JP2016504590A - 可溶型線維芽細胞増殖因子受容体の高感度多重イムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年12月21日出願の米国特許出願第61/740,466号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の全容を参照によって本明細書に援用するものである。
本明細書に述べられ、特許請求される主題は、被測定物質検出の分野のものであり、詳細には、生体試料中の、2型、3型、及び4型受容体(sFGFR2、sFGFR3及びsFGFR4)をはじめとする線維芽細胞増殖因子受容体の可溶性又は細胞外ドメインを測定及び同定するためのキット並びに方法に関する。
本明細書で使用される用語「キット」は、試薬及び他の材料の組合わせのことを指す。キットは、緩衝剤、タンパク質安定化試薬、シグナル生成システム(例えば蛍光シグナル生成システム)、抗体、コントロールタンパク質、及び試験容器(例えばマイクロタイタープレートなど)を含むことが考えられる。「キット」なる用語は、試薬及び/又は他の材料の特定の組合わせに限定されるものではない。一実施形態では、キットは、試薬を使用するための使用説明書を更に含む。試験キットは、任意の適当な態様で、通常は、必要に応じて1個の容器又は異なる容器に入れられた各要素が、試験を実施するための1枚の使用説明書とともにパッケージングされていてよい。幾つかの実施形態では、キットは、ポジティブコントロール試料も含んでいることが好ましい。キットは、当該技術分野で周知の様々な方法で製造することができる。
・それぞれ個々のsFGFRについて別のキットが必要とされないため、アッセイのコストが安価である。
・1つのキットで複数のsFGFRを試験できることから、アッセイを行うのに必要な生体試料の量が大幅に低減される。
・生体試料の前処理又は力価測定が必要とされないため、アッセイの定量測定の再現性が高い。
sFGFRは大部分がタンパク質分解的切断後に循環中に放出されることから、血液、血清、及び血漿試料(Bioreclamation社(ニューヨーク州ウェストベリー))を用いて多重免疫測定の開発及び検証を行った。同意を得た健常者の前腕前部の場所から、州の資格免許を有する瀉血技術者によって血液試料を採取し、450〜500mLの乾燥採血バッグに入れ、冷蔵庫内で一晩凝固させた。27N(2800×G)、5℃で20分間遠心して血清を分離した。分離した血清を、赤血球が混入しないように血漿抽出装置を使用してトランスファーバッグに移した。ヒト血漿を、カリウムーEDTAが入ったコレクションバッグ中に回収し、5分間穏やかに混合し、30分間室温で静置した。各バッグを27N(2800×g)、5℃で20分間遠心した。分離した血漿を、赤血球が混入しないように血漿抽出装置を使用してトランスファーバッグに移した。これらのヒト血清及びヒト血漿を両方とも、4℃で最大1週間保存した後、分取物アリコートに分けてクライオチューブに入れ、使用時まで−80℃で保存した。
生体試料中のsFGFRを検出するためのマイクロスフェアに基づく多重免疫測定の効果的な実施には、プロトコールの開発及び最適化が必要である。最初に、最も感度の高いアッセイが得られる試薬を特定する必要がある。評価を行った第1の試薬のセットは、sFGFR2、sFGFR3、及びsFGFR4に対する捕捉及び検出抗体のペアである。いくつかの異なる抗体のソースについて調べたが、表1に示される抗体のペアが、sFGFR2、sFGFR3、及びsFGFR4の最良の検出範囲を与えたことから、多重システムにおいて使用した。
・3種類のsFGFRのすべてについて、希釈した捕捉抗体標識されたマイクロスフェア5μL(各被測定物質当たり各ウェル当たり1800個のビーズ)を、免疫グロブリンGを加えたPBSに1%ウシγグロブリン(MP Biomedicals社、カリフォルニア州サンタアナ、カタログ番号:82041)を含むものからなるブロッカー5μLと混合した。
・この混合物を96ウェル平底マイクロタイタープレートに加えた。
・使用する試料を試験の直前に室温で解凍した。
・10μLのスタンダード、クオリティーコントロール、又は、保存剤(アジ化ナトリウム)を含む4% BSAバッファーに1:5で希釈した血清をプレートに加え、各試料をピペットで混合し、プレートを室温で1時間、振盪せずにインキュベートした。
・10μLのビオチン標識検出抗体(3種類の被測定物質のすべてについて、保存剤を含む1% BSAバッファーに、3μg/mLの最終濃度にまで希釈したもの)を各ウェルに加え、よく混合し、室温で1時間インキュベートした。
・100μg/mLに希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリン10μLを各ウェルに加え、よく混合し、室温で30分間インキュベートした。
・フィルターメンブレンマイクロタイタープレートを、アジ化ナトリウムを含むBSA系洗浄バッファー100μLで予め濡らした後、真空マニホールド装置で吸引した。
・平底マイクロタイタープレート中の反応内容物をフィルタープレートのそれぞれのウェルに移した。すべてのウェルを真空吸引し、内容物を100μLの洗浄バッファーで2回洗った。
・最後の洗浄後、100μLの洗浄バッファーを各ウェルに加え、よく混合することによってマイクロスフェアを再懸濁した。
・次いで、独自技術の分析ソフトウェアを用いたLuminex 100/200(商標)リーダーでプレートを分析した。各プレートについて、独自技術のソフトウェアを用いて各sFGFRの標準曲線を作成する。sFGFR2及びsFGFR3の標準曲線では5変量ロジスティック回帰を用い、sFGFR4の標準曲線では4変量ロジスティック回帰を用いる。
アメリカ食品医薬品局の指針(U.S.Department of Health and Human Services,Center for Drug Evaluation and Research(CDER),and Center for Veterinary Medicine(CVM).Guidance for Industry.Bioanalytical method validation.May 2001.http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf)に基づき、sFGFR2、sFGFR3、及びsFGFR4多重免疫測定の完全な検証を行う検証プログラムを開発した。このプログラムは、最良の試料マトリックス、アッセイ選択性、標準曲線により決定される直線性範囲、最小検出可能用量(LDD)、定量下限(LLOQ)、精度、絶対回収率、希釈直線性、マトリックス干渉、凍結/解凍安定性、室温安定性、及び基準範囲の評価を含むものである(図1)。
がん試料中のsFGFRを検出するアッセイの能力を評価した。図16は、アッセイにおける最良のsFGFRシグナルは、がん血清の分析用の試料バッファーが4% BSAを含み、ブロッキングバッファーが洗剤であるNP−40を含んでいる場合に得られた。最良のバッファーの選択後、5個の前立腺がん試料、及び10個の肺がん試料からなる15個の異なるがん試料を調べた(図17)。これら15個の試料のうち、sFGFR2が、4個の試料においてのみ、0.007〜0.41ng/mLの範囲の測定可能な量で検出することができた。興味深い点として、sFGFR3が、0.015〜1.2ng/mLの範囲の測定値で15検体の試料すべてで測定することができた。更に、sFGFR4はすべての試料中に存在し、0.07〜4.4ng/mLの範囲の最も高い濃度であった。
Claims (19)
- 生体試料中の可溶型線維芽細胞増殖因子受容体(sFGFR)を検出するためのキットであって、
マイクロスフェアにコンジュゲートされたsFGFRと特異的に結合する捕捉抗体組成物と、
検出標識にコンジュゲートされたsFGFRと特異的に結合する検出抗体組成物とを含み、
前記生体試料中で0.14〜494ng/mLのsFGFR2、0.023〜74ng/mLのFGFR3、及び0.033〜123ng/mLのFGFR4が検出される、
前記キット。 - 前記生体試料が、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸液、滑液、涙液、胆汁、膵臓分泌からなる群から選択される、請求項1に記載のキット。
- 前記sFGFRが、sFGFR2、sFGFR3、又はsFGFR4である、請求項2に記載のキット。
- 前記捕捉抗体組成物が、FGFR2と特異的に結合する捕捉抗体、FGFR3と特異的に結合する捕捉抗体、及びFGFR4と特異的に結合する捕捉抗体を含む、請求項3に記載のキット。
- 前記捕捉抗体が、
マウス抗ヒトFGFR2モノクローナル抗体、
マウス抗ヒトFGFR3モノクローナル抗体、及び
マウス抗ヒトFGFR4モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項4に記載のキット。 - 前記検出抗体組成物が、FGFR2と特異的に結合する検出抗体、FGFR3と特異的に結合する検出抗体、及びFGFR4と特異的に結合する検出抗体を含む、請求項5に記載のキット。
- 前記検出抗体が、
マウス抗ヒトFGFR2モノクローナル抗体、
マウス抗ヒトFGFR3モノクローナル抗体、及び
マウス抗ヒトFGFR4モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項6に記載のキット。 - 前記マイクロスフェアが、2種類のフルオロフォアにコンジュゲートされる、請求項6に記載のキット。
- 前記マイクロスフェアにコンジュゲートされた2種類のフルオロフォアが赤色と赤外領域とのフルオロフォアである、請求項8に記載のキット。
- 前記マイクロスフェアが約5μmの直径を有する、請求項9に記載のキット。
- ブロッキングバッファー及びインキュベーションバッファーを更に含む、請求項10に記載のキット。
- 生体試料中のsFGFR2、sFGFR3、及びsFGFR4を検出するためのキットであって、
マイクロスフェア上にコンジュゲートされたマウス抗ヒトFGFR2モノクローナル抗体と、
マイクロスフェア上にコンジュゲートされたマウス抗ヒトFGFR3モノクローナル抗体と、
マイクロスフェア上にコンジュゲートされたマウス抗ヒトリン酸化FGFR4ポリクローナル抗体と、
検出標識にコンジュゲートされたマウス抗ヒトFGFR2モノクローナル抗体と、
検出標識にコンジュゲートされたマウス抗ヒトFGFR3モノクローナル抗体と、
検出標識にコンジュゲートされたマウス抗ヒトFGFR4ポリクローナル抗体とを含み、
前記生体試料中で0.14〜494ng/mLのsFGFR2、0.023〜74ng/mLのFGFR3、及び0.033〜123ng/mLのFGFR4が検出される、
前記キット。 - ブロッキングバッファー及びインキュベーションバッファーを更に含む、請求項12に記載のキット。
- 試料中のsFGFRを測定する方法であって、
a.前記試料を提供することと、
b.請求項13のキットを使用して前記試料中のsFGFRを測定することとを含む、
前記方法。 - 前記試料が生きた対象から得られる、請求項14に記載の方法。
- 生体試料中のsFGFR2、sFGFR3、及び/又はsFGFR4の量を測定するための方法であって、
a.前記生体試料を、マイクロスフェア上にコンジュゲートされたsFGFR2、sFGFR3、及び/又はsFGFR4と特異的に結合する捕捉抗体組成物と接触させることと、
b.前記生体試料を、検出標識に連結されたsFGFR2、sFGFR3、及び/又はsFGFR4と特異的に結合する検出抗体組成物と接触させることと、
c.前記検出抗体によって発生されるシグナルを測定することと、
d.前記cで発生されたシグナルの量を、前記生体試料中のsFGFR2、sFGFR3、又はsFGFR4の量と関連付けることとを含む、
前記方法。 - 最小検出感度が、
sFGFR2について0.14ng/mLであり、
sFGFRについて0.023ng/mLであり、
sFGFRについて0.033ng/mLである、請求項16に記載の方法。 - 前記生体試料が、血液、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸液、滑液、涙液、胆汁、膵臓分泌からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 各マイクロスフェアが約5μmの直径を有する、請求項18に記載の方法。
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