ES2705328T3

ES2705328T3 - Inmunoensayo sensible de múltiples etapas para receptores solubles de factor de crecimiento de fibroblastos

Info

Publication number: ES2705328T3
Application number: ES13865805T
Authority: ES
Inventors: Shalini Chaturvedi; Suso Platero; Derick Siegel
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: LT2936153T; CN114062680A; HK1215070A1; JP6488236B2; TR201820490T4; JP2016504590A; HUE042184T2; AU2013362937A1; EP2936153A4; SI2936153T1; CY1121482T1; PT2936153T; HRP20190157T1; DK2936153T3; WO2014099933A1; PL2936153T3; CN104995512A; RS58147B1; JP2019053068A; EP2936153B1

Abstract

Un kit para detectar receptores solubles de factor de crecimiento de fibroblasto (RssFCF) en una muestra biológica, que comprende: una composición de anticuerpo de captura que específicamente se enlaza con RsFCF conjugado con la microesfera; y una composición de anticuerpo de detección que específicamente se enlaza con RsFCF conjugado con una etiqueta de detección; donde 0,14-494 ng/ml RsFCF2, 0,023-74 ng/mL de RsFCF3 y 0,033-123 ng/mL de RsFCF4 se detectan en la muestra biológica; donde la composición de anticuerpo de captura comprende un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF2, un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF3 y un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF4; y donde la composición de anticuerpo de detección comprende un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RFCF2, un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RFCF3 y un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RFCF4.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoensayo sensible de múltiples etapas para receptores solubles de factor de crecimiento de fibroblastos Campo de la invención

El contenido aquí descrito y reivindicado pertenece al campo de la detección de analitos y específicamente, se refiere a kits y métodos para medir e identificar dominios solubles o extracelulares de receptores de factor de crecimiento de fibroblastos que incluyen tipos de receptor 2, 3, y 4 (RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4) en muestras biológicas.

Antecedentes de la invención

La carcinogénesis es un proceso con múltiples etapas durante el cual células normales se transforman en células cancerígenas al acumular varias mutaciones genéticas y adquirir características comunes que promueven los fenotipos malignos, a menudo referido como marcadores característicos de cáncer. Los seis marcadores característicos clásicos incluyen autosuficiencia en señales de crecimiento, insensibilidad a señales anti-crecimiento, réplica ilimitada, evasión de apoptosis, angiogénesis prolongada y la habilidad para invadir tejido y formar metástasis (Hanahan, D., Weinber, R. A. Cell 2000, 100: 57-70). Muchas de estas características están causadas por alteraciones genéticas que implican la ganancia de función, amplificación y/o sobreexpresión de oncogenes claves junto con la pérdida de función, eliminación y/o silenciamiento epigenético de supresores tumorales (Luo, J., Solimini, N. L.., Elledge, S. J. Cell 2009, 136: 823-837). Por ejemplo, se han identificado varias alteraciones y mutaciones dentro de la familia de receptores de factor de crecimiento de fibroblastos (RsFCF) en una variedad de cánceres humanos. Estas mutaciones provocas la desregulación de señalización de RFCF o sobreexpresión de los receptores en cánceres que incluyen cáncer de mama, vejiga, gástrico, próstata, colon, mieloma múltiple y particularmente cáncer de pulmón (Turner, N., Grose, R., Nat Rev Cancer. 2010, 10:116-129; Volm, M., Koomagi, R. Mattern, J., Stammler, G. Eur J Cancer. 1997, 33:691-693; Bergsagel, P. L., Kuehl, W. M. J clin Oncol. 2005, 23: 6333-6338. Trudel, S., Stewart, A.K., Rom, E. Wei, E. Li, Z.H. Kotzer, S. Chumakov, I., Singer, Y., Chang, H., Liang, S. B., Yayon, a., Blood, 2006, 107: 4039-4046).

El cáncer de pulmón es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer tanto para hombres como para mujeres, y representó 157.000 muertes en 2010 en los Estados Unidos de América (Jemal, A., Siegel, J. Xu, J., Ward, E. CA Cancer J Clin. 2010, 60: 277-300). La mayoría de casos de cáncer de pulmón (aproximadamente el 85%) se clasifican como cánceres de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cuya supervivencia ha mejorado mínimamente en las últimas décadas (American Cancer Society, Cancer Facts & Figures, 2010, Atlanta, GA). Recientemente, han aparecido tratamientos nuevos dirigidos a receptor de factor de crecimiento epidérmico (RFCE) y factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV) a partir de una comprensión mejorada de señalización de factores de crecimiento en CPCNP. Aunque los inhibidores RFCE muestran beneficio en pacientes no seleccionados, la activación de mutaciones en el RFCE identifica un subconjunto de tumores que son sumamente sensibles a los inhibidores de tirosina quinasa de RFCE (Lynch, T. J., Bell, D. W. Sordella, R., Gurubhagavatula, S., Okimoto, r. A., Brannigan, B. W. Harris, P. L. Haserlat, S. M. Supko, J. G. Haluska, F. G., Louis, D. N., Christiani, D. C. Settleman, J., Haber, D.A.N Engl J Med. 2004, 350: 2129-2139; Shepherd, F. A., Pereira, J.R., Ciuleanu, t., Eng, H.T., Hirsh, V., Thongprasert, S., Campos, D. Maoleekoonpiroj., S., Smylie, M., Martins, R., Van Kooten, M. Dediu, M., Findlay, B., Tu, D., Johnston, D., Bezjak, A., Clark, G., Santabárbara, P., Seymour, L. N Engl J Med., 2005, 353: 123-132). Similarmente, el tratamiengo anti-FCEV produce un resultado mejorado para ciertos pacientes con CPCNP (Sandler, A., Gray, R. Perry, M. C., Brahmer, J. Schiller, J. H., Dowlati, A., Libenbaum, R. Johnson, D. H. N Engl J Med. 2006, 355: 2542-2550), aunque la definición de biomarcadores predictivos para eficacia terapéutica anti-FCEV ha tenido menos éxito (Ramalingam, S.S., Belani, C.P. Curr Opin Oncol. 2010, 22:79-85). La experiencia con inhibidores de RFCE y FCEV en CPCNP subraya la necesidad de definir otras rutas señalizadoras implicadas en la progresión tumoral, angiogénesis y resistencia a tratamientos actualmente disponibles (Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. CA Cancer J Clin. 2012, 62:10-29).

Los receptores de factor de crecimiento de fibroblastos (RsFCF) son receptores tirosina quinasa de transmembrana que participan en múltiples procesos fisiológicos que incluyen angiogénesis, organogénesis, desarrollo de tejido y señalización endocrina. Estructuralmente, RsFCF consisten en un péptido señal que se parte, tres dominios de tipo inmunoglobulina (Ig), una caja ácida, un dominio de transmembrana y un dominio partido de tirosina quinasa (Turner, N., Grose, R. Nat Rev Cancer. 2010, 10:116-29; Beenken, A., Mohammadi, M. Nat Rev Drug Disco. 2009, 8: 235-253). Hasta ahora, se han identificado cuatro genes para codificar RsFCF, llamados RFCF1, RFCF2, RFCF3 y RFCF4. Cada tipo de RFCF varia en sensibilidad y especificidad. El sistema se complica además por la unión extensiva que ocurre en mARNs RFCF3 que generan una multitud de variantes con diferentes actividades que transducen señales y se enlazan con ligandos (Turner, N., Grose., R. Nat Rev Cancer. 2010, 10: 116-29; Beenken, A., Mohammadi, M. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8:235-253). Los factores de crecimiento de fibroblastos (FsCF) son los ligandos para los RsFCF y consisten en veintidós péptidos secretados solubles, que se liberan dependiendo de las necesidades celulares. Juntos, FsCF y RsFCF crean un número extremadamente alto de combinaciones ligando/receptor que permiten un ajuste fino y preciso de señales de crecimiento. La regulación de señalización de FCF implica varios mecanismos que incluyen la liberación de formas solubles de RsFCF (RssFCF), generado por la división proteolítica en la superficie celular por metaloproteasas (Müllberg J, Althoff K, Jostock T, Rose-John S. Eur Cytokine Netw. 2000, 11:27-38): La pérdida de estos receptores proporciona un mecanismo clave para la reducción de señalización de FCF y la liberación de proteínas biológicamente activas en la circulación (Peschon J. J., Slack J. L., Reddy Pl, Stocking K.L., Sunnarborg, S.W., Lee, D. C., Russell, W. E., Castner, B.J., Johnson, R.S., Fitzner, J.N., Boyce, R.W., Nelson, N., Kozlosky, C.J.,Wolfson, M.F., Rauch, C.T., Cerretti, D.Pl, Paxton, R.J., March, C.J. Black, R.A. Science. 1998, 282: 1281-2184).

En los últimos veinte años ha habido cada vez más evidencias que muestran la existencia de receptores FCF solubles en la sangre en niveles particularmente altos en pacientes con cáncer (Hanneken, A., Ying, W., Ling, N. Baird, A. Proc Natl Acad Sci. 1994, 91:9170-9174; Hanneken A. FEBS Lett. 2001, 489: 176-181), que sugiere que la monitorización de la presencia de estos receptores en circulación puede ser importante para entender la progresión y/o tratamiento de cáncer. Por ejemplo, una forma soluble truncada en terminal C de RFCF4 la expresan líneas celulares de cáncer de mama epitelial humano que pueden modular funcionalmente la acción de FCF (Ezazt, S, Zheng, L., Yu, S., Asa, S.L. Biochem Biophys Res Commun. 2001, 287:60-65). Además, una forma alternativamente unida de RFCF3 se ha identificado en una línea celular de carcinoma escamosos, que tiene la capacidad para unirse con FCF1 y FCF2, como lo muestran los experimentos de enlace cruzado (Terada, M. Shimizu, A., Sato, N., Miyakaze, S.I., Katayama, H., Kurokawa-Seo. M. Mol Cell Biol Res Commun. 2001, 4: 365 373). Las afinidades de enlace con ligando de estos RssFCF secretados son a menudos similares a los de la forma unida a la membrana de estos receptores, lo que sugiere que su papel biológico es modular la acción de ligandos al competir con el receptor de superficie celular.

Aunque los RsFCF en algunos de estos estudios se han identificado en la sangre o medio celular, el único método que se ha utilizado en la técnica anterior es la inmunoelectrotransferencia (Hanneken, A., Ying, W., Ling, N. Baird, A. Proc Natl Acad Sci. 1994, 91:9179-9174; Hanneken A. FEBS Lett. 2001, 489: 176-181), una técnica que no es sensible, lineal o de diagnóstico. Por consiguiente, existe una necesidad no cubierta del desarrollo de una detección estandarizada, rápida, precisa y económica de RsFCF que sea susceptible de automatización. Ya que los anticuerpos DuoSet® comercialmente disponibles están disponibles para detectar formas solubles de RFCF2, RFCF3 y RFCF4, los solicitantes usaron el método ELISA para desarrollar un ensayo de detección para RssFCF similar al usado para detectar receptores solubles de factor de crecimiento epidérmico (Muller, V., Witzel, I, Pantel, K., Krenkel, S., Luck, H. J., Neumann, R., Keller, T., Dittmer, J., Janicke, F., Thomssen, C. Anticancer Res. 2006, 26: 1479-1487). Sin embargo, el sistema DuoSet ELISA no fue satisfactorio porque solamente se detectó RFCF3 soluble (RsFCF3) en las muestras biológicas ensayadas. Los solicitantes después transfirieron el ensayo a un formato Meso Scale Discovery para aumenta la sensibilidad de detección para RFCF2 soluble (RsFCF2) y RFCF4 soluble (RsFCF4). Sin embargo, RsFCF2 y RsFCF 4 siguiente sin detectarse. Por lo tanto, se desarrolló con éxito un sistema de ensayo completamente diferente para detectar RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en muestras biológicas, que utiliza una plataforma múltiple basada en esferas. El objeto aquí descrito proporciona kits y métodos para la detección de RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en muestras biológicas.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a un kit para detectar receptores solubles de factor de crecimiento de fibroblastos (RssFCF) en una muestra biológica, que comprende:

una composición de anticuerpo de captura que específicamente se enlaza con RsFCF conjugado con la microsesfera; y

una composición de anticuerpo de detección que específicamente se enlaza con RsFCF conjugado con una etiqueta de detección;

donde 0,14-494 ng/ml RsFCF2, 0,023-74 ng/mL de RsFCF3 y 0,033-123 ng/mL de RsFCF4 se detectan en la muestra biológica;

donde la composición de anticuerpo de captura comprende un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF2, un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF3 y un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF4, y

donde la composición de anticuerpo de detección comprende un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RFCF2, un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RFCF3 y un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RFCF4.

La presente invención también está dirigida a un método para medir la cantidad de RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en una muestra biológica, que comprende:

a. contactar la muestra biológica con una composición de anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 conjugado en una microesfera,

b. contactar la muestra biológica con una composición de anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 acoplado a una etiqueta de detección;

c. medir la señal producida por la etiqueta de detección;

d. correlacionar la cantidad de señal producido en c. con la cantidad RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en la muestra biológica.

Los pacientes de cáncer típicamente tienen un mayor contenido de receptor soluble FCF en sus fluidos biológicos y tejidos en comparación con pacientes sin la enfermedad. Los kits y métodos aquí descritos permiten a aquellos expertos en la técnica identificar y cuantificar múltiples isoformas de receptores solubles FCF en tales pacientes y proporciona una base para identificar y cuantificar el contenido FCF en pacientes de oncología. Otras realizaciones de las invenciones aquí descritas también pertenecen a una tecnología múltiples con microesferas para detección simultanea de RssFCF.

El kit de la presente invención se usa para detectar RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4. El kit comprende una composición de anticuerpo de captura, que comprende un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RsFCF2, un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RsFCF3 y un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RsFCF4 que se conjuga con una microesfera. La microesfera que tiene el anticuerpo de captura conjugado tiene un diámetro de aproximadamente 5 pm y dos fluoróforos. Cada fluoróforo es espectralmente distingo del otro fluoróforo. El kit comprende además una composición de anticuerpo de detección, que comprende un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RsFCF2, un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RsFCF3 y un anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RsFCF4 que se conjuga con cualquier etiqueta detectable conocida en la técnica adecuada para el fin que se pretende describir. Además, el kit puede comprender un tampón de bloqueo y un tampón de incubación.

El kit de la presente invención detecta niveles umbrales predefinidos de RsFCF2, RsFCF3 y/o RsFCF4, donde los niveles umbrales predefinidos son 0,14-494 ng/ml de RsFCF2, 0,023-74 ng/mL de RsFCF3 y 0,033-123 ng/mL de RsFCF4 y se detectan en la muestra biológica. Preferentemente, tales niveles se detectan en niveles que tienen valores como los siguientes: al menos 0,14-494 ng/ml de RsFCF2, 0,023-74 ng/mL de RsFCF3 y 0,033-123 ng/mL de RsFCF4 en una muestra biológica. El kit comprende anticuerpos de captura para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 conjugados con microesferas y anticuerpos de detección para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 conjugados con una etiqueta de detección conocida en la técnica. El kit comprende además un tampón de bloqueo y un tampón de incubación.

La presente invención está también dirigida a un método para medir la cantidad de RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en una muestra biológica. El método comprende contactar la muestra biológica con una composición de anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 conjugado en una microesfera, contactar la muestra biológica con una composición de anticuerpo de detección que se enlaza específicamente con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 acoplado a una etiqueta de detección, medir la señal producida por la etiqueta de detección y correlacionar la cantidad de señal producido en c. con la cantidad RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en la muestra biológica.

Abreviaturas

FCF factor de crecimiento de fibroblasto

RFCF receptor de factor de crecimiento de fibroblasto

RsFCF receptores de factor de crecimiento de fibroblasto

RsFCF receptor soluble de factor de crecimiento de fibroblasto

RsFCF2 receptor soluble de factor de crecimiento de fibroblasto 2

RsFCF3 receptor soluble de factor de crecimiento de fibroblasto 3

RsFCF4 receptor soluble de factor de crecimiento de fibroblasto 4

RssFCF receptores solubles de factor de crecimiento de fibroblasto

CPCNP Carcinoma de pulmón de células no pequeñas

ADMAs adamalisina

ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

MSD Meso Scale Discovery

AEDT ácido etilendiaminotetraacético

ASB albúmina de suero bovino

DMD dosis mínima detectable

CV coeficiente de variación

LMDC límite menor de cuantificación

IRTQ inhibidores de receptor tirosina quinasa

FCEV factores de crecimiento endoteliales vasculares

RsFCDPreceptores de factor de crecimiento derivados de plaquetas

Definiciones

El término “kit” como aquí se usa se refiere a una combinación de reactivos y otros materiales. Se contempla que el kit puede incluir reactivos tales como agentes amortiguadores, reactivos estabilizadores de proteínas, sistemas productores de señales (por ejemplo, sistemas que generan fluorescencia), anticuerpos, proteínas de control, así como recipientes para pruebas (por ejemplo, placas de microtítulo). No se pretende que el término “kit” se limite a una combinación particular de reactivos y/u otros materiales. En una realización, el kit comprende además instrucciones para usar los reactivos. El kit de prueba puede estar empaquetado de una manera adecuada, típicamente con los elementos en un único recipiente o varios recipientes, como sea necesario, junto con una hoja de instrucciones para realizar la prueba. En algunas realizaciones, los kits incluyen preferentemente una muestra de control positivo. Los kits pueden estar producidos en una variedad de maneras conocidas en la técnica.

Los términos “muestra biológica” abarcan una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo y pueden usarse en un ensayo diagnóstico o de monitorización. Los términos abarcan sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, como especímenes de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. Los términos abarcan muestras que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes. Los términos abarcan una muestra clínica, y también incluyen células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido. Los términos “muestra biológica” pretende distinguir entre una muestra en un escenario clínico y una muestra que puede ser una muestra recombinante o derivada de una muestra recombinante.

Los términos “anticuerpo de captura” y “anticuerpo de detección” en el sentido de la presente solicitud pretenden abarcar aquellos anticuerpos que se enlazan con un RsFCF específico con una alta afinidad.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre y cuando muestren la propiedad biológica deseada. El anticuerpo puede derivarse de cualquier especie y puede ser IgM, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgD, IgA o IgE, por ejemplo. La actividad biológica deseada es enlazarse con RsFCF.

Los términos “anticuerpo monoclonal” como aquí se usan se refieren a una preparación de anticuerpos de la composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de enlace sencilla para un epítope particular de RsFCF.

Los términos “anticuerpo policlonal” como aquí se usan se refieren a una composición de diferentes moléculas de anticuerpo que es capaz de enlazarse o reaccionar con varios determinantes antigénicos específicos diferentes en el mismo o en diferentes antígenos. La variabilidad en la especificidad de antígenos de un anticuerpo policlonal se sitúa en las regiones variables de los anticuerpos individuales que constituyen el anticuerpo policlonal, en particular las regiones determinantes de complementariedad (RDC)1, RDC2 y RDC3. Preferentemente, el anticuerpo policlonal se prepara mediante inmunización de un animal con RsFCF diana o partes del mismo. Alternativamente, el anticuerpo policlonal puede prepararse mezclando múltiples anticuerpos monoclonales que tengan la especificidad deseada para un RsFCF diana.

Los términos “enlace específico” se refiere a un enlace entre dos moléculas, por ejemplo, un antígeno y un anticuerpo, caracterizado por la habilidad de una molécula (antígeno) para asociarse con otra molécula específica (anticuerpo) incluso en presencia de muchas otras moléculas diversas, esto es, para mostrar un enlace preferencial de una molécula con otra en una mezcla heterogénea de moléculas.

El término “microesfera” se refiera a un soporte sólido pequeño y discreto. Estos soportes sólidos discretos pueden usarse para la unión de una población de sondas de tal manera que cada sonda individual en la población difiera de otra. La composición de una microesfera pude varias, dependiendo de, por ejemplo, el formato, química y/o método de unión y/o el método de síntesis de ácido nucleico. Las composiciones de microesfera ejemplares incluyen soportes sólidos y funcionalidades químicas impartidas a los mismos, usados en síntesis de polinucleótido, polipéptido y/o fracciones orgánicas. Tales composiciones incluyen, por ejemplo, plásticos, cerámicas, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, solución de torio, carbón-grafito, dióxido de titanio, látex y dextranos entrecruzados, como sefarosa, nailon, micelas entrecruzadas y Teflón™, así como otros materiales.

El término “fluoróforo” como aquí se usa se refiere a cualquier compuesto o proteína fluorescente que pueda usarse en la cuantificación y detección de antígenos RsFCF.

El término “sensibilidad” es esencialmente una medida de cómo el ensayo múltiple descrito en la presente invención identificar correctamente un RsFCF específico en su mínima concentración. Como aquí se describe, la sensibilidad se describe como la dosis mínima detectable (ng/mL) de un RsFCF específico que puede recuperarse de manera precisa entre 80-120%.

El término “tampón” se refiere a una solución amortiguada o a agua. El tampón soporta una reacción entre el analito de interés (por ejemplo, RsFCF) y el agente que se une al analito (por ejemplo, anticuerpo de RsFCF) y no interfiere con la interacción anticuerpo/antígeno.

El término “sujeto vivo” como aquí se usa se refiere a cualquier organismo vivo, incluyendo el humano.

Los términos “un”, “uno”, “una” como aquí se usan en la especificación pueden significar uno o más. Como aquí se usan en las reivindicaciones, cuando se usan junto con la palabra “comprende”, las palabras “un”, “uno”, “una” pueden significar más de uno, Como aquí se usa, “otro/a” puede significar al menos un segundo/una segunda o más.

El termino “comprende” o variaciones como “comprenden”, o “que comprende(n)”, como aquí se usan pueden usarse para implicar la inclusión de un elemento o número entero establecido o un grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí usado tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que esta invención pertenece.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Parámetros establecidos de validación para suero y plasma usando el ensayo desarrollado para RFCF2, RFCF3 y RFCF4 solubles.

Figura 2: Recuperación de pico para RFCF2 en concentraciones 7,8, 2,9, 1,7 y 0,82 ng/mL en suero y plasma (N=3).

Figura 3: Recuperación de pico para RFCF3 en concentraciones 1,4, 0,57, 0,30 y 0,15 ng/mL en suero y plasma (N=3).

Figura 4: Recuperación de pico para RFCF4 en concentraciones 2,2, 0,94, 0,54 y 0,29 ng/mL en suero y plasma (N=3).

Figura 5: Reactividad cruzada de: RFCF3 y RFCF4 con anti- RFCF2 como captura, RFCF2 y RFCF4 con anti- RFCF3 como captura y RFCF2 y RFCF3 con anti- RFCF4como captura.

Figura 6: Curvas estándares (N=5) para RFCF2 con concentración nominal en ng/mL versus concentraciones anteriores calculadas en ng/mL.

Figura 7: Curvas estándares (N=5) para RFCF3 con concentración nominal en ng/mL versus concentraciones anteriores calculadas en ng/mL.

Figura 8: Curvas estándares (N=5) para RFCF4con concentración nominal en ng/mL versus concentraciones anteriores calculadas en ng/mL.

Figura 9: Evaluación experimental de concentración de suero de RFCF2 en muestras de control en series clavadas con concentración baja, media y alta del analito (N=5).

Figura 10: Evaluación experimental de concentración de suero de RFCF3 en muestras de control en series clavadas con concentración baja, media y alta del analito (N=5).

Figura 11: Evaluación experimental de concentración de suero de RFCF4 en muestras de control en series clavadas con concentración baja, media y alta del analito (N=5).

Figura 12: Datos de recuperación de pico en suero (N=3) y plasma (N=3) en concentraciones 7,8, 2,9, 1,7 y 0,82 ng/mL para RFCF2, concentraciones ,4, 0,57, 0,30 y 0,15 ng/mL para RFCF3 y concentraciones 2,2, 0,94, 0,54 y 0,29 ng/mL para RFCF4.

Figura 13: Datos de linealidad dilucional para RFCF2 en plasma, suero y control con pico alto.

Figura 14: Datos de linealidad dilucional para RFCF3 en plasma, suero y control con pico alto.

Figura 15: Datos de linealidad dilucional para RFCF4 en plasma, suero y control con pico alto.

Figura 16: Panel superior: tampones de muestra usados para establecer un mejor rango en suero de cáncer de próstata y suero de cáncer de pulmón. Panel inferior: diferentes tampones de bloqueo probados para conseguir una señal mejorada para suero de cáncer metastático.

Figura 17: Rango de referencia para RFCF2, RFCF3 y RFCF4 en cáncer de próstata (N=5) y cáncer de pulmón (N=10).

Descripción detallada de la invención

El análisis temprano de concentraciones de RFCF es beneficioso para entender el estado de un cáncer (antes y después de tratamiento) y ayudará a la selección de fármacos candidatos específicos que se dirijan a los RsFCF. Tales análisis también darán pistas sobre el modo de acción de un fármaco RFCF. Por lo tanto, es imperativo tener un ensayo de diagnóstico adecuado, que sea sensible y específico para RFCF.

Los intentos anteriores para obtener un ensayo adecuado que detecte de manera fiable múltiples isoformas de RsFCF fallaron a pesar de probar éxito en la detección de otros receptores solubles de factor de crecimiento. Sorprendentemente, el uso de una tecnología inmunoensayo múltiple basada en microesferas (específicamente la plataforma “Luminex 100/200™” aquí descrita en las patentes de Estados Unidos 6.599.331, 6.592.822 y 6.268.222 posibilitan el desarrollo de un ensayo para medir de manera precisa RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en muestras biológicas. La tecnología de inmunoensayo múltiple basado en microesferas es un ensayo sándwich. El término “ensayo sándwich” se refiere a un inmunoensayo donde el antígeno se coloca entre dos reactivos de enlace, que son típicamente anticuerpos. El primer reactivo de enlace (anticuerpo de captura) está unido a una microesfera y el segundo reactivo de enlace (anticuerpo de detección) comprende un grupo detectable. Ejemplos de grupos detectables incluyen, por ejemplo y sin limitación: fluorocromos, enzimas para unir un segundo reactivo de enlace (por ejemplo, cuando el segundo reactivo de enlace/anticuerpo es un anticuerpo de ratón, que se detecta por un anticuerpo anti-ratón etiquetado fluorescentemente), por ejemplo, con un antígeno o un miembro de una pareja de enlace, como biotina.

Las microesferas de poliestireno son componentes importantes en este ensayo. Estas gotas de microesfera se tiñen internamente con dos fluoróforos espectralmente distintos. Usando proporciones precisas de estos fluoróforos, se crea una selección consistente en 100 conjuntos diferentes de microesferas con direcciones espectrales específicas. Cada conjunto de microesfera puede poseer un reactivo diferente sobre su superficie. En esta solicitud, el reactivo se refiere como “anticuerpo de captura”. Debido a que los conjuntos de microesferas pueden distinguirse por sus direcciones espectrales, pueden combinarse permitiendo que hasta 100 analitos diferentes puedan medirse simultáneamente en un único recipiente de reacción. Un tercer fluoróforo unido a una molécula reportera, en esta solicitud referido como “anticuerpo de detección”, cuantifica la interacción biomolecular que ha ocurrido en la superficie de la microesfera. Las microesferas se interrogan individualmente en un chorro de fluido que fluye rápidamente cuando pasan por dos láseres separados en el analizador Luminex. El procesamiento de señal digital a alta velocidad clasifica la microesfera en base a su dirección espectral y cuantifica la reacción sobre la superficie en unos pocos segundos por reacción de muestra.

Para los ensayos aquí descritos, el inmunoensayo múltiple basado en microesferas ofrece varias ventajas:

• Los costes del ensayo son económicos porque no se requiere un kit separado para cada RsFCF individual.

• Ya que un kit puede analizar múltiples RssFCF, la cantidad de muestra biológica requerida para realizar un ensayo se reduce en gran medida.

• Las mediciones de cuantificación del ensayo ofrecen una alta reproducibilidad porque el pre-procesamiento o la valoración de la muestra biológica no son necesarios.

Por estas razones, aunque otros inmunoensayos, como radioinmunoensayos son capaces de usarse en el contexto de la presente invención, el inmunoensayo múltiple basado en microesferas es preferente.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan para ilustrar de manera más completa la presente invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que las técnicas desveladas en los ejemplos que siguen representan técnicas que los inventores han encontrado que funcionan bien en la práctica de las invenciones reivindicadas, y por lo tanto deberían considerarse que constituyen ejemplos de modos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica, a la luz de la presente divulgación, deberían apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan y seguir obteniendo un resultado igual o similar sin partir del alcance de la invención.

EJEMPLO 1: Recogida y almacenamiento de muestras biológicas

Ya que RssFCF se liberan generalmente en circulación después de división proteolítica, se usaron muestras de sangre, suero y plasma [Bioreclamation, LLC (Westbury, NY)] para desarrollar y validar el inmunoensayo múltiple. Flebotomistas con licencia recogieron muestras de sangre del área de fosa cubital de voluntarios sanos mayores de edad y las dejaron coagular en bolsas de recogida secas de 450-500 mL en una nevera durante la noche. Los sueros se separaron mediante centrifugación a 2800x g durante veinte minutos a 5 °C. Los sueros separados se transfirieron a bolsas de transferencia usando un dispositivo extractor de plasma para asegurar que no hubiera contaminación de glóbulos rojos. El plasma humano se recogió en bolsas de recogida que contenían potasio-EDTA, se mezcló suavemente durante cinco minutos y se dejó asentar a temperatura ambiente durante treinta minutos. Las bolsas se centrifugaron a 2800x durante veinte minutos a 5 °C. El plasma separado se transfirió a bolsas de transferencia usando un dispositivo extractor de plasma para asegurar que no hubiera contaminación de glóbulos rojos. Tanto el suero humano como el plasma humano se almacenaron a 4 °C durante hasta una semana antes de separarse en alícuotas en criotubos y se congelaron a -80 °C hasta su uso.

EJEMPLO 2: Desarrollo del inmunoensayo múltiple

La implementación exitosa de un inmunoensayo múltiples basado en microesferas para la detección de RsFCF en muestras biológicas requiere un desarrollo y optimización de protocolo. Primero, deben identificarse los reactivos que darán como resultado en el ensayo más sensible. El primer conjunto de reactivos que se evaluó fue las parejas de anticuerpo de captura y de detección para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4. Se exploraron varias fuentes diferentes de anticuerpo; sin embargo, las parejas de anticuerpo enumeradas en la Tabla 1 dieron el mejor rango de detección para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 y por lo tanto se usaron en el sistema múltiple.

Tabla 1: Combinación de anticuerpos de captura y de detección para establecer el ensayo para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4.

El siguiente componente del ensayo que se preparó fue el anticuerpo de captura unido a microesferas. Los anticuerpos de captura fueron carboxilados (<<-COOH->>) específicamente con microesferas de poliesterieno 5,6 micrones de la siguiente manera: anti-RFCF2 con gota #(88), anti-RFCF3 con gota #(16) y anti-RFCF4 con gota #(79). Estas regiones corresponden a 3 de las 100 regiones potenciales únicamente teñidas por el sistema Luminex 100/200™. La unión de los anticuerpos de captura diana con las microesferas de poliestireno se realizó usando un sistema de conjugación patentado, que usa un procedimiento similar al kit de unión de Amina Bio-Plex® de Bio-Rad Life Sciences (Cat 171-406001). En resumen, el enlace covalente del anticuerpo de captura diana con la microesfera de poliestireno carboxilada se consigue mediante reacciones de carbodiimida que incluyen los grupos amino primarios de proteína y los grupos funcionales carboxilos unidos sobre la superficie de microesferas de poliestireno. La unión covalente es permanente, dejando ninguna proteína no unida después de limpiar, incluso después de periodos largos de almacenamiento. Los anticuerpos de detección para RsFCF2 y RsFCF3 se biotinilizaron usando Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Cat #21327) de acuerdo con el protocolo del fabricante, mientras que el anticuerpo de detección para RsFCF4 se compró con la etiqueta de biotina ya unida.

Otro conjunto de reactivos evaluados fue los tampones que se usaron para las diluciones de muestra, las etapas de bloqueo e incubaciones. Los tampones típicos utilizados en los ensayos múltiples son con base PBS y base Tris. El tampón que funcionó mejor para incubaciones y diluciones fue PBS con 1% ASB y para bloqueo de proteína no específico fue PBS con 1% de Globulina Gamma Bovina e Inmunoglobulina G.

Una vez que los reactivos para el inmunoensayo se prepararon, se usó el siguiente protocolo para cuantificar RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF24 en muestras biológicas:

• Cinco |^jL de microesferas etiquetadas con anticuerpo de captura para los tres RssFCF (1800 gotas por analito por pocillo) se mezclaron con cinco j L de un bloqueador que consistió en 1% Globulina Gamma Bovina (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, Catálogo #82041) en PBS con Inmunoglobulina añadida.

• La mezcla se añadió a una placa microtítulo con fondo plano y 96 pocillos.

• La muestra que se iba a usar se descongeló a temperatura ambiente inmediatamente antes de la prueba.

• Diez ^jL de control estándar de calidad, o suero diluido 1:5 en un 4% tampón ASB que contenía un conservante (azida de sodio) se añadieron a la placa, la muestras se mezclaron con una pipeta y la placa se incubó a temperatura ambiente durante una hora sin agitar.

• Diez ^jL de anticuerpos de detección biotinilizados (diluidos en 1% tampón ABS con conservante a una concentración final de 3 jg/mL para los tres analitos) se añadieron a cada pocillo, se mezclaron cuidadosamente y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente.

• Diez j L de estreptavidina-ficoeritrina diluidos en 100 jg/mL se añadieron a cada pocillo, se mezclaron cuidadosamente y se incubaron durante treinta minutos a temperatura ambiente.

• Una placa microtítulo con membrana de filtró se pretrató con 100 ^jL de un tampón de lavado con base de ASB con azida de sodio seguido de aspiración por medio de un dispositivo con colector de vacío.

• Los contenidos de reacción en la placa microtítulo con fondo plano se transfirieron a los respectivos pocillos de la placa filtro. Todos los pocillos se aspiraron con vacío y los contenidos se lavaron dos veces con 100 j L de tampón de lavado.

• Después del lavado final, 100 pL de tampón de lavado se añadió a cada pocilio y las microesferas se volvieron a suspender mediante una mezcla cuidadosa.

• La placa después se analizó en un lector Luminex 100/200™ que usa un software de análisis patentado.

Para cada placa, se crea una curva estándar para cada RsFCF usando software patentado. Las curvas estándares para RsFCF2 y RsFCF3 usan una regresión logística de Parámetro 5 y la curva estándar RsFCF4 usa una regresión logística de Parámetro 4.

EJEMPLO 3: Validación estadística del inmunoensayo múltiple

En base a las normas de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (Departamento de Salud y Servicios Humanos, Centro para Evaluación e Investigación de fármacos (CDER), y Centro para Medicina Veterinaria (CVM). Guía para Industria. Validación de método bioanalítico. Mayo 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drug/GuidanceComplianceRegulatorvInformation/Guidances/UCM070107.pdf.). se desarrolló un programa de validación que implicó una validación completa del inmunoensayo múltiple con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4. El programa incluyó evaluación de la mejor matriz de muestra, selectividad de ensayo, rango lineal como el determinado por una curva estándar, dosis mínima detectable (DMD), límite mínimio de cuantificación (LIDC), precisión, recuperación absoluta, linealidad dilucional, interferencia de matriz, estabilidad de congelación/descongelación, estabilidad a temperatura ambiente y rango de referencia (FIG. 1).

Comparación de muestras de plasma y suero: Ya que la sangre se estaba usando para medir el contenido de RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en el ensayo, se hizo una comparación entre plasma y suero para identificar la mejor matriz biológica. Como se ve en las FIG. 2, FIG. 3 y FIG. 4, la recuperación de RsFCF fue consistentemente mejor cuando se hizo el ensayo con suero. Por lo tanto, el suero fue la elección final de matriz para posteriores análisis de validación. Los métodos de inmunoensayo múltiple en la presente invención están también dispuestos para otras muestras biológicas (fluido cerebroespinal, orina, linfa, saliva, sudor, fluido pleural, fluido sinovial, fluido acuoso, fluido lagrimal, bilis, secreción del páncreas), aunque una validación que cumple sus fines también necesitará establecerse para identificar la mejor elección de matriz.

Selectividad de ensayo: Ya que RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 se probaron en el mismo pocillo de muestra, fue importante confirmar que no hay una significativa reactividad cruzada entre los tres analitos. Con el fin de investigar la reactividad cruzada, el anticuerpo de captura RsFCF2 se probó contra la concentración más alta de RsFCF3 y RsFCF4 para señal. Similarmente, todas las otras combinaciones se evaluaron y solamente se encontró un 1,6% de reactividad cruzadas entre el anticuerpo de captura de RsFCF4 y RsFCF2 en la concentración más alta (FIG. 5). Curvas estándares: Se usaron el estándar total de RFCF2a (parte #841650), el estándar total de RFCF3 (parte #841879) y el estándar total de RFCF4 (parte #842742), disponibles en R&D Systems Duosets (Números de Catálogo DYC665, DYC766 y DYC685, respectivamente) para generar las curvas estándares. Las curvas estándares para cada RsFCF se hicieron primero creando una mezcla alta estándar para los tres estándares en un tampón de suero de pescado/tampón ASB: 100 ng/mL para RFCF2, 15 ng/mL para RFCF3 y 25 ng/mL para RFCF4. Este estándar alto se diluyó en serie siete veces añadiendo 37 pL de cada estándar con 88 pL de diluyente estándar. Los rangos de curva estándar para RFCF2, RFCF3 y RFCF4 fueron 100 ng/mL - 0,020 ng/mL, 15 ng/mL - 0,003 ng/mL y 25 ng/mL - 0,005 ng/mL, respectivamente. Las curvas estándares para cada analito se usaron en cada placa, y se calculó una media de los valores, con CV porcentuales calculados en las series (FIG. 6, FIG. 7 y FIG. 8). CV media para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 fueron 8,38%, 6,38%, 5,13%, respectivamente, lo que indica que las curvas tenían una variación muy mínima de placa a placa.

Dosis mínima detectable: La concentración más baja de analito que puede discriminarse del espacio en blanco con 99% de seguridad es conocida como la dosis mínima detectable (DMD). DMD se calculó haciendo la media de la señal de 20 determinaciones réplicas del espacio en blanco de la curva estándar añadiendo tres desviaciones estándares a la señal media del espacio en blanco.

Límite menor de cuantificación (LMDC): El límite menor de cuantificación (LMDC) es el estándar más bajo que puede detectarse de manera precisa. Con el fin de encajar en la definición de LMDC, el estándar deber ser lineal, corresponder al rango del ensayo dentro de un CV de 30% y deber recuperar entre 75-125% cuando se clava en la matriz. LMDC se determinó usando diluciones dobles y sometiendo a ensayo en triplicados durante tres series diferentes. El CV se calculó y trazó contra concentración. El LMDC, interpolado de este gráfico y multiplicado por el factor de dilución, se calculó para ser 0,53 ng/mL, 0,084 ng/mL y 0,15 ng/mL, respectivamente para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4. Como se ha mencionado, es también importante para el analito recuperar dentro del 75 -125% en la concentración del LMDC. Sin embargo, no se recuperaron muestras de manera exitosa para RsFCF2 en concentraciones por debajo de 0,82 ng/mL. La recuperación media en 0,82 ng/mL para suero (N=3) se determinó que fue 85,67%. Las muestras de RFCF3 no pudieron recuperarse de manera exitosa en concentraciones por debajo de 0,15 ng/mL, y la recuperación media de muestras de suero (N=3) clavadas con RsFCF3 fue 103,3%. Las muestras de RFCF4 no pudieron recuperarse de manera exitosa en concentraciones por debajo de 0,17 ng/mL, y la recuperación media de muestras de suero (N=3) clavadas con RsFCF3 fue 101,3%. Finalmente, el LMDC determinado para RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 fue 0,82 ng/mL, 0,15 ng/mL y 0,17 ng/mL, respectivamente (Tabla 2).

Tabla 2: LMDC y rango dinámico para RFCF2, RFCF3 y RFCF4

Precisión: La precisión para el ensayo se determinó en una serie (intra-ensayo CV) y sobre una serie de secuencias (inter-ensayo CV) midiendo tres niveles de controles por duplicado durante un mínimo de cinco series. Los valores medios para los controles de RsFCF2 fueron 1,3, 9,3 y 35 ng/mL con inter ensayo CV en el rango de 8-13% e intraensayo CV en el rango de 1-11% (FIG. 9). Los valores medios para los controles de RsFCF3 fueron 0,117, 2,8 y 14 ng/mL con inter ensayo CV en el rango de 8-13% e intra-ensayo CV en el rango de 0-16% (FIG. 10). Los valores medios para los controles de RsFCF4 fueron 0,095, 4,1 y 23 ng/mL con inter ensayo CV en el rango de 3-33% e intra-ensayo CV en el rango de 1-21% (FIG. 11). El rango superior para RsFCF4 es un poco más alto que 30%, que es el resultado de una serie mala que tiene un CV alto de 21%. La razón para un CV alto es porque la concentración media de la muestra es 0,095 ng/mL, que es mucho más bajo que el LMDC para RsFCF4.

Recuperación absoluta: Con el fin de determinar la recuperación porcentual de cada RsFCF, se clavó suero con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en cuatro concentraciones de los estándares y se analizaron por triplicado. La recuperación porcentual se calculó restando el valor referencia de la concentración clavada y dividiendo el resultado entre la concentración clavada y multiplicando por 100. Se observó que la recuperación media para RsFCF2 estuvo en el rango de 76-126% (N=3), para RsFCF3 estuvo en el rango de 89-143% (N=3), y para RsFCF4 estuvo en el rango de 81-145% (N=3) (FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4 y FIG. 12).

Linealidad dilucional: Ocasionalmente, puede haber muestras que lean más alto que el rango superior del ensayo para cada uno de los analitos. Con el fin de conseguir un valor correcto, es importante confirmar que las muestras se diluyen linealmente en el tampón de ensayo y que tienen un porcentaje de recuperación dentro de 70-130%. Las muestras se diluyeron dos veces en tampón de ensayo, comenzando desde la muestra original 1:5, y después diluyendo hasta una concentración final de 1:10, 1:20 y 1:40. La prueba de linealidad de dilución se realizó en muestras normales netas de suero y plasma, peor las concentraciones calculadas de RsFCF para estas muestras estuvieron por debajo del LMDC del ensayo. El suero humano normal agrupado se clavó inicialmente con RsFCF recombinante y después se diluyó hasta una concentración final de 1:10, 1:20 y 1:40. Las muestras de suero clavadas pueden diluirse con éxito hasta 1:40 con una recuperación porcentual media de 109% para RsFCF2, 109% para RsFCF3 y 96% para RsFCF4 (FIG. 13, FIG. 14 y FIG. 15).

Interferencia de matriz: La interferencia de matriz mide si los componentes comunes encontrados en muestras como hemoglobina, bilirrubina o triglicéridos introducen error en el ensayo múltiple. La interferencia de matriz se evaluó clavando hemoglobina (hasta 5000 mg/dL), bilirrubina (hasta 20 mg/dL) y triglicéridos (hasta 500 mg/mL) en una muestra de control y determinando la recuperación porcentual observada en la muestra clavada versus la muestra no clavada. La recuperación porcentual después de clavar hemoglobina (hasta 500 mg/mL), bilirrubina (hasta 20 mg/dL) y triglicéridos (hasta 500 mg/mL) para RsFCF2 fue 89%, 91% y 117%, para RsFCF3 fue 88%, 90% y 107% y para RsFCF4 fue 85%, 89% t 117%, respectivamente.

Estabilidad: Durante el análisis, las muestras pueden pasar a través de varios ciclos congelación-descongelación; por lo tanto, es importante evaluar la estabilidad del analito después de varias rondas de congelacióndescongelación y también determinar la estabilidad a 4 °C. La estabilidad congelación-descongelación se determinó sometiendo a ensayo muestras de suero durante hasta tres ciclos de congelación-descongelación y se determinó la recuperación porcentual de cada muestra. Además, también se probó la estabilidad de las muestras de suero mediante incubación a temperatura ambiente y a 4 °C durante 24 horas cada una. Las muestras incubadas se analizaron junto con muestras que no se habían incubado y se determinó la recuperación porcentual.

En resumen, el suero (N=3) se clavó con el estándar recombinante y la concentración referencia se midió para cada uno. Las muestras pasaron por tres ciclos de congelación-descongelación y la recuperación porcentual se calculó comparándolas con la muestra de referencia. La recuperación porcentual media para suero (N=3) durante tres ciclos de congelación-descongelación fue 90,11% RsFc F2, 84,11% para RFCF3 y 89,00% para RfCf4. Las muestras (N=3) también se evaluaron para su estabilidad de antígeno a 4 °C durante puntos temporales de 2, 4 y 24 horas y a temperatura ambiente durante puntos temporales de 4 y 24 horas. La recuperación porcentual media para suero (N=3) después de 24 horas a temperatura ambiente y 4 °C fue 83,93%, 83,33% y 89,87% para R^sfC^f2, RsFCF3 y RsFCF4.

EJEMPLO 4: Aplicación de ensayo

Se evaluó la habilidad del ensayo para detectar RssFCF en muestras de cáncer. La FIG. 16 muestra que las mejores señales de RsFCF en el ensayo se obtuvieron cuando el tampón de muestra para análisis de sueros de cáncer contenía 4% de ASB y el tampón de bloqueo contenía el detergente, NP-40. Después de la selección de los mejores tampones, se examinaron quince muestras diferentes de cáncer. Cinco muestras de cáncer de próstata y diez muestras de cáncer de pulmón (FIG. 17). De esas quince muestras, RsFCF2 solamente pudo detectarse en cuatro muestras con cantidades medible s que oscilaban entre 0,007-0,41 ng/mL. De manera interesante, RsFCF3 pudo medirse en las quince muestras con mediciones en el rango de 0,015 a 1,2 ng/mL. Además, RsFCF4 estuvo presente en todas las muestras en las concentraciones más altas en el rango de 0,07 a 7,4 ng/mL.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un kit para detectar receptores solubles de factor de crecimiento de fibroblasto (RssFCF) en una muestra biológica, que comprende:

una composición de anticuerpo de captura que específicamente se enlaza con RsFCF conjugado con la microesfera; y

donde la composición de anticuerpo de captura comprende un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF2, un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF3 y un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RFCF4; y

2. El kit de la reivindicación 1, donde la muestra biológica se selecciona del grupo consistente en sangre, suero, orina, fluido cerebroespinal (FCE), plasma, linfa, saliva, sudor, fluido pleural, fluido sinovial, fluido lagrimal, bilis y secreción del páncreas.

3. El kit de la reivindicación 1, donde el anticuerpo de captura se selecciona del grupo consistente en: anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF2;

anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF3; y

anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF4;

4. El kit de la reivindicación 1, donde el anticuerpo de detección se selecciona del grupo consistente en: anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF2;

anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF3; y

anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF4;

5. El kit de la reivindicación 1, donde la microesfera se conjuga con dos fluoróforos.

6. El kit de la reivindicación 5, donde los dos fluoróforos conjugados con las microesferas son fluoróforos rojos y de infrarrojo.

7. El kit de la reivindicación 6, donde la microesfera tiene un diámetro de aproximadamente 5 pm, y el kit comprende opcionalmente un tampón de bloqueo y un tampón de incubación.

8. El kit de la reivindicación 1 para detectar RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en una muestra biológica, que comprende: un anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF2 conjugado en una microesfera;

un anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF3 conjugado en una microesfera;

un anticuerpo policlonal de ratón anti-humano fosfo-RFCF4 conjugado en una microesfera;

un anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF2 conjugado con una etiqueta de detección;

un anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano RFCF3 conjugado con una etiqueta de detección;

un anticuerpo policlonal de ratón anti-humano RFCF4 conjugado con una etiqueta de detección;

9. El kit de la reivindicación 8, que además comprende un tampón de bloqueo y un tampón de incubación.

10. Un método para medir RsFCF en una muestra, que comprende:

a. proporcionar la muestra

b. medir RsFCF en la muestra usando el kit de la reivindicación 9, opcionalmente donde la muestra se obtiene de un sujeto vivo.

11. Un método para medir la cantidad de RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en una muestra biológica, que comprende: a. contactar la muestra biológica con una composición de anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 conjugado en una microesfera;

c. medir la señal producida por la etiqueta de detección;

d. correlacionar la cantidad de la señal producido en c. con la cantidad de RsFCF2, RsFCF3 y RsFCF4 en la muestra biológica.

12. El método de la reivindicación 11, donde la sensibilidad de detección mínima para

RsFCF2 es 0,14 ng/mL;

RsFCF3 es 0,023 ng/mL; y

RsFCF4 es 0,033 ng/mL.

13. El método de la reivindicación 12, donde la muestra biológica se selecciona del grupo consistente en sangre, suero, orina, fluido cerebroespinal (FCE), plasma, linfa, saliva, sudor, fluido pleural, fluido sinovial, fluido lagrimal, bilis y secreción del páncreas, opcionalmente donde cada microesfera tiene un diámetro de aproximadamente 5 pm.