KR20160036058A

KR20160036058A - 가용성 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물의 안정성을 측정하기 위한 시험관 내 방법

Info

Publication number: KR20160036058A
Application number: KR1020167005136A
Authority: KR
Inventors: 피터 썬더만; 토마스 폴; 도미닉 테르 메르
Original assignee: 수프레몰 게엠베하
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2016-04-01
Also published as: US20160195541A1; ES2687716T3; EP3028041B1; CN105593685B; SG11201600706PA; KR102282823B1; JP2016525364A; CN105593685A; BR112016001898A2; IL243861A0; CA2919997A1; CA2919997C; US10866247B2; EP2833139A1; EA030087B1; MX370732B; WO2015015001A1; IL243861B; AU2014298371B2; EP3028041A1

Abstract

본 발명은 본질적으로 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물의 저장 안정성(shelf stability); 시간에 따른 안정성; 저장 기간(shelf life)과 같은 안정성을 측정하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면을 응집된 인간 IgG 일정량과 접촉시키는 단계; 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면을 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 상기 조성물 일정량과 접촉시키는 단계; 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 측정하는 단계; 및 단계 (c)에서 측정되는 바와 같은 상기 표면에 결합되는 응집된 인간 IgG의 양을 기준 값과 비교하고 (이에 따라) 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 근본적으로 구성되는 상기 조성물의 안정성(저장 안정성; 시간에 따른 안정성; 저장 기간)을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본원에서 정의되는 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 응집된 인간 IgG, 및 본 발명의 방법에서 상기 응집된 인간 IgG의 용도에 관한 것이다.

Description

가용성 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물의 안정성을 측정하기 위한 시험관 내 방법{IN VITRO METHOD FOR DETERMINING THE STABILITY OF COMPOSITIONS COMPRISING SOLUBLE FC GAMMA RECEPTOR(S)}

본 발명은 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물의 안정성을 측정하기 위한 근본적인 시험관 내 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면을 응집된 인간 IgG 일정량과 접촉시키는 단계; 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면을 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 상기 조성물 일정량과 접촉시키는 단계; 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 측정하는 단계; 및 단계 (c)에서 측정되는 바와 같은 상기 표면에 결합되는 응집된 인간 IgG의 양을 기준 값과 비교하고, (이에 따라) 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB을 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 상기 조성물의 안정성을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본원에서 정의되는 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 응집된 인간 IgG, 및 본 발명의 방법에서 상기 응집된 인간 IgG의 용도에 관한 것이다.

Fc 수용체(FcR)는 면역계에서 핵심적인 역할을 하며 면역계에서 이들은 면역 반응의 범위와 강도를 조절한다. 병원체는 혈액순환에 접근한 이후, 면역글로불린(Ig)에 의해 옵소닌화(opsonized)된다. 생성된 면역복합체(IC)는 이들의 다원자가성(multivalency)에 기인하여 높은 결합력으로 FcR 함유 세포에 결합하여 FcR의 군집(clustering)을 야기하며, 이는 여러 효과기 기능을 유발한다[문헌: etzger, H., J. Immunol. 1992, 149:1477-1487]. 이는, 발현되는 FcR 유형 및 관련 단백질에 따라, 후속의 병원체의 중화 및 항원 제시를 갖는 세포내이입, 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 매개체의 분비 또는 항체 생산의 조절을 포함한다[문헌: Fridman et al, Immunol. Rev. 1992, 125:49-76; van de Winkel and Capel, Immunol. Today 1993, 14:215-221].

면역 복합체는 적응 면역의 일부로서 항체, 항원, 보체 및 다양한 수용체 간의 복잡한 상호작용에서 비롯된다. 면역 복합체에서 항체에 결합된 항원은 일반적으로 순환으로부터의 매우 적은 양의 '외래' 항원도 생리학적으로 제거할 수 있는 다양한 세포 메커니즘에 의해 제거된다. 면역 복합체는, 인간이 단백질(감염, 백신, 약물 등) 및 캐스캐이드를 활성화시키기 위하여 단백질 캐리어를 필요로 하는 비단백질 물질(합텐)과 같은 외래 물질에 노출될 때 형성될 수 있다. 자가면역 장애는 (병원성) 면역 복합체가 상이한 기관에 병리학적으로 쌓였을 때 발병하며, 이는 기관 손상/질환을 야기하는 염증성 캐스캐이드를 개시한다. 면역 복합체 질환은 이러한 성분 중 하나 이상에서 조절장애가 발생할 때 무수한 양상으로 발병할 수 있다.

모든 면역글로불린(Ig) 부류에 대하여 특이적인 FcR가 존재한다. IgG가 인간 순환에서 발견되는 가장 풍부한 항체 동형(isotype)이기 때문에, IgG에 대한 FcR[Fc 감마 수용체 (FcγR)]도 가장 폭넓은 다양성을 가지며 가장 풍부하다. 인간 FcγR에 상응하는 이종상동성(orthologous) 단백질이 원숭이 및 마우스와 같은 다른 영장류를 포함하는 다른 포유동물 종에서 발견된다. 인간과 마찬가지로, 다른 종도 이들의 상응하는 IgG 아부류(subclass)에 대하여 다양한 친화성을 갖는 여러 FcγR를 갖는다. FcγR는 활성 및 억제성 수용체 모두를 포함하며, 이러한 양성 및 음성 시그널의 통합은 생산적 면역 반응에 필수적이다.

인간에서 3가지 부류의 FcγR가 존재한다: 고친화성 수용체 FcγRI 및 저친화성 수용체 FcγRII 및 FcγRIII. FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIIIA(CD16)는 유형 I 막관통 단백질 또는 가용성 형태(sFcR)로 발생하지만, FcγRIII의 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커된(anchored) 형태(FcγRIIIB) 또한 존재한다. 게다가, FcγR은 다양한 이소형(isoform)(FcγRIA, B1, B2, C; FcγRIIA1-2, B1-3, C) 및 대립형질(FcγRIIa1-HR, -LR; FcγRIIIb-NA1,-NA2)로 나타난다[문헌: van de Winkel and Capel, Immunol. Today 1993, 14:215-221]. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 FcγR는 IgG에 대하여 상이한 친화성을 갖고, 상이한 IgG 아부류에 대하여 특이적으로 상이한 결합 친화성을 갖는다. 인간에서는 혈청에서의 풍부도의 순서대로 명명한 4개의 IgG 아부류가 있다(IgG1 (66%), 2 (23%), 3 (7%), 및 4(4%); 문헌(Hashira et al., Pediatr. Int. 2000, 42(4):337-342)].

FcγRII는, 주로 면역 복합체의 세포내섭취에 관련되는 FcγRIIIA와 함께, 면역적격세포(immunocompetent cell) 상에 가장 폭넓게 분포하는 수용체이다. FcγRII는 FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC의 3가지 이소형으로 존재하며, FcγRIIA의 세포외 영역이 단지 7%의 아미노산 잔기에 의해 이와 상이한 것에 비해 FcγRIIB 및 FcγRIIC의 세포외 영역은 동일하다. 그럼에도 불구하고, 이 두 형태는 인간 및 마우스 IgG 아부류에 대한 이들의 결합 특성[문헌: van de Winkel and Capel, Immunol. Today 1993, 14:215-221] 및 인간 IgG에 대한 이들의 상이한 친화성에 의해 구별될 수 있다[문헌: Bruhns et al., Blood 2009, 113:3716-3725]. FcγRIIIA는 ADCC의 유도를 위한 핵심 수용체이고, 억제성 FcγRIIB는 B 세포 상에 발현되는 유일한 FcγR이다. FcγRIIB의 발현은 B 세포를 하향 조절하여 항체 생산을 감소시키는데 필수적이다.

sFcγRIIB에 기반하여, 본 발명자들은 자가면역 질환의 치료를 위한 신규 수단 및 방법을 개발한다. 가장 진행된 생성물은 SM101이며, 이는 병원성 면역 복합체의 결합에 대해 면역 세포 상에서 발현되는 FcγR과 경쟁한다. 현재 SM101은 전신홍반루푸스 및 면역혈소판결핍증과 같은 자가면역 장애의 치료를 위하여 미국 및 유럽에서 임상 시험에 사용된다.

단백질성(proteinaceous) 의약, 예를 들어, SM101을 포함하는 의약 또는 약제학적 조성물이 저장 동안에 분해될 수 있음을 가정하여, 이들을 포함하는 단백질 또는 조성물의 잔여 활성(residual activity)을 반영하는 재현가능한 시험관 내 시험을 개발하는 것이 매우 바람직하다.

따라서, 본 발명의 기술적 문제는 가용성 인간 FcγR을 포함하는 조성물의 안정성을 측정하기 위한 시험관 내 방법을 개발하는 것이었다.

본 발명자들은, "정상" 또는 "건강한" 인간의 집단으로부터 수득된 인간 IgG 제제[예를 들어, 시판되는 정맥내 면역글로불린(IVIG) 제제]가 응집/올리고머화된 믿을만한 방식으로 제공될 수 있는 지금껏 규명되지 않은 응집된 인간 IgG의 분획을 포함한다는 것을 관찰하였다. 병원성 면역 복합체의 이러한 유사체가 다른 "정상" 또는 "건강한" 인간 집단으로부터 유래될 수 있다는 것이 이전에 알려지지 않았기 때문에, 이는 놀라운 것이다. 상기 응집된 인간 IgG는 FcγR 수용체에 결합하고 이에 따라 생체 내 상황을 모방하며(즉, 응집된 인간 IgG는 상기 언급된 병원성 면역 복합체를 모방함), 따라서 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 조성물의 안정성을 검출, 측정 또는 입증하고자 하는 방법에 사용될 수 있다. 주목할 만하게도, 응집된 인간 IgG는, 예를 들어, 문헌[참조: Engelhard, et al., (1990), Eur. J. Immunol. 20, 1367-1377, Bruhns et al. (2009), Blood J. 113(16), 3716-3725 또는 US　2008/008700]에서 기재된 바와 같이 열 응집되지 않는다. Bruhns등은, 임의의 후속 처리 없이 30분 동안 pH 8.0 및 36℃에서 붕산염-완충된 식염수 중에서 인간 IgG를 항온처리하여 생성된 비-가열 인간 IgG(3718 페이지, 면역글로불린 결합 검정) 및 세포 배양 상층액으로부터 정제된 항-NIP mAb와 복합된 화학적으로 개질된 BSA(NIP12-BSA-바이오틴)으로부터 유도되는 인위적 면역 복합체(3717 페이지, 항체 및 시약)를 개시한다. 마찬가지로, 문헌[참조: US　2008/008700]은 8 페이지에서 HAGG(열-응집된 IgG)의 용도를 개시한다.

결과적으로, 본 발명은 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물(의약과 동일함)의 안정성[예: 저장 안정성(shelf stability) 또는 보관 안전성(storage stability)]을 측정하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면을 응집된 인간 IgG 일정량과 접촉시키는 단계;

(b) 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면을 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 상기 조성물 일정량과 접촉시키는 단계;

(c) 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 측정하는 단계; 및

(d) 단계 (c)에서 측정되는 바와 같은 상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 기준 값과 비교하고 (이에 따라) 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물의 저장 안정성; 시간에 따른 안정성; 저장 기간과 같은 안정성을 측정하는 단계.

본 발명의 방법의 단계 (a) 및 (b)는 동시에(concomitantly) 또는 연속하여(consecutively) 수행될 수 있다. 단계 (b) 및 (a)의 순서가 역으로 바뀌는 것 또한 가능하다.

본 발명의 방법은 단계 (c) 이전 및 바람직하게는 단계 (a) 및 (b) 후에 수행되는 세척 단계를 포함하는 것이 가능하다.

본 발명의 맥락에서 사용되는 상기 가용성 인간 Fc 감마 수용체가 가용성 Fc 감마 IIB 수용체인 것이 바람직하다. 상기 가용성 인간 Fc 감마 IIB 수용체가 SM101(서열 번호 1)인 것이 특히 바람직하며, 이는 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 세포 또는 이.콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 세포 내에서 이러한 수용체의 발현을 통해 수득될 수 있는 이러한 수용체의 제제를 포함한다.

마찬가지로, 본 발명은 본 발명의 방법 및 실시형태에서, 본원에서 정의되는 응집된 인간 IgG의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "시험관 내 방법"은 생체 내 방법과는 대조적으로 인간 또는 동물 신체의 외부에서 수행되는 방법을 지칭한다.

용어 "방법"은 "시험" 또는 "검정" 등으로 대체될 수 있다.

용어 "안정성"은 "저장 안정성" 또는 "저장 기간" 또는 "반감기"를 포함한다. 조성물의 "안정성"은 본질적으로 이에 포함되는 주요 성분의 안정성, 즉, 본원에서 정의된 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 안정성에 관한 것이다. 상기 안정성은, 예를 들어, 시간(즉, "시간에 따른 안정성"); 온도, 완충액 조건, 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 생산 숙주; 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 서열; 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 제조 방법 등과 같은 상이한 매개변수에 의해 영향을 받을 수 있다.

본 발명의 조성물(가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진)의 안정성을 측정함으로써, 상기 조성물(즉, 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB가 상기 조성물의 본질적인 주요 성분인)의 품질/조건/결합 능력을 모니터링/조절하는 것 또한 가능하다.

"조성물"은 바람직한 실시형태에서 약제학적 조성물(의약과 동일함) 또는 진단 조성물이며, 부가적으로 약제학적으로 또는 진단학적으로 허용가능한 담체, 완충액, 성분 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 약제학적으로 활성인 성분을 추가로 포함할 수 있다.

용어 "응집된 인간 IgG"(때때로 "인간 응집된 IgG"로도 표시됨)는 인간 IgG 제제의 응집된 부분을 지칭한다. 이러한 제제는 놀랍게도 정맥내 또는 피하 또는 근육 투여에 사용될 수 있는 혈액-기반 생성물(예: 풀링된 인간 IgG 제제 또는 IVIG)로 존재하며, 이러한 생성물은 풀링된[바람직하게는 다원자가(polyvalent)] IgG를 포함한다. 따라서, 응집된 인간 IgG는 바람직하게는 IVIG 제제/조성물과 같은 풀링된 인간 IgG 제제로부터 수득/단리될 수 있거나 수득 가능하다. 상기 응집된 인간 IgG는 적어도 90%의 인간 IgG의 함량으로 특징지어지는 "인간 단백질"로부터 단리될 수 있는 것으로 예상된다. 상기 인간 단백질은 인간 혈청 또는 혈장으로부터 유래되고/유래 가능하며, 바람직한 실시형태에서 의약품 통계 방법론에 대한 WHO 협력 센터(WHOCC, WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology)의 해부 치료 화학(ATC) 분류 시스템[Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) classification system]에 따른 ATC-코드 J06BA01 또는 J06BA02로 보통 인간 면역글로불린(인간 IgG)으로 특징지어지거나 규명된다. 용어 "인간 단백질"이 본원에서 사용되는 경우, 풀링된 인간 IgG 제제를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 인간 IgG는 아형(subtype) IgG1의 적어도 50%의 IgG를 포함한다. 보다 바람직한 실시형태에서, 인간 IgG는 아형 IgG2의 적어도 20%의 IgG를 (추가로) 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 응집된 인간 IgG는 베리글로빈®, 베리텍트(Varitect®) 또는 벤비그(Venbig®)로부터 수득/단리되거나 수득 가능하며, 베리글로빈이 바람직하다. 베리글로빈은 95% 이상의, 예를 들어 100%의 IgG를 포함한다. 예를 들어, 베리글로빈을 포함하는 100% IgG는 61% IgG1, 28% IgG2, 5% IgG3, 6% IgG4를 포함할 수 있으며, 약 1% IgA를 최대로 포함할 수 있다. 베리글로빈, 베리텍트 및 벤비그에 대해 나타낸 백분율 값은 %(w/w)로 지칭한다. 전형적인 베리글로빈은 뱃치(batch) 번호 26840311A 또는 23840311B를 갖는다. 베리텍트는 95% 이상의, 예를 들어 100%의 IgG를 포함한다. 예를 들어, 100% IgG 베리텍트는 59% IgG1, 36% IgG2, 3% IgG3, 2% IgG4를 포함할 수 있으며, 약 5% 이하의 IgA를 포함할 수 있다. 벤비그는 95% 이상의, 예를 들어 100% IgG를 포함한다. 예를 들어, 100% IgG 벤비그는 52 내지 80% IgG1, 26 내지 50% IgG2, 2.4 내지 5% IgG3, 0.3 내지 1% IgG4를 포함할 수 있다. 물론, 당업자는 본 발명의 방법 및 용도에서 베리글로빈, 베리텍트, 벤비그 또는 이들 3개 의약과 같은 임의의 다른 조성물을 적용할 수 있다. 또 다른 바람직한 응집된 인간 IgG는 서브쿠비아(Subcuvia®)로부터 수득/단리되거나 수득 가능하다. 예를 들어, 100% IgG 서브쿠비아는 45 내지 75% IgG1, 20 내지 45% IgG2, 3 내지 10% IgG3, 2 내지 8% IgG4를 포함할 수 있다. 서브쿠비아에 대해 나타낸 백분율 값은 %(w/w)로 지칭한다. 전형적인 서브쿠비아는 뱃치(batch) 번호 BVNG1M032A를 갖는다.

그러나, 당업자는 이러한 3개 의약을 사용하는 것뿐만 아니라, 스스로 인간 IgG 제제를 제조할 수 있어야 한다. 사실, 당업자는, 예를 들어, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900명 이상, 바람직하게는 1000명 이상의 인간 공여자의 혈장으로부터 IgG를 풀링하고, 이에 따라 (풀링된) 인간 IgG 제제를 수득함으로써 본원에서 기재된 바와 같은 IgG 제제를 용이하게 제조할 수 있다. 결과적으로, 본 발명에서 적용되는 바와 같은 인간 IgG 제제는 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어 100%의 IgG를 포함한다. 본원에서 적용되는 바와 같은 IgG 제제는 바람직하게는 다음과 같은 IgG 아부류를 포함한다: 52 내지 80% (w/w) IgG1, 26 내지 50% IgG2 (w/w), 2 내지 5% IgG3 (w/w), 및/또는 0.2 내지 6% (w/w) IgG4, 단, 총 IgG 함량은 100% (w/w)를 초과하지 않는다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 인간 단백질은 적어도 100명, 즉, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000명 등의 인간(건강한 또는 "응집/올리고머의") 공여자로부터의 모든 4개 IgG 아그룹을 포함하는 혼합된 혈청 또는 혈장으로 이루어지거나 이를 포함한다. 적어도 500명의 인간(건강한 또는 "표준의") 공여자로부터의 혼합된 혈청 또는 혈장이 바람직하다. 용어 "건강한"은 공여 혈액에 대한 현재(공여시의) 표준 자격 기준을 충족하는 개인을 의미하며, 이러한 자격 기준은 계속하여 개선 및 변경될 수 있음을 유념해야 한다.

또 다른 실시형태에서, 상기 응집된 인간 IgG가 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 단리 방법에 의해 인간 단백질로부터 수득가능한 응집된 인간 IgG인 것으로 예상된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 크기 배제 크로마토그래피는 상기 응집된 인간 IgG로부터 단량체 및/또는 이량체 IgG를 분리한다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 응집된 인간 IgG를 단리하기 위한 수단 및 방법이 본원 어디에나 기재된다(예를 들어, 실시예에서). 또한, 본 발명의 응집된 인간 IgG는, 예를 들어, 문헌[참조: Engelhard, et al., (1990), Eur. J. Immunol. 20, 1367-1377, Bruhns et al. (2009), Blood J. 113(16), 3716-3725 또는 US　2008/008700]에 기재된 바와 같은 비-가열 응집된 인간 IgG인 것으로 예상된다. 사실, 비-가열 IgG는 본원에서 기재된 바와 같이 수득되고/단리 가능한 응집된 IgG와는 상이할 것이다. 즉, 가열 응집은 융해온도(Tm) 이상의 온도가 소정의 단백질에 적용되는 경우, 단백질의 부분적 변성의 결과이다. 융해온도는 단백질의 기능이며, 인간 IgG의 혼합물의 경우 넓은 범위의 Tm이 필수적으로 관찰될 것이다. 따라서, 응집 정도는 IgG의 혼합물이 사용되는 것에 따라 하나의 뱃치로부터 다른 뱃치까지 다양할 것이다.

게다가, 수많은 단량체 IgG가 필연적으로 가열에 의한 응집된 IgG의 제제의 일부일 것이며, 따라서 불순물로 간주되는 다양한 양의 단량체 IgG가 없는 응집된 IgG 제제가 가능하지 않을 수 있다. 그러나, 본원에서 기재된 바와 같은 응집된 IgG의 제제를 위한 방법은 응집된 IgG로부터 단량체 및/또는 이량체 IgG를 분리하며, 따라서 본원에서 기재된 방법에 의해 수득되고/수득 가능한 바와 같이 생성된 응집된 IgG는 당해 분야로부터의 가열-응집된 IgG와는 상이하다.

따라서, 가열 응집된 IgG는, 장기간 안정성을 제공하고 뱃치 릴리즈 시험(batch relase testing) 또는 다른 일반적인 시험에 완벽하게 적합한, 본 발명에 의해 기재된 바와 같은 응집된 IgG 제제와 비교할 수 없다는 것이 명백하다.

때때로 정맥내 투여를 위한 혈장 면역글로불린으로도 불리는 정맥내 면역글로불린(IVIG) 제제와 같은 풀링된 인간 IgG 제제는 수백명의 건강한 공여자의 풀링된 혈장으로부터 유래되고, 공여자 집단의 누적 항원 경험(cumulative antigen experience)을 반영하는 면역 및 자연 항체(NAb) 모두를 포함하는 것으로 예상된다. 풀링된 인간 IgG 제제는 그의 본연의 높은 다클론성에 의한 것이며 많은 항체 종을 포함한다. 따라서, 이는 넓은 범위의 병원체 및 외래 항원에 대한 특이성을 갖는 소위 "면역 항체" 및 자기/자가항원(self/autoantigen)을 포함하는 다양한 항원과 반응하는 NAb를 포함한다. NAb는 의도적 면역화 및 독립적으로 외래 항원으로의 노출 없이 생성되는 바와 같이 정의된다.

정맥내 제제 외에도, 피하(SCIG) 및 근육내(IMIG) 투여를 위해 고안된 제제가 존재한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IVIG"는 IVIG, SCIG 및 IMIG 제제를 포함하는 것으로 의도된다. IVIG 제형은 잘 공지되어 있으며 인트라겜(INTRAGAM®) P, 프리비겐(PRIVIGEN®), 히젠트라(HIZENTRA®), 가뮤넥스(Gamunex®), 플레보감마(Flebogamma®), 옥타겜(Octagam®) 및 가미뮨(Gamimune®)를 포함한다.

IVIG 제제와 같이 풀링된 인간 IgG 제제에 의하여 공유되는 한가지 특징은 이들이 보통 혈장 또는 혈청으로부터 유래되는 바와 같이, 이들이 포함하는 주요 면역글로불린 종은 IgG라는 것이다(예를 들어, 인트라겜® P 및 프리비겐®에서의 면역글로불린의 적어도 98%가 IgG이다). 따라서, IVIG와 같이 풀링된 인간 IgG 제제를 IgG의 농축된 제제로 볼 수 있다.

바람직한 실시형태에서, IVIG는 적어도 5% w/v, 적어도 10% w/v, 적어도 20% w/v 또는 적어도 25% 면역글로불린을 포함한다.

IVIG 제제의 예시는 WO　2005/023867의 표 1에서 주어진다. 이러한 모든 예들은 본 발명의 맥락에서 적용될 수 있는 바람직한 IVIG 제제이다.

본원에서 정의되는 응집된 인간 IgG는 임의로 표지되며, 표지는 직접적으로 또는 간접적으로 응집된 인간 IgG와 연결된다. 이에 따라 "직접적으로"는 공유결합으로 연결된 표지(또한 링커도 포함함)를 의미하지만, 간접적으로는, 응집된 인간 IgG, 예를 들어, 이의 항체 또는 단편으로서 표지된 결합 도메인(예를 들어, 표지된 2차 항- 인간 IgG 항체와 같은 항-인간 항체)에 결합하는 표지된 제2의 실체(entity)에 의한 응집된 인간 IgG의 결합을 포함한다. 2차 표지된 항체는, 하기의 실시예에서 R-피코에리트린(Dianova, Cat. No 109-116-088)으로 표지된 염소 항-인간 IgG가 사용되었던 임의의 항-IgG 항체가 가능할 수 있으나, 동일하게 적합한 많은 다른 항체들이 시판된다. 그 중에서도 "형광 표지"가 본 발명의 맥락에서 가능하나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다; 즉, 다른 표지도 마찬가지로 가능하다(예를 들어, ELISA 방법과 같은 면역학적 방법에서 사용될 수 있는 표지). 형광 표지는 바람직하게는 양자 점 제제(quantum dot agent), 형광 단백질, 형광 염색, pH-감수성 형광 염색, 전압 감수성 형광 염색 및/또는 형광 표지된 미세구를 포함하는 그룹 중에서 선택된다. FACS 장치에 의해 검출가능한 세트 파장에서 레이저 빔 및 방출 광으로 흥분되는 형광 표지가 바람직하다.

본 발명에 도달하는 실험을 위해, 상품 베리글로빈®을 사용하였으며 응집된 인간 IgG를 제조용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 단량체 및 이량체로부터 분리하였다(하기의 상세한 설명 및 실시예 2 참조). 그러나, 본원에서 기재되는 바와 같은 임의의 다른 "인간 단백질"을, 현재 독일 시장에서 적합한 제품, 예를 들어, 베리글로빈, 베리텍트 및 벤비그와 같은 응집된 인간 IgG의 단리를 위한, 또는 예를 들어, 적어도 100, 200, 300, 400, 500명 이상, 바람직하게는 1000명 이상의 인간 공여자의 혈장으로부터의 IgG를 풀링함에 의한 본원에서 기재된 바와 같은 IgG 제제를 위한 출발점으로 사용하였다. 임의의 이러한 "출발점"(본원에서 정의되는 바와 같은 인간 단백질, IVIG와 같은 (풀링된) IgG 제제를 포함함)을, 예를 들어, 제조용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 응집된 인간 IgG의 단리를 위하여 사용한다(하기의 상세한 설명 및 실시예 2 참조). 미국 FDA는 현재 등록된 10개의 상품을 갖는다. 베리글로빈이 조절된 공급원을 위하여 본 발명의 실시형태에서 표준물로서 사용되는 응집된 인간 IgG 생성물을 제공하기 때문에, 원료로서 "인간 단백질", 예를 들어, 베리글로빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 응집된 인간 IgG를 0.35 mg/mL 내지 1.40 mg/mL, 바람직하게는 0.5 mg/mL 내지 1.35 mg/mL의 단백질 함량을 갖도록 조정할 수 있다. 당업자는 단백질 함량을 적절한 완충액으로 희석하거나 예를 들어, 초미세여과로 농축하여 조정할 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 추가의 지침이 본 발명의 실시예 1 및 2에 제공된다.

가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물의 안정성을 측정하기 위한 방법의 마지막 단계에서, 표면에 결합되고 본원에서 기재된 바와 같이 측정되는 응집된 인간 IgG의 양을 기준 값과 비교한다. 상기 비교 단계는 하기와 같은 상기 조성물의 안정성의 측정을 따른다.

예를 들어, 또한 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물과 비교하여 측정되는 안정성을 갖는 조성물의 안정성이 더 높을수록, 응집된 IgG가 상기 조성물에 의해 포함되는 하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체에 의해 결합될 것이기 때문에, 더 적은 응집된 IgG가 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면에 결합할 것이다.

반면, 예를 들어, 더 많은 응집된 IgG가 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면에 결합할수록, 본원에서 기재된 방법에 따라 안정성이 측정되는 조성물과 같은, Fc 감마 수용체를 또한 포함하는 조성물에 비해 조성물은 보다 덜 안정해진다. 그러나, "덜 안정한"은 측정되는 조성물의 안정성이 쓸모없다는 것을 의미하지는 않는다. 반대로, 특정한 경우, 예를 들어, 더 짧은 반감기, 더 낮은 pH 안정성 등을 갖는 성분을 포함하는 조성물을 갖는 것이 더 바람직할 수 있기 때문에, 기준 조성물보다 덜 안정한 조성물을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

상기와 같이, 본 발명의 방법에 따라 안정이 측정되는 조성물이 기준 조성물로서 본원에서 언급되는 바와 같이, 기준 조성물은 또한 하나 이상의 인간 Fc 감마 수용체를 포함한다.

상기 기준 조성물에 대하여 상기 값이 기준 값으로 이용되도록 본원에서 기재된 바와 같이, 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 반영하는 값을 측정하였다. 이에 기준 값을 측정하고, 따라서 조성물의 안정성이 본 발명의 교시에 따라 측정되기 전에 기준 값을 이용할 수 있다. 그에 따라, 상기 기준 값을 본원에서 기재된 바와 같이 측정되는 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양과 비교할 수 있고, 이어서 그 양을 기준 값과 비교되는 값으로 전환한다. 이를 비교함으로, 조성물의 안정성을 측정하는 것이 가능하다. 사실, 설명되는 바와 같이 기준 값을 측정하였고, 상기 기준 값은 표면에 결합된 특정량의 응집된 인간 IgG를 반영한다. 따라서, 기준 값은 상기 조성물에 의해 포함되는 하나 이상의 가용성 인간 Fc 수용체에 결합된 IgG의 양을 간접적으로 반영한다.

물론, 만약 조성물이 동일한 하나 이상의 가용성 Fc 감마 수용체를 비슷한 양으로(이상적으로는 동일한 양으로) 포함한다면, 기준 조성물을 오직 본 발명의 실시형태에 따라 측정되는 안정성을 갖는 조성물로만 비교할 수 있다.

기준 값은, 본원에서 기재되는 바와 같은 조성물의 안정성, 예를 들어, 온도 안정성, pH 안정성, 저장 완충액 안정성, 저장 안정성, 저장 기간, 반감기, 분해에 대한 안정성(또는 저항성), 단량체형(monomeric form)에 관한 안정성 등과 관련하는 안정성을 반영할 수 있다. 그러나, 이는, 예를 들어, 조성물이 사용될 수 있는 수요 및/또는 관심 및/또는 목적에 따라 의존적일 수 있기 때문에, 조성물의 안정성 특성 또는 안정성 매개변수를 특정하는 것이 결정적인 것은 아니다.

사실, 본 발명의 방법은, 본원에서 기재되는 바와 같이 측정되는 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양 또는 본 발명의 교시에 따라 안정성이 측정되는 조성물에 포함되는 하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체에 결합된 응집된 인간 IgG의 양이 항상 존재하여, 본 발명의 방법이 조성물의 안정성의 일반적 판독을 허용하기 때문에, 안정성에 영향을 끼칠 수 있는 임의의 특이적인 매개변수의 시험에 제한되지 않는다.

상기 설명된 바와 같이, 더 적은 응집된 IgG가 표면에 결합될수록, 상기 조성물에 포함되는 하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체는 보다 강력해지거나 한층 더 강력해진다. 예를 들어, 조성물의 pH 안정성에 관심이 있는 경우, 당업자는 조성물에 다양한 pH 조건을 제공하고 이어서 상기 조성물과 접촉시킴으로 표면에 결합된 응집된 인간 IgG를 시험할 수 있다. 상기 조성물이 예를 들어, 산성 pH에 대하여 안정하다는 것을 가정하면, 하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체는 응집된 인간 IgG에 여전히 결합할 수 있을 것이고, 따라서 더 적은 응집된 IgG가 본원에서 기재되는 바와 같은 표면에 결합할 것이다. 물론, 당업자는, 본 발명의 방법을 수행하는 경우 pH 안정성을 시험한 후에 적절한 완충액을 적용할 수 있다는 것을 알고 있다. 예를 들어, 너무 산성이거나 염기성인 환경은 본원에서 기재된 방법을 방해할 수 있으며, 따라서 이를 적용하기 전에 당업자는 당해 분야에 일반적으로 공지된 수단 및 방법에 의해 완충 조건을 조정하거나 변경할 수 있다.

다른 예로써, 만약 분해에 대한 긴 저장 기간 또는 저항성을 갖는 조성물에 관심이 있다면, 당업자는, 예를 들어, 1, 2, 6 또는 12 개월 동안 조성물을 저장하고 조성물의 목적하는 특정에 대한 기준 값으로서 값을 사용한 후에, 이러한 조성물을 기준 조성물로서 사용하며 본원에서 기재되는 바와 같은 표면에 결합된 응집된 IgG의 양을 측정할 것이다. 그 후, 또한 본 발명의 방법에 의해 측정되는 안정성을 갖는 조성물과 접촉하는 경우, 예를 들어, 분해에 대한 긴 저장 기간 또는 저항성을 반영하는 상기 기준 값을 본원에서 기재되는 바와 같은 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 반영하는 값과 비교할 것이다.

상대 값이 표면에 결합된 특정량의 응집된 인간 IgG를 미미하게 반영하기 때문에, 기준 값이, 예를 들어, 12개월 축적 후 측정되며, 의료진의 예상치가 100으로 설정될 수 있는 것을 충족시키는 바와 같이 간주된다.

만약 응집된 인간 IgG의 적어도 50%, 바람직하게는 60% 또는 70%, 보다 바람직하게는 80% 또는 90%가 표면에 결합되지 않지만, 측정되는 안정성을 갖는 조성물에 포함되는 하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체에 결합 되는 경우, 기준 값을 허용가능한 것으로 간주한다. 구체적으로는, 상기 설명된 바와 같이, 더 적은 응집된 인간 IgG가 표면에 결합될수록, 더 많은 응집된 IgG가 하나 이상의 가용성 Fc 감마 수용체에 결합되며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 따라서, 조성물의 안정성이 더 높을수록, 더 적은 응집된 인간 IgG(하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체가 아닌)가 표면에 결합될 것이다. 반대로, 조성물의 안정성이 더 낮을수록, 더 많은 응집된 인간 IgG가 표면에 결합될 것이며, 더 적은 응집된 인간 IgG가 하나 이상의 가용성 인간 Fc 감마 수용체에 결합될 것이다.

또한, 본 발명은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 적어도 500명(건강한 또는 "표준의")의 공여자의 혼합된 혈장으로부터의 응집된 인간 IgG를 단리하기 위한 방법을 포함한다.

이는 또한, 본 발명의 응집된 인간 IgG가 게잡이원숭이(cynomolgous), 마모셋(callithrix), 마카크(macaqua), 산구이스(sanguis)등과 같은 비-인간 영장류의 상응하는 IgG 제제에 의해 보충되거나 대체되는 것으로 예상된다.

본 발명의 "가용성 인간 FcγRIIA , FcγRIIB , FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB"는 예를 들어, 문헌[참조: EP 1 135 486 및 EP 1 642 974 및 EP 1 446 139]에 기재된다. 본 발명의 "가용성 인간 FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB"는 막관통 도메인 및 시그널 펩타이드의 부재에 의해 특징지어지는 바람직한 실시예이다. 본 발명의 주장된 가용성 FcγR은 바람직한 실시예에서 각각의 핵산 서열 번호 2, 4, 6, 8 및 10에 의해 코딩된 서열 번호 1(SM101, 재조합 인간 FcγRIIB), 서열 번호 3(FcγRIIB), 서열 번호 5(FcγRIIA), 서열 번호 7(FcγRIIIA) 또는 서열 번호 9(FcγRIIIB)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 또한, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 또는 9의 단백질과 적어도 90%, 바람직하게는 95% 동일성을 갖는 가용성 FcγR를 포함한다. 서열 동일성의 측정을 위하여, 아미노산의 최대 상응성을 제공하는 방식으로 서열을 정렬함으로써 비교한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 가용성 인간 Fc 감마 수용체는 FcγRIIB(서열 번호 3)이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 가용성 인간 수용체는 SM101(서열 번호 1)이며, 이는 가용성 FcγRIIB 수용체이다. 본 발명의 방법의 추가의 바람직한 실시형태에서, 한번에 오직 하나의 가용성 수용체(또는 상기 언급된 바와 같이, 관심있는 수용체에 적어도 90% 동일성을 갖는 모든 단백질의 혼합물)만을 시험해야 한다.

본 출원이 지칭하는 서열이 하기에 나와있다.

서열 번호 1 (SM101)

서열 번호 2 (SM101, cDNA)

서열 번호 3 (인간 FcγRIIB)

서열 번호 4 (인간 FcγRIIB, cDNA)

서열 번호 5 (인간 FcγRIIA)

서열 번호 6 (인간 FcγRIIA, cDNA)

서열 번호 7 (인간 FcγRIIIA)

서열 번호 8 (인간 FcγRIIIA, cDNA)

서열 번호 9 (인간 FcγRIIIB)

서열 번호 10 (인간 FcγRIIIB, cDNA)

본 발명의 실시형태가 인간 FcγR에 관한 것이지만, 이는 또한 다른 포유동물 FcγR, 구체적으로 마우스 또는 원숭이와 같은 영장류의 FcγR에도 적용될 수 있다.

"인간 Fc 감마 수용체 IIA , IIB , IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면"은 일부 실시형태에서 하나 이상의 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 발현하는 세포 또는 세포주, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주이거나 이를 포함한다. 이러한 세포는 일부 실시형태에서 임의의 다른 인간 Fc 감마 수용체가 없는 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA or IIIB를 발현한다, 즉, 이러한 세포/세포주는 오직 하나의 FcγR만을 발현한다. 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면이 필수적으로 또는 심지어 독점적으로 인간 FcγRIIB를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 표면에 의해 포함되는 인간 Fc 감마 수용체의 아형 및 상기 가용성 인간 Fc 감마 수용체에 의해 포함되는 인간 Fc 감마 수용체의 아형은 동일하다. FcγRIIB가 시험될 때, 세포는 바람직하게는 Raji 림프아구성(Raji lymphoblastoid) 세포주(CCL-86, ATCC)와 같은 FcγRIIB 만을 발현한다. FcγRIIA의 경우 적백혈병성(erythroleukemic) 세포주 K562(CCL-243, ATCC)를 사용할 수 있고, FcγRIIIA의 경우 NKL 세포주[참조: Robertson et al., Exp. Haematol. 1996, 24(3):406-15]를 사용할 수 있다. 대안적으로, 관심있는 FcR로 형질전환된 CHO 세포를 사용할 수 있다. 관심있는 단백질을 발현하기 위하여 CHO 세포를 형질전환하는 방법은 당해 기술에 잘 공지되어 있고, 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Bruhns et al., Blood 2009, 113:3716-3725]에 기재된다.

또한, "인간 Fc 감마 수용체 IIA , IIB , IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면"이 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB로 코팅될 수 있는 고체 표면이거나 이를 포함한다는 것이 가능하다. 이에 따라 "고체 표면"은, 예를 들어, 자기적으로 당겨질 수 있는 미립자(particulate) 물질(비즈) 또는 ELISA 플레이트 또는 바이아코어(Biacore) 검출 장치와 같은 평면을 포함한다. 상기 표면 물질은 플라스틱, 폴리머, 금속, 유리 등과 같은 임의의 적합한 고체 물질일 수 있다. 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB과 같은 단백질의 고체 표면(예를 들어, 평면 또는 미립자 표면)으로의 코팅은 기술자에게 잘 공지된 표준 방법으로 수행된다. 고체 표면의 코팅은, 세포 표면 상에서 생물학적인 발현(막 앵커가 필요한)을 필요로 하지 않기 때문에, 본 발명의 "인간 FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB" 및/또는 "가용성 인간 FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB"로 수행될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 가용성 인간 Fc 감마 수용체의 결합 활성을 측정하기 위한 시험관 내 방법에서의 응집된 인간 IgG의 용도에 의존한다. 본 발명의 방법에서의 제1 단계는 오직 하나의 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA or IIIB(바람직하게는 임의의 다른 Fcγ 수용체가 없는) 만을 발현하는 세포주로부터의 포유동물 세포를 응집된 인간 IgG의 일정량 및 상응하는 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB IIIA or IIIB의 일정량과 접촉시키는 단계를 포함한다. IgG에 결합하는 추가의 수용체의 존재가 시험되는 가용성 FcγR의 활성을 방해할 수 있기 때문에, 본 방법의 제1 단계를 위해 선택된 포유동물 세포가, 가능하다면 다른 Fc 감마 수용체 외에 오직 관심있는 Fc 감마 수용체만을 발현하는 것이 바람직하다.

"상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 측정하는 것"은 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양, 즉, 바람직하게는 본 발명의 맥락에서 측정되는 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양의 측정 또는 정량을 지칭한다. 상기 응집된 인간 IgG는 간접적인 표지(예를 들어, 항-인간 IgG 결합 도메인)에 의해 또는 직접적인 표지(예를 들어, 본원에서 어디에서나 설명된 - 직접적으로 표지된 응집된 인간 IgG)에 의해 검출된다. 예를 들어, 낮은 수준의 응집된 인간 IgG에 결합된 표지된 2차 항체는 높은 수준의 가용성 FcγR의 응집된 인간 IgG로의 결합을 나타내고 그 반대의 경우도 마찬가지이다.

대안적으로 또는 부가적으로, 세척에 의해 제거되는(본 발명의 방법의 단계 (c) 이전의) - 상기 응집된 인간 IgG는 관심있는 가용성 FcγR(조성물에 포함되는)에 결합되고 이와 함께 세척된다 - 응집된 인간 IgG의 양을 분석, 측정 또는 정량하는 것이 마찬가지로 가능하다.

본 발명의 방법의 "접촉시키는 단계"는 표면, 수용체 및 응집된 인간 IgG가 서로 결합할 수 있도록 이들을 서로 물리적으로 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 시약이 서로 반응하는 시간을 갖도록 항온처리 단계를 포함할 수 있다.

용어 "일정량"은 단순히 결과를 예측하고 나아가 정량화시킬 수 있도록 각각의 시약의 양이 고정되어야 한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 하기의 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 가용성 수용체가 표면에 결합하는 응집된 인간 IgG를 억제하는 시점에서의 양이 측정될 수 있도록 응집된 인간 IgG의 표준량이 가용성 수용체의 일련의 희석물과 함께 사용되었다.

본 발명의 방법의 세척 단계는 단계 (c) 이전에 "세척" 함으로 비결합된 응집된 인간 IgG 및 비결합된 가용성 인간 FcγR를 제거하는 것을 포함한다. 이러한 단계는 본 방법에서 사용되는 표면에 결합되지 않은 시약의 제거를 지칭한다. 세척 단계는 임의의 표준 완충액, 예를 들어, 하기의 실시예에서 사용되는 FACS 완충액으로 수행될 수 있다.

본 발명의 가용성 FcγR가 연속 희석되는 경우, 표지의 "검출"로 가용성 FcγR의 IC₅₀을 측정할 수 있다. "최대 억제 농도의 절반(IC₅₀,half maximal inhibitory concentration)"는 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 화합물의 유효성의 척도이다. 이러한 정량적 척도는 주어진 생물학적 과정을 절반으로 억제하는데에 얼마나 많은 특정 약물 또는 다른 물질이 필요되는지를 나타낸다. 다시 말해서, 이는 물질의 최대 (50%) 억제 농도의 절반(IC; 50% IC, IC₅₀)이다. 이는 일반적으로 약리학적 조사에서 길항제 약물 효능의 척도로서 사용된다. FDA에 따르면, IC₅₀는 시험관 내 50%의 억제를 필요로 하는 약물의 농도를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 방법에서 사용되는 응집된 IgG의 양과 비교하여 포유동물 세포에 결합되는 응집된 IgG의 양은 세포에 결합하는 응집된 IgG의 50%를 억제하는데 필요되는 FcγR의 양의 측정을 가능하게 한다. 마찬가지로, 세포에 결합하는 IgG의 95%를 억제하는데 필요한 양인 IC₉₅를 측정할 수 있다. 데이터에 대한 임의의 다른 평가 기법, 예를 들어, 문헌[참조: the European Pharmacopoeia 5.0; 2005; Chapter 5.3 ("Statistical analysis of results of biological assays and tests")]에 따른 4개 매개변수 로지스틱 방법(4PL)이 당업자에 의해 사용될 수 있다.

본 발명의 시험관 내 방법의 특히 바람직한 실시형태에서, 가용성 인간 수용체는 FcγRIIB(서열 번호 3), 보다 더욱 바람직하게는 SM101(서열 번호 1)이고, 세포는 Raji(Raji) 세포이고, 응집된 인간 IgG는 인간 IgG 제제, 예를 들어, 베리글로빈®으로부터 단리되며, 2차 항체는 FACS 장치에 의해 검출가능한 세트 파장에서 레이저 빔 및 방출 광으로 흥분되는 형광 표지를 갖는다.

본 발명은 또한 본 발명의 표면 및/또는 본 발명의 응집된 인간 IgG를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 방법을 수행하는데 필수적인 수단(예를 들어, 표지, 완충액, 기준 값, 대조군, 표준물 등)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에서 개시되는 바와 같은 응집된 인간 IgG에 관한 것이다.

하기에 기재된 실험에서, SM101(가용성 인간 FcγRIIB, 서열 번호 1)이, 응집된 IgG에 결합하기 위하여 Raji 세포 상의 세포-결합된 FcγRIIB와 경쟁하고, 일정한 양의 세포 및 응집된 베리글로빈에 첨가되는 SM101의 증가하는 농도는 막 결합된 FcγRIIB에 대한 응집된 IgG의 결합을 점진적으로 억제한다는 것을 본 발명의 시험관 내 방법을 사용하여 밝혔다. 이러한 시험은 의학적 또는 진단적 응용에 필수적인 SM101의 가능한 용량을 측정할 수 있게 한다. 본 방법은 또한 상이한 뱃치가 일정한 결합 활성을 갖도록 SM101를 품질 관리하는 데에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 방법은 가능한 용량을 측정하고 품질 관리로서 가용성 FcγR의 상이한 뱃치가 동일한 결합 활성을 갖는 것을 보장하기 위하여 임의의 다른 가용성 FcγR에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 시험관 내 방법은 응집된 IgG가 시험관 내에서 IgG 면역 복합체를 모방할 수 있다는 발견에 기초하여 가용성 FcγR의 결합 활성에 대한 신규 시험을 제공한다.

구체적으로, 하기의 실시예 1에서, "SM101에 대한 세포-기반 효능 검정"이라고도 불리는 본 발명의 시험관 내 방법은 SM101의 생물학적 기능/활성의 측정을 가능하게 한다. 확립된 인간 B 세포주 Raji 및 다클론 응집된 인간 IgG(베리글로빈, 응집된 분획)의 사용은 세포-기반 검정 방법에 의한 SM101의 활성을 분석하기 위한 훌륭한 구성을 나타낸다. 실시예에서, SM101은 수개의 분리된 FACS-실험에서 Raji 세포 상의 막-결합 FcγRIIB에 대한 응집된 인간 IgG의 결합 억제를 나타냈다. SM101에 대한 IC₅₀ 값을 측정하기 위하여 일련의 SM101 희석물을 사용하였다. 하기의 실시예 1에서, 농도 시리즈 1.3664, 0.80, 0.40, 0.20, 0.10, 0.06, 0.036, 0.0216, 0.01296, 0.00648, 0.003888, 0.001944 ㎍/㎕ 또는 관심 영역에서 선형 곡선을 허용하는 임의의 다른 희석물 시리즈도 사용할 수 있지만, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01565, 0.0078, 0.0039, 0.00195 ㎍/㎕의 최종 농도를 갖는 일련의 희석물을 사용하였다. 0.98x10^-6M의 측정된 겉보기 K_D는 문헌[참조: Sondermann et al., Biochemistry 1999, 38(26):8469-77]에서 밝힌 곤충세포 유래된 (글리코실화된) 가용성 FcγRIIB를 사용한 1.4x10^-6M의 K_D값 또는 문헌[참조: Maenaka et al., J Biol Chem. 2001, 276(48):44898-904]에서 밝힌 이.콜라이(E.coli)로부터의 재조합 sFcγRIIB를 사용한 1.67x10^-6M K_D값의 데이터에 필적한다.

실시예 1.6에서, 발명자들은 시험용 의약품 SM101의 생물학적 활성이 표준품(reference standard)의 생물학적 활성에 필적하다는 것을 밝혔다. 구체적으로, 생물학적 활성을 측정하는 청구된 방법에 관하여, 실시예 1은 Raji 세포를 사용하는 가용성 인간 FcγRIIB에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 당업자는 이러한 방법을 다른 수용체 및 세포 유형에 적용시키는데 필요한 조정에 관하여 잘 알고 있을 것이다. 실시예 1에서 사용되는 예시적인 프로토콜이 하기에 반복된다. 그러나, 당업자는 이러한 프로토콜에 관한 가능한 변형을 잘 알고 있다:

1. Raji 세포 배양물의 세포 농도를 측정한다.

2. 원심분리로 Raji 세포를 수거한다.

3. 웰 플레이트에 Fc 감마 수용체(예를 들어, SM101) 농도 시리즈를 제조한다.

4. 응집된 베리글로빈 완충액= "응집된 베리-믹스(Beri-Mix)"을 제조한다.

5. 단계 2로부터의 Raji 세포를 단계 4로부터의 "응집된 베리-믹스"에 재현탁한다.

6. Raji 세포를 Fc 감마 수용체(예를 들어, SM101) 농도 시리즈를 포함하는 각 웰에 첨가한다.

7. 얼음 위에서 항온처리한다.

8. "FACS-완충액"을 각 웰에 첨가하고, 원심분리한다.

9. 상층액을 버린다.

10. 2차 항체-믹스를 각 웰에 첨가한다.

11. "FACS-완충액"을 첨가하고 원심분리한다.

12. 상층액을 버린다.

13. "FACS-완충액"을 첨가하고 샘플을 폴리스티렌 튜브에 옮기고 FACS 상에서 분석한다.

실시예 2는 베리글로빈으로부터 응집된 IgG를 단리하기 위한 특이적인 방법을 제공한다. 마찬가지로, 당업자는 유사한 결과를 도출할 수 있는 이러한 방법의 가능한 변형을 잘 알고 있을 것이다. 구체적으로는, 본원에서 기재되는 응집된 IgG를 생산하는 방법이 하기의 단계로 요약될 수 있다:

1. PBS-N으로 베리글로빈® 160 mg/mL을 100 mg/mL로 조정한다.

2. 단량체 또는 이량체 IgG로부터 응집된 IgG를 분리할 수 있는 컬럼을 사용하여 제조용 SEC(크기 배제 크로마토그래피)로 분리한다; 예를 들어, 컬럼: 수퍼덱스(Superdex) 200 10/300 GL, 이동상: 5 mM His, 150 mM NaCl pH 6.5, 0.01% (w/v) NaN₃, 실온에서 유속 0.5 ml/분, 주입: 0.4 g/l로 100 νl (도 12 참조).

3. 응집된 IgG 분획의 단백질 함량을 측정한다.

4. 선택: 만약 함량이 < 0.50 mg/mL라면 초미세여과로 농축시키고 또는 만약 함량이 > 1.40 mg/mL라면 PBS-N(0.02% 나트륨 아지드를 갖는 인산염 완충 식염수)으로 희석시킨다.

5. 20% (v/v) 글리세롤로 조정한다.

6. 0.5 mL에서 분액하여 액체 질소로 급속 동결시킨다.

응집된 IgG의 단리를 위한 상기의 방법은 또한, 예를 들어, 당해 기술에서 사용 가능하거나 본원에서 기재되는 바와 같은 임의의 다른 인간 IgG 제제에 적용할 수 있다.

실시예 3에서, 실시예 2의 방법에 따라 단리된 응집된 IgG의 함량 및 순도를 시험하였다. 따라서 실시예 2 및 3은 당업자에게 본 발명의 방법에서 사용되는 응집된 IgG에 대한 특이적인 지침을 제공한다. 구제적으로, 완충액으로 PBS-N(0.02% 나트륨 아지드를 갖는 인산염 완충된 식염수)을 사용하여 1 ml/분에서 SEC(크기 배제 크로마토그래피)를 사용하며, 응집된 IgG는, Superdex 200, HiLoad 26/60, GE Healthcare를 사용하고 Acta Explorer 10 FPLC 또는 임의의 다른 적합한 FPLC를 사용시, 약 115mL 이후에 용출되는 것으로 나타났다. 이어서 용출액의 단백질 함량을 실시예 3의 단계 1에 따라 측정하고, 필요한 경우 0.30 내지 1.4 mg/ml, 바람직하게는 0.50 내지 1.35 mg/ml의 값으로 조정하였다. 그 후, 응집된 IgG의 순도를 실시예 2의 방법에 따라 측정하고, 응집/올리고머 IgG의 상대적인 피크 면적이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%라는 것을 확증하였다.

사용된 응집된 IgG의 품질의 영향, 시험 샘플 내의 다양한 양의 단량체 IgG의 효과, 배양되거나 새롭게 해동된 Raji 세포 상의 막-결합된 FcγRIIB에 대한 발현 안정성, 단클론 항체를 통한 Raji 세포 상의 막-결합된 FcγRIIB에 대한 차단 효과 및 Raji 세포 상의 사용된 항-인간 2차 항체의 백그라운드 염색에 대한 안정성에 대해 시험함으로써, 본 발명의 강점을 추가로 연구하였다(실시예 4 내지 10). n = 25회 실험에 대한 겉보기 K_D 및 IC₅₀의 수득된 평균 값을 비교함으로써 검정내 및 검정간 안정성을 평가하였다. 따라서, 본 발명의 시험관 내 방법이 표준품과 비교하여 SM101의 새로운 뱃치에 대한 효능을 평가하기 위한 적절한 도구라는 결론을 내릴 수 있다.

또한, 상기 관측 및 특이적인 방법 및 본 실시예에서 기재되는 프로토콜을 적절한 세포와 조합하여 FcγRIIA, FcγRIIIA 또는 FcγIIIB에 적용할 수 있다(예를 들어, FcγRIIA의 경우 인간 백혈병증 세포주 K562 또는 FcγRIIIA의 경우의 경우 인간 NKL 세포). 대안적으로, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 관심있는 FcγR로 형질전환시켜 본 발명의 시험관 내 방법에 사용할 수 있다. 실시예 2의 응집된 IgG의 제조 방법 및 실시예 3의 조절에 관해서, 이러한 방법을 시장에서 다른 인간 IgG 제제 상품, 예를 들어, 베리글로빈을 대신하여 사용될 수 있는 베리텍트(Varitec) 또는 벤비그(Venbig)에 동일하게 적용할 수 있다.

수개의 문헌이 본 출원의 텍스트 전반에 걸쳐 인용된다. 본원에서 인용된 각 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 제조자의 설명서, 지침 등)의 내용 전반부 또는 후반부는 이들 전체가 본 발명에서 참고로 인용된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 이전의 발명으로 이러한 개시를 선행하는 자격이 주어지지 않은 것으로 해석될 수 없다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "하나" 및 "하나의"가 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는다면 복수의 참조를 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 시약"을 언급하는 것은 이러한 상이한 시약 하나 이상을 포함하고, "하나의 방법"을 언급하는 것은 본원에서 기재되는 방법에 대하여 변형되거나 대체될 수 있는 당업자에게 공지된 해당 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.

달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 수많은 실험을 사용함으로 본원에서 기재된 발명의 특이적인 실시형태에 관한 많은 등가물을 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 용어 "포함하다" 및 예를 들어, "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 용어 "포함하는"이 본원에서 사용되는 경우, 용어 "함유하는" 또는 때때로 본원에서 사용되는 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다.

"이루어진"이 본원에서 사용되는 경우, 본 청구 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "필수적으로 이루어진"이 본원에서 사용되는 경우, 본 청구의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 끼치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.

본원에서 기재되는 바와 같은 "바람직한 실시형태"는 "본 발명의 바람직한 실시형태"를 의미한다. 마찬가지로, 본원에서 기재되는 바와 같은 "다양한 실시형태" 및 "또 다른 실시형태"는 각각 "본 발명의 다양한 실시형태" 및 "본 발명의 또 다른 실시형태"를 의미한다.

도면은 하기를 도시한다:
도 1: 1x10⁵ Raji 세포의 SSC-A/FSC-A를 도시하는 FACS 분석에 대한 게이팅 전략(gating strategy). G1은 생존가능한 세포를 포함한다(전체 세포의 94.9 %). 생존가능한 세포를 SM101의 부재하의 2차 항체(αhu IgG(H+L)-PE)의 막-결합 응집된 인간 IgG(응집된 베리글로빈)로의 결합에 대해 분석한다. 점으로 플롯팅된 다이어그램은 집단 분포 만을 예시하며, 맨 오른쪽의 히스토그램 플롯은 결합된 인간 응집된 IgG를 갖는 Raji 세포(응집된 베리글로빈)를 나타낸다.
도 2: 다양한 SM101(가용성 인간 FcγRIIB) 농도(가장 낮은 농도 0 ㎍/μL, 샘플의 농도 범위 0.0078 내지 0.5 ㎍/㎕)로 항온처리된 샘플의 히스토그램에 대한 오버레이. 음성 대조군에 대하여 지시된 오버레이에서 상응하는 히스토그램의 쉬프트(= sek AK; 2차 항체 단독으로만 염색, 붉은색으로 표시됨)는 인간 응집된 IgG(응집된 베리글로빈)의 세포로의 결합의 억제를 나타낸다. 샘플의 PE-A 형광의 중간값이 오른쪽에 도시된다.
도 3: SM101을 대체하여 다양한 농도(가장 낮은 농도 0 ㎍/μL, 샘플의 농도 범위 0.0078 내지 0.5㎍/㎕)의 닭 혈청 알부민(CSA)을 사용한 대조군 실험의 히스토그램에 대한 오버레이. 음성 대조군(SM101_sekAK.fcs; 2차 항체로만 염색된 세포는 붉은색으로 표시됨).
도 4: 실시예 1의 표 1로부터 표준화된 측정된 중간값을 랭뮤어 방정식에 대하여 피팅하였다.
도 5: FACS 실험 7(FACS007)로부터의 데이터를 사용하여 SM101(㎍/μL)의 질량 농도 대비 억제율(%)을 나타내는 S자형 로지스틱 함수에 대하여 피팅된 데이터.
도 6: 표 3에서 계산된 바와 같은(FACS021로부터의 데이터) SM101 표준품 및 SM101 IMP의 표준화된 측정 중간값에 대하여 피팅된 랭뮤어-다이어그램.
도 7: 제조용 SEC에 의하여 응집된 IgG의 정제. 280(상단 트레이스), 260 nm(하단 트레이스)에서의 용출액의 광학 밀도 및 전도율(라인 스레이스)을 도시한다. 풀링된(pooled) 응집된 인간 IgG 분획을 회색으로 표시한다.
도 8: 다양한 응집된 인간 IgG 분획의 분석용 SEC. 블랭크 완충액 주입(하단 트레이스, 선형), 제조용 SEC 크로마토그램에서 약 180 mL에서의 피크에 상응하는 베리글로빈®으로부터의 단량체 IgG 50 ㎍ 주입(가장 높은 피크를 갖는 트레이스), 비교; 제조용 SEC 크로마토그램에서 약 145 mL에서의 피크에 상응하는 베리글로빈®으로부터의 이량체 IgG 50 ㎍ 주입(가장 낮은 피크를 갖는 트레이스), 비교; 뱃치 27/10/10으로부터의 응집/올리고머 IgG 24 ㎍ 주입(중복 제1 피크보다 낮은) 및 뱃치 15/07/11으로부터의 응집/올리고머 IgG 24 ㎍ 주입(중복 제1 피크보다 높은) 이후의 크로마토그램을 도시한다. 전체 크로마토그램 (a) 및 확대된 부분 (b)을 나타낸다.
도 9 a/b: 응집된 인간 IgG 뱃치 27/10/10 (a) 및 뱃치 15/07/11 (b)로부터의 분석용 SEC 크로마토그램의 전형적인 통합.
도 10: 생존가능한 Raji 세포에 결합된 다양한 양 및 상이한 뱃치의(Beri 1, Beri 2 또는 Beri 3) 응집된 인간 IgG에 대한 FACS-분석.
도 11: (a) 응집된 IgG의 Raji 세포에 대한 결합의 pH 의존성(중간값 MFI)
(b) pH 의존성의 중간값 MFI. 샘플의 중간값 MFI - 2차 항체의 중간값 MFI(대조군)을 도시하는 그래프.
도 12: 2개의 가능한 풀링된 IgG 제제로부터 응집된 IgG의 단리(베리글로빈 뱃치 번호 26840311A 및 서브쿠비아 뱃치 번호 BVNG1M032A), 컬럼: 수퍼덱스 200 10/300 GK; 이동상: 5 mM His, 150 mM NaCl pH 6.5, 0.01% (w/v) NaN_3;유속: 실온에서 0.5 ml/분; 주입: 0.4 g/l로 100 ml.

실시예

하기의 실시예는 본 발명을 예시한다. 이러한 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 예시의 목적으로 포함되며 본 발명은 오직 청구항에 의해서만 제한된다. 하기의 약어가 실시예(및 설명)에서 사용된다:

실시예 1

1.1 실험 개요

이러한 실시예에서 본 발명의 시험관 내 방법(또한 FACS 효능 검정이라고도 불림)을 SM101(가용성 인간 FcγRIIB, sFcγRIIB)의 결합 활성을 측정하기 위해 사용하였다.

구체적으로, FcγRIIB를 발현하는 세포주 Raji[Raji; DSMZ # ACC319, 인간 버킷 림프종(human Burkitt Lymphoma)]의 인간 세포를 일정한 양의 응집된 리간드(인간 IgG) 및 다양한 양의 SM101(즉, sFcγRIIB 서열 번호 1)으로 항온처리 하였다. SM101은 세포-결합된 FcγRIIB-단백질과 경쟁하고, 이는 Raji 상에 발현되는 Fcγ 수용체만(IgG-결합)을 나타낸다.

FcγRIIB를 발현하는 세포에 결합된 응집된 IgG를 인간 IgG의 중쇄 및 경쇄 모두를 인식하는 형광 표지된 다클론 2차 항체에 의하여 검출할 수 있고, 이어서 세포의 FACS 검정에 의해 검출할 수 있다. 일정한 양의 세포 및 응집된 IgG에 첨가된 SM101의 농도를 증가시키면 IgG의 막-결합된 FcγRIIB로의 결합이 잠재적으로 억제된다. 염색된 세포 뿐만 아니라 2차 항체만으로 항온처리된 세포를 갖는 평행 대조군 샘플을 사용된 세포의 자가형광 및 2차 항체의 비특이적 결합 모두를 측정하기 위해 사용한다.

BD FACS-디바 소프트웨어(Diva software)를 사용하는 벡톤, 디킨슨 & 컴퍼니 [Becton, Dickinson & Company (BD)] FACS-Canto-II 기계 상에 1x10⁴ 생존가능한 세포를 기록함으로 FACS-분석을 수행하였다. 데이터를 플로우조 소프트웨어(FlowJo Software; Treestar Inc. OR/USA)를 사용하여 평가하였다.

1.2 재료 :

- 플레이트 : U-자형 96웰(Cellstar, #650180)

- 튜브 : 15mL 팔콘(Falcon) 튜브

5mL 폴리스티렌 12 × 75 mm(BD, #352054)

- 피펫 : 멸균 여과된 10 mL, 5 mL(TPP # 94010, 94005), 눈금필터 팁 1 내지 200 ㎕, 101 내지 1000 ㎕(StarLab, #S1120-8810 and S1126-7810)

- 마이크로플레이트 접착 테이프(83mm, 66m, Permacel, #25082)

- SM101(sFcγRIIB) 표준품 : 8.2 mg/mL, 416μM로 -80℃에서 저장됨

- FACS-완충액 : HBSS(Gibco, #14175) + 5 % FCS(Gibco, #10270-106)

+ 0.01 % (w/v) 나트륨 아지드(Merck)

- 세포 배양물 배지 :

TM -배지 :

PRMI(Gibco, #31570) + 1% MEM NEA(Gibco, #11140) + 1%　나트륨 피루브산염(Gibco, #11360) + 2mM 글루타맥스-I(GlutaMAX-I; 200 mM 원액, Gibco, #35050-061) + 10 % FCS(Gibco, #10270-106)

- IgG(응집된 베리글로빈) :

20% (v/v) 글리세롤을 갖는 PBS/0.02% 나트륨 아지드에서의 IgG 0.96 mg/mL, -80℃에서 저장됨. 수퍼덱스-200(16/60) 또는 수퍼덱스 200(10/300) GL에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 단리됨. 출발 물질: 베리글로빈(®, ZLB BehringGmbH, Ch.-B. 23840311B 또는 Ch.-B. 26840311A; 5mL 앰풀) 또는 서브쿠비아® Ch. -B. BVNG1M032A

- 2차 항체 :

염소 항-인간 IgG (H+L) R-리코에리트린 접합 (Fab)₂ 단편(Dianova, Cat. No 109-116-088).

1.3 프로토콜 :

1. 0.2 내지 1.0 x10⁶ 세포/mL의 밀도를 갖는 Raji 세포 배양물의 세포 농도를 측정한다.

2. 1.2 내지 1.0 x10⁶ Raji 세포를 수거하고, 15 mL 팔콘 튜브에서 5분 동안 477 x g로 원심분리한다.

3. 여기서부터, 모든 단계는 얼음 상에서 또는 4℃에서 수행되어야 한다.

4. 96 웰 플레이트(U자형 바닥)에 1.0 ㎍/μL SM101로 시작하여 0.0039 ㎍/μL로 끝나는(희석제: "FACS-완충액") SM101 농도 시리즈 뿐만 아니라, 대응하는 대조군 웰에 50 μL의 TM-배지를 첨가함으로 대조군 샘플(오직 2차 항체에 사용될 0 μg/μL SM101)을 제조한다.

5. FACS-완충액에 500 ㎕의 50 ㎍/mL 응집된 베리글로빈을 제조한다(즉, 26.04 ㎕의 0.96 ㎍/㎕ 원액을 473.96 ㎕의 FACS-완충액에 첨가함으로)= "응집된 베리-믹스".

6. 단계 2로부터의 1.2 x10⁶ Raji 세포를 단계 5로부터의 500 ㎕의 "응집된 베리-믹스"에 재현탁하여 완전히 혼합한다(중간 속도로 30초간 볼텍싱).

7. 50 ㎕의 Raji 세포 현탁액을 50 ㎕ SM101 농도 시리즈 및 대조군 웰을 포함하는 각 웰(최종 부피 = 100 ㎕)에 첨가한다.

8. 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 30분 동안 항온처리 한다.

9. 150 ㎕의 "FACS-완충액"을 각 웰에 첨가하고, 접착 테이프를 사용하여 웰을 밀봉하고, 513 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.

10. " FACS-완충액"에 1mL의 1/100 2차 항체-혼합물을 제조한다.

11. 상층액을 버리고 교차오염을 피하기 위하여 웰을 밀봉한 채로 플레이트를 짧게 볼텍싱한다.

12. 50 ㎕의 2차 항체-혼합물을 염색하지 않은 대조군을 제외한 각 웰에 첨가한다.

13. 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 30분 동안 항온처리 한다.

14. 150 ㎕의 "FACS-완충액"을 첨가하고 513 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.

15. 상층액을 버리고 플레이트 위를 밀봉한 채로 플레이트를 짧게 볼텍싱한다.

16. 150 ㎕의 "FACS-완충액"을 첨가하고, 샘플을 5 mL 폴리스티렌 튜브에 옮기고, BD FACS-칸토(FACS-Canto) II(BD 디바 소프트웨어 v.6.0을 사용하는) 상에서 분석한다.

1.4 SM101에 대한 농도 시리즈(최종 농도) :

0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01565, 0.0078, 0.0039, 0.00195 ㎍/μL;

최종 부피(V_END) = 100 μL

1.5 FACS 데이터 분석

BD FACS-칸토 II 상에 FACS-데이터를 기록하고, 데이터를 fcs-파일 포맷에 저장하였다. 후속 분석을 위해 플로우-조 소프트웨어(v. 8.8.4)를 사용하였다. 도 1은 전형적인 게이팅 전략을 도시한다.

생존가능한 세포를 게이팅시키고 이의 피코에리트린-형광에 대해 평가하였다. SM101 농도 시리즈로부터의 샘플의 히스토그램을 플로우조 소프트웨어를 사용하는 히스토그램 오버레이에 분류하였다. 중간 형광 값을 각 샘플에 대해 소프트웨어로 계산하였다(도 2). 도 2는 응집된 IgG의 Raji 세포 상의 막-결합 FcγRIIB로의 결합의 강한 농도 의존성 억제를 도시한다. 평행한 실험에서, SM101에 의한 특이적 억제를 확증하기 위하여, SM101을 동일한 상기 언급된 농도 시리즈를 사용하여 닭 혈청 알부민의 동일한 양으로 대체하였다(도 3). 본 발명의 시험관 내 방법은 도 2에 도시된 시연 실험에 의해 입증되는 바와 같은 SM101의 결합 활성을 평가하기 위한 정성적 세포-기반 수단을 제공한다.

1.6 활성 계산

이러한 세포 검정에서 SM101의 활성을 계산하기 위하여 중간 형광 강도 시그널를 하기의 식을 사용하여 표준화하였다(표 1에 보여지는 표준화된 데이터):

% 표준화된 시그널 = (시그널 _(0㎍/ _μL _SM101) - 시그널 _(x) )/(시그널 _(0㎍/ _μL _SM101) - 시그널 _{(2차 Ab)} )

SM101			중간값
[㎍/μL]	농도 [M]	nM	시그널	표준화된 시그널
0	0.00E+00	0.00E+00	3877	0.00%
0.0078	3.90E-07	3.90E+02	3008	23.24%
0.0156	7.80E-07	7.80E+02	2270	42.97%
0.03125	1.56E-06	1.56E+03	1242	70.45%
0.0625	3.13E-06	3.13E+03	466	91.20%
0.125	6.25E-06	6.25E+03	329	94.87%
0.25	1.25E-05	1.25E+04	197	98.40%
0.5	2.50E-05	2.50E+04	238	97.30%
		2차 Ab	137	100.00%

표 1: 도 2에 도시된 FACS 측정치에 대해 계산된 표준화된 값[랭뮤어(Langmuir) 등온식의 후속 피팅에 사용됨]

겉보기 K_D와 최대 억제를 결정하기 위하여 엑셀에서 솔버-애드-인(Solver-add-in) 함수를 사용하여 랭뮤어-결합-등온식

억제율( % ) = (c*최대. 억제)/K _D + c

에 대한 데이터의 후속 피팅을 수행하고, 도 4에 도시된 바와 같은 억제-곡선을 생성하였다. Raji 세포 상의 FcγRIIB의 알려지지 않은 세포 표면 농도 뿐만 아니라 유리(free) SM101의 농도가 계산에 고려되지 않았기 때문에, 겉보기 K_D는 실제 K_D와 상이할 수 있다. % 억제에 대하여 % 정규화된 시그널를 사용하였고, c = 가용성 FcR의 농도이다(몰농도 또는 질량농도). 식은 엑셀에서 솔버-애드-인 기능 또는 이러한 유형의 계산이 가능한 임의의 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 최대.억제 및 KD에 대하여 피팅되었다.

이러한 피팅 전략을 사용함으로 FACS-데이터는 0.0226의 잔차 제곱의 합을 갖는 0.99x10^-6M의 겉보기 K_D를 나타냈다(표 2).

SM101
겉보기 K_D [M]	0.99x10^-6
겉보기 K_A [M^-1]	1.02x10⁶
R_최대	107.61%
잔차	0.0226

표 2: FACS007로부터의 데이터를 랭뮤어 방정식에 피팅함으로 얻은 매개변수.

FACS의 데이터로부터 SM101의 IC₅₀을 측정하기 위하여 분석-소프트웨어 마이크로칼 오리진(Microcal Origin®)(Version: 6.0)을 사용하였다. 경쟁 SM101의 농도에 대해 % 억제를 플로팅하였다. S자형 로지스틱 함수에 대해 데이터를 피팅하였다:

A2: 100% 억제 (최대 억제)

A1: 0% 억제 (최소 억제)

X₀: IC₅₀

p: 슬로프

IC₅₀의 계산에 대해 매개변수 A1을 0으로, 매개변수 A2를 100으로 설정하였다.

표 1로부터의 데이터(FACS007)를 사용함으로 슬로프 1.63을 갖는 17.7 ㎍/mL의 IC₅₀ 를 평가하였다(도 5).

1.7 표준품 및 SM101의 비교

후속 실험에서 시험용 의약품 SM101(sFcγRIIB)의 생물학적 활성을 조사하고, 약물 표준품(FACS021)에 대해 비교하였다. FACS-기반 효능 검정을 단일 96-웰 플레이트 상에서 병행하여 IMP 및 표준품에 대하여 상기 항목 1.4에 기재된 바와 같이 수행하였다.

FACS-데이터를 기록하고 기재된 바와 같이(상기 항목 1.5) 분석하고, 상기 약술된 랭뮤어-결합-등온식을 사용하여 데이터 피팅을 수행하였다(하기의 표 3 및 도 6).

			SM101 표준품		SM101 IMP
SM101 IMP/ 표준품			중간값		중간값
[μg/μL]	농도 [M]	nM	시그널	표준화된 시그널	시그널	표준화된 시그널
0	0.00E+00	0.00E+00	6459	0.00%	6930	0.00%
0.0078	3.90E-07	3.90E+02	5234	19.32%	5309	23.81%
0.0156	7.80E-07	7.80E+02	2326	65.17%	3811	45.81%
0.03125	1.56E-06	1.56E+03	1644	75.92%	1780	75.65%
0.0625	3.13E-06	3.13E+03	921	87.32%	831	89.59%
0.125	6.52E-06	6.25E+03	362	96.14%	478	94.77%
0.25	1.25E-05	1.25E+04	269	97.60%	281	97.66%
0.5	2.50E-05	2.50E+04	182	98.98%	195	98.93%
		2차 Ab	137	100.00%	122	100.00%

표 3: 랭뮤어 등온식의 피팅에 사용된 FACS 측정으로부터 얻은 값(FACS021로부터의 데이터)

FACS 데이터는 SM101 표준품에 대한 0.739x10^-6M의 겉보기 K_D및 SM101 IMP에 대한 0.904x10^-6M의 겉보기 K_D를 나타냈다(표 4).

SM101	표준품	IMP
겉보기 K_D [M]	0.74x10^-6	0.90x10^-6
겉보기 K_A [M^-1]	1.35x10⁶	1.11x10⁶
R_최대	105.64	107.21
잔차	0.05	0.02
IC₅₀ [μg/mL]	12.9	16.2

표 4: 표 3, 도 6(FACS021)로부터의 데이터의 랭뮤어- 및 S자형 로지스틱 함수-피팅에 대해 얻은 매개변수.

분석-소프트웨어 마이크로칼 오리진(Microcal Origin®)(Version: 6.0)을 상기 기재된 S자형 로지스틱 함수를 사용하는 FACS-분석의 데이터로부터 SM101 표준품 및 IMP의 IC₅₀를 계산하기 위해 사용하였다. SM101 표준품은 12.9 ㎍/mL의 IC₅₀및 16.5 ㎍/mL의 SM101의 IMP를 나타내었다(표 4).

+/- 20%의 검정간 편차가 세포 검정에서 허용가능하다는 점을 감안함으로, 따라서, FACS-기반 효능 검정에서 측정된 바와 같은 IMP의 생물학적 활성이 SM101 약물 표준품과 필적할만 하다는 결론에 도달할 수 있다.

실시예 2

이러한 실시예에서 시판되는 IVIG(베리글로빈)로부터 응집된 IgG를 제조하기 위한 방법이 기재된다. 응집된 IgG는 본 발명의 가용성 인간 Fc 감마 수용체의 결합 활성을 측정하기 위한 시험관 내 방법을 위한 원료이다. 이러한 실시예에서, 하기의 시약을 사용하였다:

응집된 IgG를 생산하기 위한 방법은 하기의 단계로 요약될 수 있다:

1. PBS-N으로 베리글로빈® 160 mg/mL을 100 mg/mL로 조정한다.

2. 제조용 SEC로 분리한다.

3. 단백질 함량을 측정한다.

5. 20% (v/v) 글리세롤로 조정한다.

6. 0.5 mL에서 분액하여 액체 질소로 급속 동결시킨다.

구체적으로, 5 mL의 베리글로빈® 160 mg/mL을 균일한 용액을 수득할 때까지 3 mL의 PBS-N과 조심스럽게 혼합한다. 3.0 mL의 희석액을 1 mL/분의 유속에서(악타 익스플로러 10, GE 헬스케어) 이전에 PBS-N에서 평형화된 수퍼덱스 200 하이로드 26/60 컬럼(GE Healthcare) 상으로 주입한다. 완충액으로 PBS-N을 사용하여 1 mL/분에서 단백질을 분리한다. 약 115 mL 이후에 응집된 IgG를 용리하고, 280 nm에서 용출액의 광학 밀도가 50 mAU를 초과한 후에 3 mL 분획에서 수집한다. 제1 3개의 분획을 풀링하고, 이들이 추가적인 SEC 시행으로부터의 풀과 혼합될 때까지 2 내지 8 ℃에서 최대 3일 동안 저장한다. 만약 모든 SEC 시행으로부터의 응집된 IgG 풀의 단백질 함량이 0.50 mg/mL 이하일 경우, 풀을 초미세여과(Amicon Ultra, Ultracel 100 kDa MWCO, Millipore)에 의해 1.00 내지 1.40 mg/mL로 농축해야 한다. 만약 응집된 IgG 풀의 단백질 함량이 1.40 mg/mL 이상일 경우, 풀을 PBS-N으로 1.40 mg/mL로 희석한다. 최종적으로 동결 방지제 글리세롤을 20% (v/v)의 최종 농도가 될 때까지 일정한 교반하에서(500 rpm) 적가하여 첨가한다. 조정되고 응집된 베리글로빈® 풀의 함량을 방출하여 측정하고, 풀을 1.5 mL 반응 튜브[안전한 밀봉된 튜브, 사스테트(Sarstedt)]에 0.5 mL 에서 분액한다. 분액을 액체 질소에서 급속 동결시키고 -60℃ 내지 -80℃에 저장한다. 정제의 결과를 도 7에 도시하며, 여기서 음영진 부분은 풀링된 응집된 IgG 분획을 나타낸다.

실시예 3

이러한 실시예에서 실시예 2의 방법에 따라 제조된 응집된 IgG의 품질을 시험하기위한 방법이 기재된다. 제1 단계에서, 응집된 베리글로빈® 분획의 함량을 측정한다. 제2 단계에서, 응집된 베리글로빈®의 순도를 분석 SEC에 의하여 시험한다. 제2 단계를 응집된 베리글로빈®의 동결된 분액으로 수행한다. 동결된 분액은 사용하기 전에 부드럽게 흔들어주면서(500 rpm; 분당 회전수, Thermomixer Rm Eppendorf) 실온에서(25±2℃) 해동시켜야 한다.

부적절한 배치일 경우의 시험 효과를 최소화하기 위하여, 품질 시험을 단계별로 수행한다. 하기의 시험은 시험의 각 단계에서 수행된다:

단계 1: UV/ VIS 분광법에 의한 함량 측정

실시예 1의 방법에 따라 생산된 응집된 베리글로빈® 분획의 함량을 UV/VIS 분광법에 의해 측정할 수 있다. 만약 필요하다면, 0.2와 0.8 사이 280 nm에서 광학 밀도를 산출하기 위하여 단백질 용액을 각 완충액으로 희석한다. 400 μL의 용액을 UV-마이크로큐벳(UV-cuvette micro, Brand)으로 옮긴다. 블랭크로서 PBS-N에 대하여 280 nm 및 320 nM에서의 흡광도를 기록하고(Cary 100 Bio, Varian), mg/mL의 농도를 하기 방정식에 따라 계산한다:

c_응집된 _{베리글로빈} [mg/mL] = (OD₂₈₀ - OD₃₂₀) / 1.40

검정을 3번 수행하고 결과를 평균낸다.

단계 2: 분석 SEC에 의한 순도

이량체 및 단량체 형태에 대한 응집된/ 올리고머 베리글로빈®의 양을 분석 SEC로 측정한다. PBS-N으로 이전에 평형화된 수퍼덱스 200 10/300GL 컬럼(GE Healthcare)이 구비된 연속 1200 HPLC 시스템(Agilent)을 사용한다. 응집된 베리글로빈®의 새롭게 해동된 분액 150μL을 원심분리하고(20'000·g, 5분), 상층액 50 μL을 0.5 mL/분의 유속으로 주입한다. 완충액으로 PBS-N을 사용하여 0.5 mL/분의 유속으로 단백질을 분리하고, 280 nm에서의 용출액의 흡광도를 모니터링한다. 총 실행 시간은 50분으로 제한한다. 50 μL PBS-N, 20% 글리세롤의 주입에 의해 각각의 응집된 베리글로빈® 주입이 선행된다. 수공으로 크로마토그램을 통합하고, 13.0 분부터 30.0 분까지의 모든 피크와 비교하여 응집/올리고머 베리글로빈® 피크의 상대적인 면적으로서 순도를 기록한다. 다양한 베리글로빈® 분획의 분석 SEC를 도 8에 도시한다. 도 9a 및 9b는 2개의 응집된 베리글로빈® 뱃치로부터의 분석 SEC 그로마토그램의 전형적인 통합을 도시한다.

실시예 4

이러한 실시예에서, Raji 세포 상에 결합하는 응집된 베리글로빈®의 양과 질의 추정적 영향을 측정하기 위하여 실험을 수행하였다. 다양한 양의 응집된 베리글로빈® 및 상이한 뱃치의 베리글로빈을 사용하여 실험을 수행하였다.

응집된 베리글로빈®의 시험된 농도는 20, 10, 5, 3, 및 2.55 ㎍/1x10⁵ 세포를 포함하였다. 후속 실험에서, 2차 항체 αhu IgG(H+L)-PE의 농도는 2차 항체가 응집된 베리글로빈®과 비교하여 과량이 가능한지의 여부를 측정하기 위하여 변화를 수반하였다(도 10).

도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, Raji 세포로의 결합은 심지어 가장 낮은 농도에서도 응집된 베리글로빈®의 양에 의해 제한되지 않는다. 1x10⁵ 세포 당 2.5 ㎍(V_최종 = 100 μL)은 세포 상 가능한 수용체에 결합하기에 충분한 양이다.

표 5는 상이한 뱃치의 응집된 베리글로빈®(#1, 2, 3), 계산된 평균 및 SD의 MFI의 중간값을 도시한다.

	중간값 MFI	중간값 MFI
응집된 베리글로빈 뱃치#	2.5 ㎍/μL	5.0 ㎍/μL
1	1353	1234
2	1498	1145
3	1001	960
평균	1284	1113
SD	256	140

실시예 5

이러한 실시예에서, 응집된 베리글로빈®의 Raji 세포로의 결합의 pH-의존성을 조사하였다. 실시예 1(FACS-효능-검정)에서 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에 사용되는 배지는 RPMI, MEM, 나트륨-피루브산염, 10% FSC 및 L-글루타민 공급원(Glutamax-I, Gibco)을 포함한다. L-글루타민은 시간에 따라 PCA 및 NH₃로 분해되고 이는 알칼리성 pH를 야기한다. 글루타맥스-I이 감소된 분해 경향을 가짐에도 불구하고, 배양물 배지는 시간에 따라 더욱 알칼리성 pH로 변한다. 응집된 베리글로빈®의 Raji 세포로의 결합의 pH-의존성을 시험하기 위하여, 0.1E6 Raji 세포를 다양한 pH 조건(pH 6.5, 6.7, 7.0, 7.2, 7.8, 8.0, 8.5, 9.0, 10.0)에서 2.5 ㎍의 응집된 베리글로빈®로 항온처리 하고, 응집된 베리글로빈®의 세포로의 결합을 1/200 αhu IgG(H+L)-PE 2차 항체를 사용하는 FACS 검정에서 평가하였다. 도 11(a) 및 11(b)에서 볼 수 있는 바와 같이, 시험된 pH 조건의 pH 6.5에서 겉보기 최적의 조건을 갖는 응집된 베리글로빈®의 Raji 세포로의 결합의 의존성이 존재한다. 더 낮은 pH 조건은 세포에 대한 유해한 효과가 예상되기 때문에 시험하지 않았다. 따라서 오직 7.0 ± 0.25에서의 pH를 갖는 새로운 배지만이 시험에 사용될 수 있다는 것이 가능하다. 검정에서 희석제로서 TM 배지 대신에 FACS-완충액(HBSS + 5 % FCS+ 0.01 % (w/v) 나트륨 아지드, pH 6.5 내지 6.8)을 사용하는 것이 바람직하다.

실시예 6

SM101에 의해 FcγRIIB 양성인 세포에 결합하는 IC의 경쟁적 억제에 대한 단량체 인간 IgG의 효과를 부가적인 실험에서 시험하였다. 이러한 목적을 위하여, Raji 세포를 일정량의 응집된 베리글로빈®(2.5 ㎍/1x10⁵ 세포)과 함께 일정량의 단량체 베리글로빈® 및 다양한 양의 SM101(100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39 μM)로 항온처리 하거나 일정량의 응집된 베리글로빈® 및 SM101 및 다양한 양의 단량체 베리글로빈®(3.3, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0 μM)으로 항온처리하였다. 2차 항체를 과량으로 첨가하였다(원액의 1/100 희석, 20 μL을 1980 μL에 첨가함, 2차 항체의 단백질 농도 : 0.5㎍/μL, 0.25 ㎍/1x10⁵와 동일). 단량체 베리글로빈®이 nM 농도 범위에서 면역 복합체의 Raji 세포로의 결합을 경쟁적으로 억제함을 밝혔다. SM101이 μM 농도 범위일지라도 동일한 효과를 보인다. 단량체 베리글로빈®이 막-결합 FcγRIIB에 결합하고, 따라서 응집된 베리글로빈의 결합을 억제한다는 결론을 내릴 수 있다. 이러한 시스템에서 응집된 및 활성인 베리글로빈® 분자의 수는 공지되지 않고, 따라서 관찰된 효과가 단량체 IgG의 막-결합 FcγRIIB로의 우선적인 결합에 기인한 것인지 첨가된 단량체 IgG에 의한 응집된 베리글로빈®의 압도적인 수에 기인한 것인지는 명확하지 않다. 단량체 IgG의 가장 높은 농도(3.3 μM)는 0.5 ㎍/1x10⁵ 세포에 상응하며, 이는 단량체 IgG가 모든 가능한 2차 항체에 결합할 가능성을 의미한다.

실시예 7

이러한 실험에서, 2차 항체 백그라운드의 MFI에 관한 검정간/검정내 재현성을 시험하였다. 후향 분석에서, n=25 시험의 데이터를 Raji 세포에 대한 2차 항체의 백그라운드 염색의 변화에서 평가하였다. 하기의 표 7에서, 항-인간 IgG(H+L)-PE 2차 항체(1/100 희석)로 염색된 Raji 세포의 MFI, 샘플의 평균값 및 표준 편차. 색은 평행하여 수행된(검정 내 안정성) 실험을 나타낸다.

표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 2차 항체로 염색된 Raji 세포의 MFI(첨가된 응집된 베리글로빈이 없는)는 21%의 표준 편차(SD, SD MFI 29, 평균 MFI 134.9)를 갖는 분리 실험(검정간 안정성) 또는 평행 실험(검정내 안정성)과 비교하였을 때, 꽤 일정하게 유지된다.

실시예 8

이러한 실시예에서, 겉보기 K_D 및 IC₅₀에 관한 검정간/검정내 재현성을 시험하였다. 25회 실험으로부터의 FACS-기반 효능 검정 데이터 세트의 검정간 및 검정내 안정성을 평가하기 위하여, 피팅된 겉보기 K_D 및 IC₅₀에 대해 평가하였다.

하기의 표 7에서, 25회 FACS-실험의 수거 이전의 Raji 세포의 K_D, IC₅₀ 및 세포 밀도를 도시한다. 실험 12 내지 15 및 16 내지 17은 K_D 및 IC₅₀을 단일 플레이트에서 분리하여 평가하였기 때문에 검정내 안정성을 나타낸다. 시험 # 4 내지 6(회색으로 표시됨)은 측정된 데이터가 명백한 가외치(outlier)를 나타냈기 때문에 후속 분석으로부터 배제되었다.

표 7에 나타난 데이터로부터 검정간 및 검정내 안정성이 높다는 결론에 도달할 수 있다. 그러나, 시험 # 18로부터 시작하여 보다 낮은 K_D 및 IC₅₀ 값이 측정되었음에 유의해야 한다. 이는 FACS-칸토 II 기계의 새로운 베이스라인-셋업(Baseline-Setup)과 연관된다.

	K_D[10^-6M]	IC₅₀[㎍/mL]
평균	0.53	10.6
SD	0.26	4.7
평균D	0.25	4.1

표 8: 표 8로부터의 25회 실험의 K_D 및 IC₅₀의평균값, 표준 편차 및 평균 편차.

표 8은 표 7에 나타낸 모든 25회 실험의 K_D (0.53x10^-6M) 및 IC₅₀(10.6 ㎍/mL)에 대한 평균값을 도시한다. 이는 약 50% (SD = 0.26)의 SD를 야기한다. 만약 시험 # 1 내지 17(명맥한 가외치 #4 및 6을 제외한) 및 # 18 내지 25에 대하여 개별적으로 평균을 계산한다면, SD는 시험 # 1 내지 17(0.68x10^-6M의 평균 K_D를 갖는)에 대하여 29%에서 및 시험 # 18 내지 25(0.26x10^-6M의 평균 K_D를 갖는)에 대하여 26%에서 상당히 낮을 것이다(표 9).

시험	#1-17	#18-25
	K_D[10^-6M]	IC₅₀ IC₅₀ [㎍/mL]
평균	0.68	0.26
SD	0.2	0.07

표 9: 시험 # 1 내지 17 및 # 18 내지 25의 평균 K_D 및 IC₅₀ 값.

SEQUENCE LISTING <110> Suppremol GmbH <120> In vitro method for determining the stability of compositions comprising soluble Fc gamma receptor(s) <130> IPA160084-DE <150> EP 13003835.9 <151> 2013-08-01 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> artificial <220> <223> soluble Fc gamma receptor IIB <400> 1 Met Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn 1 5 10 15 Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser 20 25 30 Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro 35 40 45 Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser 50 55 60 Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val 65 70 75 80 His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu 85 90 95 Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys 100 105 110 Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys 115 120 125 Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His 130 135 140 Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser 165 170 175 Pro <210> 2 <211> 534 <212> DNA <213> artificial <220> <223> soluble Fc gamma receptor IIB <400> 2 atggcaccgc cgaaagcagt tctgaaactg gaaccgcagt ggattaacgt tctgcaggaa 60 gatagcgtta ccctgacctg tcgtggcacc catagcccgg aaagcgatag cattcagtgg 120 tttcacaacg gcaatctgat tccgacccat acccagccga gctatcgttt taaagcgaac 180 aacaacgata gcggcgaata tacctgtcag accggtcaga ccagcctgag cgatccggtt 240 catctgaccg ttctgagcga atggctggtt ctgcagaccc cgcatctgga atttcaggaa 300 ggcgaaacca ttgttctgcg ttgccacagc tggaaagata aaccgctggt taaagttacc 360 ttcttccaga acggcaaaag caaaaaattc agccgtagcg atccgaattt tagcattccg 420 caggcgaatc atagccatag cggcgattat cattgtaccg gcaacattgg ctataccctg 480 tatagcagca aaccggtgac cattaccgtt caggcgccga gcagcagccc gtaa 534 <210> 3 <211> 181 <212> PRT <213> human <220> <221> misc_feature <222> (1)..(181) <223> human Fc gamma RIIB <400> 3 Met Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg 20 25 30 Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly 35 40 45 Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn 50 55 60 Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln 85 90 95 Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro 130 135 140 Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala 165 170 175 Pro Ser Ser Ser Pro 180 <210> 4 <211> 543 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5443) <223> human Fc gamma RIIB <400> 4 atggggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 60 gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac 120 tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg 180 ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc 240 agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg 300 gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg 360 gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac 420 ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata 480 ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca 540 ccg 543 <210> 5 <211> 184 <212> PRT <213> human <220> <221> misc_feature <222> (1)..(184) <223> human Fc gamma RIIA <400> 5 Met Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro 1 5 10 15 Pro Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly 35 40 45 Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn 50 55 60 Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln 85 90 95 Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro 130 135 140 Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val 165 170 175 Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro 180 <210> 6 <211> 554 <212> DNA <213> human <220> <221> misc_feature <222> (1)..(554) <223> human Fc gamma RIIA <400> 6 atggggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac 60 gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac 120 tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg 180 ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc 240 agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc gaatggctgg tgctccagac ccctcacctg 300 gagttccagg agggagaaac catcatgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg 360 gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tctcccattt ggatcccacc 420 ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata 480 ggctacacgc tgttctcatc caagcctgtg accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc 540 agctcttcac caat 554 <210> 7 <211> 182 <212> PRT <213> human <220> <221> misc_feature <222> (1)..(182) <223> human Fc gamma RIIIA <400> 7 Met Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg 1 5 10 15 Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser 20 25 30 Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser 35 40 45 Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser 50 55 60 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val 65 70 75 80 Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp 85 90 95 Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys 100 105 110 Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg 115 120 125 Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu 130 135 140 Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn 145 150 155 160 Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ser Val 165 170 175 Ser Thr Ile Ser Ser Phe 180 <210> 8 <211> 546 <212> DNA <213> human <220> <221> human <222> (1)..(546) <223> human Fc gamma RIIIA <400> 8 atggatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 60 gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 120 tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 180 gttgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 240 cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 300 gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 360 tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 420 aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 480 gtgtcttcag 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Claims

가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물의 안정성을 측정하기 위한 시험관 내 방법으로서,
(a) 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면을 응집된 인간 IgG 일정량과 접촉시키는 단계;
(b) 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면을 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB의 상기 조성물 일정량과 접촉시키는 단계;
(c) 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 측정되는 바와 같은 상기 표면에 결합된 응집된 인간 IgG의 양을 기준 값과 비교하고 (이에 따라) 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하거나 필수적으로 이로 이루어진 조성물의 안정성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
단계 (a) 및 (b)가 동시에(concomitantly) 또는 연속하여(consequently) 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 상기 표면이 (포유동물) 세포 또는 세포주, 및/또는 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB로 코팅될 수 있는 고체 표면이거나 이를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 응집된 인간 IgG가 적어도 90%의 인간 IgG의 함량으로 특징지어지는 인간 단백질로부터 단리될 수 있는 응집된 인간 IgG인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 응집된 인간 IgG가 베리글로빈(Beriglobin)으로부터 단리될 수 있는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 응집된 인간 IgG가 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 단리 방법에 의해 인간 단백질로부터 수득가능한 응집된 인간 IgG인, 방법.
제6항에 있어서,
상기 크기 배제 크로마토그래피가 상기 응집된 IgG로부터 단량체 및/또는 이량체 IgG를 분리하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 응집된 인간 IgG가 표지되는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 표지가 2차 표지된 인간 항-IgG 항체를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가용성 인간 Fc 감마 수용체가 가용성 Fc 감마 IIB 수용체인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 가용성 인간 Fc 감마 IIB 수용체가 SM101(서열 번호 1)인, 방법.
제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물 세포가 ATCC 번호 CCL-86 하에 수탁된 Raji(Ragji) 세포인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표면에 의해 포함된 인간 Fc 감마 수용체의 아형(subtype) 및 가용성 인간 Fc 감마 수용체의 상기 제제에 의해 포함된 인간 Fc 감마 수용체의 아형이 동일한 것인, 방법.
제6항 또는 제7항에서 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한, 비-가열(not-heat) 응집된 인간 IgG.
제14항에서 정의된 바와 같은 비-가열 응집된 인간 IgG 및 선택적으로 인간 Fc 감마 수용체 IIA, IIB, IIIA 및/또는 IIIB를 포함하는 표면을 포함하는 키트.