JP2016525364A - 可溶性Ｆｃガンマレセプタを含む組成物の安定性をインビトロで測定するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、本質的に、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＭＢ、ＩＩＩＡおよび／または１ＭＢを含むかまたは本質的にそれらからなる組成物の保存安定性、時間的安定性、保存寿命等の安定性をインビトロで測定するための方法に関し、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＭＢ、ＩＩＩＡおよび／または１ＭＢを含む表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ；ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＭＢ、ＩＩＩＡおよび／または１ＭＢを含む表面を1セット量の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＭＢ、ＩＩＩＡおよび／または１ＭＢの組成物と接触させ；ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＭＢ、ＩＩＩＡおよび／または１ＭＢを含む表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、そしてステップ（ｃ）で測定した表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＭＢ、ＩＩＩＡおよび／または１ＭＢを含むかまたは本質的にそれらからなる組成物の安定性［保存安定性、時間的安定性、保存寿命］を測定するステップを含む。本発明は、本方法により取得可能な凝集ヒトＩｇＧ、および、本方法で示した凝集ヒトＩｇＧの使用にも関する。

Description

本発明は、本質的に、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性をインビトロ（in vitro）で測定するための方法に関し、その方法がヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面を１セット量（a set amount）の凝集ヒトＩｇＧと接触させ；ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むその表面を1セット量の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの組成物と接触させ；そのヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、そしてステップ（ｃ）で測定した表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性を測定するステップを含む。本発明は、また、ここに定められる方法により取得可能な凝集ヒトＩｇＧ、および、本発明の方法で示した凝集ヒトＩｇＧの使用にも関する。

Ｆｃレセプタ（ＦｃＲｓ）は、それらが免疫応答の範囲および強さをコントロールする免疫システムにおいて中心的役割を果たす。病原体が循環血液に接近した後、それらは免疫グロブリン（Ｉｇｓ）によりオプソニン作用を受ける。その結果である免疫複合体（ＩＣｓ）は、高結合活性（high avidity）を有する多価性のために、ＦｃＲｓのクラスタリング（clustering、集合）に細胞を導くことができるＦｃＲと結合し、いくつかのエフェクタ機能のトリガーとなる（メッツゲル（Metzger, H.）、ジャーナル オブ イムノロジィ（J. Immunol.）１９９２、１４９：１４７７−１４８７）。これらは、発現したＦｃＲタイプや関連タンパク質に依存して、後続の病原体の無力化を伴うエンドサイトシスや抗原提示、抗体依存性の細胞性障害（ＡＤＣＣ）、メディエータの分泌や抗体産生の調整を含む（フリートマンら（Fridman et al）、イムノロジカル レビュー（Immunol. Rev.）１９９２、１２５：４９−７６；ファン デ ウィンケルおよびカペル（van de Winkel and Capel）、イムノロジィ トゥデイ（Immunol. Today）１９９３、１４：２１５−２２１）。

免疫複合体は、抗体、抗原、補体および順応的免疫性の一部としての種々のレセプタの間の複雑な相互作用に由来する。免疫複合体における抗体に結合した抗原は、少量の「外来」抗原でさえも循環から排除することが生理学的に可能な種々の細胞性メカニズムにより通常取り除かれる。免疫複合体は、タンパク質（感染、ワクチン、医薬品、等）やカスケードを活性化するためにタンパク質キャリアを必要とする非タンパク質材料（ハプテン）のような外来物質にヒトがさらされたときに形成され得る。自己免疫異状（disorder）は、（病原性の）免疫複合体が異なる器官に病理学的に堆積したときに、器官損傷／疾病にいたる炎症性カスケードを開始させる。免疫複合体疾患は、これらの成分の１またはそれ以上における調整不全が生じたときに、無数のやり方で明らかにすることができる。

特異的なＦｃＲｓは、全ての免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラスに対して存在する。ＩｇＧがヒト循環系に見られる最も豊富な抗体アイソタイプであるため、結果として、ＩｇＧに対するＦｃＲｓ、Ｆｃガンマレセプタ（ＦｃγＲｓ）は、最も広範な多様性を伴い最も豊富である。ヒトＦｃγＲｓに関連するオルソロガスな（orthologous）タンパク質は、サル等の他の霊長類やネズミを含む他の哺乳動物の種に見られる。ヒトのように、他の種は、対応するＩｇＧサブクラスに対して変化する親和性を有するいくつかのＦｃγＲｓを有している。ＦｃγＲｓは活性化レセプタおよび抑制レセプタの両者を含んでおり、このポジティブおよびネガティブなシグナルの統合が生じる免疫応答のために必要である。

ヒトには、ＦｃγＲｓの３つのクラスが存在する：高親和性レセプタＦｃγＲＩ、低親和性レセプタＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩである。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）は、タイプＩの膜貫通タンパク質としてまたは可溶性の形態で生じるものの、グリコシルホスファチジルイノシトールで裏打ちされた形態のＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）も存在する。また、ＦｃγＲｓは、種々のアイソフォーム（ＦｃγＲＩＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ；ＦｃγＲＩＩＡ１−２、Ｂ１−３、Ｃ）やアレル（対立遺伝子、allele）（ＦｃγＲＩＩａ１−ＨＲ、−ＬＲ；ＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１、−ＮＡ２）（ファン デ ウィンケルおよびカペル、イムノロジィ トゥデイ１９９３、１４：２１５−２２１）を生じる。上述したように、これらのＦｃγＲｓは、ＩｇＧに対して異なる親和性、特に異なるＩｇＧサブクラスに対して異なる結合親和性を有している。ヒトには４つのＩｇＧサブクラスがあり、血清中での豊富さの順で呼称される（ＩｇＧ１（６６％）、２（２３％）、３（７％）および４（４％）；ハシラら（Hashira et al.）、ペディアトリクス インターナショナル（Pediatr. Int.）２０００、４２（４）：３３７−３４２）。

ＦｃγＲＩＩは免疫適格細胞で最も広い分布を有するレセプタであり、それとともに、ＦｃγＲＩＩＩＡは免疫複合体のエンドサイトシスに主として含まれる。ＦｃγＲＩＩは、３つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣに存在するが、しかしながらＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣの細胞外領域が同じであるのに対して、ＦｃγＲＩＩＡはほんの７％のアミノ酸残基によりその細胞外領域が異なる。それでも、いずれの形態も、ヒトおよびマウスＩｇＧサブクラスに対する結合特性（ファン デ ウィンケルおよびカペル、イムノロジィ トゥデイ１９９３、１４：２１５−２２１）、および、それらのヒトＩｇＧｓに対する異なる親和性（ブルーンズら（Bruhns et al.）、ブラッド（Blood）２００９、１１３：３７１６−３７２５）により区別され得るものである。ＦｃγＲＩＩＩＡはＡＤＣＣの導入のためのキーとなるレセプタであるものの、抑制ＦｃγＲＩＩＢはＢ細胞に発現される単独のＦｃγＲを表している。そこで、ＦｃγＲＩＩＢの発現は、Ｂ細胞のダウンレギュレーションに必須であり、結果として抗体産生の減少となる。

ｓＦｃγＲＩＩＢを基に、本発明者らは、自己免疫疾患の治療のための新規な手法および方法を開発した。最も進歩した産物はＳＭ１０１であり、病原性免疫複合体の結合のために免疫細胞に発現するＦｃγＲｓと競合する。ＳＭ１０１は、現在、紅斑性狼瘡（Lupus Erythematosus）や免疫性血小板減少症（Immune Thrombocytopenia）等の自己免疫異状の治療のために、米国および欧州において臨床治験に係わりあっている。

タンパク性の医薬品、例えば、ＳＭ１０１を含む医薬品や医薬品組成物が保管中に劣化することが推測されており、それゆえ、それらを含むタンパク質や組成物の残存活性を反映する再現可能なインビトロ（in vitro）でのテストの開発が高度に望まれている。

従って、本発明の技術的課題は、可溶性ヒトＦｃγＲｓを含む組成物の安定性をインビトロで測定するための方法を開発することであった。

本発明者らは、「正常な（normal）」または「健康的（healthy）」なヒトの集団から得たヒトＩｇＧ調製物（例えば、市販の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）調製物）が、正規化された確かな様式で提供されうる凝集ヒトＩｇＧのこれまで未確定な分画を含むことを見出している。これは驚くべきことであり、病原性免疫複合体のそのような類似物が異なる「正常な」や「健康的」なヒトの集団から誘導され得ることは以前には知られていなかったためである。その凝集ヒトＩｇＧは、ＦｃγＲレセプタに結合し、それによりインビボ（in vivo）での状況を擬態し（すなわち、上述した病原性免疫複合体を模倣する）、このため、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む組成物の安定性を検出し（detect）測定し（determine）検定する（verify）ことを目的とする方法に使用され得る。とりわけ、凝集ヒトＩｇＧは、例えば、インゲルハードら（Engelhard et al.）の（１９９０）、ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジィ（Eur. J. Immunol.）２０、１３６７−１３７７、ブルーンズら（Bruhns et al.）の（２００９）、ブラッド ジャーナル（Blood J.）１１３（１６）、３７１６−３７２５や米国特許２００８／００８７００に記載されたように熱凝集したものではない。ブルーンズらは、ホウ酸緩衝生理食塩水中、ｐＨ８．０、６３℃で３０分間のヒトＩｇＧのインキュベーションにより後続の処理を伴うことなく生成された熱凝集ヒトＩｇＧ（３７１８頁、免疫グロブリン結合アッセイ）、および、細胞培養上清から精製した抗−ＮＩＰ ｍＡｂｓと複合化した化学修飾ＢＳＡ（ＮＩＰ１２−ＢＳＡ−ｂｉｏｔｉｎ）に由来する人工的な免疫複合体（３７１７頁、抗体および試薬）を記載している。同様に、米国特許２００８／００８７００は、８頁の［００９３］にＨＡＧＧ（熱凝集ＩｇＧ）の使用を開示している。

本発明は、従って、組成物、好ましくは医薬品組成物（医薬品と同義）の安定性（保存安定性や保管安定性等）をインビトロで測定するための方法に関し、その組成物が可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物であり、その方法は、
（ａ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ、
（ｂ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む前記表面を１セット量の前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはしＩＩＩＢの組成物と接触させ、
（ｃ）前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む前記表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定した前記表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる前記組成物の保存安定性、時間的安定性、保存寿命等の安定性を測定する、
ステップを含む。

本発明の方法におけるステップ（ａ）および（ｂ）は、並行してまたは連続して行われ得る。また、ステップ（ｂ）および（ａ）の順序を反対にすることも予想される。

本発明の方法がステップ（ｃ）の前に、好ましくはステップ（ａ）および（ｂ）の後に行われるべき洗浄ステップを含むことも予想される。

本発明の文脈で用いられる可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは可溶性ＦｃガンマＩＩＢレセプタであることが好ましい。その可溶性ヒトＦｃガンマＩＩＢレセプタはＳＭ１０１（配列番号１）であることが特に好ましく、例えば哺乳動物の細胞や大腸菌（E. coli）のような細菌細胞等のホスト細胞におけるこれらレセプタの発現を介して取得され得るこれらのレセプタの調製物を含む。

本発明は、同様に、本発明の方法および実施形態において、ここに定められる凝集ヒトＩｇＧの使用に関する。

本発明の文脈において、用語「インビトロ法」は、インビボ法に対して、ヒトや動物の身体の外側で行われる方法に関する。

語句「方法（method）」は、「テスト（test）」や「アッセイ（assay）」等に置き換えられてもよい。

用語「安定性（stability）」は、「保存安定性（shelf stability）」、「保存寿命（shelf life）」や「半減期（half-time）」を含む。組成物の「安定性」は、そこに含有される主要成分の安定性、すなわち、ここに定められる可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの安定性に本質的に関する。その安定性は、時間、つまり「時間的安定性」等、温度、バッファ条件、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの産生ホスト、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの配列、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの製造方法等の異なるパラメータにより影響される。

本発明の組成物（可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物）の安定性を測定することにより、その組成物（すなわち、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢであるその組成物の主要成分の本質において）の品質／状態／結合能力をモニタ／コントロールすることが同様に可能である。

「組成物」は、好適な実施形態において、医薬品組成物（医薬品と同等である）や診断上の組成物であり、薬学的または診断上で受容可能なキャリア、バッファ、成分等をさらに含んでもよい。また、その組成物は、さらに治療上の活性成分を含んでもよい。

用語「凝集ヒトＩｇＧ」（しばしば「ヒト凝集ＩｇＧ」等としても表記される）は、ヒトＩｇＧ調製物の凝集した部分に関する。その調製物は、驚くべきことに、静脈内、皮下または筋肉内の投与のために用いられる血液ベースの製造物（プールされたヒトＩｇＧ調製物やＩＶＩＧｓ等）に存在しており、その製造物はプールされた（好適には多価の）ＩｇＧを含有している。このため、凝集ヒトＩｇＧは、好適には、ＩＶＩＧ調製物／組成物等のプールされたヒトＩｇＧ調製物から取得／分離され得るものであり、取得可能である。その凝集ヒトＩｇＧは、少なくとも９０％のヒトＩｇＧ含量により特徴づけられる「ヒトタンパク質」から分離され得る凝集ヒトＩｇＧであることが予想される。そのヒトタンパク質は、ヒトの血清や血漿に由来する／由来し得るものであり、好適な実施形態において、世界保健機関の医薬品統計法共同研究センタ（WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology）（ＷＨＯＣＣ）の解剖治療化学（ＡＴＣ）分類法（Anatomical Therapeutic Chemical classification system）に従うＡＴＣコードのＪ０６ＢＡ０１またはＪ０６ＢＡ０２を有する正常ヒト免疫グロブリン（ヒトＩｇＧ）として特徴づけられ、同定される。用語「ヒトタンパク質」は、ここで用いられるときに、プールされたヒトＩｇＧ調製物を含む。好適な実施形態において、ヒトＩｇＧはサブタイプＩｇＧ１のＩｇＧを少なくとも５０％含む。より好適な実施形態において、ヒトＩｇＧは（さらに）サブタイプＩｇＧ２のＩｇＧを少なくとも２０％含む。特に好適な実施形態において、その凝集ヒトＩｇＧは、ベリグロビン（Beriglobin、登録商標）、バリテクト（Varitect、登録商標）やベンビッグ（Venbig、登録商標）から取得／分離されまたは取得可能であり、ベリグロビンが好適である。ベリグロビンは、９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含む。例えば、１００％のＩｇＧを含むベリグロビンは、６１％のＩｇＧ１、２８％のＩｇＧ２、５％のＩｇＧ３、６％のＩｇＧ４を含んでおり、最大で約１％のＩｇＡを含んでもよい。ベリグロビン、バリテクトおよびベンビッグについて示されるパーセント値は、％（ｗ／ｗ）を示す。代表的なベリグロビンは、バッチ番号（batch number）の２６８４０３１１Ａまたは２３８４０３１１Ｂを有するものである。バリテクトは、９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含む。例えば、１００％ＩｇＧのバリテクトは、５９％のＩｇＧ１、３６％のＩｇＧ２、３％のＩｇＧ３、２％のＩｇＧ４を含んでおり、５％以下のＩｇＡを含んでもよい。ベンビッグは、９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含む。例えば、１００％ＩｇＧのベンビッグは、５２−８０％のＩｇＧ１、２６−５０％のＩｇＧ２、２．４−５％のＩｇＧ３、０．３−１％のＩｇＧ４を含むことができる。もちろん、当業者は、ベリグロビン、バリテクト、ベンビッグ、または、これら３つの医薬品のような他のいずれかの組成物を、本発明の方法および使用に適用することができる。別の好適な凝集ヒトＩｇＧは、サブクビア（Subcuvia、登録商標）から取得／分離されまたは取得可能である。例えば、１００％ＩｇＧのサブクビアは、４５−７５％のＩｇＧ１、２０−４５％のＩｇＧ２、３−１０％のＩｇＧ３、２−８％のＩｇＧ４を含むことができる。サブクビアについて示されるパーセント値は、％（ｗ／ｗ）を示す。代表的なサブクビアは、バッチ番号のＢＶＮＧ１Ｍ０３２Ａを有するものである。

しかしながら、当業者は、これら３つの医薬品を用いるばかりではなく、自身でヒトＩｇＧ調製物を調製することもできる。実際、当業者は、ここに記載されたようにＩｇＧ調製物を調製することがたやすい立場にあり、例えば、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００またはそれ以上、好適には１０００以上のヒトのドナーの血漿からＩｇＧをプールすることで、それにより（プールされた）ヒトＩｇＧ調製物が得られる。結果として、本発明に適用されるようなヒトＩｇＧ調製物は、好適には９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含む。ここに好適に適用されるＩｇＧ調製物は、全体のＩｇＧ含量が１００％（ｗ／ｗ）を超えない条件で、次のようなＩｇＧサブクラス：５２−８０％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ１、２６−５０％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ２、２−５％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ３および／または０．２−６％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ４、を含む。

さらに好適な実施形態において、そのヒトタンパク質は、少なくとも１００、つまり１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００等のヒト（健全または「標準的（standard）」）のドナーからの混合された血清または血漿からなるかまたは含んでおり、全４つのＩｇＧサブグループを含む。少なくとも５００のヒト（健全または「標準的」）のドナーからの混合された血清または血漿が好適である。用語「健全」は、現時点（提供する時点）で血液を提供するための標準的な適格性基準を満たす個人を意味しており、その適格性基準が繰り返しの改善や変更を受けることに留意する。

別の実施形態において、その凝集ヒトＩｇＧは、サイズ排除クロマトグラフィを含む分離法によりそのヒトタンパク質から取得可能な凝集ヒトＩｇＧであることが予想される。好適な実施形態において、そのサイズ排除クロマトグラフィは、その凝集ヒトＩｇＧから単量体および／または二量体のＩｇＧを分離する。本発明の文脈において用いられ得る凝集ヒトＩｇＧを分離するための手段および方法は、このどこかに（例えば、実施例欄）開示されている。また、本発明の凝集ヒトＩｇＧは、例えば、エンゲルハードらのヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジィ（(1990), Eur. J. Immunol. 20, 1367-1377）、ブルーンズらのブラッド ジャーナル（(2009), Blood J. 113(16), 3716-3725）や米国特許２００８／００８７００に記載されているような熱凝集したヒトＩｇＧではない。実際、熱凝集ＩｇＧは、ここに記載されているように取得された／取得可能な凝集ＩｇＧと異なっている。つまり、熱凝集は、一定のタンパク質に融解温度（Ｔｍ）以上の温度がかけられたときに、タンパク質の部分的な変性の結果である。融解温度は、タンパク質の機能であり、ヒトＩｇＧｓの混合物の場合、広い範囲のＴｍが必然的に得られる。このため、凝集の度合は、用いたＩｇＧの混合物に依存して、１バッチ毎に変化するものである。
さらに、いくつかの単量体ＩｇＧは、当然に、熱による凝集ＩｇＧの調製物の一部であり、このため不純物と考えられる単量体ＩｇＧの量を変えることなく凝集ＩｇＧの調製物を認めることはできない。しかしながら、ここに記載されるような凝集ＩｇＧ調製用の方法では、凝集ＩｇＧから単量体および／または二量体のＩｇＧを分離しており、このため、ここに記載された方法により取得された／取得可能な結果となる凝集ＩｇＧは、従来技術からの熱凝集したＩｇＧと異なる。
従って、熱凝集したＩｇＧは、長期の安定性をもたらし、バッチ放出テストや他のルーチンテストに完全に適している本発明により開示された凝集ＩｇＧ調製物と同等のものではない。

時には静脈内投与用の血漿免疫グロブリンとも称される静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＳ）調製物等のプールされたヒトＩｇＧ調製物は、数百の健全なドナーのプールされた血漿に由来するものであり、ドナー集団の累積的な抗原履歴を反映する免疫抗体および自然抗体（ＮＡｂｓ）の両者を含有することが予想される。プールされたヒトＩｇＧ調製物は、その自然により高価なポリクローナル性であり、多くの抗体種を含有している。このため、それは、病原体および外来抗原、ならびに、自己／自己抗原（self/autoantigens）を含む広範囲の抗原と反応するＮＡｂｓに向けられた特性を有する「免疫抗体」と俗称される大きなスペクトルを含有する。ＮＡｂｓは、意図的な免疫化や独立して外来抗原にさらすことなく生成されるものとして定義される。

静脈内調製物に加えて、皮下投与用（ＳＣＩＧ）および筋肉内投与用（ＩＭＩＧ）に設計された調製物がある。ここで用いられるように、用語「ＩＶＩＧ」は、ＩＶＩＧ、ＳＣＩＧおよびＩＭＩＧの調製物を包含しようとするものである。ＩＶＩＧ製剤は、よく知られており、イントラガム（INTRAGAM、登録商標）Ｐ、プリビゲン（PRIVIGEN、登録商標）、ハイゼントラ（HIZENTRA、登録商標）、ガムネックス（Gamunex、登録商標）、フレボガンマ（Flebogamma、登録商標）、オクタガム（Octagam、登録商標）およびガムイミュン（Gamimune、登録商標）を含む。

ＩＶＩＧ調製物等のプールされたヒトＩｇＧ調製物により共有される１つの特徴は、それらが正常な血漿または血清に由来するため、それらが含有する主要な免疫グロブリン種が、例えば、イントラガム（登録商標）Ｐにおいて少なくとも９８％の免疫グロブリンであり、プリビゲンがＩｇＧである、ということである。従って、ＩＶＩＧ等のプールされたヒトＩｇＧ調製物は、ＩｇＧの濃縮された調製物とみなされ得る。

好適な実施形態において、ＩＶＩＧは、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも１０％ｗ／ｖ、少なくとも２０％ｗ／ｖ、または、少なくとも２５％の免疫グロブリンを含有する。
ＩＶＩＧ調製物の例は、国際公開ＷＯ２００５／０２３８６７の表１に示されている。これらの例の全ては、本発明の文脈において適用され得る好適なＩＶＩＧ調製物である。

ここに定められる凝集ヒトＩｇＧは選択的にラベル（標識）されており、そのラベルは直接的または間接的のいずれかで凝集ヒトＩｇＧと結合する。「直接的」はそれにより共有結合したラベル（リンカーを含んでもよい）を意味しているのに対し、間接的は凝集ヒトＩｇＧと結合するラベルされた第２の要素、例えば抗体やそのフラグメント等のラベルされた結合ドメインによる凝集ヒトＩｇＧの結合を含む（例えば、ラベルされた二次抗−ヒトＩｇＧ抗体等の抗−ヒト抗体）。二次ラベルされた抗体は、いずれの抗−ＩｇＧ抗体も有効であり、以下の実施例ではＲ−フィコエリトリンでラベルされたヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ディアノヴァ（Dianova）社、カタログ番号１０９−１１６−０８８）が用いられているが、しかしながら好適な多くの他の抗体が市販されている。本発明の文脈においては、特に「蛍光ラベル」が予想されるが、本発明はそれに制限されるものではなく、すなわち、他のラベル（例えば、ＥＬＩＳＡ法等の免疫的方法に用いられ得るラベル）が同様に予想される。蛍光ラベルは、量子ドット剤、蛍光タンパク質、蛍光染料、ｐＨ感受性蛍光染料、電圧感受性蛍光染料および／または蛍光ラベルされたマイクロスフェアを含むグループから好適に選択される。蛍光ラベルはレーザービームで励起され、セットされた波長での発光はＦＡＣＳ装置により検出可能であることが好適である。

本発明に導く実験のために、市販製品であるベリグロビン（Beriglobin、登録商標）が用いられ、分取用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により単量体および二量体のＩｇＧから凝集ヒトＩｇＧが分離された（以下の詳細な説明および実施例２参照）。しかしながら、ここに記載されるような他のいずれの「ヒトタンパク質」も凝集ヒトＩｇＧの分離用の開始点（starting point）として用いられ得るものであり、例えば、ドイツ市場における現時点の適切な製品であるベリグロビン、バリテクトやベンディグ（Vendig）、または、ここに記載されるような、例えば、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００またはそれ以上、好適には１０００以上のヒトのドナーの血漿からＩｇＧをプールすることによるＩｇＧ調製物である。これら「開始点」のいずれか（ここに定義されたヒトタンパク質、ＩＶＩＧｓ等の（プールされた）ＩｇＧ調製物、を含む）は、例えば分取用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による凝集ヒトＩｇＧの分離のために用いられ得る（以下の詳細な説明および実施例２参照）。米国ＦＤＡは現時点で１０の製品を揃えている。「ヒトタンパク質」例えばベリグロビンの原料としての使用は、特に好適であり、これが本発明の実施形態における標準として用いられるべき凝集ヒトＩｇＧ製品用の制御された供給源を提供するためである。凝集ヒトＩｇＧは、０．３５ｍｇ／ｍＬおよび１．４０ｍｇ／ｍＬの間、好ましくは０．５および１．３５ｍｇ／ＭＬの間のタンパク質含量を有するように調整され得る。当業者は、タンパク質含量が適切なバッファで希釈されること、または、例えば限外濾過により濃縮されることにより調整され得ることを認識しているであろう。さらなるガイダンスは、本発明の実施例１および２で提供される。

可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性を測定するための方法の最終ステップにおいて、表面に対して結合され、ここに記載されたように測定される凝集ヒトＩｇＧの量は、レファレンス値と比較される。その比較ステップは、以下のように、その組成物の安定性の測定を許容する。

例えば、その安定性がＦｃガンマレセプタをも含む組成物と比較して測定される組成物の安定性が高くなるほど、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面と結合する凝集ＩｇＧが減少するが、凝集ＩｇＧがその組成物により含まれる１またはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタにより結合されるためである。

一方、例えば、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面と結合する凝集ＩｇＧが増加するほど、ここに記載された方法に従いその安定性が測定される組成物のようなＦｃガンマレセプタをも含む組成物と比較してその組成物をより低い安定となる。しかしながら、「より低い安定」は、その安定性が測定された組成物が有益でないことを意味するものではない。これに対して、特定の応用では、その原料成分が短縮された半減期、より低いｐＨ安定性等を有する組成物を有することが望ましいため、例えば、レファレンス組成物より低い安定である組成物を有することが望ましい。

説明したように、本発明の方法に従いその安定性が測定される組成物のようにヒトＦｃガンマレセプタの１つまたはそれ以上をも含むレファレンス組成物は、レファレンス組成物としてここに参照される。
そのレファレンス組成物について、表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を反映する値は、ここに記載されたように測定され、その値がレファレンス値として有効である。このため、本発明の教示に従い組成物の安定性が測定される前に、レファレンス値が測定され、有効となる。従って、そのレファレンス値は、ここに記載されるように測定された表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量と比較され得るものであり、その量がレファレンス値と比較した値に変換される。その比較により、組成物の安定性を測定することが可能である。事実、説明したように、レファレンス値が測定され、そのレファレンス値が表面により結合された凝集ヒトＩｇＧの特定量を反映する。このため、レファレンス値は、その組成物により含まれた１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃレセプタにより結合されたＩｇＧの量を間接的に反映する。
もちろん、レファレンス組成物は、比較可能な量（望ましくは同じ量）で同じ１つまたはそれ以上の可溶性Ｆｃガンマレセプタを含むのであれば、本発明の実施形態に従いその安定性が測定される組成物と単に比較可能である。

例えば、ここに記載されるようなＦｃガンマレセプタの温度安定性、ｐＨ安定性、保存バッファ安定性、貯蔵安定性、貯蔵寿命、半減期、劣化に対する安定性（または抵抗性）、単量体形態についての安定性、等の点では、レファレンス値がここに記載される組成物の安定性を反映することができる。しかしながら、組成物の安定性特性または安定性パラメータのどちらが測定されるかは、例えば、どの組成物が用いられるかについての要求および／または興味および／または目的に依存し得るため、決定的なことではない。
事実、本発明の方法は、組成物の安定性の一般的な読み出しを許容するから、安定性に影響するような特定のパラメータをテストすることに制限されるものではないが、それが通常、ここに記載されたように表面に結合され測定された凝集ヒトＩｇＧの量であるためであり、代わりに、本発明の教示に従いその安定性が測定された組成物により含まれた１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタにより結合された凝集ヒトＩｇＧの量であるためである。
先に説明したように、表面に結合される凝集ＩｇＧが少ないほど、その組成物により含まれる１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタがより強力になりさらに強力になる。例えば、組成物のｐＨ安定性に興味があるとすれば、当業者は、その組成物に種々のｐＨ条件を受けさせ、その組成物に接触したまま表面に結合した凝集ヒトＩｇＧをテストすることができる。その組成物が例えば酸性ｐＨに対して安定であると仮定すれば、１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは、凝集ヒトＩｇＧを結合することがまだ可能であり、ここに記載されたようにより少ない凝集ＩｇＧが表面に結合するであろう。もちろん、当業者は、本発明の方法を実施するときに、ｐＨ安定性をテストした後、適切なバッファを供給しなければならないことを承知している。例えば、過度に酸性または塩基性の環境がここに記載された方法を妨げることとなり、このため、それらを供給する前に、当業者は、従来一般的に知られた手段および方法によりバッファリング条件を調整し適合させなければならない。

別の例のために、長期の貯蔵寿命や劣化に対する抵抗性を有する組成物に興味があるとすれば、その組成物をレファレンス組成物として用い、例えば、１、２、６または１２ヶ月間組成物を保存した後にここに記載されたように表面に結合した凝集ＩｇＧの量を測定し、その値を組成物の所望の性質用のレファレンス値として用いる。その後、例えば、長期安定性や劣化に対する抵抗性を反映するそのレファレンス値は、ここに記載されたように表面に結合しており、また本発明の方法によりその安定性が測定された組成物と接触している凝集ヒトＩｇＧの量を反映する値と比較される。

例えば１２ヶ月の保存後に測定され、技術者の期待を満たすとみなされるレファレンス値は、表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの特定量を反映しているにすぎないため、例えば、１００に設定でき、１００を相対値にすることができる。

少なくとも５０％、好ましくは６０％または７０％、より好ましくは８０％または９０％の凝集ヒトＩｇＧが表面に結合されていないものの、その安定性が測定された組成物により含まれる１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタにより結合されているとすれば、レファレンス値は受容可能とみなされる。特に、先に説明したように、表面に結合される凝集ヒトＩｇＧが少なくなるほど、１つまたはそれ以上の可溶性Ｆｃガンマレセプタによる結合が多くなり、反対もまた同様である。従って、組成物の安定性が高くなれば、１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタによるものを除いて、表面により結合される凝集ヒトＩｇＧが少なくなる。反対に、組成物の安定性がより低くなれば、表面により結合される凝集ヒトＩｇＧが多くなり、１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタによる結合が少なくなる。

本発明は、また、少なくとも５００の（健全または「標準的」）ドナーの混合された血漿からサイズ排除クロマトグラフィにより凝集ヒトＩｇＧを分離するための方法を包含する。

また、本発明の凝集ヒトＩｇＧがサイノモルガス（cynomolgous、カニクイザル）、カリスリクス（callithrix、マーモセット）、マカク（macaqua、マカクザル）、サンギス（sanguis）等のヒト以外の霊長目の対応するＩｇＧ調製物により追加され、または、置換されることも予想される。

本発明の「可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」は、例えば、欧州特許出願ＥＰ １ １３５ ４８６、ＥＰ １ ６４２ ９７４およびＥＰ１ ４４６ １３９に記載されたものである。本発明の「可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」は、好適な実施形態において、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドの不存在により特徴づけられる。本発明のクレームした可溶性ＦｃγＲｓは、好適な実施形態において、配列番号：２、４、６、８および１０の核酸配列のそれぞれによりエンコードされた配列番号：１（ＳＭ１０１、組換えヒトＦｃγＲＩＩＢ）、配列番号：３（ＦｃγＲＩＩＢ）、配列番号：５（ＦｃγＲＩＩＡ）、配列番号：７（ＦｃγＲＩＩＩＡ）および配列番号：９（ＦｃγＲＩＩＩＢ）のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列からなる。本発明は、また、配列番号：１、３、５、７または９のタンパク質に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一性を有する可溶性ＦｃγＲｓも包含する。配列同一性の測定について、アミノ酸の最大の一致をもたらすように配列を整列させることにより比較がなされる。本発明の好適な実施形態において、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは、ＦｃγＲＩＩＢ（配列番号：３）である。より好適な実施形態において、可溶性ヒトレセプタは、可溶性ＦｃγＲＩＩＢレセプタであるＳＭ１０１（配列番号：１）である。本発明の方法のさらに好適な実施形態において、１つの可溶性レセプタのみ（または上述したように、対象のレセプタに対して少なくとも９０％の同一性を有する全てのタンパク質の混合物）が一時にテストされるべきである。

本発明が言及する配列を以下に示す。

配列番号：１（ＳＭ１０１）
MAPPKAVLKL EPQWINVLQE DSVTLTCRGT HSPESDSIQW FHNGNLIPTH
TQPSYRFKAN NNDSGEYTCQ TGQTSLSDPV HLTVLSEWLV LQTPHLEFQE
GETIVLRCHS WKDKPLVKVT FFQNGKSKKF SRSDPNFSIP QANHSHSGDY
HCTGNIGYTL YSSKPVTITV QAPSSSP

配列番号：２（ＳＭ１０１、ｃＤＮＡ）
1 ATGGCACCGC CGAAAGCAGT TCTGAAACTG GAACCGCAGT GGATTAACGT TCTGCAGGAA
61 GATAGCGTTA CCCTGACCTG TCGTGGCACC CATAGCCCGG AAAGCGATAG CATTCAGTGG
121 TTTCACAACG GCAATCTGAT TCCGACCCAT ACCCAGCCGA GCTATCGTTT TAAAGCGAAC
181 AACAACGATA GCGGCGAATA TACCTGTCAG ACCGGTCAGA CCAGCCTGAG CGATCCGGTT
241 CATCTGACCG TTCTGAGCGA ATGGCTGGTT CTGCAGACCC CGCATCTGGA ATTTCAGGAA
301 GGCGAAACCA TTGTTCTGCG TTGCCACAGC TGGAAAGATA AACCGCTGGT TAAAGTTACC
361 TTCTTCCAGA ACGGCAAAAG CAAAAAATTC AGCCGTAGCG ATCCGAATTT TAGCATTCCG
421 CAGGCGAATC ATAGCCATAG CGGCGATTAT CATTGTACCG GCAACATTGG CTATACCCTG
481 TATAGCAGCA AACCGGTGAC CATTACCGTT CAGGCGCCGA GCAGCAGCCC GTAA

配列番号：３（ヒトＦｃγＲＩＩＢ）
MGTPAAPPKA VLKLEPQWIN VLQEDSVTLT CRGTHSPESD SIQWFHNGNL IPTHTQPSYR FKANNNDSGE YTCQTGQTSL SDPVHLTVLS EWLVLQTPHL EFQEGETIVL RCHSWKDKPL VKVTFFQNGK SKKFSRSDPN FSIPQANHSH SGDYHCTGNI GYTLYSSKPV TITVQAPSSS P

配列番号：４（ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ｃＤＮＡ）
1 atggggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 61 gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac121 tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg181 ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc241 agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg301 gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg361 gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac421 ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata481 ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca
541 ccg

配列番号：５（ヒトＦｃγＲＩＩＡ）
MGTPAAPPKA VLKLEPPWIN VLQEDSVTLT CQGARSPESD SIQWFHNGNL IPTHTQPSYR
FKANNNDSGE YTCQTGQTSL SDPVHLTVLS EWLVLQTPHL EFQEGETIML RCHSWKDKPL
VKVTFFQNGK SQKFSHLDPT FSIPQANHSH SGDYHCTGNI GYTLFSSKPV TITVQVPSMG
SSSP

配列番号：６（ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ｃＤＮＡ）
1 atggggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac 61 gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac121 tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg181 ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc241 agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc gaatggctgg tgctccagac ccctcacctg301 gagttccagg agggagaaac catcatgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg361 gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tctcccattt ggatcccacc421 ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata481 ggctacacgc tgttctcatc caagcctgtg accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc541 agctcttcac caat

配列番号：７（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ）
MDLPKAVVFL EPQWYRVLEK DSVTLKCQGA YSPEDNSTQWF HNESLISSQA SSYFIDAATV DDSGEYRCQ TNLSTLSDPV QLEVHIGWLL LQAPRWVFKEE DPIHLRCHSW KNTALHKVTY LQNGKGRKY FHHNSDFYIP KATLKDSGSY FCRGLVGSKNV SSETVNITIT QGLSVSTISS F

配列番号：８（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ｃＤＮＡ）
1 atggatctcccaa aggctgtggt gttcctggag cctcaatggt acagggtgct cgagaaggac 61 agtgtgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg acaattccac acagtggttt121 cacaatgaga gcctcatctc aagccaggcc tcgagctact tcattgacgc tgccacagtt181 gacgacagtg gagagtacag gtgccagaca aacctctcca ccctcagtga cccggtgcag241 ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc ggtgggtgtt caaggaggaa301 gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg ctctgcataa ggtcacatat361 ttacagaatg gcaaaggcag gaagtatttt catcataatt ctgacttcta cattccaaaa421 gccacactca aagacagcgg ctcctacttc tgcagggggc ttgttgggag taaaaatgtg481 tcttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgt cagtgtcaac catctcatca541 ttc

配列番号：９（ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ）
MDLPKAVVFLE PQWYSVLEKD SVTLKCQGAY SPEDNSTQWF HNENLISSQA SSYFIDAATVNDSGEYRCQT NLSTLSDPVQ LEVHIGWLLL QAPRWVFKEE DPIHLRCHSW KNTALHKVTYLQNGKDRKYF HHNSDFHIPK ATLKDSGSYF CRGLVGSKNV SSETVNITIT QGLAVSTISSF

配列番号：１０（ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ｃＤＮＡ）
1 atggatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagcgt gcttgagaag 61 gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg121 tttcacaatg agaacctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca181 gtcaacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg241 cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag301 gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca361 tatttacaga atggcaaaga caggaagtat tttcatcata attctgactt ccacattcca421 aaagccacac tcaaagatag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat481 gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca541 tcattc

本発明の実施形態がヒトＦｃγＲｓを示しているものの、他の哺乳動物のＦｃγＲｓ、特にネズミまたはサル等の霊長目のものにも適用され得るものである。

「ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面」は、いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを発現する細胞や細胞株、好ましくは哺乳動物細胞や哺乳動物細胞株であるかまたはそれらを含む。これらの細胞は、いくつかの実施形態において、他のヒトＦｃガンマレセプタの存在なくして、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢを発現し、すなわち、これらの細胞／細胞株が１つのＦｃγＲを単に発現する。ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むその表面が本質的にまたは排他的でもヒトＦｃγＲＩＩＢを含むことが特に好適である。さらに好適な実施形態では、その表面により含まれるヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプと、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタのその組成物により含まれるヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプとが同一である。ＦｃγＲＩＩＢがテストされるときは、ラジリンパ芽細胞株（Raji lymphoblastoid cell line）(ＣＣＬ−８６、ＡＴＣＣ)等のＦｃγＲＩＩＢのみを発現する細胞が好ましい。ＦｃγＲＩＩＡについては赤白血症細胞株（erythroleukemic cell line）Ｋ５６２（ＣＣＬ−２４３、ＡＴＣＣ）が用いられ、ＦｃγＲＩＩＩＡについてはＮＫＬ細胞株（ロバートソンら（Robertson et al.）、エクスペリメンタル ヘマトロジィ（Exp. Haematol.）１９９６、２４（３）：４０６−１５）が用いられる。代わりに、対象のＦｃＲ（ｓ）を感染させたＣＨＯ細胞が用いられ得る。対象のタンパク質を発現するためにＣＨＯ細胞の移入のための方法は従来よく知られており、この方法が、例えば、ブルーンズら、ブラッド２００９、１１３：３７１６−３７２５に記載されている。

「ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面」は、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢでコートされ得る固体表面であるかまたは固体表面を含むものであることも予想される。「固体表面」は、それにより、例えば磁気で引きつけられるような微粒子材料（ビーズ）、または、ＥＬＩＳＡプレートやバイアコア（Biacore）検出ユニット等の平坦表面のいずれかを含む。その表面の材料は、それぞれの方法において用いられ得るプラスチック、ポリマ、金属、ガラス等の適切な固体材料としてもよい。ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢのようなタンパク質の固体表面（例えば、平坦な表面や微粒子の表面）へのコーティングは、当業者によく知られた標準的な方法により行われる。固体表面のコーティングは、本発明の「ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」で、および／または、「可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」で行われてもよく、細胞表面での（膜アンカ（membrane anchor）を要求する）生物学的発現の必要がないためである。

好適な実施形態において、本発明は、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタの結合活性をインビトロで測定するための方法における凝集ヒトＩｇＧの使用に依存する。本発明の方法における第１のステップは、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢの１つのみを（好ましくは他のＦｃγレセプタの存在なくして）発現する細胞株からの哺乳動物細胞を、１セット量の凝集ヒトＩｇＧ、および、１セット量の対応する可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢと接触させる。本方法の第１のステップで選択される哺乳動物細胞が対象のＦｃガンマレセプタのみを発現すること、可能であれば他のＦｃガンマレセプタがないことが好適であり、これはＩｇＧに結合する他のレセプタの存在がテストされる可溶性ＦｃγＲの活性を妨げるためである。

「その表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量を測定すること」は、表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量の計測または定量に関しており、すなわち、本発明の文脈において好適に計測されるものがヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量である。その結合した凝集ヒトＩｇＧは、例えば、間接的ラベル（例えば、抗−ヒトＩｇＧ結合ドメイン）の手段または直接ラベル（すなわち、凝集ヒトＩｇＧが直接的にラベルされる−このどこかに説明されている）の手段により検出される。例えば、凝集ヒトＩｇＧに結合した低レベルのラベルされた二次抗体は、凝集ヒトＩｇＧに対する可溶性ＦｃγＲの高レベルの結合を示し、その反対も同様である。
これに代えてまたはこれに付加して、洗浄（本発明の方法におけるステップ（ｃ）の前）により除去された凝集ヒトＩｇＧの量を分析し、計測し、定量することも同様に可能であり、その凝集ヒトＩｇＧが対象の（組成物に含まれた）可溶性ＦｃγＲに結合しており、それとともに洗い出される。

本発明の方法における「接触させるステップ」は、表面、レセプタおよび凝集ヒトＩｇＧに相互に物理的な接触をもたらすことを包含しており、それによりそれらが相互に結合し得る。このステップは、インキュベーションステップを包含してもよく、それにより試薬が反応するための時間を有する。

用語「セット量」は、単純に、それぞれの試薬の量が固定されるべきことを示しており、それにより結果が推定され、定量さえもなされ得る。例えば、以下の実施例からもわかるように、凝集ヒトＩｇＧの標準量は、可溶性レセプタの系列希釈で用いられており、それにより可溶性レセプタが表面に結合する凝集ヒトＩｇＧを阻害する量が測定され得る。

本発明の方法における洗浄ステップは、ステップ（ｃ）の前の「洗浄」により、結合していない凝集ヒトＩｇＧおよび結合していない可溶性ヒトＦｃγＲの除去を包含する。このステップが本発明において用いられる表面に結合していない試薬の除去に関することに留意すべきである。洗浄ステップは、以下の実施例で用いられるＦＡＣＳバッファ等の標準バッファで行われ得る。

本発明の可溶性ＦｃγＲの系列的希釈に適用するときは、ラベルの「検出」が可溶性ＦｃγＲのＩＣ_５０の測定を考慮する。「最大の半分の抑制濃度（ＩＣ_５０）」は、生物学的、生化学的機能を阻害することでの化合物の有効性の計測である。この定量的な計測は、特定の薬品や他の物質のいかなる量が所与の生物学的プロセスを半分に阻害するために必要とされるか、を示している。換言すれば、それは、物質の最大の半分（５０％）の抑制濃度（ＩＣ）である（５０％ＩＣまたはＩＣ_５０）。それは、医薬品研究におけるアンタゴニスト（antagonist）薬剤力価の計測として一般的に用いられる。ＦＤＡによれば、ＩＣ_５０は、インビトロにおける５０％抑制に要求される薬剤の濃度を表している。このため、本文脈において、本方法で用いられる凝集ＩｇＧの量と比較して、哺乳動物細胞に結合した凝集ＩｇＧの量は、細胞に結合する凝集ＩｇＧの５０％抑制に必要とされるＦｃγＲの量の測定を許容する。同様に、細胞に結合するＩｇＧの９５％抑制に必要な量であるＩＣ_９５も計測され得る。データのための他のいずれの評価テクニックも当業者に用いられ得るものであり、例えば、欧州薬局方５．０；２００５；チャプター５．３（「生物学的アッセイおよびテストの結果の統計学的分析」）による４パラメータのロジスティック法（４ＰＬ）がある。

本発明のインビトロ法の特に好適な実施形態において、可溶性ヒトレセプタはＦｃγＲＩＩＢ（配列番号：３）、さらに好適にはＳＭ１０１（配列番号：１）であり、細胞はラジ細胞であり、凝集ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ調製物から分離されており、例えば、ベリグロビン（登録商標）や二次抗体がレーザービームで励起可能であり、セットされた波長での発光がＦＡＣＳ装置の手段により検出可能な蛍光ラベルを有している。

本発明は、また、本発明の表面および／または本発明の凝集ヒトＩｇＧを含むキットに関する。そのキットは、本発明の方法を行うために必要な手段（例えば、ラベル、バッファ、レファレンス値、コントロール、標準物、等）をさらに含んでもよい。

本発明は、また、ここに開示されるような凝集ヒトＩｇＧに関する。

以下に記載した実験において、本発明のインビトロ法を用いることで、ＳＭ１０１（可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、配列番号：１）が凝集ＩｇＧへの結合のためのラジ細胞で細胞に結合したＦｃγＲＩＩＢと競合すること、一定量の細胞および凝集ベリグロビンに添加したＳＭ１０１の濃度を増加させることでＦｃγＲＩＩＢを結合した膜に結合する凝集ＩｇＧの漸進的抑制の結果となること、が見出された。このテストは、医療や診断上の応用に必要なＳＭ１０１の可能な用量の測定を許容する。この方法は、また、異なるバッチが一定の結合活性を有することを確かめるためにＳＭ１０１の品質管理に用いられ得る。同様に、この方法は、可能な用量を測定するために他のいずれの可溶性ＦｃγＲに適用されてもよく、異なるバッチの可溶性ＦｃγＲが同じ結合活性を有することを保証するための品質管理として適用されてもよい。このため、本発明のインビトロ法は、可溶性ＦｃγＲｓの結合活性のための新しいテストを提供するものであり、凝集ＩｇＧがインビトロでＩｇＧ免疫複合体を模倣するために用いられ得るという知見に基づいている。

特に、以下の実施例１において、本発明のインビトロ法は、「ＳＭ１０１のための細胞ベースの力価アッセイ」とも呼称され、ＳＭ１０１の生物学的機能／活性の測定を許容する。樹立されたヒトＢ細胞株であるラジおよびポリクローナルな凝集ヒトＩｇＧ（ベリグロビン、凝集した分画）の使用は、細胞ベースのアッセイの手段によるＳＭ１０１の活性を分析するために優れた構成（set-up）を表す。実施例において、ＳＭ１０１は、いくつかの別々のＦＡＣＳ実験で、ラジ細胞で膜に結合したＦｃγＲＩＩＢに対する凝集ヒトＩｇＧｓの結合の抑制を示した。ＳＭ１０１の系列希釈は、ＳＭ１０１についてのＩＣ_５０値を測定するために用いられた。以下の実施例１において、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１５６５、０．００７８、０．００３９、０．００１９５μｇ／μｌの終端濃度での系列希釈が用いられているものの、１．３６６４、０．８０、０．４０、０．２０、０．１０、０．０６、０．０３６、０．０２１６、０．０１２９６、０．００６４８、０．００３８８８、０．００１９４４μｇ／μＬの系列や、他の濃度でも対象の範囲で線状のカーブ（a linear curve）を許容する他の希釈系列が用いられてもよい。計測した０．９８×１０^−６ＭのみかけＫ_Ｄは、文献に見られるデータ、昆虫細胞由来の（グリコシル化された）可溶性ＦｃγＲＩＩＢを用いた１．４×１０^−６Ｍ（ゾンダーマンら（Sondermann et al.）、バイオケミストリィ（Biochemistry）１９９９、３８（２６）：８４６９−７７）や、大腸菌からの組換えｓＦｃγＲＩＩＢを用いた１．６７×１０^−６Ｍ（マエナカら（Maenaka et al.）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリィ（J. Biol. Chem.）２００１、２７６（４８）：４４８９８−９０４）に相当する。算出されたＳＭ１０１のＩＣ_５０である１７．７μｇ／ｍＬ（実施例１）は、他のアッセイで測定されたＩＣ_５０値と適合する。

実施例１．６において、本発明者らは、調査的な医薬用製造物ＳＭ１０１の生物学的活性が標準品の活性に相当することを示すことができた。特に、クレームした結合活性を測定する方法に関し、実施例１は、ラジ細胞を用いる可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢのための詳細なプロトコルを提供する。当業者は、この方法を他のレセプタや細胞タイプに適合させるために必要な調整に十分に気づいているであろう。実施例１で用いられた代表的なプロトコルを以下に繰り返すが、当業者は、このプロトコルの変更が可能であることに十分に気づいている；
１．ラジ細胞培養の細胞濃度を測定する
２．遠心分離によりラジ細胞を回収する
３．ウェルプレートにＦｃガンマレセプタ（例えばＳＭ１０１）の濃度系列を準備する
４．凝集（aggr.）ベリグロビンバッファ＝「凝集ベリ−ミックス（aggr. Beri-Mix）」を準備する
５．ステップ４の「凝集ベリ−ミックス」にステップ２のラジ細胞を再懸濁させる
６．Ｆｃガンマレセプタ（例えばＳＭ１０１）の濃度系列を含有するそれぞれのウェルにラジ細胞懸濁液を添加する
７．氷上でインキュベートする
８．それぞれのウェルに「ＦＡＣＳ−バッファ」を添加し、遠心分離する
９．上清を廃棄する
１０．それぞれのウェルに二次抗体−混合物を添加する
１１．「ＦＡＣＳ−バッファ」を添加し遠心分離する
１２．上清を廃棄する
１３．「ＦＡＣＳ−バッファ」を添加し、サンプルをポリスチレンチューブに移し、ＦＡＣＳで分析する

実施例２は、ベリグロビンからの凝集ＩｇＧの分離のための特徴的な方法を提供する。また、当業者は、同様の結果となるようなこの方法の変更が可能であることに十分に気づくであろう。特に、ここに開示された凝集ＩｇＧの製造のための方法は、以下のステップにより要約され得る；
１．ベリグロビン（登録商標）の１６０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳ−Ｎで１００ｍｇ／ｍＬに調整する
２．凝集ＩｇＧを単量体または二量体のＩｇＧから分離することが可能なカラムを用いる分取ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）により分離する、例えば、カラム：スーパーデックス（Superdex）２００ １０／３００ＧＬ、移動相：５ｍＭのＨｉｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム ｐＨ６．５、０．０１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、フロー０．５ｍｌ／ｍｉｎ 室温、注入：０．４ｇ／ｌで１００μｌ（図１２参照）
３．凝集ＩｇＧ分画のタンパク質含量を測定する
４．選択的に：含量が０．５０ｍｇ／ｍＬ未満であれば限外濾過で濃縮し、含量が１．４０ｍｇ／ｍＬを超えればＰＢＳ−Ｎ（０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）で希釈する
５．２０％（ｖ／ｖ）グリセロールに調整する
６．０．５ｍＬに等分し、液体窒素で急速凍結する
上述した凝集ＩｇＧの分離のための方法は、他のヒトＩｇＧ調製物、例えば、従来入手可能なものやここに記載されたものにも適用可能である。

実施例３では、実施例２に従い分離された凝集ＩｇＧの含量および純度をテストした。このため、実施例２および３は、本発明の方法で用いられるべき凝集ＩｇＧでの特徴的なガイダンスを当業者に提供する。特に、バッファとしてＰＢＳ−Ｎ（０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）を用い１ｍＬ／ｍｉｎでＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）を用いることで、凝集ＩｇＧは、スーパーデックス２００、ハイロード（HiLoad）２６／６０、ジーイーヘルスケア（GE Healthcare）を用い、エクタ エクスプローラ（Akta Explorer）１０ ＦＰＬＣや他の適切なＦＰＬＣを用いるときに、およそ１１５ｍＬ後に溶出することが見出された。溶出液のタンパク質含量を実施例３のステップ１に従い計測し、必要であれば、０．３０および１．４ｍｇ／ｍＬの間、好ましくは０．５０および１．３５ｍｇ／ｍｌの間、より好ましい範囲の数値に調整した。この後、凝集ＩｇＧの純粋含量を実施例２、ステップ２に従い計測し、凝集／オリゴマＩｇＧの相対的ピーク面積が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であることを確保した。

本発明の方法が確実に実施できることを、予備的確認実験（実施例４−１０）において、用いた凝集ＩｇＧの品質の影響、テストサンプルにおける単量体ＩｇＧの量を変えることの効果、培養したまたは新たに解凍したラジ細胞での膜結合ＦｃγＲＩＩＢの発現の安定性、モノクローナル抗体を介したラジでの膜結合ＦｃγＲＩＩＢの阻害の効果について、および、ラジ細胞で用いた抗−ヒト二次抗体のバックグランド染色の安定性についてテストすることでさらに研究した。インターアッセイおよびイントラアッセイの安定性を、ｎ＝２５の実験で得られたみかけＫ_ＤおよびＩＣ_５０の平均値を比較することにより評価した。従って、本発明のインビトロ法（細胞ベースの力価アッセイ）が新たなバッチのＳＭ１０１の力価を標準品と比較して評価するための適切なツールであることが結論され得る。

上記知見、特徴的な方法および実施例に記載されたプロトコルは、ＦｃＲＩＩＡのためのヒト赤白血症細胞株Ｋ５６２やＦｃγＲＩＩＩＡのためのヒトＮＫＬ細胞等の適切な細胞との組み合わせで、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡやＦｃγＲＩＩＩＢに適用することも可能である。代わりに、チャイニーズハムスタ卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を、対象のＦｃγＲで感染させ、本発明のインビトロ法に用いた。実施例２の凝集ＩｇＧおよび実施例３のコントロールを調製する方法に関し、これらの方法を、ベリグロビンの代わりに用いることができるバリテクトやベンビッグ等の市場における他のヒトＩｇＧ調製物の製造物に等しく適用するであろう。

いくつかの文書が本明細書の本文を通じて指摘されている。ここに指摘されたそれぞれの文書（全ての特許、特許出願、学術論文、製造者の説明書、指示書、等を含む）は、上述のものであっても以下のものであっても、その全体として参照によりここに組み入れられる。ここにないものは、本発明が以前の発明による開示であるような以前のものと称されるものではないことを承認したものとして解釈されるべきである。

ここで用いられる単数形「１の（a）」、「１つの（an）」や「その（the）」は、この文脈が他のことを明確に示していない限り、複数の参照を包含することに留意するべきである。このため、例えば、「試薬（a reagent）」の参照が１またはそれ以上の異なる試薬を含有し、「その方法（the method）」の参照がここに記載された方法について改変することや置換することができる当業者に知られたものと同等のステップや方法の参照を含有する。

他のことが示されていない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連の全ての要素に関連することが理解されるべきである。当業者は、わずかなルーチン実験で、ここに記載された発明の特徴的な実施形態に対する多くの同等のものを承認し確認することができる。そのような同等のものは、本発明に包含されるべきものである。

この明細書および続くクレームを通じて、本文脈が他のことを要求しない限り、語句「含む（comprise）」、および。「含む（comprises）」や「含んでいる（comprising）」等の変化形は、明示された整数やステップまたは複数の整数や複数のステップのグループを含むものを包含することが理解されるべきであり、他の整数やステップまたは整数やステップのグループを排除するものではない。ここで用いられるときに用語「含んでいる（comprising）」は、用語「包含している（containing）」と置き換えられ得るものであり、しばしばここで用いられるときに用語「有している（having）」と置き換えられ得る。

ここで用いられるときに「からなる（consisting of）」は、クレーム要素に明示されていない要素、ステップや成分を排除する。ここで用いられるときに、「本質的にからなる」は、クレームの基本的で新しい特性に物質的に影響しない材料やステップを排除しない。

ここに記載されたように、「好適な実施形態」は、「本発明の好適な実施形態」を意味する。同様に、ここに記載されたように、「種々の実施形態」および「別の実施形態」は、それぞれ、「本発明の種々の実施形態」および「本発明の別の実施形態」を意味する。

ラジ細胞１×１０^５のＳＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ａを示すＦＡＣＳ分析用の主要な戦略（ゲーティングストラテジィ、gating strategy）である。Ｇ１は生細胞（全細胞の９４．９％）を含む。生細胞では、ＳＭ１０１不在下における二次抗体（αｈｕ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ）の膜結合した凝集ヒトＩｇＧ（凝集ベリグロビン）に対する結合について分析する。集団分布のみの図解のためにドット−プロットダイアグラムを含んでおり、右端のヒストグラムプロットが結合したヒト凝集ＩｇＧ（凝集ベリグロビン）を含むラジ細胞を表している。 ＳＭ１０１（可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ）濃度を変えて（最低濃度０μｇ／μＬ、サンプルの濃度範囲０．００７８−０．５μｇ／μｌ）インキュベートしたサンプルのヒストグラムのオーバーレイである。オーバーレイにおける対応するヒストグラムのネガティブコントロール（二次抗体単独での染色（＝ｓｅｋ ＡＫ、影付き赤））の方へのシフトは、ヒト凝集ＩｇＧｓ（凝集ベリグロビン）の細胞への結合の阻害を示している。サンプルのＰＥ−Ａ蛍光のメジアンを右側に示している。 ＳＭ１０１の代わりにチキン血清アルブミン（ＣＳＡ）を用い、変化させた濃度（最低濃度０μｇ／μＬ、サンプルの濃度範囲０．００７８−０．５μｇ／μｌ）でのコントロール実験のヒストグラムのオーバーレイである。ネガティブコントロール（ＳＭ１０１＿ｓｅｋＡＫ．ｆｃｓ：二次抗体単独での細胞の染色、影付き赤）。 実施例１の表１から、計測したメジアンを正規化した値を、ラングミュア等式（Langmuir equation）に当てはめた。 実験７のＦＡＣＳからのデータ（ＦＡＣＳ００７）を用い、シグモイドロジスティック関数（sigmoid logistic function）に当てはめたデータを、ＳＭ１０１の質量濃度（μｇ／μＬ）に対する％阻害で示す。 表３（ＦＡＣＳ０２１からのデータ）において算出されたＳＭ１０１標準品（reference standard）およびＳＭ１０１ＩＭＰの計測したメジアンを正規化した値に当てはめたデータのラングミュア−ダイアグラムである。 分取ＳＥＣによる凝集ＩｇＧの精製である。２８０ｎｍ（上側トレース（upper trace））、２６０ｎｍ（下側トレース（lower trace））での溶出液の光学密度および電導性（線状トレース（line trace））を示す。プールされた凝集ヒトＩｇＧ分画はグレーの影付きである。 種々の凝集ヒトＩｇＧ分画の分析ＳＥＣである。ブランクのバッファ注入（トレースボトム（trace bottom）、ライン）後のクロマトグラムであり、ベリグロビン（登録商標）からの単量体ＩｇＧの５０μｇ注入（最高ピークを含むトレース）が分取ＳＥＣクロマトグラム（参照）におけるおよそ１８０ｍＬでのピークに対応しており、ベリグロビン（登録商標）からの二量体ＩｇＧの５０μｇ注入（最低ピークを含むトレース）が分取ＳＥＣクロマトグラム（参照）におけるおよそ１４５ｍＬでのピークに対応しており、バッチ２７／１０／１０からの凝集／オリゴマＩｇＧの２４μｇ注入（オーバーラップしている第１ピークの低い方）およびバッチ１５／０７／１１からの凝集／オリゴマＩｇＧの２４μｇ注入（オーバーラップしている第１ピークの高い方）を示す。全体のクロマトグラム（ａ）および拡大部分（ｂ）を表している。 バッチ２７／１０／１０の凝集ヒトＩｇＧからの分析ＳＥＣクロマトグラムの代表的なインテグレーションである。 バッチ１５／０７／１１の凝集ヒトＩｇＧからの分析ＳＥＣクロマトグラムの代表的なインテグレーションである。 生きたラジ細胞に結合した凝集ヒトＩｇＧについて量を変えた異なるバッチ（Ｂｅｒｉ１、Ｂｅｒｉ２およびＢｅｒｉ３）でのＦＡＣＳ−分析である。 ラジ細胞に対する凝集ＩｇＧの結合のｐＨ依存性である（メジアンＭＦＩ）。 メジアンＭＦＩのｐＨ依存性である。グラフは、サンプルのメジアンＭＦＩ−二次抗体のメジアンＭＦＩ（コントロール）を示す。 ２つの有効なプールされたＩｇＧ調製物からの凝集ＩｇＧの分離を示す（ベリグロビンのバッチ番号２６８４０３１１Ａおよびサブクビアのバッチ番号ＢＶＮＧ１Ｍ０３２Ａ）。カラム：スーパーデックス２００ １０／３００ＧＫ；移動相：５ｍＭのＨｉｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム ｐＨ６．５、０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム；フロー：０．５ｍｌ／ｍｉｎ 室温；注入：０．４ｇ／ｌで１００μｌ。

以下の実施例は本発明を例証する。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。実施例は例証の目的で含まれるものであり、本発明はクレームによってのみ限定される。以下の略語が実施例（および明細書）で用いられる。
ｇ 地球の重力加速度
Ｃ 高速液体クロマトグラフィ
ＭＷＣＯ ｋＤａでの分子量カットオフ
ＰＢＳ−Ｎ ０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水
ｒｐｍ 回転数／分
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィ
ＦＳＣ 前方散乱
ＳＳＣ 側方散乱
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
ＰＥ フィコエリトリン
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞ソーティング
ＤＳＭＺ ドイツ細胞バンク（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＩＭＰ 調査的な医薬用製造物
ＡＵ 吸光度単位

（実施例１）
１．１ 実験の概要
本実施例では、ＳＭ１０１（可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ｓＦｃγＲＩＩＢ）の結合活性を測定するために本発明のインビトロ法（ＦＡＣＳ力価アッセイとも称される）を用いた。特に、ＦｃγＲＩＩＢを発現するヒト細胞の細胞株ラジ（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ３１９、ヒトバーキットリンパ腫）を一定量の凝集したリガンド（ヒトＩｇＧ）および量を変えたＳＭ１０１（すなわち、ｓＦｃγＲＩＩＢ、配列番号：１）とともにインキュベートした。ＳＭ１０１は、細胞結合ＦｃγＲＩＩＢ−タンパク質と競合し、ラジで発現された唯一の（ＩｇＧ−結合性の）Ｆｃγレセプタを表している。
ＦｃγＲＩＩＢ発現細胞により結合された凝集ＩｇＧは、ヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖の両者を認識する蛍光ラベルされたポリクローナル二次抗体を用い、続いて細胞のＦＡＣＳ分析により検出され得る。一定量の細胞および凝集ＩｇＧｓに添加された増加する濃度のＳＭ１０１は、膜結合ＦｃγＲＩＩＢに結合するＩｇＧの漸進的阻害の結果となる。用いた細胞の自己蛍光および二次抗体の非特異的結合の両者を測定するために、無染色細胞でのパラレルコントロールのサンプルと、二次抗体と排他的にインキュベートした細胞とを用いた。
ベクトン−ディッキンソン社（Becton, Dickinson & Company、ＢＤ）のＦＡＣＳ−カント−ＩＩ（FACS-Canto-II）装置でＢＤのＦＡＣＳ−ディバ ソフトウェア（FACS-Diva software）を用いて１×１０^４の生細胞を記録することにより、ＦＡＣＳ−分析を行った。フロージョー ソフトウェア（FlowJo Software）（ツリースター社（Treestar Inc.）、米国オレゴン州（OR/USA））を用いてデータを評価した。
１．２ 材料：
−プレート：Ｕ形状９６ウェル（セルスター（Cellstar）社、番号６５０１８０）
−チューブ：１５ｍＬファルコンチューブ
５ｍＬポリスチレン製、１２×７５ｍｍ（ＢＤ、番号３５２０５４）
−ピペット：滅菌済、フィルタ付き１０ｍＬ、５ｍＬ（ＴＰＰ、番号９４０１０、９４００５）、目盛付きフィルタ付き１−２００μＬ、１０１−１０００μＬ（スターラボ（StarLab）社、番号Ｓ１１２０−８８１０およびＳ１１２６−７８１０）
−マイクロプレート粘着テープ（８３ｍｍ、６６ｍｍ、パーマセル（Permacel）社、番号２５０８２）
−ＳＭ１０１（ｓＦｃγＲＩＩＢ）標準品：８．２ｍｇ／ｍＬ、４１６μＭ、−８０℃保存
−ＦＡＣＳ−バッファ：ＨＢＳＳ（ギブコ（Gibco）社、番号１４１７５）＋５％ＦＣＳ（ギブコ社、番号１０２７０−１０６）＋０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（メルク（Merck）社）
−細胞培養メディウム：
ＴＭメディウム：
ＲＰＭＩ（ギブコ社、番号３１５７０）＋１％ＭＥＭ ＮＥＡ（ギブコ社、番号１１１４０）＋１％ピルビン酸ナトリウム（ギブコ社、番号１１３６０）＋２ｍＭグルタマックス−Ｉ（GlutaMAX-I）（２００ｍＭストック溶液、ギブコ社、番号３５０５０−０６１）＋１０％ＦＣＳ（ギブコ社、番号１０２７０−１０６）
−ＩｇＧ（凝集ベリグロビン）：
２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＰＢＳ／０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中にＩｇＧ０．９６ｍｇ／ｍＬ、−８０℃保存。スーパーデックス２００（１６／６０）またはスーパーデックス２００（１０／３００）ＧＬでのサイズ排除クロマトグラフィにより分離されたもの。開始材料：ベリグロビン（登録商標）（ＺＬＢベーリング社（ZLB Behring GmbH）、Ｃｈ．−Ｂ．２３８４０３１１ＢまたはＣｈ．−Ｂ．２６８４０３１１Ａ；５ｍＬアンプル）またはサブクビア（登録商標）Ｃｈ．−Ｂ．ＢＶＮＧ１Ｍ０３２Ａ
−二次抗体：
ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒ−フィコエリトリン結合（conj.）（Ｆａｂ）_２フラグメント（ディアノヴァ社、カタログ番号１０９−１１６−０８８）
１．３ プロトコル：
１．密度０．２−１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのラジ細胞培養の細胞濃度を測定する
２．ラジ細胞の１．２×１０^６を採取し、１５ｍｌファルコンチューブ中、４７７×ｇで５分間遠心分離する
３．ここから、全てのステップを氷上または４℃で行う
４．９６ウェルプレート（Ｕ底状）で、１．０μｇ／μＬのＳＭ１０１で開始し０．００３９μｇ／μＬで終了するＳＭ１０１の濃度系列（希釈液：「ＦＡＣＳ−バッファ」）を準備し、同様に、対応するコントロールウェルに５０μＬのＴＭ−メディウムを添加することによりコントロールサンプル（二次抗体のみに０μｇ／μＬのＳＭ１０１を用いた）を準備する
５．ＦＡＣＳ−バッファ中で５０μｇ／ｍｌ凝集ベリグロビンの５００μＬを準備する（すなわち、０．９６μｇ／μＬストックの２６．０４μＬを４７３．９６μＬのＦＡＣＳ−バッファに添加することにより）、「凝集ベリ−ミックス」
６．ステップ２からのラジ細胞１．２×１０^６をステップ５からの「凝集ベリ−ミックス」５００μＬに再懸濁させ、十分に混合する（ボルテックス、３０秒、ミディアムスピード）
７．ＳＭ１０１濃度系列の５０μＬを含むそれぞれのウェルおよびコントロールウェルにラジ細胞懸濁液の５０μＬを添加する（最終容量＝１００μＬ）
８．暗所の氷上で３０分間インキュベートする
９．それぞれのウェルに「ＦＡＣＳ−バッファ」１５０μＬを添加し、粘着テープを用いてウェルをシールし５１３×ｇで５分間遠心分離する
１０．「ＦＡＣＳ−バッファ」中で１／１００二次抗体−混合物の１ｍＬを準備する
１１．上清を廃棄し、クロスコンタミネーションを回避するためにウェル上をシールしてプレートを短時間ボルテックスする
１２．無染色のコントロールを除き、それぞれのウェルに二次抗体−混合物５０μＬを添加する
１３．暗所の氷上で３０分間インキュベートする
１４．「ＦＡＣＳ−バッファ」１５０μｌを添加し、５１３×ｇで１０分間遠心分離する
１５．上清を廃棄し、プレート上をシールしてプレートを短時間ボルテックスする
１６．「ＦＡＣＳ−バッファ」１５０μｌを添加し、サンプルを５ｍＬポリスチレン製チューブに移し、ＢＤのＦＡＣＳ−カント−ＩＩで分析する（ＢＤのディバ ソフトウェア ｖ．６．０を用いる）
１．４ ＳＭ１０１の濃度系列（終了濃度）：
０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１５６５、０．００７８、０．００３９、０．００１９５μｇ／μＬ；最終容量（Ｖ_ＥＮＤ）＝１００μＬ
１．５ ＦＡＣＳデータ分析
ＢＤのＦＡＣＳ−カント−ＩＩでＦＡＣＳ−データを記録し、ｆｃｓ−ファイルフォーマットでデータを保存した。続く分析ではフロージョー ソフトウェア（ｖ．８．８．４）を用いた。図１は代表的なゲーティングストラテジィを表している。
生細胞を採取しそのフィコエリトリン−蛍光を評価した。ＳＭ１０１濃度系列からのサンプルのヒストグラムをフロージョー ソフトウェアを用いてヒストグラムのオーバーレイにグループ化した。それぞれのサンプルについて、そのソフトウェアにより蛍光メジアン値を算出した（図２）。図２は、ラジ細胞での膜結合ＦｃγＲＩＩＢに対する凝集ＩｇＧｓの結合における強力な濃度依存性阻害を示している。並行実験において、ＳＭ１０１による特異的阻害を確認するために、上述したものと同じ濃度系列を用いる同量のチキン血清アルブミンでＳＭ１０１を置換した（図３）。本発明のインビトロ法は、図２に表されるショーケース実験で立証されるように、ＳＭ１０１の結合活性を評価するための定性的な細胞ベースの手段を提供する。
１．６ 活性の算出
この細胞アッセイにおいてＳＭ１０１の活性を算出するために、蛍光強度シグナルのメジアンを以下の式を用いて正規化した（正規化したデータを表１に示す）。
表１は、図２に示されたＦＡＣＳ計測について算出された正規化した値であり、続いてのラングミュア等温線の当てはめ（fitting）に用いたものである。
みかけＫ_Ｄおよび最大阻害の測定のために、エクセル（Excel）のソルバーアドイン関数（Solver-add-in function）を用いて、以下のラングミュア結合等温式に対するデータの続いての当てはめを行い、図４に示されるような阻害曲線の結果を得た。ラジ細胞でのＦｃγＲＩＩＢの未知の細胞表面濃度およびフリーなＳＭ１０１の濃度が計算に考慮され得ないため、みかけＫ_Ｄが真正（real）Ｋ_Ｄと異なることとなる。％阻害では％正規化したシグナルを用いており、ｃが可溶性ＦｃＲの濃度（モル濃度または質量濃度）である。エクセルのソルバーアドイン関数やこのタイプの算出を許容する他のコンピュータプログラムを用い、最大阻害およびＫ_Ｄのために以下の式に当てはめた。
この当てはめストラテジィを用いることで、ＦＡＣＳデ−タからみかけＫ_Ｄが０．９９×１０^−６Ｍであり、平方残差の和が０．０２２６であることが明らかとなった（表２）。表２は、ＦＡＣＳ００７からのデータのラングミュア等式に当てはめて得られたパラメータである。
ＦＡＣＳのデータからＳＭ１０１のＩＣ_５０を算出するために、分析ソフトウェアであるマイクロカル（Microcal、登録商標）オリジン（Origin）（バージョン：６．０）を用いた。％阻害を競合ＳＭ１０１の濃度に対してプロットした。以下のシグモイドロジスティック関数にデータを当てはめた。ＩＣ_５０の算出では、パラメータＡ１を０とし、パラメータＡ２を１００とした。
表１からのデータ（ＦＡＣＳ００７）を用いることで、ＩＣ_５０が１７．７μｇ／ｍＬ、スロープが１．６３と評価された（図５）。
１．７ 標準品およびＳＭ１０１の比較
後続の実験において、調査的な医薬品製造物であるＳＭ１０１（ｓＦｃγＲＩＩＢ）の生物活性を調査し、薬剤物質である標準品（ＦＡＣＳ０２１）と比較した。ＩＭＰおよび標準品について、シングル９６−ウェルプレートで並行して上記項目１．４に記載されたようにＦＡＣＳベースの力価アッセイを行った。
記載したようにＦＡＣＳ−データを記録し分析し（上記項目１．５）、上記概説したラングミュア結合等温式を用いてデータの当てはめを行った（以下の表３および図６）。表３は、ラングミュア等温線の当てはめに用いたＦＡＣＳ計測（ＦＡＣＳ０２１からのデータ）から得られた値である。
ＦＡＣＳデ−タからＳＭ１０１標準品のみかけＫ_Ｄが０．７３９×１０^−６Ｍであり、ＳＭ１０１のＩＭＰのみかけＫ_Ｄが０．９０４×１０^−６Ｍであることが明らかとなった（表４）。表４は、表３、図６からのデータ（ＦＡＣＳ０２１）をラングミュア関数およびシグモイドロジスティック関数に当てはめて得られたパラメータである。
上述したシグモイドロジスティック関数を用いるＦＡＣＳ−分析のデータからＳＭ１０１の標準品およびＩＭＰのＩＣ_５０を算出するために、分析ソフトウェアのマイクロカル（登録商標）オリジン（バージョン：６．０）を用いた。ＳＭ１０１標準品は、ＩＣ_５０が１２．９μｇ／ｍＬを示し、ＳＭ１０１のＩＭＰが１６．２μｇ／ｍＬであった（表４）。
インターアッセイ偏差の＋／−２０％が細胞アッセイにおいて容認できるとすれば、ＦＡＣＳベースの力価アッセイにおいて測定されたように、ＩＭＰの生物活性が薬剤物質であるＳＭ１０１標準品に相当することが結論付けられ得る。

（実施例２）
本実施例では、市販のＩＶＩＧ、ベリグロビンからの凝集ＩｇＧの調製のための方法を記載する。凝集ＩｇＧは、本発明の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタの結合活性をインビトロで測定するための方法の原料である。本実験では、以下の試薬を用いた：
（品目） （購買先） （品質）
ベリグロビン（登録商標） 地元薬局 承認番号
１６０ｍｇ／ｍＬ １７６ａ／９２
ＣＳＬベーリング（Behring）
５ｍＬプレフィルドシリンジ
塩化ナトリウム ロス、または同等物 ｐ．ａ．
塩化カリウム メルク、または同等物 ｐ．ａ．
リン酸水素２ナトリウム・２水塩 シグマ、または同等物 ｐ．ａ．
リン酸２水素カリウム メルク、または同等物 ｐ．ａ．
アジ化ナトリウム メルク、または同等物 精製済
グリセロール９８％、無水 ロス、または同等物 欧州薬局方
凝集ＩｇＧの製造のための方法は、以下のステップに要約することができる：
１．ベリグロビン（登録商標）の１６０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳ−Ｎで１００ｍｇ／ｍＬに調整する
２．分取ＳＥＣにより分離する
３．タンパク質含量を測定する
４．選択的に：含量が０．５０ｍｇ／ｍＬ未満であれば限外濾過で濃縮し、含量が１．４０ｍｇ／ｍＬを超えればＰＢＳ−Ｎ（０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）で希釈する
５．２０％（ｖ／ｖ）グリセロールに調整する
６．０．５ｍＬに等分し、液体窒素で急速凍結する
特に、１６０ｍｇ／ｍＬベリグロビン（登録商標）の５ｍＬを、均質な溶液が得られるまで、ＰＢＳ−Ｎの３ｍＬと慎重に混合する。予めＰＢＳ−Ｎで平衡化したスーパーデックス２００ハイロード２６／６０カラム（ジーイーヘルスケア）に、３．０ｍＬの希釈物を流速１ｍＬ／ｍｉｎ（エクタ エクスプローラ１０、ジーイーヘルスケア）で注入する。バッファとしてＰＢＳ−Ｎを用い１ｍＬ／ｍｉｎでタンパク質を分離する。凝集ＩｇＧは、およそ１１５ｍＬ後に溶出し、溶出液の２８０ｎｍでの光学密度が５０ｍＡＵを超えた後、３ｍＬずつの分画で回収する。はじめの３つの分画をプールし、さらなるＳＥＣ処理からのプールと混合されるまで、最大３日間、２−８℃で保存する。全てのＳＥＣ処理からの凝集ＩｇＧプールのタンパク質含量が０．５０ｍｇ／ｍＬを下回れば、プールを限外濾過（アミコンウルトラ（Amicon Ultra）、ウルトラセル（Ultracel）１００ｋＤａのＭＷＣＯ、ミリポア（Millipore））により１．００−１．４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮すべきである。凝集ＩｇＧプールのタンパク質含量が１．４０ｍｇ／ｍＬを超えれば、プールをＰＢＳ−Ｎで１．４０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。最後に、凍結保護剤のグリセロールを、最終濃度の２０％（ｖ／ｖ）まで、定速攪拌（５００ｒｐｍ）しながら滴下する。調整した凝集ベリグロビン（登録商標）プールの含量を放出用に測定し、プールを１．５ｍＬ反応チューブ（セーフシールチューブ（Safe seal tubes）、ザルステッド（Sarstedt））に０．５ｍＬずつ分取する。分取したものを液体窒素で急速凍結し、−６０℃から−８０℃で保存する。精製の結果を図７に示しており、影付き領域がプールされた凝集ＩｇＧ分画を表している。

（実施例３）
本実施例では、実施例２の方法に従い調製された凝集ＩｇＧの品質をテストするための方法を記載する。第１のステップにおいて、凝集ベリグロビン（登録商標）分画の含量を測定する。第２のステップにおいて、凝集ベリグロビン（登録商標）の純度を分析ＳＥＣによりテストする。第２のステップを凝集ベリグロビン（登録商標）の凍結した分取品で行う。凍結した分取品を、その使用前に穏やかに振盪（５００ｒｐｍ（回転／分）、サーモミキサー（Thermomixer）Ｒ、エッペンドルフ（Eppendorf））しながら室温（２５±２℃）で解凍しなければならない。
不適当な（incongruous）バッチの場合にテストの労力を最少化するために、品質テストを段階的に行う。それぞれのステップのテストで以下のテストを行う。
（ステップ）（項目）（方法／プラン） （目標とする値）
１ 含量 ＵＶ／ＶＩＳ ０．３０ｍｇ／ｍＬ≦
分光法 ｃ_{凝集ベリグロビン}≦１．３５ｍｇ／ｍL
２ 純度 分析ＳＥＣ 相対ピーク面積
凝集／オリゴマの
ベリグロビン（登録商標）＞７０％
ステップ１：ＵＶ／ＶＩＳ分光法による含量計測
実施例１の方法に従い製造した凝集ベリグロビン（登録商標）分画の含量を、ＵＶ／ＶＩＳ分光法により計測する。必要であれば、タンパク質溶液を、２８０ｎｍでの光学密度が０．２および０．８の間となるまで、それぞれのバッファで希釈する。その溶液の４００μＬをＵＶマイクロキュベット（ＵＶ−キュベット マイクロ、ブランド（Brand））に移す。ブランクとしてのＰＢＳ−Ｎに対して２８０ｎｍおよび３２０ｎＭでの吸光度を記録し（キャリィ１００バイオ（Cary 100 Bio）、ヴァリアン（Varian））、ｍｇ／ｍＬでの濃度を以下の等式に従い算出する。アッセイを３回行い、結果を平均する。
ステップ２：分析ＳＥＣによる純度
二量体および単量体の形態に対して相対的な凝集／オリゴマのベリグロビン（登録商標）の量を分析ＳＥＣにより測定する。予めＰＢＳ−Ｎで平衡化したスーパーデックス２００ １０／３００ＧＬカラム（ジーイーヘルスケア）を備えたシリーズ１２００ＨＰＬＣシステム（アギレント（Agilent））を用いる。凝集ベリグロビン（登録商標）の新たに解凍した分取品の１５０μＬを遠心分離し（２０，０００・ｇ、５分間）、上清の５０μＬを流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで注入する。バッファとしてＰＢＳ−Ｎを用い流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでタンパク質を分離させ、２８０ｎｍで溶出液の吸光度をモニタする。全体の処理時間を５０分に制限する。５０μＬのＰＢＳ−Ｎ、２０％グリセロールの注入を、それぞれの凝集ベリグロビンの注入に先行させる。クロマトグラムをマニュアルで統合（integrate）し、純度を、１３．０分から３０．０分までの全てのピークと比較した凝集／オリゴマのベリグロビン（登録商標）ピークの相対面積として報告する。種々のベリグロビン（登録商標）分画の分析ＳＥＣを図８に示す。図９ａおよび９ｂは、２つの凝集ベリグロビン（登録商標）バッチからの分析ＳＥＣクロマトグラムの代表的な統合（integration）を示す。

（実施例４）
本実施例では、ラジ細胞への結合における凝集ベリグロビン（登録商標）の量および品質の推定される影響を測定するために実験を行った。量を変えた凝集ベリグロビン（登録商標）および異なるバッチのベリグロビンを用いて実験を行った。
凝集ベリグロビン（登録商標）のテストした濃度は、２０、１０、５、３および２．５μｇ／１×１０^５細胞を含むものとした。続く実験では、二次抗体が凝集ベリグロビン（登録商標）と比較して過剰に有効であるかを測定するために、二次抗体（αｈｕ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ）の濃度を付随して変更した（図１０）。
図１０からわかるように、ラジ細胞への結合は、最低濃度であっても、凝集ベリグロビン（登録商標）の量により制限されない。１×１０^５細胞あたり２．５μｇの量（Ｖ_ｅｎｄ＝１００μＬ）が細胞における有効なレセプタへの定量的な結合に十分である。表５は、凝集ベリグロビン（登録商標）の異なるバッチ（番号１、２、３）のＭＦＩのメジアン、算出した平均値およびＳＤを示す。

（実施例５）
本実験では、ラジ細胞への凝集ベリグロビン（登録商標）の結合のｐＨ−依存性を調査した。実施例１（ＦＡＣＳ−力価−アッセイ）に記載したように本発明の方法に用いられるメディウムは、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ピルビン酸塩ナトリウム、１０％ＦＣＳおよびグルタミン源（グルタマックス−Ｉ、ギブコ）を包含する。Ｌ−グルタミンは、次第にＰＣＡおよびＮＨ３に分解しアルカリ性ｐＨに到る。グルタマックス−Ｉが低減した分解傾向を有しているとしても、培養メディウムのｐＨは、次第によりアルカリ性となる。ラジ細胞への凝集ベリグロビン（登録商標）の結合のｐＨ−依存性をテストするために、０．１×１０^６のラジ細胞を２．５μｇの凝集ベリグロビン（登録商標）とともに種々のｐＨ条件（ｐＨ６．５、６．７、７．０、７．２、７．８、８．０、８．５、９．０、１０．０）でインキュベートし、細胞に結合する凝集ベリグロビン（登録商標）を１／２００αｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ二次抗体を用いるＦＡＣＳアッセイで評価した。図１１（ａ）および１１（ｂ）からわかるように、ラジ細胞への凝集ベリグロビン（登録商標）の結合の依存性がテストしたｐＨ条件のｐＨ６．５で見かけ上最適となる。より低いｐＨ条件は、細胞への有害な効果が予想されるため、テストしなかった。このため、ｐＨ７．０±０．２５のフレッシュなメディウムのみをテストにもちいたことで安全なはずである。アッセイでの希釈液として、ＴＭメディウムに代えてＦＡＣＳ−バッファ（ＨＢＳＳ＋５％ＦＣＳ＋０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ６．５−６．８）を用いることが好適である。

（実施例６）
ＳＭ１０１によるＦｃγＲＩＩＢ陽性（positive）細胞へのＩＣ結合の競合阻害における単量体ヒトＩｇＧの効果を追加の実験でテストした。この目的のために、ラジ細胞を、１セット量の凝集ベリグロビン（登録商標）（２．５μｇ／１×１０^５細胞）、１セット量の単量体ベリグロビン（登録商標）および変化する量のＳＭ１０１（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９μＭ）とともにインキュベートするか、または、１セット量の凝集ベリグロビン（登録商標）、ＳＭ１０１および変化する量の単量体ベリグロビン（登録商標）（３．３、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０μＭ）とともにインキュベートするか、のいずれかとした。二次抗体を過剰に添加した（１／１００希釈のストック、２０μＬを１９８０μＬに添加、二次抗体のタンパク質濃度：０．５μｇ／μＬ、０．２５μｇ／１×１０^５と同じ）。単量体ベリグロビン（登録商標）がｎＭ（ナノモル）濃度範囲でラジ細胞への免疫複合体の結合を競合的に阻害することが見出された。ＳＭ１０１は、μＭ（マイクロモル）濃度範囲にもかかわらず同様の効果を示す。単量体ベリグロビン（登録商標）が膜結合ＦｃγＲＩＩＢに結合し、このため凝集ベリグロビンの結合を阻害するものと結論付けることができる。このシステムにおける凝集した活性なベリグロビン（登録商標）分子の数は不明であり、このため観測された効果が、膜結合ＦｃγＲＩＩＢへの単量体ＩｇＧの優先的な結合に起因するものか、または、添加した単量体ＩｇＧにより凝集ベリグロビン（登録商標）の数が優ることによるものかははっきりしていない。単量体ＩｇＧの最高濃度（３．３μＭ）は０．５μｇ／１×１０^５細胞に相当しており、単量体ＩｇＧが全ての有効な二次抗体に結合することを意外なものにする。

（実施例７）
本実験では、二次抗体バックグランドのＭＦＩに関連するインターアッセイ／イントラアッセイの再現性をテストした。遡及的な分析において、ｎ＝２５のテストのデータをラジ細胞での二次抗体のバックグランド染色の変化について評価した。以下の表７は、抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ二次抗体（１／１００希釈）で染色したラジ細胞のＭＦＩ、サンプルの平均値および標準偏差を示す。色つきは並行して行った実験（イントラアッセイ安定性）を示す。
表６からわかるように、二次抗体（凝集ベリグロビンを添加していない）で染色したラジ細胞のＭＦＩは、別の実験（インターアッセイ安定性）または並行の実験（イントラアッセイ安定性）のいずれを比較しても、標準偏差（ＳＤ）２１％であり（ＭＦＩのＳＤが２９、平均ＭＦＩが１３４．９）、まずまず一定のままである。

（実施例８）
本実施例では、みかけＫ_ＤおよびＩＣ_５０に関連するインターアッセイ／イントラアッセイの再現性をテストした。２５の実験からのＦＡＣＳベースの力価アッセイのデータセットにおけるインターアッセイおよびイントラアッセイの安定性を評価するために、当てはめたみかけＫ_ＤおよびＩＣ_５０を分析した。以下の表７において、Ｋ_Ｄ、ＩＣ_５０および２５のＦＡＣＳ実験の採取前のラジ細胞の細胞密度を示す。シングルプレートでの別のテストでＫ_ＤおよびＩＣ_５０を評価したため、実験１２−１５および１６−１７がイントラアッセイ安定性を示している。テストＮｏ．４および６（グレーで強調）は、計測データが明らかな異常値を示しているため、後続の分析から排除した。
表７に示されたデータから総括されるように、インターアッセイおよびイントラアッセイの安定性は高い。ところが、テストＮｏ．１８以降はより低いＫ_ＤおよびＩＣ_５０値が測定されたことに留意すべきである。このことは、ＦＡＣＳ−カントＩＩ装置の新たなベースライン設定と相関する。
表８は、表８からの２５の実験におけるＫ_ＤおよびＩＣ_５０の平均値、標準偏差および平均偏差を示す。
表８は、表７に示された全２５の実験におけるＫ_Ｄ（０．５３×１０^−６Ｍ）およびＩＣ_５０（１０．６μｇ／ｍＬ）の平均値を示している。これは、およそ５０％のＳＤとなる（ＳＤ＝０．２６）。テストＮｏ．１−１７（明らかな異常値のＮｏ．４および６を除く）とテストＮｏ．１８−２５とについて別々に平均を算出すれば、ＳＤは、テストＮｏ．１−１７について２９％（平均Ｋ_Ｄが０．６８×１０^−６Ｍ）、テストＮｏ．１８−２５について２６％（平均Ｋ_Ｄが０．２６×１０^−６Ｍ）で顕著に低下する（表９）。表９は、テストＮｏ．１−１７とテストＮｏ．１８−２５との平均Ｋ_ＤおよびＩＣ_５０値を示す。

Claims (15)

1. 可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性をインビトロで測定するための方法であって、
   （ａ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ、
   （ｂ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む前記表面を１セット量の前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの組成物と接触させ、
   （ｃ）前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む前記表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、
   （ｄ）ステップ（ｃ）において測定した前記表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる前記組成物の安定性を測定する、
   ステップを含むことを特徴とする方法。
2. ステップ（ａ）および（ｂ）は、並行してまたは連続して行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む前記表面は、（哺乳動物の）細胞もしくは細胞株、および／または、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢでコートされ得る固体表面であるかまたは該細胞もしくは細胞株および／または該固体表面を含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記凝集ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧの少なくとも９０％の含量により特徴づけられるヒトタンパク質から分離され得る凝集ヒトＩｇＧであることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記凝集ヒトＩｇＧは、ベリグロビンから分離され得ることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記凝集ヒトＩｇＧは、サイズ排除クロマトグラフィを含む分離法によりヒトタンパク質から取得可能な凝集ヒトＩｇＧであることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記サイズ排除クロマトグラフィは、前記凝集ＩｇＧから単量体および／または二量体のＩｇＧを分離することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 前記凝集ヒトＩｇＧは、ラベルされていることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ラベルは、二次ラベルされたヒト抗−ＩｇＧ抗体を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは、可溶性ＦｃガンマＩＩＢレセプタであることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記可溶性ヒトＦｃガンマＩＩＢレセプタは、ＳＭ１０１（配列番号１）であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 前記哺乳動物の細胞は、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６として寄託されたラジ細胞であることを特徴とする請求項３ないし請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記表面により含まれたヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプおよび可溶性ヒトＦｃガンマレセプタの前記調製物により含まれたヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプは、同一であることを特徴とする請求項１ないし請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 請求項６または請求項７において定められる方法により取得可能な非熱凝集ヒトＩｇＧ。
15. 請求項１４において定められる非熱凝集ヒトＩｇＧと、選択的にヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面と、を含むキット。