JP6329127B2 - 細胞フィブロネクチンについての迅速な検査 - Google Patents
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Description
本願は、米国仮特許出願第60/505,606号および第60/556,411号に基づく米国実用特許第7,634,360号の一部継続出願である米国実用特許第7,392,140号の一部継続出願である米国実用特許出願第11/890,134号の一部継続出願である。これらの出願の全ての内容は、本明細書の全ての表、図面、および特許請求の範囲を含め、全体が本願に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、特に明記しない限り、抗体の断片または部分(これらの断片または部分が特定されているか否かにかかわらず)、そして一本鎖形態を含む。あるタンパク質が特異的または優先的にc−Fn分子のEDA領域と結合する能力を保持し、かつ本明細書に開示の1つまたは複数の配列を含む限り、そのタンパク質は、用語「抗体」に含まれる。抗体は、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローン等の単一コピー又はクローン由来であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、均一または実質的に均一な集団内に存在する。抗体は、Fc領域を含むインタクトで完全または完全長の定常領域を含んでいてもよく、あるいは任意の短縮形態が抗原結合部分を含みかつ抗原結合能力を保持するように設けられた抗体の部分または断片を含むものであってもよい。このような短縮形態としては、例えば、開示された抗c−Fnの抗体のCDRまたは可変領域を含むFab断片、Fab’断片、またはF(ab’)2断片が挙げられる。さらに、そのような短縮抗体の形態は、LCVR及びHCVRをコードするDNAをリンカー配列でつなげることにより作成できる一本鎖Fv断片であってもよい(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,N.Y.,pp 269−315,1994参照)。本発明の抗体は、当該技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはこれらの技術と当該技術分野において容易に思いつく他の技術の組み合わせ、を用いて製造することができる。
2.1 抗体(ab)の開発および評価
我々は、いくつかの抗体開発方法を使用した。我々が試みた最初の2つの方法では、スクリーニング対象の抗原を認識可能な抗体が得られたが、しかしこれらの抗体のc−Fn分子全体に対する親和性は弱く、c−Fn分子全体を認識することはできなかった。追加として3つの方法を試みた。5つの異なる抗体開発手法を、抗体を生成するのに使用した抗原と共に、以下記載する。
−ペプチドA1を使用したABD Serotec HUCALライブラリのパニング
−p−Fn分子全体への結合に対してネガティブスクリーニングした、c−Fn分子全体に対するマウスの標準的な免疫法
−完全ED−A領域を使用したABD Serotec HUCALライブラリのパニング
−3種ペプチド混合物(B1,B2,B3)に対するマウスの標準的な免疫法
−ペプチドA2および完全ED−A領域に対するマウスの標準的な免疫法
−P4F6
−P3A3
−P1H11
−19B12−3H5
−市販のIST−9
2つの重要な理由のため、c−Fnに対して質の高い抗体を得るのは非常に困難である。c−Fnには存在するがp−Fnには存在しないED−A領域は、抗体結合にとって非常にありふれた領域というわけではない。加えて、このように結合のための領域が小さいので、c−Fnのみに特異的に高い親和性を有する抗体ペアを取得することが不可能である。よって、ELISAシステムにおける抗体の一つは、非特異的であろうと思われる。さらに、我々は、凍結融解サイクルで、c−fnが急速に劣化し、および/または、急速にED−A抗原性を失うことを発見した。
本発明は、以下の実施例に記載された特定の実施形態を参照してより良く理解されるであろう。
本実施例において、我々は、c−Fnの迅速な検査用に競合アッセイ様式を実施した。開発において、2つの基本的な競合アッセイ様式を用いた。1つの形式(図1の画像d)では、「試料」中の抗原は、磁性粒子に結合した抗体上の結合部位をめぐり、標識抗原と競合する。類似の様式(図1の画像c)では、「試料」中の抗原は、標識抗体上の結合部位をめぐり、磁性粒子に結合した抗原と競合する。両方の様式において、アッセイ応答は、試料中の抗原の量に逆相関する。
原材料
材料を、図2aおよび図2bに示す。プライマーペプチドは、Affinity Life Sciences,Inc.から入手した。
表1は、実施したビオチン化およびアルカリホスファターゼ結合をまとめたものである。cFn抗原のビオチン化は、PEG4ビオチンを用い、抗原:ビオチンのモル比を1:5、1:10、1:20、および1:50にして実施した。P4F6抗体のビオチン化は、PEG4ビオチンを用い、抗体:ビオチン比を1:5および1:20にして実施した。P1H1およびP3A3のビオチン化は、抗体でPEG4ビオチンを用い、抗体:ビオチン比を1:20にして実施した。アルカリホスファターゼ結合は、SMCCおよびSPDPヘテロ二官能性試薬を利用した酵素−抗体結合についてQualigenプロトコルに従い酵素アルカリホスファターゼ(ALP)を用いて実施した。
FASTPACK(登録商標)システムで使用する試薬パックを、フィラーIIに充填した。開発に際し、ビオチン化およびALP結合した試薬について複数の組み合わせを検査した。構成成分の概要は以下の通りである:
・ バッファー溶液中にALP結合体(抗原、ペプチドまたは抗体)を含む抗体溶液(100μL/pack)
・常磁性粒子(150μL/pack):バッファー溶液中に、ビオチン化抗原、ビオチン化ペプチド、またはビオチン化抗体のいずれかを含む、ストレプトアビジンに結合(カップリング)した0.5mg/mLのSpeedbead PMP(Seradyne)
・洗浄液(2.1mL/pack):洗浄剤入りトリスバッファー
・基質(140μL/pack):Immuglow Plus
スクリーニング試験
抗原、ペプチド、および抗体スクリーニング
ビオチン化抗原、ペプチド、および抗体を、対応する抗体、抗原およびペプチドアルカリホスファターゼ(ALP)結合体とペアにして、最適なアッセイ性能を生みだすペアの組み合わせを決定した。表3は、開発において検査した、ビオチンと結合体のペアについて詳しく説明するものである。ペアは、最大アッセイ応答および既知のcFn濃度を有するスパイクした試料の%相対置換(% relative displacement)について検査した。これらの分析の結果を、本報告に添付の付記1に詳述する。これらのスクリーニング評価から、以下の2組のペアを最終的な継続評価用に選択した:
1)EDA−Fcビオチン/P4F6抗体結合体
2)cFnビオチン/P4F6抗体結合体
安定性、応答、およびcFn抗原の%相対置換を最適化するために、様々なpHバッファー、洗浄剤、タンパク質、および他の添加剤を、cFn FASTPACK(登録商標)アッセイで検査した。ビオチン溶液を常磁性粒子(PMP)にカップリングするのにカップリングバッファーを使用し、ALP結合体を希釈するのに結合体バッファーを使用した。
カップリングバッファー:
#1)0.1M TBS pH8+0.1%Prionex+0.02%Tween20
#2)25mM PBS pH6+1%BSA+0.1%Prionex+0.02%Tween20
#3)25mM PBS pH6+0.1%Prionex+0.02%Tween20
#4)BBC pH8(トリス+3%BSA)+0.02%Tween20
#5)BBC pH8(トリス+3%BSA)+0.25mg/mL α−シクロデキストリン+0.02%Tween20
#6)BBC pH8(トリス+3%BSA)+5%トレハロース+0.02%Tween20
結合体バッファー;
#1)PBS pH6+1%BSA
#2)PBS pH6+0.1%Prionex
カップリングバッファー=25mM PBS pH6+0.1%Prionex+0.02%Tween20
結合体バッファー=PBS pH6+0.1%Prionex
既知の濃度の細胞フィブロネクチン(cFn)試料を様々なバッファー添加剤で処理し、cFnを含有しないブランクバッファーにより生じた応答と比較するアッセイで検査した。添加剤の2×ストック溶液を、PBS pH6バッファーで調製した。検査の直前に、試料(ブランクまたはcFn)を適切な2×ストックバッファーで1:2に希釈した。表5は、バッファー添加物および生じた応答を詳述するものである。
この試験は、試料の前処理としてSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を使用する効果を詳述するものである。SDSは、cFn結合の機会を増やすようにタンパク質の構造を変化させる能力があるため選択した。SDS2×ストックバッファーを、PBS pH6、0.1%Prionex、0.02%Tween−20バッファーで調製した。検査の直前に、試料を各SDSバッファーで1:2に希釈した。表6は、初期のSDS力価スクリーニングのデータを示す。表7は、狭いSDS力価でのスクリーニングのデータを示す。
アッセイおよび試料(対照)バッファーのpHを比較するため、2つの試験を詳述する。1つの試験では、PMPカップリング、結合体、および試料バッファーで使用したpH6および8のバッファーを比較した(表8)。もう1つの試験では、SDSを添加したpH4、5、および6の試料バッファーを比較した(表9)。
アッセイ応答を最適化し、結合体の不安定性による影響を低減するために、ヤギ抗マウスIgG(Fab’特異的)(GAM)ALPを検出酵素として用いて、ALP標識P4F6抗体(結合体)を非標識P4F6抗体と比較した。ALPが結合したP4F6抗体の安定性は決定されなかったが、日々変動することは観察された。表10は、この比較による詳細なデータを示す。
細胞フィブロネクチンに対するモノクローナル抗体を、Sigmaから購入し、アッセイで検査し、現在の抗cFnクローンP4F6抗体と比較した。両方の抗体は、ヤギ抗マウスIgG(Fab’)ALPを用いて検出した。アッセイ応答およびcFnの置換を比較した。表11は、この試験の結果を詳述するものである。
アッセイ応答及びcFnの置換を最適化するために、様々なアッセイインキュベーション時間を検査した。FASTPACK(登録商標)アッセイシステムは、2種類のインキュベーションを含む;1つ目は、試料/抗体インキュベーションであり、2つ目は、試料/抗体およびビオチンにカップリングさせたストレプトアビジンPMP免疫複合体の混合中に起こるインキュベーションである。表12は、検査したインキュベーションの組み合わせについてのアッセイ応答および置換比を示す。
以下は、最適化されたcFn競合様式のFASTPACK(登録商標)アッセイの概要である:
・抗体溶液(100μL/pack):P4F6抗cFnモノクローナル抗体(0.5μg/mL)およびヤギ抗マウスIgG(Fab’特異的)ALP(1:2000希釈)を含む、0.1%prionexおよび0.02%Tween20を含有するPBS pH6
・常磁性粒子(150μL/pack):0.1%prionexおよび0.02%Tween20を有するPBS pH6中に、cFnビオチン(2μg/mL)をカップリングさせた0.5mg/mLのSpeedbeadストレプトアビジンPMP(Seradyne)
・基質(140μL/pack):Immuglow Plus
・洗浄液(2.1mL/pack):洗浄剤入りのトリスバッファー
Prediction BioSciencesからQualigenに供給された材料ならびに購入された試薬を用いたところ、競合アッセイ様式でのcFnの免疫アッセイは、FASTPACK(登録商標)システム上で最適化され、その合計インキュベーション時間は約7分であった。
本実施例において、我々は、液体媒体中を自由に流動する常磁性ビーズを用いてc−Fnの迅速な検査のためのサンドイッチアッセイを実施した。実施した実験は、ビオチン−モノクローナル抗体、酵素アルカリホスファターゼにカップリングしたポリクローナル抗体の調製、アッセイの最適化、およびマスター検量線の作成である。また、アッセイの性能特性を、直線性、感度および不正確性について評価した。P4F6抗体が、ELISAシステムにおいて最良であることが証明されているが、これは、全ての迅速な流体免疫測定システムについて当てはまるわけではないので、3c−Fnモノクローナル抗体についても検査した。ヒト包皮線維芽細胞由来のフィブロネクチンを、Sigma Aldrich P/N F2518 L/N 031M4065Vから購入した。
・抗体溶液(100μL/pack):IgG−ビオチン(2.5μg/mL)およびRIgG−ALP(1.5μg/mL)を含む、安定剤および0.05%Tween20入りのPBSを含有するQualigen抗体溶液
・常磁性粒子(150μL/pack):3%BSAおよび0.02%Tween20入りのトリスバッファー中に、0.5mg/mLのSpeedビーズPMP(Seradyne)
・基質(140μL/pack):Immuglow Plus
・洗浄液(2.1mL/pack):洗浄剤入りトリスバッファー
本発明は、血液中の二量体糖タンパク質細胞フィブロネクチンについて15分未満の迅速な検査を可能にする。本発明の一態様では、細胞フィブロネクチンのEDA領域と結合する抗体が提供され、当該抗体は、細胞フィブロネクチンのEDA領域に対する親和性は高いが、血漿フィブロネクチンに対する親和性は少なくとも2桁少ない。本発明は、さらに、細胞性フィブロネクチンのEDA領域に対して生じる抗体を含む診断アッセイおよびキットを包含する。
本発明は、ヒト細胞フィブロネクチンを検出するための迅速なアッセイに関し、生体液中の細胞フィブロネクチンを検出および測定するために従来から開発されてきたELISAベースのアッセイでは実用的な臨床診断で使用するのに時間がかかりすぎていたという背景がある。このアッセイは、迅速な時間規模で、出血事象の予想を可能にする。また、高い親和性を有するヒトモノクローナル抗体、特に細胞フィブロネクチン(c−Fn)の同位体決定基に対する抗体、ならびにこれらの抗体の均等物および誘導体についても記載する。これらの抗体は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも100倍を超える親和性を持ってこれらの標的にそれぞれ結合し、そして様々な検出様式において30分未満で、いくつかの検出様式では15分未満で、c−Fnを検出するアッセイの作成を可能にする。これらの抗体は、診断、特に、出血事象の予測,疾患の予防および治療に有用である。
Claims (13)
- ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン(c−Fn)のレベルを60分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み:
(a)ヒト検査被験者から得られた検査試料を抗体および標準エピトープと混合すること、
ここで、前記抗体は、単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または抗体およびその抗原結合部分の両方であり、前記抗体は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも100倍を超える親和性を持ってc−Fnに結合し、当該抗体は、c−Fn分子のアミノ酸配列1631−1721(「EDA領域」)に結合する、
ここで、前記標準エピトープは
左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
i)DGEEDTAELQGLRPGSEC(配列番号1)、
ii)ESPQGQVSRYRVTYSSPEDC(配列番号2)、
iii)HDDMESQPLIGTQSC(配列番号3)、
および
iv)NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTA(配列番号4)
からなる群より選択されるアミノ酸配列から成る合成ポリペプチドであり;
ここで、(1)前記抗体もしくはその抗原結合部分は磁性粒子に結合し、かつ前記標準エピトープは標識されている、又は(2)前記標準エピトープは磁性粒子に結合し、かつ前記抗体もしくはその抗原結合部分は標識されており、
ここで、前記アッセイは、前記抗体が、前記検査試料においてc−Fn分子のEDA領域又は標準エピトープと免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記抗体がEDA領域及び標準エピトープに結合する場合、前記アッセイは、検査試料のc−Fn抗原のEDA領域が前記抗体上の結合部位をめぐり標識エピトープと競合する競合アッセイである;
(b)その後、前記抗体と、前記検査試料のc−FnのEDA領域又はi)、ii)、iii)、もしくはiv)の標準エピトープのいずれかとの複合体を形成し、磁性粒子に結合した標識エピトープもしくは磁性粒子に結合したその標識抗原結合部位の量を測定すること、
ここで、結合した標識抗原または結合した標識エピトープの量が、前記検査試料中のヒト細胞フィブロネクチンの量に逆相関し、前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、60分以内に起こる、
前記アッセイ。 - 前記検査試料のEDA領域又はi)、ii)、iii)、もしくはiv)の標識標準エピトープのいずれかと結合した標識抗体の量を20分以内で決定する、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- 前記被験者は、神経系疾患を有する、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- 前記検査被験者はアルツハイマー病又はパーキンソン病を有する、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- 前記アッセイは、液体媒体中を自由に流動する常磁性ビーズを用いる流体アッセイである、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- 前記単離したヒトモノクローナル抗体はIST−9もしくはIST−9の抗原結合部分、またはIST−9およびその抗原結合部分の両方である、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- 前記検査試料中においてc−Fnは0〜20mg/mlの範囲内にあると決定される、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン(c−Fn)のレベルを60分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み:
ヒト検査被験者から得られた検査試料を単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または当該抗体およびその抗原結合部分の両方と混合すること、ここで、当該抗体および/またはその抗原結合部分は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも100倍を超える親和性を持ってc−Fnに結合し、当該抗体および/またはその抗原結合部分(「捕捉抗体」)は、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
i)DGEEDTAELQGLRPGSEC(配列番号1)、
ii)ESPQGQVSRYRVTYSSPEDC(配列番号2)、
iii)HDDMESQPLIGTQSC(配列番号3)、
および
iv)NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTA(配列番号4)
からなる群より選択されるアミノ酸配列に結合し、
その後、前記捕捉抗体と前記検査試料のc−Fnとの複合体を形成し、当該複合体を、前記捕捉抗体に結合するコーティングされた常磁性粒子と混合し、そして前記検査試料中における複合体を検出すること;
ここで、前記アッセイは、前記捕捉抗体が、前記検査試料においてc−Fn分子と免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記検査試料中の複合体の量が前記検査試料中のc−Fnレベルを示し、これが前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、60分以内に起こる、
前記アッセイ。 - 前記抗体は標識されている、請求項1に記載の迅速なアッセイ。
- 前記捕捉抗体と前記検査試料のc−Fnとの複合体は、当該複合体に結合した標識抗体の量を検出することによりサンドイッチアッセイで検出される、請求項9に記載の迅速なアッセイ。
- 前記標識抗体は前記捕捉抗体またはc−Fnに結合する、請求項10に記載の迅速なアッセイ。
- ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン(c−Fn)のレベルを60分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み:
(a)ヒト検査被験者から得られた検査試料を抗体および標準エピトープと混合すること、
ここで、前記抗体は、単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または抗体およびその抗原結合部分の両方であり、前記抗体は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも100倍を超える親和性を持ってc−Fnに結合し、当該抗体は、c−Fn分子のアミノ酸配列1631−1721(「EDA領域」)に結合し、かつ標準エピトープに結合し、
ここで、前記標準エピトープは
左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGC(配列番号5)のアミノ酸配列から成る合成ポリペプチドであり;
ここで、前記アッセイは、前記抗体が、前記検査試料においてc−Fn分子のEDA領域または標識エピトープと免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記アッセイは、検査試料のc−Fn抗原のEDA領域が前記抗体上の結合部位をめぐり標識エピトープと競合する競合アッセイである;
(b)前記抗体と、前記c−FnのEDA領域または標準エピトープのいずれかとの複合体を形成すること;および、
(c)磁性粒子に結合した標識エピトープまたは磁性粒子に結合した標識抗体もしくはその標識抗原結合部位の量を測定すること、
ここで、磁性粒子に結合した標識抗原もしくは標識エピトープの量が、前記検査試料中のヒト細胞フィブロネクチンの量に逆相関し、前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、60分以内に起こる、
前記アッセイ。 - ヒト検査被験者から採取した検査試料中のヒト細胞フィブロネクチン(c−Fn)のレベルを60分以内で決定する、ヒト検査被験者における出血を予測するための迅速なアッセイであって、
前記検査試料は、全血、血清、および血漿試料からなる群から選択され、
前記アッセイは、以下の工程を含み:
(a)ヒト検査被験者から得られた検査試料を単離したヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分、または当該抗体およびその抗原結合部分の両方と混合すること、ここで、当該抗体および/またはその抗原結合部分は、血漿フィブロネクチンに対する親和性よりも少なくとも100倍を超える親和性を持ってc−Fnに結合し、当該抗体および/またはその抗原結合部分(「捕捉抗体」)は、
左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で、
TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGC(配列番号5)から成るアミノ酸配列に結合する:
(b)その後、前記捕捉抗体と前記検査試料のc−Fnとの複合体を形成すること;および、
(c)前記検査試料中における複合体を検出すること;
ここで、前記アッセイは、前記捕捉抗体が、前記検査試料においてc−Fn分子と免疫反応するために固体マトリクスに固定されることを必要とせず、
ここで、前記検査試料中の複合体の量が前記検査試料中のc−Fnレベルを示し、これが前記ヒト検査被験者における出血の予測因子となり、
ここで、前記得る、混合する、形成するおよび測定する工程は、60分以内に起こる、
前記アッセイ。
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