RS58147B1 - Senzitivni višestruki imunotest za rastvorljive receptore faktora rasta fibroblasta - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmet koji se ovde opisuje i navedeni zahtevi je iz oblasti kojom se detektuju analiti i specifično se odnosi na kitove i postupke merenja i identifikovanja rastvorljivih ili vanćelijskih domena receptora faktora rasta fibroblasta uključujući tipove 2, 3, i 4 (sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4) u biološkim uzorcima.

Stanje tehnike

[0002] Karciogeneza je višestepeni proces u kome se normalne ćelije transformišu u ćelije kancera akumulacijom nekoliko genskih mutacija i dobijanjem nekoliko zajedničkih karakteristika koje promovišu maligni fenotip, koji je često naznačeno obeležje kancera. Šest klasičnih oznaka kancera uključuju samoodrživost u vezi sa signalima rasta, neosetljivost na anti-signale rasta, neograničenu replikaciju, izbegavanje apoptoze, postojanu angiogenezu, i sposobnost invazije u tkiva i obrazovanje metastaza (Hanahan, D., Weinber, R.A. Cell 2000, 100 : 57-70). Mnoge od ovih karakteristika su prouzrokovane genskim izmenama koje uključuju sticanje funkcije, umnožavanje, i/ili prekomernu ekspresiju ključnih onkogena zajedno sa gubitkom funkcije, delecijom, i/ili epigenetičkim utišavanjem tumorskih supresora (Luo, J., Solimini, N.L., Elledge, S.J. Cell 2009, 136 :823-837). Na primer, identifikovano je nekoliko izmena i mutacija u okviru familije receptora faktora rasta fibroblasta (FGFRs) kod različitih humanih kancera. Ove mutacije prouzrokuju deregulaciju signalnih puteva FGFR ili prekomernu ekspresiju receptora u kancerima uključujući kancer grudi, bešike, želuca, prostate, debelog creva, multiplog mijeloma, i posebno kancera pluća (Turner, N., Grose, R., Nat Rev Cancer.2010, 10:116-129; Volm, M., Koomägi, R., Mattern, J., Stammler, G. Eur J Cancer.1997, 33:691-693; Bergsagel, P.L., Kuehl, W.M. J Clin Oncol.2005, 23: 6333-6338. Trudel, S., Stewart, A.K., Rom, E., Wei, E., Li, Z.H., Kotzer, S., Chumakov, I., Singer, Y., Chang, H., Liang, S.B., Yayon, A., Blood.2006,107: 4039-4046).

[0003] Kancer pluća je vodeći uzrok smrtnosti koja je povezana sa kancerom i kod muškaraca i kod žena, i obuhvata 157,300 smrtnih slučajeva u 2010 u Sjedinjenim Američkim Državama (Jemal, A., Siegel, J. Xu, J., Ward, E. CA Cancer J Clin. 2010, 60 : 277-300). Većina slučajeva kancera pluća (približno 85%) su klasifikovani kao nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) kod koga je preživljavanje minimalno unapređeno u poslednjih nekoliko decenija (American Cancer Society. Cancer Facts & Figures, 2010, Atlanta, GA).

Nedavno, su se pojavili novi tretmani koji ciljaju receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR) i vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) na osnovu boljeg razumevanja signalnih puteva faktora rasta u NSCLC. Pored toga što inhibitori EGFR ispoljavaju neka korisna svojstva kod neodabranih pacijenata, aktivirajuće mutacije u EGFR identifikuju podset tumora koji su izuzetno osetljivi na EGFR tirozin kinazne inhibitore (Lynch, T.J., Bell, D.W., Sordella, R., Gurubhagavatula, S., Okimoto, R.A., Brannigan, B.W., Harris, P.L., Haserlat, S.M., Supko,J.G., Haluska, F.G., Louis, D.N., Christiani, D.C., Settleman, J., Haber, D.A.N Engl J Med.2004, 350: 2129-2139; Shepherd, F.A., Pereira, J.R., Ciuleanu, T., Eng, H.T., Hirsh, V., Thongprasert, S., Campos, D., Maoleekoonpiroj, S., Smylie, M., Martins, R., Van Kooten, M., Dediu, M., Findlay, B., Tu, D., Johnston, D., Bezjak, A., Clark, G., Santabárbara, P., Seymour, L. N Engl J Med.2005, 353 : 123-132.). Slično, anti-VEGF tretman proizvodi poboljšani ishod za određene pacijente sa NSCLC (Sandler, A. , Gray, R., Perry, M.C., Brahmer, J., Schiller, J.H., Dowlati, A., Lilenbaum, R., Johnson, D.H. N Engl J Med. 2006, 355 : 2542-2550.), pored toga što je bilo manje uspešno definisanje predviđenih biomarkera sa anti-VEGF terapeutskom efikasnosti (Ramalingam, S.S., Belani, C.P. Curr Opin Oncol. 2010, 22 : 79-85). Iskustvo sa EGFR i VEGF inhibitorima u NSCLC naglašava potrebu da se definišu drugi signalni putevi koji su uključeni u progresiju tumora, angiogenezu, i rezistenciju na trenutno dostupne tretmane (Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. CA Cancer J Clin.2012, 62: 10-29).

[0004] Receptori faktora rasta fibroblasta (FGFRs) su transmembranski tirozin kinazni receptori koji su uključeni u brojne fiziološke procese uključujući angiogenezu, organogenezu, razvoj tkiva, i endokrinu signalizaciju. Strukturno, FGFRs se sastoje iz signalnog peptida koji se iseca, tri domena slična imunoglobulinu (Ig), kiselim boksom, transmembranskim domenom, i podeljenim tirozin kinaznim domenom (Turner, N., Grose, R. Nat Rev Cancer. 2010, 10 : 116-29; Beenken, A., Mohammadi, M. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8: 235-253). Do sada, identifikovana su četiri gena koja kodiraju FGFRs koja su poznata pod imenom FGFR1, FGFR2, FGFR3, i FGFR4. Svaki tip FGFR se razlikuje u senzitivnosti i specifičnosti. Sistem se dodatno komplikuje obimnim spajanjem koje može da se desi u molekulima FGFR1-3 iRNK, pri čemu nastaju brojne varijante sa različitim aktivnostima vezivanja liganda i transdukcije signala (Turner, N., Grose, R. Nat Rev Cancer.2010, 10 :116-29; Beenken, A., Mohammadi, M. Nat Rev Drug Discov.2009, 8: 235-253). Faktori rasta fibroblasta (FGFs) su ligandi za FGFRs i sastoje se iz dvadeset dva rastvorljiva sekretovana peptida, koji se oslobađaju u zavisnosti od ćelijskih potreba. Zajedno, FGFs i FGFRs stvaraju izuzetno visok broj kombinacija liganda/receptora koji omogućavaju precizno fino podešavanje signala rasta. Regulacija FGF signalizacije uključuje nekoliko mehanizama uključujući oslobađanje rastvorljivih oblika FGFRs (sFGFRs), koji se dobijaju proteolitičkim isecanjem na ćelijskoj površini pomoću metaloproteaza (Müllberg J, Althoff K, Jostock T, Rose-John S. Eur Cytokine Netw. 2000, 11: 27-38). Uklanjanje ovih receptora obezbeđuje ključni mehanizam smanjene regulacije FGF signalizacije i oslobađanja biološki aktivnih molekula u krvotok (Peschon J.J., Slack J.L., Reddy P., Stocking K.L., Sunnarborg, S.W., Lee, D.C., Russell, W.E., Castner, B.J., Johnson, R.S., Fitzner, J.N., Boyce, R.W., Nelson, N., Kozlosky, C.J., Wolfson, M.F., Rauch, C.T., Cerretti, D.P., Paxton, R.J., March, C.J., Black, R.A. Science.1998, 282: 1281-2184).

[0005] Tokom prošlih dvadeset godina sve je više dokaza koji pokazuju da je postojanje rastvorljivih FGFR receptora u krvi na posebno visokom nivou kod pacijenata koji imaju kancer (Hanneken, A., Ying, W., Ling, N., Baird, A. Proc Natl Acad Sci.1994, 91: 9170-9174; Hanneken A. FEBS Lett.2001, 489: 176181), što ukazuje da praćenje prisustva ovih receptora u krvi može da bude važno za razumevanje progresije i/ili tretmana kancera. Na primer, C-terminalno prekinuti rastvorljivi oblik FGFR4 je eksprimiran od strane ćelijskih linija humanog epitelnog kancera grudi koje funkcionalno moduliraju delovanje FGF (Ezzat, S, Zheng, L., Yu, S., Asa, S.L. Biochem Biophys Res Commun. 2001,287: 60-65). Dodatno, alternativno spojeni oblici FGFR3 su identifikovani u humanoj ćelijskoj liniji skvamoznog karcinoma, koja ima kapacitet da vezuje FGF1 i FGF2, kao što je prikazano eksperimentima unakrsnog povezivanja (Terada, M., Shimizu, A., Sato. N., Miyakaze, S.I., Katayama, H., Kurokawa-Seo. M. Mol Cell Biol Res Commun.2001, 4: 365-373). Afiniteti vezivanja liganda ovih sekretovanih sFGFRs su često slični receptorima koji su vezani za membranu, što ukazuje na to da je njihova biološka uloga u modulisanju delovanja liganda pomoću kompeticije sa receptorima na ćelijskoj površini.

[0006] Iako su FGFRs u nekim od ovih studija identifikovani u krvi ili ćeljskom medijumu, jedini postupak koji se koristi u stanju tehnike je imunoblotovanje (Hanneken, A., Ying, W., Ling, N., Baird, A. Proc Natl Acad Sci. 1994, 91: 9170-9174 ; Hanneken A.FEBS Lett. 2001, 489: 176-181), postupak koji nije senzitivan, linearan, ili dijagnostički. Prema tome, postoji nezadovoljena potreba za razvijanje standardizovanog, brzog, preciznog, i ekonomskog skrininga sFGFR, koji je podložan automatizaciji. S obzirom da su komercijalno dostupna DuoSet® antitela dostupna za detekciju rastvorljivih oblika ukupnih FGFR2, FGFR3, i FGFR4 prijavioci su koristili ELISA postupak za razvijanje testa za detekciju sFGFRs koji je sličan onome koji se koristi za detekciju rastvorljivih receptora epidermalnog faktora rasta (Muller, V., Witzel, I., Pantel, K., Krenkel, S., Luck, H.J., Neumann, R., Keller, T., Dittmer, J., Janicke, F., Thomssen, C. Anticancer Res. 2006, 26 : 1479-1487). Međutim, DuoSet ELISA sistem nije bio zadovoljavajući zbog toga što se u testiranim biološkim sistemima detekuje samo rastvorljivi FGFR3 (sFGFR3). Prijavioci su zatim preneli test na Meso Scale Discovery format da bi se povećala osetljivost detekcije za rastvorljivi FGFR2 (sFGFR2) i FGFR4 (sFGFR4). Međutim, sFGFR2 i sFGFR4 su ostali nedetektovani. Prema tome, razvijen je potpuno različit sistem testiranja da bi se SFGFR2, SFGFR3, i sFGFR4 detektovali u biološkim uzorcima, koji koristi višestruku platformu koja je zasnovana na mikrosferama. Ovde opisani predmet obezbeđuje kitove i postupke za detekciju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 u biološkim uzorcima.

Suština pronalaska

[0007] Predmetni pronalazak je usmeren na kit za detekciju rastvorljivih receptora faktora rasta (sFGFRs) u biološkom uzorku, koji sadrži:

kompoziciju antitela za hvatanje konjugovanih na mikrosferi koja specifično vezuju sFGFRs; i kompoziciju antitela za detekciju konjugovanih sa obeleživačem za detekciju koja specifično vezuju sFGFRs;

gde se 0,14 - 494 ng/mL sFGFR2, 0,023 - 74 ng/mL FGFR3, i 0,033 - 123 ng/mL FGFR4 detektuje u biološkom uzorku;

gde kompozicija antitela za hvatanje sadrži antitelo za hvatanje koje specifično vezuje FGFR2, antitelo za hvatanje koje specifično vezuje FGFR3, i antitelo za hvatanje koje specifično vezuje FGFR4; i

gde kompozicija antitela za detekciju sadrži antitelo za detekciju koje specifično vezuje FGFR2, antitelo za detekciju koje specifično vezuje FGFR3, i antitelo za detekciju koje specifično vezuje FGFR4.

[0008] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na postupak za merenje količine sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 u biološkom uzorku, koji obuhvata:

a. dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa kompozicijom antitela za hvatanje konjugovanih na mikrosferi koja specifično vezuju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4;

b. dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa kompozicijom antitela za detekciju spojenih sa obeleživačem za detekciju koja specifično vezuju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4;

c. merenje signala koji proizvodi obeleživač za detekciju;

d. dovođenje u korelaciju signala proizvedenog u c. sa količinom sFGFR2, sFGFR3 ili sFGFR4 u biološkom uzorku.

[0009] Pacijenti koji imaju kancer obično imaju veći sadržaj rastvorljivog FGF receptora u njihovim biološkim tečnostima i tkivima u poređenju sa pacijentima koji nisu oboleli. Ovde opisani kitovi i postupci omogućuju stručnjacima iz oblasti tehnike da identifikuju i kvantifikuju višestuke izooblike rastvorljivih FGF receptora kod takvih pacijenata i obezbeđuju osnovu za identifikovanje i kvantifikovanje sadržaja FGF kod onkoloških pacijenata. Drugo izvođenje ovde opisanih pronalazaka takođe se odnosi na tehnologiju višestrukih mikrosfera za istovremeni skrining sFGFRs.

[0010] Kit iz predmetnog pronalaska se koristi za detekciju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4. Kit sadrži kompoziciju antitela za hvatanje, koja sadrži antitelo za hvatanje koje specifično vezuje sFGFR2, antitelo za hvatanje koje specifično vezuje sFGFR3, i antitelo za hvatanje koje specifično vezuje sFGFR4 koji je konjugovan sa mikrosferom. Mikrosfera koja ima konjugovano antitelo za hvatanje ima prečnik od oko 5 µm i dve fluorofore. Svaka fluorofora se spektralno razlikuje od druge fluorofore. Kit dalje sadrži kompoziciju antitela za detekciju, koja sadrži antitelo za detekciju koje specifično vezuje sFGFR2, antitelo za detekciju koje specifično vezuje sFGFR3, i antitelo za detekciju koje specifično vezuje sFGFR4 koje je konjugovano sa bilo kojim obeleživačem koji može da se detektuje koji je poznat iz oblasti tehnike i koji je pogodan za opisanu namenjenu svrhu. Dalje, kit može da sadrži pufer za blokiranje i pufer za inkubaciju.

[0011] Kit iz predmetnog pronalaska detektuje prethodno određene nivoe praga sFGFR2, sFGFR3 i/ili sFGFR4, gde se prethodno određeni nivoi praga 0,14 - 494 ng/mL sFGFR2, 0,023 - 74 ng/mL sFGFR3, i 0,033 – 123 ng/mL sFGFR4 detektuju u biološkom uzorku. Poželjno, takvi nivoi se detektuju na nivoima koji imaju vrednosti prema sledećim: najmanje 0,14-494 ng/mL sFGFR2, 0,23-74 ng/mL sFGFR3, i 0,33-123 ng/mL sFGFR4 u biološkom uzorku. Kit sadrži antitela za hvatanje sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 konjugovana sa mikrosferama i antitela za detekciju sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 konjugovana sa obeleživačem za detekciju koji je poznat iz oblasti tehnike. Kit dalje može da sadrži pufer za blokiranje i pufer za inkubaciju.

[0012] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na postupak merenja sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 u biološkom uzorku. Postupak sadrži dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa kompozicijom antitela za hvatanje koje specifično vezuje sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 konjugovanih na mikrosferi, dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa kompozicijom antitela za detekciju koje specifično vezuje sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 spojenim sa obeleživačem za detekciju koji je poznat u oblasti tehnike, merenjem signala koji je proizveden od strane obeleživača za detekciju i dovođenja u korelaciju proizvedenog signala sa količinom sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 u biološkom uzorku.

Skraćenice

[0013]

FGF faktor rasta fibroblasta

FGFR receptor faktora rasta fibroblasta

FGFRs receptori faktora rasta fibroblasta

sFGFR rastvorljivi faktor rasta fibroblasta

sFGFR 2 rastvorljivi receptor 2 faktora rasta fibroblasta

sFGFR3 rastvorljivi receptor 3 faktora rasta fibroblasta

sFGFR4 rastvorljivi faktor rasta fibroblasta 4

sFGFRs rastvorljivi receptori faktora rasta fibroblasta

NSCLC nesitnoćelijski karcinom pluća

ADAMs adamalizin

ELISA enzyme-linked immunosorbant assay – enzimski vezani imunosorbentni test

MSD Meso Scale Discovery – Ultra-senzitivna detekciona platforma

EDTA etilendiaminotetrasirćetna kiselina

BSA albumin iz seruma govečeta

LDD najmanja doza koja se može detektovati

CV koeficijent varijacije

LLOQ najniža granica kvantifikacije

RTKI inhibitori tirozinskih kinaznih receptora

VEGFs faktori rasta vaskularnog endotela

PDGFRs receptori faktora rasta izvedeni iz trombocita

Definicije

[0014] Termin "kit" kao što se ovde koristi se odnosi na kombinaciju reagenasa i drugih materijala. Smatra se da kit može da uključi reagense kao što su puferi, reagensi za stabilizovanje proteina, sisteme za proizvodnju signala (npr., sistemi za dobijanje signala fluorescencije), antitela, kontrolne proteine, kao i kontejnere za izvođenje testova (npr., mikrotitarske ploče, itd.). Nije namenjeno da termin "kit" bude ograničen na određenu kombinaciju reagenasa i/ili druge materijale. U jednom izvođenju, kit dalje sadrži uputstva za upotrebu reagenasa. Kit za izvođenje testova može da bude spakovan na bilo koji pogodan način, obično sa elementima u jednom kontejneru ili različitim kontejnerima po potrebi zajedno sa stranicama koja sadrže uputstva za izvođenje testa. U nekim izvođenjima, kitovi takođe poželjno uključuju uzorak pozitivne kontrole. Kitovi mogu da se proizvedu različitim načinima koji su poznati u oblasti tehnike.

[0015] Termin "biološki uzorak" obuhvata brojne tipove uzoraka koji se dobijaju iz organizma i mogu da se koriste u dijagnostičkom ili testu praćenja. Termin obuhvata krv i druge tečne uzorke biološkog porekla, čvrste tkivne uzorke, kao što je primer uzorka za biopsiju ili tkivnih kultura ili ćelija koje se dobijaju iz njih i njihovog potomstva. Termin obuhvata uzorke kojima se manipuliše na bilo koji način posle njihovog nabavljanja, kao što je tretman sa reagensima, solubilizacija, ili obogaćivanjem za određene komponente. Termin obuhvata klinički uzorak, i takođe uključuje ćelije u kulturi ćelija, ćelijske supernatante, ćelijske lizate, serum, plazmu, biološke tečnosti, i tkivne uzorke. Termin "biološki uzorak" je namenjen da napravi razliku između uzorka u kliničkom smislu od uzorka koji može da bude rekombinovani uzorak ili koji može da se dobije iz rekombinovanog uzorka.

[0016] Termini "antitelo za hvatanje" i "antitelo za detekciju" u smislu predmetne prijave su namenjeni da obuhvate ona antitela koja se visokim afinitetom vezuju za specifičan sFGFR.

[0017] Termin "antitelo" se koristi u najširem smislu i specifično pokriva intaktna monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) koja se obrazuju iz najmanje dva intaktna antitela, i fragmenata antitela sve dok oni ispoljavaju željena biološka svojstva. Antitelo može da se dobije iz bilo kojih vrsta i može da bude IgM, IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4), IgD, IgA, ili IgE, na primer. Željena biološka aktivnost je vezivanje sFGFR.

[0018] Termin "monoklonsko antitelo" kao što se ovde koristi se odnosi na dobijanje antitela jedne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela prikazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop sFGFRs.

[0019] Termin "poliklonsko antitelo" kao što se ovde koristi se odnosi na kompoziciju različitih molekula antitela koji mogu da se vezuju sa ili reaguju sa nekoliko različitih specifičnih antigenskih varijanti na istim ili različitim antigenima. Varijabilnost u antigenskoj specifičnosti poliklonskog antitela se nalazi u varijabilnim regionima individualnih antitela koji čine poliklonsko antitelo, posebno u regionima koji određuju komplementarnost (CDR)1, CDR2 i CDR3. Poželjno, poliklonsko antitelo se dobija imunizacijom životinje sa ciljnim sFGFR ili njegovim porcijama. Alternativno, poliklonsko antitelo može da se dobije mešanjem multiplih monoklonskih antitela koja imaju željene specifičnosti sa ciljnim sFGFR.

[0020] Termin "specifično vezivanje" se odnosi na vezivanje između dva molekula, na primer, antigena i antitela, koje se karakteriše sposobnošću molekula (antigena) da se vezuje sa drugim specifičnim molekulom (antitelom) čak i u prisustvu mnogih drugih različitih molekula, tj., da bi se pokazalo preferencijalno vezivanje jednog molekula sa drugim u heterogenoj smeši molekula.

[0021] Termin "mikrosfera" se odnosi na malu čvrstu površinu potpore. Ove diskretne čvrste potpore mogu da se koriste za vezivanje populacije proba kao što se svaka individualna proba u populaciji razlikuje od druge. Kompozicija mikrosfere može da se razlikuje, u zavisnosti od, na primer, formata, hemije i/ili postupka vezivanja i/ili od postupka sinteze nukleinske kiseline. Primeri kompozicija koje sadrže mikrosfere uključuju čvrste potpore, i hemijske funkcionalne grupe koje su im date, koje se koriste u sintezi polinukleotida, polipeptida i/ili organskog ostatka. Takve kompozicije uključuju, na primer, materijale od plastike, keramike, stakla, polistirena, metilstirena, akrilnih polimera, paramagnetnih materijala, torijum sol, ugljeničnog grafita, titanijum dioksida, lateksa ili umreženih dekstrana kao što je sefaroza, celuloza, najlon, umrežene micele i Teflon™, kao i bilo koji drugi materijali.

[0022] Termin "fluorofora" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koje fluorescentno jedinjenje ili protein koji može da se koristi u kvantifikovanju i detekciji sFGFR antigena.

[0023] Termin "senzitivnost" je u suštini mera koliko dobro višestruki test koji je opisan u predmetnom pronalasku ispravno identifikuje sFGFR na njegovoj minimalnoj koncentraciji. Kao što se ovde opisuje, senzitivnost se definiše kao najmanja detektabilna doza (ng/mL) specifičnog sFGFR koji može precizno dati odgovor u procentu regeneracije između 80-120%.

[0024] Termin "pufer" se odnosi ili na puferovani rastvor ili na vodu. Pufer podržava reakciju između analita od interesa (npr., sFGFR) i sredstva za vezivanje analita (npr., sFGFR antitelo) i ne interferira sa interakcijom antitela/sa antigenom.

[0025] Termin "živi subjekt" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koji živi organizam, uključujući čoveka.

[0026] Termini koji označavaju jedninu kao što se u specifikaciji ovde koriste, mogu da označe jedan ili više. Kao što se ovde koristi u zahtevu(ma), kada se koriste zajedno sa reči "koji sadrži", reči koje označavaju jedninu mogu da znače jedan ili više od jednog. Kao što se ovde koristi "drugi" može da znači najmanje drugi ili više.

[0027] Termin "sadrže," ili varijacije kao što su "sadrži" ili "koji sadrži," kao što se ovde koristi može da se koristi da implicira uključivanje navedenog elemenata ili broja ili grupe elemenata ili brojeva, ali ne isključuje bilo koji drugi element ili broj ili grupu elemenata ili brojeva.

[0028] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što razume onaj koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike sa kojim je ovaj pronalazak povezan.

Kratak opis slika

[0029]

Slika 1: Parametri validacije uspostavljeni za serum i plazmu upotrebom testa razvijenog za rastvorljivi FGFR2, FGFR3, i FGFR4.

Slika 2: Obogaćena regeneracija za FGFR2 na koncentracijama 7, 8, 2,9, 1,7, i 0,82 ng/mL u serumu i plazmi (N=3).

Slika 3: Obogaćena regeneracija za FGFR3 na koncentracijama 1,4, 0,57, 0,30, i 0,15 ng/mL u serumu i plazmi (N=3).

Slika 4: Obogaćena regeneracija za FGFR4 na koncentracijama 2,2, 0,94, 0,54, i 0,29 ng/mL u serumu i plazmi (N=3).

Slika 5: Unakrsna reaktivnost: FGFR3 i FGFR4 sa anti-FGFR2 za hvatanje, FGFR2 i FGFR4 sa anti-FGFR3 za hvatanje, i FGFR2 i FGFR3 sa anti-FGFR4 za hvatanje

Slika 6: Standardne krive (N=5) za FGFR2 sa nominalnom koncentracijom u ng/mL u odnosu na ponovo izračunate koncentracije u ng/mL.

Slika 7: Standardne krive (N=5) za FGFR3 sa nominalnom koncentracijom u ng/mL u odnosu na ponovo izračunate koncentracije u ng/mL.

Slika 8: Standardne krive (N=5) za FGFR4 sa nominalnom koncentracijom u ng/mL u odnosu na ponovo izračunate koncentracije u ng/mL.

Slika 9: Eksperimentalna procena koncentracije FGFR2 u serumu u kontrolnim uzorcima preko izvođenja obogaćenih sa niskim, srednjim, i visokim koncentracijama analita (N=5).

Slika 10: Eksperimentalna procena koncentracije FGFR3 u serumu u kontrolnim uzorcima preko izvođenja obogaćenih sa niskim, srednjim, i visokim koncentracijama analita (N=5).

Slika 11: Eksperimentalna procena koncentracije FGFR4 u serumu u kontrolnim uzorcima preko izvođenja obogaćenih sa niskim, srednjim, i visokim koncentracijama analita (N=5).

Slika 12: Podaci u serumu (N=3) i plazmi (N=3) u koncentracijama 7,8, 2,9, 1,7, i 0,82 ng/mL za obogaćeni regenerisani FGFR2, u koncentracijama 1,4, 0,57, 0,30, i 0,15 ng/mL za FGFR3 i koncentracijama 2,2, 0,94, 0,54, i 0,29 ng/mL za FGF R4.

Slika 13: Podaci linearnosti pri razblaženju za FGFR2 u plazmi, serumu i visoko-obogaćenoj kontroli Slika 14: Podaci linearnosti pri razblaženju za FGFR3 u plazmi, serumu i visoko-obogaćenoj kontroli Slika 15: Podaci linearnosti pri razblaženju za FGFR4 u plazmi, serumu i visoko-obogaćenoj kontroli Slika 16: Gornji Panel: Puferovani uzorci koji se koriste za uspostavljanje boljeg opsega u serumu kancera prostate i serumu kancera pluća. Donji Panel: Upotrebljeni različiti puferi za blokiranje kako bi se dobio veći signal za serum metastatskog kancera.

Slika 17: Referentni opseg za FGFR2, FGFR3, i FGFR4 u kanceru prostate (N=5); i kanceru pluća (N=10).

Detaljni opis pronalaska

[0030] Rana analiza koncentracija rastvorljivih FGFR je korisna za razumevanje statusa kancera (pre i posle tretmana) i može da pomogne u odabiru specifičnih kandidata lekova koji ciljaju FGFRs. Takva analiza takođe može da ostavi utisak u vezi sa načinom delovanja FGFR leka. Prema tome, neophodno je da se ima odgovarajući dijagnostički test, koji je senzitivan i specifičan za FGFRs.

[0031] Prethodni pokušaji da se dobije pogodan test koji pouzdano detektuje brojne izooblike sFGFR nisu uspeli pored toga što su se pokazali uspešnim u detekciji drugih rastvorljivih receptora faktora rasta. Iznenađujuće, upotreba tehnologije višestrukog imunotesta koji se zasniva na mikrosferi (specifično "Luminex 100/200™" platformi koja se ovde opisuje i u U.S. Patent Nos. 6,599,331, 6,592,822, i 6,268,222, mogućila je razvijanje testa kojim se sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 precizno meri u biološkim uzorcima. Tehnologija višestrukog imunotesta koji se zasniva na mikrosferi je sendvič test. Termin "sendvič test" se donosi na imunotest u kome se antigen nalazi u sendviču između dva vezujuća reagensa, koja su obično antitela. Prvi vezujući reagens (antitelo za hvatanje) se vezuje za mikrosferu i drugo vezujuće sredstvo (antitelo za detekciju) sadrži grupu koja može da se detektuje. Primeri grupa koje mogu da se detektuju uključuju, na primer i bez ograničenja: fluorohrome, enzime, epitope za vezivanje drugog sredstva za vezivanje (kao primeri, kad je drugo sredstvo za vezivanje/antitelo je mišje antitelo, koje se detektuje fluorescento obeleženim anti-mišjim antitelom), na primer antigenom ili članom vezujućeg para, kao što je biotin.

[0032] Polistirenske mikrosfere su važne komponenete ovog testa. Ove mikrosferne kuglice su u unutrašnjosti obojene sa fluorofore koje se razlikuju u spektru. Upotrebom preciznih odnosa ovih fluorofora, kreirani su nizovi koji se sastoje iz 100 različitih setova mikrosfera sa specifičnim spektralnim adresama. Svaki set mikrosfera može da sadrži različiti reaktant na njegovoj površini. U ovoj prijavi, reaktant je naznačen sa "antitelom za hvatanje". Zbog toga što setovi mikrosfera mogu da se razlikuju pomoću njihovih spektralnih adresa, oni mogu da se kombinuju, čime se omogućuje istovremeno merenje 100 različitih analita u jednom reakcionom sudu. Treća fluorofora koja je spojena sa reporterskim molekulom - u ovoj prijavi naznačenim sa "antitelom za detekciju" – kvantifikuje biomolekulsku interakciju koja se događa na površini mikrosfere. Mikrosfere se pojedinačno ispituju u brzom protoku tečnosti kako prolaze kroz dva zasebna lasera u Luminex analizatoru. Obrada digitalnog signala visoke brzine klasifikuje mikrosfere na osnovu njihove spektralne adrese i u nekoliko sekundi kvantifikuje reakciju na površini po reakciji uzorka.

[0033] Za ovde opisane testove, višestruki imunotest zasnovan na mikrosferi nudi nekoliko prednosti :

• Troškovi izvođenja testa nisu skupi zbog toga što nije potreban odvojeni kit za svaki individualni sFGFR.

• S obzirom da jedan kit može da testira više sFGFRs, količina neophodnog biološkog materijala za izvođenje testa je značajno smanjena.

• Kvanitativna merenja testa nude visoku reproducibilnost zbog toga što nije potrebna prethodna obrada ili titrovanje biološkog uzorka. Iz ovih razloga, iako drugi imunološki testovi, kao što je radioimunotest mogu da se koriste u kontekstu predmetnog pronalaska, poželjan je višestruki imunotest koji se zasniva na mikrosferi.

PRIMERI

[0034] Sledeći primeri koji ne ograničavaju su obezbeđeni kako bi dalje ilustrovali predmetni pronalazak. Stručnjacima iz oblasti tehnike je jasno da ovde prikazani postupci u primerima koji slede predstavljaju pristupe za koje su pronalazači pronašli da pri izvođenju navedenih pronalazaka dobro funkcionišu, i prema tome treba smatrati da predstavljaju primere načina za njihovo izvođenje. Međutim, stručnjaci iz oblasti tehnike treba, u vezi sa predmetnim pronalaskom, da razumeju da mogu da se naprave mnoge promene u prikazanim specifičnim izvođenjima i još uvek mogu da se dobiju isti ili slični rezultati bez odstupanja od obima pronalaska.

PRIMER 1: Sakupljanje i skladištenje bioloških uzoraka

[0035] S obzirom da se sFGFRs uglavnom oslobađaju u krvotok posle proteolitičkog isecanja, koriste se uzorci krvi, seruma i plazme [Bioreclamation, LLC (Westbury, NY)] za razvijanje i validaciju višestrukog imunološkog testa. Uzorci krvi se sakupljaju sa antekubitalne površine uz pristanak zdravih volontera od strane licenciranih stručnjaka za punkciju vena i omogućeno je zgrušavanje u suvim kesicama za sakupljanje koje imaju zapreminu od 450-500 mL u frižideru preko noći. Serumi se razdvajaju centrifugiranjem na 2800 x g dvadeset minuta na 5 °C. Ovojeni serumi se prenose u kesice za transfer upotrebom sprave za ekstrakciju plazme kako bi se osiguralo da ne dođe do kontaminacije crvenih krvnih ćelija. Humana plazma je sakupljena u kesicama za sakupljanje koje sadrže kalijum-EDTA, uz nežno mešanje od pet minuta i omogućeno je da odstoji na sobnoj temperaturi trideset minuta. Kesice se centrigiraju na 2800 x g dvadeset minuta na 5 °C. Odvojena plazma se prenosi u kesice za transfer upotrebom sprave za ekstrakciju plazme kako bi se osiguralo da ne dođe do kontaminacije crvenih krvnih ćelija. I humani serum i humana plazma se skladište na 4 °C u trajanju od nedelju dana pre razdvajanja u alikvote u krio epruvetama i zamrzavaju se na -80 °C do sledeće upotrebe.

PRIMER 2: Razvijanje Višestrukog imunološkog testa

[0036] Uspešna implementacija višestrukog imunološkog testa zasnovanog na mikrosferama za detekciju sFGFR u biološkim uzorcima zahteva razvijanje potokola i optimizaciju. Prvo, moraju biti identifikovani reagensi koji će imati rezultat u najosetljivijem testu. Prvi set reagenasa koji se procenjuju su parovi antitela za hvatanje i detekciju sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4. Ispitano je nekoliko različitih izvora antitela; međutim, parovi antitela koji se navode u Tabeli 1 daju najbolji opseg detekcije za sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 prema tome, se koriste u višestrukom sistemu.

Tabela 1: Kombinacija antitela za hvatanje i detekciju koji se koriste za postavljanje testa za FGFR2,

FGFR3, i FGFR4.

[0037] Sledeća komponenta testa koja se priprema su mikrosfere koje su spojene sa antitelom za hvatanje. Antitela za hvatanje su karboksilovana («-COOH ») specifično sa polistirenskim 5,6 mikrona mikrosferama prema sledećem: anti-FGFR2 za kuglicu #(88), anti-FGFR3 za kuglicu #(16), i anti-FGFR4 za kuglicu #(79). Ovi regioni odgovaraju 3 od 100 jedinstveno obojenih potencijalnih regiona korišćenih od strane Luminex 100/200™ sistema. Spajanje ciljnih antitela za hvatanje sa polistirenskim mikrosferama se izvodi upotrebom odgovarajućeg sistema za konjugaciju, koji koristi postupak sličan Bio-Plex® Amine Coupling kitu od Bio-Rad Life Sciences (Cat # 171-406001). Ukratko, kovalentno spajanje antitela za hvatanje sa karboksilovanom polistirenskom mikrosferom se postiže pomoću karbodiimidnih reakcija koje uključuju primarne amino grupe proteina i karboksilne funkcionalne grupe koje su vezane na površini polistirenskih mikrosfera. Kovalentno vezivanje je trajno, nakon čišćenja ne ostavlja nevezani protein, čak i posle dužeg perioda skladištenja. Antitela za detekciju sFGFR2 i sFGFR3 su biotinilovana upotrebom Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Cat #21327) prema protokolu proizvođača, dok je antitelo za detekciju sFGFR4 kupljeno sa već vezanim biotinskim obeleživačem.

[0038] Drugi set procenjenih reagenasa su puferi koji treba da se koriste za razblaživanje uzoraka, korake blokiranja i inkubacije. Tipično puferi koji se koriste u višestrukim testovima su zasnovani na PBS-u ili Tris-u. Pufer koji najbolje deluje za inkubiranja i razblaženja je PBS sa 1% BSA i za nespecifično blokiranje proteina je PBS sa 1% gama globulinom govečeta i imunglobulinom G.

[0039] Jednom kada se reagensi za imunološki test pripreme, sledeći protokol se koristi za kvantifikovanje sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 u biološkim uzorcima:

• Pet µL razblaženih mikrosfera obeleženih antitelima za sva tri sFGFRs (1800 kuglica po analitu po bunariću) pomešanih sa pet µL sredstva za blokiranje koji se sastoji od 1% gama globulina govečeta (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, Catalog # 82041) u PBS-u sa dodatim imunoglobilinom G.

• Ova smeša se dodaje u mikrotitarsku ploču od 96 bunarića sa ravnim dnom.

• Uzorak koji će se koristi se otapa na sobnoj temeraturi neposredno pre testiranja.

• Deset µL standarda, kontrole kvaliteta, ili seruma razblaženog 1:5 u 4% BSA puferu koji sadrži konzervans (natrijum azid) se dodaje na ploču, uzorci se mešaju sa pipetom i ploča se inkubira na sobnoj temperaturi jedan sat bez mešanja.

• Deset µL biotinilovanih antitela za detekciju (razblaženih u 1% BSA puferu sa konzervansom do finalne koncentracije 3 µg/mL za sva tri analita) se dodaje u svaki bunarić, intenzivno meša, i inkubira jedan sat na sobnoj temperaturi.

• Deset µL streptavidin-fikoeritrina razblaženog do 100 µg/mL se dodaje u svaki bunarić, intenzivno meša, i inkubira trideset minuta na sobnoj temperaturi.

• Filter-membrana mikrotitarske ploče se prethodno ovlaži sa 100 µL pufera za pranje sa osnovom BSA sa natrijum azidom nakon čega sledi usisavanje pomoću uređaja za višestruki vakuum.

• Sadržaji reakcije u mikrotitarskoj ploči sa ravnim dnom se prenose u odgovarajuće bunariće u filter ploči. Svi bunarći su usisani vakuumom i sadržaji su dva puta isprani sa 100 µL pufera za ispiranje.

• Posle finalnog ispiranja, 100 µL pufera za ispiranje se dodaje u svaki bunarić i mikrosfere se resuspenduju intenzivnim mešanjem.

• Ploča se zatim analizira na Luminex 100/200™ čitaču koji koristi odgovarajući softver za analizu. Za svaku ploču, se kreira standardna kriva za svaki sFGFR upotrebom odgovarajućeg softvera. Standardne krive za sFGFR2 i sFGFR3 koriste Logističku regresiju sa 5-parametara i standardna kriva za sFGFR4 koristi Logističku regresiju sa 4-parametra.

PRIMER 3: Statistička validacija Višestrukog Imunotesta

[0040] Na osnovu vodiča iz Uprave za hranu i lekove SAD-a (U.S. Department of Health and Human Services, Centra za evaluaciju i ispitivanje lekova (CDER), i Centra za veterinarsku medicinu (CVM). Guidance for Industry. Bioanalytical method validation. May 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/UCM070107.pdf), razvijen je program za validaciju koji je podrazumevao punu validaciju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 višestrukim imunotestom. Program obuhvata procenu najboljeg uzorka matriksa, selektivnosti testa, linearnog opsega kako se određuje standardnom krivom, najmanje detektabilne doze (LDD), niže granice za kvantifikovanje (LLOQ), preciznosti, apsolutnog procenta regeneracije, linearnosti pri razblaživanju, interferenciju matriksa, stabilnost zamrzavanja/otapanja, stabilnost na sobnoj temperaturi, i referentni opseg (SL.1).

[0041] Poređenje uzoraka plazme i seruma : S obzirom da se krv koristi za merenje sadržaja sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 u testu, izvodi se poređenje između seruma i plazme kako bi se identifikovao najbolji biološki matriks. Kao što se može videti na SL. 2, SL. 3 i SL. 4, dobijanje procenta regeneracije sFGFR je bio dosledno bolje kada se ispitivao serum. Prema tome, serum je konačan izbor matriksa za buduće analize validacije. Postupci višestrukog imunotesta koji se opisuje u predmetnom pronalasku je takođe pogodan za druge biološke uzorke (cerebrospinalnu tečnost, urin, limfu, pljuvačku, sudor, tečnost pleure, sinovijalnu tečnost, vodenu tečnost, tečnost suza, žuč, sekret iz pankreasa), iako bi se trebala uspostaviti svsihodna validacija kako bi se identifikovao najbolji izbor matriksa.

[0042] Selektivnost testa: S obzirom da se sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 testiraju u istom bunariću uzorka, važno je da se utvrdi da nije bilo značajne ukrštene reaktivnosti između tri analita. Da bi se ispitala ukrštena rektivnost, FGFR2 antitelo za hvatanje se testira prema najvećim koncentracijama sFGFR3 i sFGFR4 za signal. Slično, procenjuju se sve druge kombinacije i pronađeno je samo 1,6% ukrštene reaktivnosti između FGFR4 antitela za hvatanje i sFGFR2 na najvećoj koncentraciji (SL.5).

[0043] Standardne krive: Ukupni standard FGFR2a (deo #841650), ukupni standard FGFR3 (deo #841879) i ukupni standard FGFR4 (deo #842742) dostupan od R&D Systems Duosets (Brojevi kataloga DYC665, DYC766 i DYC685, redom) se koriste za dobijanje standardnih kriva. Standardne krive za svaki sFGFR su dobijene stvaranjem visokog miksa standarda od tri standarda u ribljem serumu/BSA puferu: 100 ng/mL za FGFR2, 15 ng/mL za FGFR3 i 25 ng/mL za FGFR4. Ovaj visoki standard je serijski razblažen sedam puta dodavanjem 37 µL svakog standarda sa 88 µL razblaživača standarda. Opsezi standardne krive za FGFR2, FGFR3 i FGFR4 su 100 ng/mL – 0,020 ng/mL, 15 ng/mL – 0,003 ng/mL i 25 ng/mL – 0,005 ng/mL, redom. Standardne krive za svaki analit se dobijaju na svakoj ploči, i određuju se srednje vrednosti, sa procentom CV izračunatom kroz izvođenja (SL. 6, SL. 7 i SL. 8). Srednje CV za sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 su bile 8,38%, 6,38%, 5,13%, redom, što ukazuje da krive imaju minimalne varijacije od ploče do ploče.

[0044] Najmanja detektabilna doza: Najniža koncentracija analita koja može da se razlikuje od blanka sa 99% poverenjem je poznata pod imenom najmanja detektabilna doza (LDD). LDD se računa usrednjavanjem signala iz određivanja 20 replikata standardne krive i dodavanjem tri standardne devijacije na srednji signal iz blanka.

[0045] Niža granica kvantifikacije (LLOQ): Niža granica kvantifikacije (LLOQ) je najniži standard koji može da se tačno detektuje. Da bi se uklopio u LLOQ definiciju, standard mora da bude linearan, da se nalazi u okviru opsega testa sa CV od 30%, i mora da daje prinos između 75-125% kada se obogati u matriksu. LLOQ se određuje sprovođenjem dvostrukih razblaženja niskih standarda u triplikatu preko tri sprovođenja. Standardi 5 - 8 se dvostruko razblažuju i testiraju u triplikatima tokom tri različita izvođenja. CV se računa i predstavlja u odnosu na koncentraciju. LLOQ, interpolira sa ovog grafika i pomnožen sa faktorom razblaženja, računa se da bude 0,53 ng/mL, 0,084 ng/mL, i 0,15 ng/mL, redom za sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4. Kao što je pomenuto, takođe je važno da se analit dobije u prinosu sa 75 -125% na koncentraciji LLOQ. Međutim, uzorci ne mogu uspešno da se dobiju za sFGFR2 na koncentracijama koje su ispod 0,82 ng/mL. Prosečna regeneracija na 0,82 ng/mL za serum (N=3) je određena da bude 85,67%. FGFR3 uzorci ne mogu da se uspešno dobiju na koncentracijama koje su ispod 0,15 ng/mL, i srednja regeneracija uzoraka iz seruma (N=3) obogaćenih sa sFGFR3 je 103.3%. FGFR4 uzorci ne mogu da se uspešno regenerišu na koncentracijama koje su ispod 0,17 ng/mL, i srednja regeneracija uzoraka iz seruma (N=3) obogaćenih sa sFGFR3 je 101.3%. Konačno, LLOQ određen za sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 je redom 0,82 ng/mL, 0,15 ng/mL, 0,17 ng/mL (Tabela 2).

Tabela 2: LLOQ i dinamički opseg za FGFR2, FGFR3, i FGFR4.

[0046] Preciznost: Preciznost testa se određuje unutar izvođenja (intra-testni CV) i tokom serija izvođenja (inter-testnim CV) merenjem tri nivoa kontrola u duplikatu tokom minimum pet izvođenja. Srednje vrednosti za sFGFR2 kontrole su 1, 3, 9,3, i 35 ng/mL sa inter testnim CV koji ima opseg od 8 -13%, i intra-testnim CV koji ima opseg od 1 - 11% (SL.9). Srednje vrednosti za sFGFR3 kontrole su 0,117, 2,8, i 14 ng/mL sa inter testnim CV opsega od 8 - 13%, i intra-testnim CV opsega od 0 - 16% (SL. 10). Srednje vrednosti za sFGFR4 kontrole su 0,095, 4,1, i 23 ng/mL sa inter testnim CV opsega od 3 - 33%, i intra-testnim CV opsega od 1 - 21% (SL. 11). Gornja granica za sFGFR4 je malo veća od 30%, što je rezultat jednog lošeg izvođenja koji ima visoki CV od 21%. Razlog za visoki CV je zbog toga što je srednja koncentracija tog uzorka 0,095 ng/mL, što je mnogo niže od LLOQ za sFGFR4.

[0047] Apsolutni procenat regeneracije: Da bi se odredio procenat regeneracije svakog sFGFR, serum je obogaćen sa sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 na četiri koncentracije standarda i analiziran je u triplikatima. Procenat regeneracije se računa oduzimanjem vrednosti osnovnog nivoa od obogaćene koncentracije i deljenjem rezultata sa obogaćenom koncentracijom i množenjem sa 100. Uočeno je da srednja regeneracija za sFGFR2 ima opseg od 76 - 126% (N=3), za sFGFR3 ima opseg od 89 - 143% (N=3), i za sFGFR4 ima opseg od 81 - 145% (N=3) (SL.2, SL.3, SL.4 i SL.12).

[0048] Linearnost pri razblaživanju: Povremeno, mogu da postoje uzorci koja imaju veća čitanja od gornje granice testa za svaki od analita. Da bi se dobila tačna vrednost, važno je da se utvrdi da se uzorci linearno razblažuju u puferu testa i da imaju procenat regeneracije u okviru 70-130%. Uzorci su dvostruko razblaženi u puferu testa, počevši od originalnog uzorka na 1:5, i zatim razblaživanjem do finalne koncentracije od 1:10, 1:20, i 1:40. Ispitivanje linearnosti pri razblaženju se izvodi na čistom normalnom serumu i uzorcima plazme, ali izračunate koncentracije sFGFR za ove uzorke su ispod LLOQ testa. Ukupni normalni humani serum je inicijalno obogaćen sa rekombinovanim sFGFR i zatim je razblažen do finalne koncentracije od 1:10, 1:20 i 1:40. Obogaćeni uzorci seruma mogu uspešno da se razblaže do 1:40 sa srednjim procentom regeneracije od 109% za sFGFR2, 109% za sFGFR3, i 96% za sFGFR4 (SL.13, SL.14 i SL.15).).

[0049] Interferencija matriksa: Merenja interferencije matriksa da li zajedničke komponente koje se nalaze u uzorcima kao što su hemoglobin, bilirubin ili trigliceridi uvode grešku u višestrukom testu. Interferencija matriksa se procenjuje obogaćivanjem sa hemoglobinom (do 500 mg/dL), bilirubinom (do 20 mg/dL), i trigliceridom (do 500 mg/dL) u kontrolnom uzorku i određivanjem procenta regeneracije kao što se uočava u obogaćenom uzorku u odnosu na neobogaćeni uzorak. Procenat regeneracije posle obogaćivanja hemoglobinom (do 500 mg/dL), bilirubinom (do 20 mg/dL), i trigliceridom (do 500 mg/dL) za sFGFR2 je redom 89%, 91%, i 117%, za sFGFR3 je 88%, 90%, i 107%, i za sFGFR4 je 85%, 89%, i 117%.

[0050] Stabilnost: Tokom analize, uzorci prolaze kroz nekoliko ciklusa zamrzavanja-otapanja; prema tome, važno je ispitati stabilnost analita posle nekoliko ciklusa zamrzavanja-otapanja, i takođe odrediti stabilnost na 4 °C. Stabilnost pri zamrzavanju-otapanju se određuje ispitivanjem uzoraka seruma do tri ciklusa zamrzavanja-otapanja i određuje se procenat regeneracije za svaki uzorak. Dodatno, uzorci seruma se takođe ispituju za stabilnost na sobnoj temperaturi i 4 °C inkubiranjem svakog na 24 časova. Inkubirani uzorci se ispituju zajedno sa uzorcima koji nisu inkubirani i određuje se procenat regeneracije dobijanja.

[0051] Ukratko, serum (N = 3) je obogaćen sa rekombinovanim standardom i za svaki se meri osnovni nivo koncentracije. Uzorci su napravljeni da idu kroz tri ciklusa zamrzavanja-otapanja i procenat regeneracije se izračunava poređenjem sa uzorkom na osnovnom nivou. Srednja vrednost procenta regeneracije za serum (N = 3) tokom tri cuklusa zamrzavanja-otapanja je 90,11% za sFGFR2, 84,11% za FGFR3, i 89,00% za FGFR4. Uzorci (N = 3) su takođe procenjeni za njihovu stabilnost antigena na 4 °C za 2, 4 i 24 hr vremenskim tačkama i na sobnoj temperaturi 4 i 24 hr vremenskim tačkama. Srednji procenat regeneracije za serum (N = 3) tokom 24 hr na sobnoj temperaturi i 4 °C je 83,93%, 83,33%, i 89,87% za sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4.

PRIMER 4: Primena testa

[0052] Procenjuje se sposobnost testa da detektuje sFGFRs u uzorcima kancera. SL. 16 pokazuje da su najbolji sFGFR signali u testu dobijeni kada uzorak pufera za analizu seruma iz kancera sadrži 4% BSA i pufer za blokiranje koji sadrži deterdžent, NP-40. Posle odabira najboljih pufera, ispitano je petnaest različitih uzoraka kancera: pet uzoraka kancera prostate i dest uzoraka kancera pluća (FIG. 17). Iz tih petnaest uzoraka, sFGFR2 može da se detektuje samo u četiri uzorka sa količinama koje se mogu izmeriti, koje su opsega između 0,007-0,41 ng/mL. Interesantno, sFGFR3 može da se izmeri u svim petnaest uzoraka sa merenjima u rasponu od 0,015-1,2 ng/mL. Osim toga, sFGFR4 se nalazi u svim uzorcima na najvećim koncentracijama u rasponu od 0,07-4,4 ng/mL.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Kit za detekciju rastvorljivih receptora faktora rasta fibroblasta (sFGFRs) u biološkom uzorku, koji sadrži:

kompoziciju antitela za hvatanje konjugovanu na mikrosferi koja specifično vezuje sFGFRs; i kompoziciju antitela za detekciju konjugovanih sa obeleživačem za detekciju koja specifično vezuje sFGFRs;

gde se u biološkom uzorku detektuje 0,14 - 494 ng/mL sFGFR2, 0,023 - 74 ng/mL FGFR3, i 0,033 -123 ng/mL FGFR4;

gde kompozicija antitela za hvatanje sadrži antitelo za hvatanje koje specifično vezuje FGFR2, antitelo za hvatanje koje specifično vezuje FGFR3, i antitelo za hvatanje koje specifično vezuje FGFR4; i

gde kompozicija antitela za detekciju sadrži antitelo za detekciju koje specifično vezuje FGFR2, antitelo za detekciju koje specifično vezuje FGFR3, i antitelo za detekciju koje specifično vezuje FGFR4.

2. Kit prema zahtevu 1, gde se biološki uzorak bira iz grupe koja sadrži krv, serum, urin, cerebrospinalanu tečnost (CSF), plazmu, limfu, pljuvačku, znoj, pleuralnu tečnost, sinovijalnu tečnost, tečnost suza, žuč, i sekrete iz pankreasa.

3. Kit prema zahtevu 1, gde se antitelo za hvatanje bira iz grupe koja se sastoji iz:

mišjeg anti-humanog FGFR2 monoklonskog antitela;

mišjeg anti- humanog FGFR3 monoklonskog antitela; i

mišjeg anti-humanog fosfo-FGFR4 poliklonskog antitela.

4. Kit prema zahtevu 1, gde se antitelo za detekciju bira iz grupe koja se sastoji iz:

mišjeg anti-humanog FGFR2 monoklonskog antitela;

mišjeg anti-humanog FGFR3 monoklonskog antitela; i

mišjeg anti-humanog FGFR4 poliklonksog antitela.

5. Kit prema zahtevu 1, gde je mikrosfera konjugovana sa dve fluorofore.

6. Kit prema zahtevu 5, gde su dve fluorofore konjugovane sa mikrosferama, fluorofore koje se pobuđuju u crvenom i infracrvenom spektru.

7. Kit prema zahtevu 6, u kome mikrosfera ima prečnik oko 5 µm, kit koji dalje opciono sadrži pufer za blokiranje i pufer za inkubaciju.

8. Kit prema zahtevu 1 za detekciju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 u biološkom uzorku, koji sadrži:

mišje anti-humano FGFR2 monoklonsko antitelo konjugovano na mikrosferu;

mišje anti- humano FGFR3 monoklonsko antitelo konjugovano na mikrosferu;

mišje anti-humano fosfo-FGFR4 poliklonsko antitelo konjugovano na mikrosferu;

mišje anti-humano FGFR2 monoklonsko antitelo konjugovano sa obeleživačem za detekciju; mišje anti-humano FGFR3 monoklonsko antitelo konjugovano sa obleživačem za detekciju; mišje anti-humano FGFR4 poliklonsko antitelo konjugovano sa obeleživačem za detekciju; gde se 0,14 - 494 ng/mL sFGFR2, 0,023 - 74 ng/mL FGFR3, i 0.033 - 123 ng/mL FGFR4 detektuje u biološkom uzorku.

9. Kit prema zahtevu 8, koji dalje sadrži pufer za blokiranje i pufer za inkubaciju.

10. Postupak za merenje sFGFR u uzorku, koji sadrži

a. obezbeđivanje uzorka

b. merenje sFGFR u uzorku upotrebom kita prema zahtevu 9, opciono gde se uzorak dobija iz živog subjekta.

11. Postupak za merenje količine sFGFR2, sFGFR3 i sFGFR4 u biološkom uzorku, koji se sastoji od:

a. kontakta biološkog uzorka sa kompozicijom antitela za hvatanje koje specifično vezuje sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4 konjugovanih na mikrosferi;

b. kontakt biološkog uzorka s kompozicijom antitela za detekciju spojenih sa obeleživačem za detekciju koja specifično vezuju sFGFR2, sFGFR3, i sFGFR4;

c. merenja signala koji je proizveden od obeleživača za detekciju;

d. dovođenja u vezu količine proizvedenog signala sa količinom sFGFR2, sFGFR3 ili sFGFR4 u biološkom uzorku.

12. Postupak prema zahtevu 11, u kome minimum osetljivosti za detekciju za

sFGFR2 je 0,14 ng/mL;

sFGFR3 je 0,023 ng/mL; i

sFGFR4 je 0,033 ng/mL.

13. Postupak prema zahtevu 12, gde je biološki uzorak odabran iz grupe koja obuhvata krv, serum, urin, cerebrospinalnu tečnost (CSF), plazmu, limfu, pljuvačku, znoj, pleuralnu tečnost, sinovijalnu tečnost, tečnost suza, žuč, i sekreciju iz pankreasa opciono gde svaka mikrosfera ima ima prečnik od oko 5 µm.