟；

15、弃去上清液并将板短暂涡旋，同时板上密封；

16、加入150μL“FACS-缓冲剂”并将样品转移至5mL聚苯乙烯管，并在BDFACS-CantoII(使用BDDiva软件v.6.0)上进行分析。

1.4SM101的浓度系列(终浓度)：

0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01565、0.0078、0.0039、0.00195μg/μL；

终体积(V_END)＝100μL

1.5FACS数据分析

FACS数据被记录在BDFACS-CantoII上，以fcs文件格式保存数据。使用Flow-Jo软件(v.8.8.4)进行后续分析。图1描述了典型的门控策略。

对活细胞进行门控并对其藻红蛋白荧光进行评价。使用FlowJo软件将来自SM101浓度系列的样品的直方图在叠加直方图上分组。通过软件计算每个样品的平均荧光值(图2)。图2显示了对聚集IgG与Raji细胞上膜结合FcγRIIB的结合的强浓度依赖性抑制。在一个平行实验中，SM101被等量的使用上述浓度系列相同的鸡血清白蛋白所替代以确认SM101的特异性抑制(图3)。如在图2所示展示实验所证明的，本发明的体外方法提供了一种基于细胞的定性方法以评价SM101的结合活性。

1.6计算活性

为了计算在此细胞测定中SM101的活性，使用下述公式对中值荧光强度信号进行标准化(标准化后的数据在表1中显示)：

％标准化的信号＝(信号_{(0μg/μLSM101)}–信号_(x))/(信号_{(0μg/μLSM101)}–信号_{(第二抗体)})

表1：为FACS测量而计算得到的标准化值在图2中显示，所述标准化的值被用于Langmuir等温式的后续拟合。

数据用Langmuir-结合-等温式

％抑制＝(c*最大抑制)/(K_D+c)

的后续拟合使用Excel中的Solver-add-in函数执行，以测定表观K_D和最大抑制，得到如图4所示的抑制曲线。由于无法考虑FcγRIIB在Raji细胞上的未知细胞表面浓度以及游离的SM101的浓度，表观K_D可能与实际K_D不同。对于％抑制，使用％标准化的信号，c＝可溶性FcR的浓度(摩尔浓度或质量浓度)。使用Excel中的Solver-add-in函数或者任何其它允许这种计算类型的计算机程序进行公式拟合，以得到最大抑制和K_D。

使用这种拟合策略，FACS数据显示表观K_D为0.99x10^-6M，平方残差的和为0.0226(表2)。

表2：将来自FACS007的数据用Langmuir等式进行拟合得到的参数。

使用分析软件Microcal^TMOrigin(版本：6.0)计算来自FACS数据的SM101的IC₅₀。相对于竞争性SM101的浓度标绘％抑制。将数据用SigmoidLogistic函数拟合：

y = A 2 + \frac{A 1 - A 2}{1 + {(\frac{x}{x_{0}})}^{p}}

A2：100％抑制(最大抑制)

A1：0％抑制(最小抑制)

X0：IC₅₀

p：斜率

将参数A1设为0，将参数A2设为100，计算IC₅₀。

使用来自表1(FACS007)的数据，斜率取1.63，估算IC₅₀为17.7μg/mL(图5)。

1.7参考标准与SM101的比较

在后续实验中，调查研究型医疗产品SM101(sFcγRIIB)的生物学活性并将其与药物参考标准(FACS021)相比较。基于FACS的效力测定如上文1.4项中所述针对平行放置于单个96孔板中的IMP和参考标准进行。

FACS数据如上文1.5项所述被记录和分析，并使用上文概述的Langmuir-结合-等温式进行数据的拟合(下文表3和图6)。

表3：从FACS测量中获得的值用于Langmuir等温式的拟合(数据来自FACS021)。

FACS数据显示，对于SM101参考标准，表观K_D为0.739x10^-6M，对于SM101IMP，表观K_D为0.904x10^-6M(表4)。

表4：对于来自表3、图6(FACS021)的数据进行Langmuir-和Sigmoidlogistic函数拟合所获得的参数。

使用分析软件Microcal^TMOrigin(版本：6.0)计算来自使用如上所述的sigmoidlogistic函数的FACS分析数据的SM101参考标准和IMP的IC₅₀。SM101参考标准显示IC₅₀为12.9μg/mL，SM101IMP的IC₅₀为16.2μg/mL(表4)。

考虑到在细胞测定中+/-20％的测定间偏差是可以接受的，由此可以得出结论，如在基于FACS的效力测定中测得的，IMP的生物学活性与SM101的药物参考标准相当。

实施例2

在这个实施例中描述了用于从市售IVIG即Beriglobin制备聚集IgG的方法。聚集IgG是用于本发明的用于测定可溶性人Fcγ受体的结合活性的体外方法的原材料。在这个实验中，所用的试剂如下所示：

用于制备聚集IgG的方法可以总结为以下步骤：

1、用PBS-N将160mg/mL调整为100mg/mL；

2、通过制备用SEC进行分离；

3、测定蛋白含量；

5、调整至20％(v/v)甘油；

6、以0.5mL进行分装并在液氮中速冻。

具体地，将5mL160mg/mL与3mLPBS-N小心地混合直至获得均一的溶液。将3.0mL稀释液以1mL/min的流量注入(Explorer10,GEHealthcare)到Superdex200HiLoad26/60柱子(GEHealthcare)上，所述柱子预先在PBS-N中平衡。使用PBS-N作为缓冲剂以1mL/min分离蛋白质。聚集IgG在约115mL后洗脱并且当洗脱液在280nm处的光密度超过50mAU后以3mL的级分收集。合并前三个级分，将其在2-8℃下贮存最多三天直到将它们与来自另外的SEC运行的合并物混合。如果来自所有SEC运行的聚集IgG合并物的蛋白含量在0.50mg/mL以下，所述合并物必须通过超滤浓缩至1.00-1.40mg/mL(AmiconUltra,Ultracel100kDaMWCO,Millipore)。如果聚集IgG合并物的蛋白含量在1.40mg/mL以上，用PBS-N将所述合并物稀释至1.40mg/mL。最后在不断搅拌(500rpm)下滴加冷冻保护剂甘油至终浓度为20％(v/v)。测定调整后的聚集合并物的含量以了解释放情况，并将该合并物以0.5mL分装在1.5mL反应管(Safe密封管，Sarstedt)中。分装品在液氮中速冻并贮存于-60℃～-80℃下。纯化的结果在图7中显示，其中阴影面积代表了合并的聚集IgG级分。

实施例3

在这个实施例中描述了用于测试根据实施例2的方法制备的聚集IgG的质量的方法。在第一步中，测量聚集级分的含量。在第二步中，通过分析用SEC测试聚集的纯度。第二步用冷冻的聚集分装品进行。冷冻的分装品在使用前必须在室温(25±2℃)下缓慢振摇(500rpm(转/分钟),ThermomixerR,Eppendorf)解冻。

为了在批次不一致的情况下使测试工作量最少，质量测试分步进行。下列测试以测试的每个步骤进行：

第一步：通过UV/VIS光谱测量含量

根据实施例1的方法产生的聚集级分的含量然后可以通过UV/VIS光谱测定。如果必要，用相应的缓冲剂稀释蛋白溶液以得到在280nm处为0.2-0.8的光密度。将400μL溶液转移至UV微量吸收池(UV微比色皿，Brand)。针对作为空白的PBS-N记录在280nm和320nm处的吸光度(Cary100Bio,Varian)，并根据下述等式计算以mg/mL计的浓度：

测定一式三份进行，结果取平均值。

第二步：通过分析用SEC测定纯度

通过分析用SEC测定相对于二聚体和单体形式的聚集/低聚体的量。使用1200系列HPLC系统(Agilent)，其装配有预先在PBS-N中平衡的Superdex20010/300GL柱子(GEHealthcare)。将150μL新鲜解冻的聚集分装品离心(20′000·g,5min)并以0.5mL/min的流量注射50μL上清液。使用PBS-N作为缓冲剂以0.5mL/min的流量分离蛋白质并监测洗脱液在280nm处的吸光度。总运行时间限制为50min。在聚集的每次注射之前先注射50μLPBS-N、20％甘油。色谱图是手工整合的，纯度以与来自13.0min-30.0min的所有峰相比较的聚集/低聚体峰的相对面积记录。各种级分的分析用SEC在图8中显示。图9a和9b显示了来自2个聚集批次的分析用SEC色谱图的示例性整合。

实施例4

在这个实施例中，进行实验以测定聚集的数量和质量在与Raji细胞结合方面的假定影响。实验使用不同量的聚集和不同批次的Beriglobin进行。

测试的聚集的浓度包括20、10、5、3和2.5μg/1x10⁵细胞。在后续实验中，第二抗体(αhuIgG(H+L)-PE)的浓度相伴变化，以测定第二抗体与聚集相比较是否过量可得(图10)。

如从图10中可以看出，与Raji细胞的结合并不受聚集的量的限制，即便在最低浓度下也是如此。每1x10⁵细胞2.5μg的量(V_end＝100μL)对于与细胞上可用受体的定量结合来说是足够的。

表5显示了不同批次的聚集(#1、2、3)的平均荧光强度(MFI)的中值、计算得到的平均值(Mean)和标准偏差(SD)。

实施例5

在这个实验中，研究了聚集与Raji细胞结合的pH依赖性。用于如实施例1所述的本发明方法(FACS效力测定)的培养基含有RPMI、MEM、丙酮酸钠、10％FSC和L-谷氨酰胺源(Glutamax-I,Gibco)。L-谷氨酰胺随着时间推移降解为PCA和NH₃，导致碱性pH。虽然Glutamax-I具有降低的降解趋势，但是培养基的pH随着时间的推移碱性更强。为了测试聚集与Raji细胞结合的pH依赖性，将0.1E6Raji细胞与2.5μg聚集在不同的pH条件(pH6.5、6.7、7.0、7.2、7.8、8.0、8.5、9.0、10.0)下孵育，并在FACS测定中使用1/200αhuIgG(H+L)-PE第二抗体评价聚集与细胞的结合。从图11(a)和11(b)中可以看出，聚集与Raji细胞的结合存在依赖性，表观最佳为在所测试的pH条件中的pH6.5。由于预期对细胞的有害作用，未测试更低的pH条件。因此必须确保只有pH为7.0±0.25的新鲜培养基用于该测试。在测定中优选使用FACS-缓冲剂(HBSS+5％FCS+0.01％(w/v)叠氮化钠,pH6.5-6.8)代替TM培养基作为稀释剂。

实施例6

在另外的实验中测试单体人IgG在与FcγRIIB阳性细胞的IC结合被SM101竞争性抑制方面的作用。为了这个目的，Raji细胞或者与设置量的聚集(2.5μg/1x10⁵细胞)连同设置量的单体以及不同量的SM101(100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39μM)一起孵育，或者与设置量的聚集和SM101以及不同量的单体(3.3、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0μM)一起孵育。加入过量的第二抗体(将原液1/100稀释，20μL加入到1980μL，第二抗体的蛋白浓度：0.5μg/μL，相当于0.25μg/1x10⁵)。发现，在纳摩尔(nM)浓度范围，单体竞争性地抑制免疫复合物与Raji细胞的结合。虽然是在微摩尔(μM)浓度范围，但是SM101也展现了相同的效果。可以得出结论，单体结合至膜结合FcγRIIB，由此抑制聚集Beriglobin的结合。体系中聚集并活跃的分子的数目是未知的，因此并不清楚所观察到的效果是由于单体IgG与膜结合FcγRIIB的优先结合，还是由于加入的单体IgG在数量上超过了聚集单体IgG的最高浓度(3.3μM)对应于0.5μg/1x10⁵细胞，从而使得单体IgG不可能结合所有可得到的第二抗体。

实施例7

在这个实验中，测试关于第二抗体背景的MFI的测定间/测定内可再现性。在回顾分析中，对于第二抗体在Raji细胞上的背景染色的变化，评价n＝25个测试的数据。下文表7中显示了用抗人IgG(H+L)-PE第二抗体(1/100稀释)染色的Raji细胞的MFI、样品的平均值和标准偏差。颜色指示平行执行的实验(测定内稳定性)。

如从表6中可以看出，当分离实验(测定间稳定性)或者平行实验(测定内稳定性)与标准偏差(SD)为21％(SDMFI29，平均MFI134.9)比较时，用第二抗体(不加入聚集Beriglobin)染色的Raji细胞的MFI保持相当恒定。

实施例8

在这个实施例中，测试了关于表观K_D和IC₅₀的测定间/测定内可再现性。为了评估基于FACS的效力测定的测定内和测定间的稳定性，分析来自25个实验的数据集合以得到拟合的表观K_D和IC₅₀。在下文表7中显示了25个FACS实验的K_D、IC₅₀和Raji细胞在收获前的细胞密度。实验12-15和16-17代表了测定内的稳定性，因为K_D和IC₅₀的评估是在单个板上的独立测试中进行的。测试#4和6(以灰色突出显示)由于所测得的数据显示明显的异常值已从后续分析中排除。

如从表7中所示的数据可以得出结论，测定间和测定内的稳定性很高。不过必须要指出的是，从测试#18开始测得的K_D和IC₅₀值低很多。这与FACS-CantoII机器的新基线设置相关。

表8：来自表8的25个实验的K_D和IC₅₀的平均值、标准偏差以及平均偏差。

	K_D[10^-6M]	IC₅₀[μg/mL]
			平均值	0.53	10.6
标准偏差(SD)	0.26	4.7
			平均偏差(MeanD)	0.25	4.1

表8描述了表7中显示的所有25个实验的K_D(0.53x10^-6M)和IC₅₀(10.6μg/mL)的平均值。由此得到约50％的SD(SD＝0.26)。如果单独计算测试#1-17(排除明显的异常值#4和6)和#18-25的平均值，对于测试#1-17(平均K_D为0.68x10^-6M)，SD相当低，为29％，对于测试#18-25(平均K_D为0.26x10^-6M)，SD为26％(表9)。

表9：测试#1-17和#18-25的K_D和IC⁵⁰的平均值。

测试	#1-17	#18-25
				K_D[10^-6M]	IC₅₀IC₅₀[μg/mL]
平均值	0.68	0.26
			标准偏差	0.2	0.07

Claims

1.一种用于测定组合物的稳定性的体外方法，所述组合物包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成，所述方法包括以下步骤：

(d)以及将如在步骤(c)中测得的结合至所述表面的聚集人IgG的量与参考值比较，并且(由此)测定所述包含可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或实质上由可溶性人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB组成的组合物的稳定性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)和(b)同时或相继进行。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面是或者包括(哺乳动物)细胞或细胞系、和/或能够被涂布人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的固体表面。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集人IgG是能够从人蛋白中分离的聚集人IgG，所述人蛋白以至少90％人IgG的含量为特征。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集人IgG能够从Beriglobin中分离。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集人IgG是可通过包括尺寸排阻色谱的分离法从人蛋白中获得的聚集人IgG。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述尺寸排阻色谱将单体和/或二聚体IgG与所述聚集IgG相分离。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集人IgG被标记。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述标记包括第二标记的人抗IgG抗体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述可溶性人Fcγ受体为可溶性FcγIIB受体。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述可溶性人FcγIIB受体为SM101(SEQIDNo.1)。

12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为如在ATCCCCL-86下保藏的Raji细胞。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面包含的人Fcγ受体的亚型和所述可溶性人Fcγ受体制备物包含的人Fcγ受体的亚型是相同的。

14.可通过如在权利要求6或7中限定的方法获得的非热聚集人IgG。

15.一种试剂盒，所述试剂盒包括如在权利要求14中限定的非热聚集人IgG和可选的包含人Fcγ受体IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面。