CN114062680A - 用于可溶性成纤维细胞生长因子受体的灵敏的多重免疫测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用多重微球技术来测量和检测生物样本中可溶性成纤维细胞生长因子受体（sFGFR）2、3和4的试剂盒和方法。

Description

用于可溶性成纤维细胞生长因子受体的灵敏的多重免疫测定

本申请是申请日为2013年12月17日，申请号为201380073634.3，发明名称为“用于可溶性成纤维细胞生长因子受体的灵敏的多重免疫测定”的发明专利的分案申请。

优先权申请

本申请要求2012年12月21日提交的美国申请61/740,466的优先权，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本文描述且受权利要求书保护的主题处于分析物检测领域，并且具体地，涉及用于测量和鉴定生物样本中可溶的或细胞外域的成纤维细胞生长因子受体的试剂盒和方法，所述受体包括2型受体、3型受体和4型受体(sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4)。

背景技术

癌变为多步过程，在此过程中，正常细胞通过积累多个基因突变并获得多个促进恶性表型的常见特征(常称为癌标志)而转化成癌细胞。六个经典的癌标志包括生长信号中的自给自足、对抗生长信号的不敏感、无限复制、细胞凋亡逃逸、持续的血管生成、以及侵入组织并形成癌细胞转移的能力(Hanahan,D.,Weinber,R.A.Cell 2000,100:57-70)。这些特征中的许多是由基因改变引起的，所述基因改变涉及关键癌基因的功能获得、扩增和/或过表达，以及瘤抑制因子的功能丧失、缺失和/或外基因沉默(Luo,J.,Solimini,N.L.,Elledge,S.J.Cell 2009,136:823-837)。例如，已在多种人癌中鉴定出许多改变和突变处于成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族内。这些突变导致FGFR信号传导反常或癌中受体过表达，所述癌包括乳腺癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤，以及尤其肺癌(Turner,N.,Grose,R.,Nat Rev Cancer.2010,10:116-129；Volm,M.,

R.,Mattern,J.,Stammler,G.Eur J Cancer.1997,33:691-693；Bergsagel,P.L.,Kuehl,W.M.JClin Oncol.2005,23：6333-6338。Trudel,S.,Stewart，A.K.，Rom，E.，Wei，E.，Li，Z.H.，Kotzer，S.，Chumakov，I.，Singer，Y.，Chang，H.，Liang，S.B.，Yayon，A.，Blood.2006，107：4039-4046)。

对于男性和女性而言，肺癌是癌症相关死亡的主要原因，并且2010年美国统计有157,300死亡例(Jemal，A.，Siegel，J.Xu，J.，Ward，E.CA Cancer J Clin.2010，60：277-300)。大多数肺癌病例(大约85％)归类为非小细胞肺癌(NSCLC)，在过去几十年中，肺癌幸存者的改善最小(American Cancer Society.Cancer Facts&Figures，2010，Atlanta，GA)。近来，由于对NSCLC中生长因子信号传导了解的提高，而兴起了把表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)作为目标的新型治疗方法。尽管EGFR抑制剂在未选择患者中表现出一些优势，但在EGFR中激活突变鉴定瘤亚群异常灵敏于EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Lynch，T.J.，Bell，D.W.，Sordella，R.，Gurubhagavatula，S.，Okimoto，R.A.，Brannigan，B.W.，Harris，P.L.，Haserlat，S.M.，Supko，J.G.，Haluska，F.G.，Louis，D.N.，Christiani，D.C.，Settleman，J.，Haber，D.A.N Engl J Med.2004，350：2129-2139；Shepherd，F.A.，Pereira，J.R.，Ciuleanu，T.，Eng，H.T.，Hirsh，V.，Thongprasert，S.，Campos，D.，Maoleekoonpiroj，S.，Smylie，M.，Martins，R.，Van Kooten，M.，Dediu，M.，Findlay，B.，Tu，D.，Johnston，D.，Bezjak，A.，Clark，G.，Santabárbara，P.，Seymour，L.N Engl JMed.2005，353：123-132)。类似地，对于患有NSCLC的某些患者，抗VEGF治疗方法产生了改善的结果(Sandler，A.，Gray，R.，Perry，M.C.，Brahmer，J.，Sehiller，J.H.，Dowlati，A.，Lilenbaum，R.，Johnson，D.H.N Engl J Med.2006，355：2542-2550)，尽管未达到定义抗VEGF疗效的预测生物标志(Ramalingam，S.S.，Belani，C.P.Curr Opin Oncol.2010，22：79-85)。NSCLC中EGFR和VEGF抑制剂的经验强调需要定义其他信号传导途径，所述其他信号传导途径涉及瘤进展、血管生成和对当前可用治疗方法的抵抗(Siegel，R.，Naishadham，D.，Jemal，A.CA Cancer J Clin.2012，62：10-29)。

成纤维细胞生长因子受体(FGFR)为涉及多个生理过程的跨膜酪氨酸激酶受体，所述多个生理过程包括血管生成、器官生成、组织发育和内分泌信号传导。结构上，FGFR由裂解的信号肽、三个免疫球蛋白(Ig)样域、酸性盒、跨膜域和分离的酪氨酸激酶域组成(Turner，N.，Grose，R.Nat Rev Cancer.2010，10：116-29；Beenken，A.，Mohammadi，M.NatRev Drug Discov.2009，8：235-253)。迄今为止，已鉴定出FGFR编码的四种基因，命名为FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。每种类型的FGFR的灵敏度和特异性不同。该体系通过可在FGFR1-3 mRNA中发生的延伸拼接而进一步复杂化，从而生成具有不同配体结合和信号转导活性的多种变体(Turner，N.，Grose，R.Nat Rev Cancer.2010，10：116-29；Beenken，A.，Mohammadi，M.Nat Rev Drug Discov.2009，8：235-253)。成纤维细胞生长因子(FGF)为FGFR的配体并由根椐细胞需要而释放的二十二种可溶性排泄肽组成。而且，FGF和FGFR产生使生长信号精确微调的极高数量的配体/受体组合。FGF信号传导的调节涉及多个机制，包括释放可溶形式的FGFR(sFGFR)，其由金属蛋白酶在细胞表面处的蛋白水解裂解而生成(Müllberg J，Althoff K，Jostock T，Rose-John S.Eur Cytokine Netw.2000，11：27-38)。这些受体的脱落提供了关于FGF信号传导下调和生物活性蛋白释放到循环的关键机制(Peschon J.J.，Slack J.L.，Reddy P.，Stocking K.L.，Sunnarborg，S.W.，Lee，D.C.，Russell，W.E.，Castner，B.J.，Johnson，R.S.，Fitzner，J.N.，Boyce，R.W.，Nelson，N.，Kozlosky，C.J.，Wolfson，M.F.，Rauch，C.T.，Cerretti，D.P.，Paxton，R.J.，March，C.J.，Black，R.A.Science.1998282：1281-2184)。

在过去二十年中，有显示癌患者中血液内存在相当高水平的可溶性FGFR受体的确凿证据(Hanneken，A.，Ying，W.，Ling，N.，Baird，A.Proc Natl Acad Sci.1994，91：9170-9174；Hanneken A.FEBS Lett.2001，489：176-181)，这表明在循环中监测这些受体的存在可能对于了解癌的进展和/或治疗方法至关重要。例如，C-末端截断的可溶形式的FGFR4由能在功能上调节FGF作用的人上皮乳腺癌细胞系表达(Ezzat，S，Zheng，L.，Yu，S.，Asa，S.L.Biochem Biophys Res Commun。2001,287：60-65)。此外，已在人鳞状癌细胞系中鉴定出另选拼接形式的FGFR3，其具有结合至FGF1和FGF2的潜力，如交联实验所示(Terada，M.，Shimizu，A.，Sato.N.，Miyakaze，S.I.，Katayama，H.，Kurokawa-Seo.M.Mol Cell Biol ResCommun.2001，4：365-373)。这些分泌的sFGFR的配体结合亲和力常类似于这些受体的膜结合形式，这表明它们的生物作用是通过与细胞表面受体竞争而调节配体的作用。

尽管这些研究中的一些已在血液或细胞培养基中鉴定出FGFR，而现有技术中使用的唯一方法为免疫印迹法(Hanneken，A.，Ying，W.，Ling，N.，Baird，A.Proc Natl AcadSci.1994，91：9170-9174；Hanneken A.FEBS Lett.2001，489：176-181)，这是一种非灵敏的、线性的或诊断的技术。因此，对经得起检验自动化的sFGFR的标准化、快速、精确和经济筛选的研发需求仍未被满足。由于可商购获得的

抗体可检测可溶形式的总FGFR2、FGFR3和FGFR4，故本申请人使用ELISA方法来研发类似于用于检测可溶性表皮生长因子受体的sFGFR的检测测定(Muller，V.，Witzel，I.，Pantel，K.，Krenkel，S.，Luck，H.J.，Neumann，R.，Keller，T.，Dittmer，J.，Janicke，F.，Thomssen，C.Anticancer Res.2006，26：1479-1487)。然而，因为DuoSet ELISA体系仅在所测定的生物样本中检测可溶性FGFR3(sFGFR3)，故其不令人满意。继而，本申请人将该测定转到Meso Scale Discovery形式以提高对可溶性FGFR2(sFGFR2)和FGFR4(sFGFR4)的检测灵敏度。然而，仍未检测到sFGFR2和sFGFR4。因此，成功研发出了检测生物样本中SFGFR2、SFGFR3和sFGFR4的完全不同的测定体系，该体系利用多重的、基于微球的平台。本文所公开的主题提供了用于检测生物样本中sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的试剂盒和方法。

发明内容

与无疾病的患者相比，癌症患者在他们的生物流体和组织中通常具有较高的可溶性FGF受体含量。本文所述的试剂盒和方法可使本领域的技术人员鉴定和定量此类患者中可溶性FGF受体的多个同种型并为鉴定和定量肿瘤患者中FGF含量提供基础。本文所述的本发明的另一个实施例也属于同时筛选sFGFR的多重微球技术。

实施例描述的方面中的第一方面为用于检测sFGFR的试剂盒。该试剂盒包含缀合至微球的特异性结合sFGFR的捕获抗体组合物。具有缀合的捕获抗体的微球具有约5μm的直径和两种荧光团。每种荧光团在光谱上不同于另一荧光团。该试剂盒还包含特异性结合sFGFR却不同于捕获抗体的检测抗体组合物，并且该检测抗体缀合至本领域中已知的适用于所述指定用途的任何可检测的标记。此外，该试剂盒可包含封闭缓冲液和孵育缓冲液。

第二实施例包括用于检测sFGFR2、sFGFR3和/或sFGFR4的某个预定义的阈值水平的试剂盒。优选地，此类水平在具有如下值的水平下检测：生物样本中至少0.14-494ng/mL的sFGFR2、0.23-74ng/mL的sFGFR3和0.33-123ng/mL的sFGFR4。该试剂盒包含缀合至微球的sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的捕获抗体和缀合至本领域中已知的检测标记的sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的检测抗体。该试剂盒还可包含封闭缓冲液和孵育缓冲液。

本文描述且受权利要求书保护的主题的第三实施例包括用于测量生物样本中sFGFR2、sFGFR3和/或sFGFR4的量的方法。该方法包括使生物样本与缀合在微球上的特异性结合sFGFR的捕获抗体组合物接触，使生物样本与偶联至本领域中已知的检测标记的特异性结合sFGFR的检测抗体组合物接触，测量由检测标记产生的信号，以及使所产生的信号的量与生物样本中sFGFR2、sFGFR3和/或sFGFR4的量相关联。

缩写

FGF 成纤维细胞生长因子

FGFR 成纤维细胞生长因子受体

FGFRs (多种)成纤维细胞生长因子受体

sFGFR 可溶性成纤维细胞生长因子受体

sFGFR2 可溶性成纤维细胞生长因子受体2

sFGFR3 可溶性成纤维细胞生长因子受体3

sFGFR4 可溶性成纤维细胞生长因子受体4

sFGFRs (多种)可溶性成纤维细胞生长因子受体

NSCLC 非小细胞肺癌

ADAM 去整合素

ELISA 酶联免疫吸附测定

MSD Meso Scale Discovery

EDTA 乙二胺四乙酸

BSA 牛血清白蛋白

LDD 最小可检测剂量

CV 变异系数

LLOQ 定量下限

RTKI 受体酪氨酸激酶抑制剂

VEGF 血管内皮生长因子

PDGFR 血小板衍生生长因子受体

定义

如本文所用，术语“试剂盒”是指试剂和其他材料的组合。试剂盒预期可包含试剂，诸如缓冲剂、蛋白稳定试剂、信号产生体系(例如，荧光信号生成体系)、抗体、对照蛋白、以及测试容器(例如，微量滴定板等)。术语“试剂盒”不旨在限于试剂和/或其他材料的特定组合。在一个实施例中，试剂盒还包含使用试剂的说明。测试试剂盒可以任何合适的方式包装，通常，其具有处于单个容器或(必要时)处于多个容器的成分以及用于进行测试的一张说明书。在一些实施例中，试剂盒还优选地包括阳性对照样本。可以本领域中已知的多种方法来制备试剂盒。

术语“生物样本”涵盖从生物体获得的多种样本类型，并且其可用于诊断或监测测定。该术语涵盖血液和其他生物源液体样本、固体组织样本，诸如活检标本或来源于其的组织培养物或细胞和其子代。该术语涵盖已在取得它们后以任何方式(诸如用试剂处理、溶解、或富集某些组分)操作的样本。该术语涵盖临床样本，并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样本。术语“生物样本”意在区分临床环境中的样本与可为重组样本或来源于重组样本的样本。

就本申请的意义而言，术语“捕获抗体”和“检测抗体”旨在涵盖以高亲和力与特异性sFGFR结合的那些抗体。

术语“抗体”在广义上使用，并且具体地，涵盖完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段(只要其表现出所需生物特性)。抗体可来源于任何物种且可为例如IgM、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。所需生物活性为与sFGFR的结合。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指制备的单分子组合物的抗体。单克隆抗体组合物显示出单一结合特异性以及对sFGFR特定表位的亲和力。

如本文所用，术语“多克隆抗体”是指不同的抗体分子的组合物，其能够与同一或不同抗原上的多个不同特异性抗原决定簇结合或反应。多克隆抗体的抗原特异性的变异度位于构成多克隆抗体的单个抗体的可变区中，具体地，位于互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3区。优选地，多克隆抗体通过用靶sFGFR或其部分免疫动物来制备。另选地，多克隆抗体可通过将具有所需靶sFGFR特异性的多个单克隆抗体混合来制备。

术语“特异性结合”是指两种分子间的结合，例如，抗原和抗体，其特征在于即使在存在许多其他不同分子情况下某一分子(抗原)与另一特异性分子(抗体)结合的能力，即，显示出在非均相分子混合物中优先将一种分子与另一种分子结合。

术语“微球”是指小的离散的固体载体。这些离散的固体载体可用于连接探针组，使得所述组中的每个单独探针彼此不同。微球组合物可依据例如形式、化学过程和/或连接方法和/或核酸合成方法而变化。示例性微球组合物包含固体载体，并且赋予其化学功能，用于多核苷酸、多肽和/或有机部分的合成中。此类组合物包含例如塑料，陶瓷，玻璃，聚苯乙烯，甲基苯乙烯，丙烯酸类聚合物，顺磁性材料，氧化钍溶胶，碳石墨，二氧化钛，胶乳或交联的右旋糖酐诸如琼脂糖，纤维素，尼龙，交联的胶束和Teflon^TM，以及任何其他材料。

如本文所用，术语“荧光团”是指可用于定量和检测sFGFR抗原的任何荧光化合物或荧光蛋白。

术语“灵敏度”本质上为本发明所述的多重测定正确鉴定最小浓度的特异性sFGFR的程度的量度。如本文所述，灵敏度定义为可准确回收80-120％的特异性sFGFR的最小可检测剂量(ng/mL)。

术语“缓冲液”是指缓冲溶液或水。缓冲液维持感兴趣分析物(例如，sFGFR)和分析物结合剂(例如，sFGFR抗体)之间的反应且不妨碍抗体/抗原相互作用。

如本文所用，术语“活体受检者”是指任何活生物体，包括人。

如本文所用，说明书中术语“一个”或“一种”可指一个(种)或多个(种)。如本文权利要求中所用，当与词语“包含(包括)”一起使用时，词语“一个”或“一种”可指一个(种)或多于一个(种)。如本文所用，“另一个”可指至少第二个或更多。

如本文所用，术语“包含(包括)”或变型诸如“含有”或“具有”可用于暗示包含所述元素或整体，或者元素或整体的组，但不排除任何其他元素或整体，或者元素或整体的组。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员一般理解相同的含义。

附图说明

图1：使用针对可溶性FGFR2、FGFR3和FGFR4研发的测定而建立的用于血清和血浆的校验参数。

图2：血清和血浆中浓度为7.8ng/mL、2.9ng/mL、1.7ng/mL和0.82ng/mL的FGFR2的加标-回收(N＝3)。

图3：血清和血浆中浓度为1.4ng/mL、0.57ng/mL、0.30ng/mL和0.15ng/mL的FGFR3的加标-回收(N＝3)。

图4：血清和血浆中浓度为2.2ng/mL、0.94ng/mL、0.54ng/mL和0.29ng/mL的FGFR4的加标-回收(N＝3)。

图5：下列物质的交叉反应性：捕获时FGFR3和FGFR4与抗FGFR2，捕获时FGFR2和FGFR4与抗FGFR3，以及捕获时FGFR2和FGFR3与抗FGFR4。

图6：标示浓度(ng/mL)对反算浓度(ng/mL)的FGFR2的标准曲线(N＝5)。

图7：标示浓度(ng/mL)对反算浓度(ng/mL)的FGFR3的标准曲线(N＝5)。

图8：标示浓度(ng/mL)对反算浓度(ng/mL)的FGFR4的标准曲线(N＝5)。

图9：在掺加低浓度、中浓度和高浓度分析物的运行之间的对照样本中FGFR2血清浓度的实验评定(N＝5)。

图10：在掺加低浓度、中等浓度和高浓度分析物的运行之间的对照样本中FGFR3血清浓度的实验评定(N＝5)。

图11：在掺加低浓度、中等浓度和高浓度分析物的运行之间的对照样本中FGFR4血清浓度的实验评定(N＝5)。

图12：血清(N＝3)和血浆(N＝3)中浓度为7.8ng/mL、2.9ng/mL、1.7ng/mL和0.82ng/mL的FGFR2，浓度为1.4ng/mL、0.57ng/mL、0.30ng/mL和0.15ng/mL的FGFR3，以及浓度为2.2ng/mL、0.94ng/mL、0.54ng/mL和0.29ng/mL的FGFR4的加标-回收数据。

图13：血浆、血清和高加标对照中FGFR2的稀释线性度数据。

图14：血浆、血清和高加标对照中FGFR3的稀释线性度数据。

图15：血浆、血清和高加标对照中FGFR4的稀释线性度数据。

图16：顶栏：用于在前列腺癌血清和肺癌血清建立较好范围的样本缓冲液。底栏：为了获得转移癌血清的较高信号而尝试的不同封闭缓冲液。

图17：前列腺癌(N＝5)和肺癌(N＝10)中FGFR2、FGFR3和FGFR4的参考范围。

具体实施方式

可溶性FGFR浓度的早期分析有利于了解癌的状态(治疗前和治疗后)并将有助于选择靶向FGFR的特定候选药物。此类分析也提出关于FGFR药物的作用模式的线索。因此，迫切需要对于FGFR灵敏和特异的合适的诊断测定。

尽管证明能成功检测其他可溶性生长因子受体，但先前尝试获得可靠检测sFGFR的多个同种型的合适的测定未能成功。令人惊奇的是，使用基于微球的多重免疫测定技术(具体地，本文和美国专利6,599,331、6,592,822和6,268,222中所述的“Luminex 100/200^TM”平台，研发出准确测量生物样本中sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的测定。基于微球的多重免疫测定技术为夹心测定。术语“夹心测定”是指其中抗原夹在两种结合试剂(通常为抗体)之间的免疫测定。第一结合试剂(捕获抗体)连接至微球，并且第二结合试剂(检测抗体)包含可检测基团。可检测基团的例子非限制地包括例如：荧色物、酶、结合第二结合试剂的表位(例如，当第二结合试剂/抗体为鼠抗体时，其通过荧光标记的抗鼠抗体而检测)，例如抗原或结合对中的成员诸如生物素。

聚苯乙烯微球为该测定的重要组分。这些微球小珠用两种光谱上不同的荧光团内部染色。使用精确比率的这些荧光团，创建由具有特定光谱位置的100种不同微球组组成的阵列。每种微球组可在其表面上具有不同的反应物。本申请中，反应物称为“捕获抗体”。因为微球组可通过它们的光谱位置来区分，故可将它们混合，从而使至多100种不同分析物在单个反应容器中同时测量。偶联至报道分子(本申请中称为“检测抗体”)的第三荧光团定量发生在微球表面处的生物分子相互作用。当微球被Luminex分析仪中两种独立激光穿过时，在快速流动的流体流中单独询问它们。根据样本反应，高速数字信号处理基于微球的光谱位置将微球归类并在表面上将反应定量在几秒内。

对于本文所述的测定，基于微球的多重免疫测定提供若干优势：

·由于不需要针对每种单个sFGFR的独立试剂盒，故测定成本廉价。

·由于一个试剂盒可测试多个sFGFR，故大大降低了运行测定所需生物样本的量。

·由于不需要预先处理或滴定生物样本，故测定的定量测量提供高的再现性。

鉴于这些原因，尽管能够在本发明背景下使用其他免疫测定诸如放射性免疫测定，仍优选基于微球的多重免疫测定。

实例

提供了以下非限制性实例来进一步说明本发明。本领域的技术人员将认识到以下实例中公开的技术符合发明人已发现在受权利要求书保护的发明实践中作用良好的代表方法，从而应被认为构成其实践模式的实例。然而，按照本公开，本领域的技术人员应认识到在不脱离本发明的实质和范围下，可对所公开的具体实施例进行多种改变而仍获得相似或类似的结果。

实例1：生物样本的采集和储存

由于sFGFR经蛋白水解裂解之后多数释放到循环中，故使用血液、血清和血浆样本[Bioreclamation，LLC(Westbury，NY)]来研发和校验多重免疫测定。由已在国家注册的采血师从自愿的健康志愿者的肘前区域采集血液样本并将该血液样本在450-500mL干燥采集袋中于冷藏库内过夜以凝结。在5℃下以2800xg离心二十分钟来分离血清。使用血浆提取装置将所分离的血清转移到转移袋中以确保无红血细胞污染。将人血浆采集在包含乙二胺四乙酸钾的采集袋中，缓慢混合五分钟并于室温下静置三十分钟。将该袋在5℃下以2800xg离心二十分钟。使用血浆提取装置将所分离的血浆转移到转移袋中以确保无红血细胞污染。在分离成冻存管中的等分试样之前，将人血清和人血浆二者在4℃下储存至多一周并将它们于-80℃冷冻直至使用。

实例2：多重免疫测定的研发

成功实施基于微球的多重免疫测定用于生物样本中sFGFR检测需要研发和优化规程。第一，必须鉴定出引起最高灵敏测定的试剂。评价的第一组试剂为用于sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的捕获和检测抗体对。探究了几种不同来源的的抗体；然而，由于列于表1中的抗体对使sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4检测的范围最大化，故将该抗体对用于多重体系中。

表1：用于建立FGFR2、FGFR3和FGFR4测定的捕获和检测抗体的组合。

所制备的该测定的下一组分为偶联捕获抗体的微球。将捕获抗体特异性羧化(《-COOH》)至5.6微米聚苯乙烯微球，如下所述：抗FGFR2羧化至小珠#(88)，抗FGFR3羧化至小珠#(16)，并且抗FGFR4羧化至小珠#(79)。这些区对应于使用Luminex 100/200^TM体系的100个潜在唯一染色区中的3个。使用专有缀合体系进行靶捕获抗体至聚苯乙烯微球的偶联，该体系使用与得自Bio-Rad Life Sciences(目录号171-406001)的

胺偶联试剂盒类似的程序。简而言之，经由涉及蛋白伯氨基基团和聚苯乙烯微球表面上结合的羧基官能团的碳二亚胺反应，得到了靶捕获抗体至羧化的聚苯乙烯微球的共价偶联。清洗之后除掉未结合的蛋白，共价连接即使在长期储存后仍为稳定的。根据制造商规程使用Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce，目录号21327)使sFGFR2和sFGFR3的检测抗体生物素酰化，而购买已连接生物素标记的sFGFR4的检测抗体。

评价的另一组试剂为用于样本稀释、封闭步骤和孵育的缓冲液。用于多重测定的典型缓冲液是基于PBS的或基于Tris的。孵育和稀释效果最好的缓冲液为含1％BSA的PBS，并且非特异性蛋白封闭效果最好的缓冲液为含1％牛γ球蛋白和免疫球蛋白G的PBS。

一旦制备出用于免疫测定的试剂，便使用之后的规程以定量生物样本中的FGFR2、sFGFR3和sFGFR4：

·对于所有三种sFGFR(每种分析物每孔1800个小珠)，在添加免疫球蛋白G的PBS中将5μL稀释的带标记的捕获抗体的微球与5μL由1％牛γ球蛋白组成的封闭剂(MPBiomedicals，Santa Ana，CA，目录号82041)混合。

·将该混合物添加到96孔平底微量滴定板。

·测试之前，使即将使用的样本在室温下即时解冻。

·将10μL以1∶5稀释于包含防腐剂(叠氮化钠)的4％BSA缓冲液中的标准物、定量对照、或血清添加到所述板，用移液管混合样本，并且在孵育所述板一小时而无需震动。

·将10μL生物素酰化的检测抗体(对于所有三种分析物，稀释于含防腐剂的1％BSA缓冲液以得到3μg/mL的终浓度)添加到每个孔，完全混合，并且在室温下孵育一小时。

·将10μL稀释至100μg/mL的链霉亲和素-藻红素添加到每个孔，完全混合，并且于室温下孵育三十分钟。

·将过滤膜微量滴定板用100μL含叠氮化钠的基于BSA的洗涤缓冲液预先润湿，之后经由真空歧管装置抽吸。

·将平底微量滴定板中的反应内容物转移到过滤板的相应孔。真空抽吸所有孔，并且用100μL洗涤缓冲液洗涤内容物两次。

·最终洗涤之后，向每个孔添加100μL洗涤缓冲液，并且通过充分混合来重悬所述微球。

·然后，在使用专有分析软件的Luminex 100/200^TM阅读器上分析所述板。对于每块板，使用专有软件针对每种sFGFR创建标准曲线。sFGFR2和sFGFR3的标准曲线使用5参数逻辑回归，并且sFGFR4的标准曲线使用4参数逻辑回归。

实例3：多重免疫测定的统计校验

基于美国食品和药物管理局的指导方针(美国卫生和人类服务部，药物评价与研究中心(CDER)，以及兽药中心(CVM)，行业指南，生物分析方法校验，2001年5月，http：//www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf)，研发了需要全部校验sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4多重免疫测定的校验程序。该程序包括最佳样本基质、测定选择性、通过标准曲线确定的线性范围、最小可检测剂量(LDD)、定量下限(LLOQ)、精度、绝对回收率、稀释线性度、基质干扰、冷冻/解冻稳定性、室温下稳定性和参考范围的评定(图1)。

血浆和血清样本的比较：由于在测定中使用血液来测量sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的含量，故比较血浆或血清以鉴定最佳生物基质。如图2、图3和图4所示，当测定血清时，sFGFR回收一致地为最佳的。因此，血清为用于进一步校验分析的最终选择的基质。尽管适于目的的校验也将需要建立鉴定基质的最佳选择，本发明所述的多重免疫测定方法也可用于其他生物样本(脑脊液、尿液、淋巴液、唾液、汗液、胸膜液、滑液、房水、泪液、胆汁、胰腺分泌物)。

测定选择性：由于在同一样本孔中测试FGFR2、sFGFR3和sFGFR4，故探知三种分析物之间无显著交叉反应性至关重要。为了研究交叉反应性，对最高浓度的sFGFR3和sFGFR4信号进行FGFR2捕获抗体测试。类似地，对所有其他组合进行评价，并且仅在FGFR4捕获抗体和最高浓度sFGFR2之间发现1.6％交叉反应性(图5)。

标准曲线：使用可从R&D Systems Duosets获得的总FGFR2α标准物(部件号841650)，总FGFR3标准物(部件号841879)和总FGFR4标准物(部件号842742)(分别为目录号DYC665、DYC766和DYC685)来生成标准曲线。每种sFGFR的标准曲线通过首先在鱼血清/BSA缓冲液中创建三种标准物的高标准混合物而制得：对于FGFR2为100ng/mL，对于FGFR3为15ng/mL，并且对于FGFR4为25ng/mL。通过对37μL每种标准物添加88μL标准稀释剂来对该高标准物进行一连串七次的稀释。FGFR2、FGFR3和FGFR4的标准曲线范围分别为100ng/mL-0.020ng/mL，15ng/mL-0.003ng/mL和25ng/mL-0.005ng/mL。在每块板上运行每种分析物的标准曲线，并且将所述值平均，计算出运行之间的CV％(图6、图7和图8)。FGFR2、sFGFR3和sFGFR4的平均CV分别为8.38％、6.38％、5.13％，表明该曲线在板与板之间的变异很小。

最小可检测剂量：可区分99％置信度的空白的最低分析物浓度被认为是最小可检测剂量(LDD)。LDD通过对来自标准曲线空白的20个平行测定的信号进行平均并向平均空白信号添加三个标准偏差来计算。

定量下限(LLOQ)：定量下限(LLOQ)为可准确检测的最低标准。为了适于LLOQ定义，标准必须为线性的，落在30％CV的测定范围内，并且当掺入基质中时必须回收75-125％。LLOQ通过在三次运行中运行一式三份的两倍稀释的低标准物来确定。将标准物5-8稀释两倍并一式三份在三次不同运行中测定。计算CV并将CV对浓度作图。经计算从该曲线图内推并乘以稀释因子的LLOQ对于sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4分别为0.53ng/mL、0.084ng/mL和0.15ng/mL。如所提及的，LLOQ浓度下回收75-125％的分析物至关重要。然而，对于sFGFR2，浓度低于0.82ng/mL的样本未能成功回收。经确定0.82ng/mL的血清(N＝3)的平均回收率为85.67％。未能成功回收浓度低于0.15ng/mL的FGFR3样本，并且掺加sFGFR3的血清样本(N＝3)的平均回收率为103.3％。未能成功回收浓度低于0.17ng/mL的FGFR4样本，并且掺加sFGFR3的血清样本(N＝3)的平均回收率为101.3％。最后，确定sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的LLOQ分别为0.82ng/mL、0.15ng/mL、0.17ng/mL(表2)。

表2：FGFR2、FGFR3和FGFR4的LLOQ和动态范围。

分析物	单位	LLOQ	动态范围
				FGF-R2	ng/ml	0.82	0.10-494
FGF-R3	ng/ml	0.15	0.015-74
				FGF-R4	ng/ml	0.17	0.025-123

精度：测定的精度通过在最少五次运行中测量两份中三种水平的对照来在一个运行内(批内测定CV)和一系列运行中(批间测定CV)确定。sFGFR2对照的平均值为1.3、9.3和35ng/mL，批间测定CV在8-13％范围内，并且批内测定CV在1-11％范围内(图9)。sFGFR3对照的平均值为0.117、2.8和14ng/mL，批间测定CV在8-13％范围内，并且批内测定CV在0-16％范围内(图10)。sFGFR4对照的平均值为0.095、4.1和23ng/mL，批间测定CV在3-33％范围内，并且批内测定CV在1-21％范围内(图11)。sFGFR4的上限稍高于30％，这是21％高CV的一个不良运行的结果。高CV的原因在于样本的平均浓度为0.095ng/mL，其比sFGFR4的LLOQ低得多。

绝对回收率：为了确定每种sFGFR的回收％，将血清掺加四种浓度的标准物sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4并以一式三份进行分析。通过从加标浓度减去基准值并将所得结果除以加标浓度再乘以100来计算回收％。观测到sFGFR2的平均回收率在76-126％(N＝3)范围内，sFGFR3的平均回收率在89-143％(N＝3)范围内，并且sFGFR4的平均回收率在81-145％(N＝3)范围内(图2、图3、图4和图12)。

稀释线性度：可读取的样本偶尔高于每种分析物的测定上限。为了获得正确值，探知样本在测定缓冲液中线性稀释且具有70-130％内的回收％至关重要。将样本在测定缓冲液中稀释两倍，以1∶5从初始样本开始，并随后稀释至1∶10、1∶20和1∶40的终浓度。稀释线性度测试在纯正常血清和血浆样本中进行，但所计算的这些样本的sFGFR浓度低于该测定的LLOQ。最初将混合正常人血清掺加重组sFGFR，随后稀释至1∶10、1∶20和1∶40的终浓度。可用对于sFGFR2为109％，对于sFGFR3为109％且对于sFGFR4为96％的平均回收％将掺加的血清样本成功稀释至1∶40(图13，图14和图15)。

基质干扰：不论存在于样本中的常见组分诸如血红素、胆红素或三甘油酯是否会在多重测定中引入误差，均应进行基质干扰测量。通过向对照样本中掺加血红素(至多500mg/dL)、胆红素(至多20mg/dL)和三甘油酯(至多500mg/dL)并确定加标样本对未加标样本中观测到的回收％来评价基质干扰。掺加血红素(至多500mg/dL)、胆红素(至多20mg/dL)和三甘油酯(至多500mg/dL)之后的回收％分别对于sFGFR2为89％、91％和117％，对于sFGFR3为88％、90％和107％，并且对于sFGFR4为85％、89％和117％。

稳定性：分析期间，样本会经历多个冷冻-解冻循环；因此，在多个冷冻-解冻循环之后评定分析物稳定性至关重要，并且确定4℃下的稳定性同样至关重要。通过对至多三个循环的冷冻-解冻而测定血清样本来确定冷冻-解冻稳定性，并且确定每个样本的回收％。此外，通过对每个样本的室温和4℃孵育24小时测试，血清样本也是稳定的。连同未孵育的样本测试孵育的样本，并且确定回收％。

简而言之，血清(N＝3)掺加重组标准物，并且测量每个样本的基线浓度。使样本经历三个冷冻-解冻循环，并且通过比较基线样本来计算回收％。血清(N＝3)三个冷冻-解冻循环的平均回收％对于sFGFR2为90.11％，对于FGFR3为84.11％，并且对于FGFR4为89.00％。样本(N＝3)也在4℃下2小时、4小时和24小时时间点处以及在室温下4小时和24小时时间点处评定它们的抗原稳定性。血清(N＝3)在室温下以及4℃下24小时内的平均回收％对于sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4为83.93％、83.33％和89.87％。

实例4：测定应用

评定了测定检测癌样本中sFGFR的能力。图16示出了当用于分析癌血清的样本缓冲液包含4％BSA且封闭缓冲液包含去污剂NP-40时获得的测定中最佳sFGFR信号。选择最佳缓冲液之后，检测了十五种不同的癌样本：五种前列腺癌样本和十种肺癌样本(图17)。从这十五种样本中，仅可在四种样本中检测到在0.007-0.41ng/mL范围内可测量量的sFGFR2。有趣的是，sFGFR3可以0.015-1.2ng/mL的测量范围对所有十五种样本测得。此外，sFGFR4以在0.07-4.4ng/mL范围内的最高浓度存在于所有样本中。

Claims (12)

1.一种用于检测生物样本中可溶性成纤维细胞生长因子受体2(sFGFR2)、sFGFR3和sFGFR4的试剂盒，所述试剂盒包含：

a) 缀合至微球的sFGFR2捕获抗体和缀合至检测标记的sFGFR2检测抗体，其中sFGFR2捕获抗体和sFGFR2检测抗体在0.14-494ng/mL之间的线性动态范围内检测sFGFR2；

b) 缀合至微球的sFGFR3捕获抗体和缀合至检测标记的sFGFR3检测抗体，其中sFGFR3捕获抗体和sFGFR3检测抗体在0.023-74ng/mL之间的线性动态范围内检测sFGFR3；和

c) 缀合至微球的sFGFR4捕获抗体和缀合至检测标记的sFGFR4检测抗体，其中sFGFR4捕获抗体和sFGFR4检测抗体在0.033-123ng/mL之间的线性动态范围内检测sFGFR4。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述生物样本选自血液、血清、尿液、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴液、唾液、汗液、胸膜液、滑液、泪液、胆汁和胰腺分泌物。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中：

a) sFGFR2捕获抗体是鼠抗人FGFR2单克隆抗体；

b) sFGFR3捕获抗体是鼠抗人FGFR3单克隆抗体；和

c) sFGFR4捕获抗体是鼠抗人磷酸化FGFR4多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中：

a) sFGFR2检测抗体是鼠抗人FGFR2单克隆抗体；

b) sFGFR3检测抗体是鼠抗人FGFR3单克隆抗体；和

c) sFGFR4检测抗体是鼠抗人FGFR4多克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述微球缀合至两种荧光团。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中两种荧光团为红色荧光团和红外荧光团。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述微球具有约5µm的直径。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述试剂盒还包含封闭缓冲液和孵育缓冲液。

9.可溶性成纤维细胞生长因子受体2(sFGFR2)捕获抗体、sFGFR2检测抗体、sFGFR3捕获抗体、sFGFR3检测抗体、sFGFR4捕获抗体和sFGFR4检测抗体在制备用于测量生物样本中sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4水平的试剂盒中的用途，其中：

a) sFGFR2捕获抗体缀合至微球，sFGFR2检测抗体缀合至检测标记，并且sFGFR2捕获抗体和sFGFR2检测抗体在0.14-494ng/mL之间的线性动态范围内检测sFGFR2；

b) sFGFR3捕获抗体缀合至微球，sFGFR3检测抗体缀合至检测标记，并且sFGFR3捕获抗体和sFGFR3检测抗体在0.023-74ng/mL之间的线性动态范围内检测sFGFR3；和

c) sFGFR4捕获抗体缀合至微球，sFGFR4检测抗体缀合至检测标记，并且sFGFR4捕获抗体和sFGFR4检测抗体在0.033-123ng/mL之间的线性动态范围内检测sFGFR4。

10.根据权利要求9所述的用途，其中：

a) sFGFR2捕获抗体是鼠抗人FGFR2单克隆抗体；

b) sFGFR3捕获抗体是鼠抗人FGFR3单克隆抗体；和

c) sFGFR4捕获抗体是鼠抗人磷酸化FGFR4多克隆抗体。

11.根据权利要求10所述的用途，其中：

a) sFGFR2检测抗体是鼠抗人FGFR2单克隆抗体；

b) sFGFR3检测抗体是鼠抗人FGFR3单克隆抗体；和

c) sFGFR4检测抗体是鼠抗人FGFR4多克隆抗体。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的试剂盒用于测量生物样本中sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的量的用途，包括：

a). 使生物样本与sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4捕获抗体接触；

b). 使生物样本与sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4检测抗体接触；

c). 测量由检测标记产生的信号；和

d). 使c)中产生的信号与生物样本中sFGFR2、sFGFR3和sFGFR4的量相关联。

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