JPH06501103A - 生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法とその方法を実施するキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法とその方法を実施するキット 本発明は生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法に関するものであり 、特に自己免疫疾患を診断する自己抗体を検出する分析方法である。

種々の免疫学的分析方法は、医学的な診断の中で非常に重要な役割を果している 。加えて、これらの分析方法は抗原又はハブテン（例えばホルモン）の質的な及 び／又は定ｌ的な決定を目指しており、生物学的液体、特に人の血清中の抗体を 決定するためのこの種の方法には多くの分析方法がある。

抗体は、免疫グロブリン（ｒｇ）で明示されるような蛋白質であり、またそれに は抗原に反応するような要部が形成されている。抗体は多くの抗原決定基を有し ており、抗体はポリクローナルであり、またそれ故に、それらが指示されるもの に対する抗原に関し興なる結合特性を育する蛋白質の集団として表現される。

それらは、通常の状態では相当する抗原決定基を有する物質から体を保護するた めに外因性の抗原を妨害するものである。もし、体内の免疫機能が誤って外因性 の細胞構造を内因性の細胞と確認してしまったならば、その外因性の要素の抗原 決定基に対してやはり抗体を形成することが可能である。同様の外因性の要素は その時自己抗原と示され、そしてそれらを防ぐように形成された抗体は自己抗体 として示される。

既知の抗体の分析方法は、１つの形態又は別のものにおいていくつかの基本的な 原理が実現されており、そのうち２つの概要、例えば、米国特許第３６５４０９ ０号の′Ｍ３欄の最初の記載が示されている。その変法に従えば、古典的なラジ オイムノアブセイ（ＲＩ　Ａ）と一致し、不充分な固定化抗原を使用し、そして 標識された状態の決定するべき抗体が検査するべき試料に既知の置加えられる。

その方法の概要は、固定化抗原に結合した標識された抗体から目的とする抗体を １縮して得ることができる。ｔＸ原は、この試験においては競合原理に基づいて 必要Ｉこ応じて高純度化される。

第２の原理に従えば、既知量の決定すべき抗体又はそれから派生する適当なもの が固体基質上に固定化され、そして検査すべき試料中に存在する抗体と固定化さ れた抗体は反応システムに標識された抗体が加えられた時に競合することを許さ れる。その存在又は決定すべき抗体の量は、固定化抗体と固相に標識された抗原 が結合する量から換算して得られる。

抗体決定の最後に述べた方法においては、その連合した高純化抗原の標識された 状態が必要とされ、またその決定すべき抗体と固定化抗体とが、固定化抗体と調 査するべき試料中の抗体との両方の間に競合作用が起こり得るような量で存在す る必要があり、実際には標識されたＫＷに親和するものは完全な同一性を持つと は考えられない。

更なる原理に従えば、抗原の過剰を決定する周知のサントイ、チ試験に類似する 操作では、禅常は固定化された状態において、取扱の最初に、決定すべき抗体の 総量によって結合され、そして、第２の免疫的反応が系２の標識された「抗体」 とともに続いて起こり、Ｍｌの工程中で相対する抗原が結合し、その後、サント イフチ状免疫複合体が形成されるとともに標識される。上記第２の「抗原」はし ばしば、抗−抗体である（二重抗体法）か又はそれは標識されたいわゆるプロテ ィンＡの標識のために使用され、細菌や多（のＩｇＧ抗体の特別でない結合から 得られる蛋白質である。この方法にあっては、要求される抗原の量は試料中に存 在する全ての抗原が結合するのに充分な結合容量になっている。もし、決定する べき抗体が大量であると予測されると、試料は一般的に高度に希釈しなければな らず、その後でこの試験に使用され得る。これは特に被覆チコーブ技法に適用し 、実朋的な理由により度々好適に眉いられ、また、微小法王プレート技法では、 抗原被覆した試験管が人の抗原的１〜２μｇの結合容量を有するのみである。

外因性抗原に相対する抗体の決定において、様々な試験の機能的な要求は、大き な困難以外にも出会うことが度々ある。外因性抗原に対する濃縮されたその抗体 はＪＩｌ富は比較的に少な（、また連合する抗原又はハブテンは化学的又は生化 学的方法により合成することが度々あり、或いは自然材料から分離し、そして濃 縮することができる。

しかしながら、もしそれが上記原理の特徴の一つによって自己抗体を決定するつ もりであるならば、それにはいくつかの困難があり、重要なものとして自己抗原 の自然現象の結果と自己抗体の濃縮が起こる結果の両方に出会うことになる。

自己抗体の決定は自己免疫疾患の存在を検査する上で非常に重要であり、殊に徴 候を観察して正確に診断し、また育害な誤うた治慶を避ける上で非常；こ重要で ある。既知の自己免疫疾患のうちのいくつかは極端に重症となり、例えばりウマ チ様関節炎、糖尿病タイプｌ、重症筋無力症及び甲状腺と連合したいくつかの自 己免疫疾患、パセドウ病と同種の甲状腺機能亢進症（またグレージス病を参照） 、貧血性粘液水腫及び橋本病である。甲状腺自己免疫疾患の場合、チレオグロブ リン、ＴＨＳレセプター及び／又はテロイドペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）が自己 抗原のように作用し、依存する疾患のタイプであり、また後者のものはミクロソ ーム抗体と呼称されるものと同一であることが最近見出された。本発明は以下の 記載、特に甲状腺の自己抗体の決定に関するもので、特にｈＴＰｏに対する抗体 、しかし本発明は新規な原理に基づいたものであり、それら特殊な決定法に限定 されることはないが、しかし他の自己抗体の決定に同じく有用に適用できるり他 の抗体の決定においては、特殊のケースにおいても、周知の原理に基づいた分析 方法よりも有利な点を有している。

甲状Ｈ＠己免疫疾患の分野における知識の現況の批評は科学的な文猷中に見出さ れ・例えばＭｙＩｘｎ　ＬｕｄｇａｌｅとＧｊｌｂｅｒｔ　Ｖａｓｓａｒｔの論 説中：　Ａｕｔｏｓ＋５ｕｎｉｔｙ、　１９９Ｇ、　Ｖｏｌｕｍｅフ、　２０１ −２１１頁；　Ｊａｄｗｉｇａ　ＦｕｒｓａｎｉａｋとＢｅｒｎａｒｄ　Ｒｅｅ ｓ　Ｓｍ１ｔｈの批評の中：Ａｕｔｏｊｍｍｕｎｉｔ７．　１９９０．　Ｖｏｌ ｕｍｅ７．６３−８０頁；及びＰ、Ｍ、Ｓｃｈｍ＊−Ｄｒａｇｅｒ、　Ｈｊ、Ｃ 。

Ｗｅｎｌｓｃｈの論説中：　Ａｋｔ、　Ｅｎｄｏｋｒ、　５ｔｏｆｆｖ、　ｔｏ 　（１９８９）、　９−１０２頁（特別版）、これらには甲状腺自己抗体を決定 する方法の考察が与えられている。

そこには甲状腺自己抗体または一致する通常の自己抗体の免疫疾患の決定に使用 される一つの決定形式について基礎的な困難との最初の出会いについて、自己抗 体が細胞膜中に停止される自己抗体に対して高い傾度で向けられ、そして高純度 でしかも平素な操作の必要量を得ることが困難であることが述べられている。

人の甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰｏ）のケースにおいては、自己抗原と同じ ようなその酵素は、橋本病によって感応し、それは、例えばグリコ／レート　ヘ ム蛋白質であり、甲状線膜組織に結合されている。その抗原性特性は、エピトー プの表面に存在する様式を包含し、それについて、ｐ、　ｃａｒｓｙｏｎら：　 Ｅｎｄｏｃｒｌｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１２５．　Ｎｏ、３．１２１１−１ ２１４頁の論説中に記載されている。この甲状腺ペルオキシダーゼは周知の原理 に基づいた免疫疾患の決定のための抗原のような十分な純度と量があり、その甲 状腺ペルオキシダーゼは、膜組織から蛋白的方法、または洗浄剤の手助けと免疫 吸着剤を経た純化、または通常のクセマドグラフィー法に関するさまざまの分離 段階によって分離せねばならず、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ ィー、水和相互作用を経たクロマトグラフィー、芳香族の相互作用を経たクロマ トグラフィー、吸着クロマトグラフィーとフンカナバリンＡを用いたクロマトグ ラフィーである。これらの方法は複雑であり、また酵素の分離の際に故意でない 変換の危険が課せられ、また高い材料ロスがある。高純度の自然甲状腺ペルオキ シダーゼ（ＴＦ’Ｏ）はそれ故に小量であり、高価格である。それに代わるよう な甲状腺の膜組織からの甲状腺ペルオキシダーゼの分離する手法として、その試 みは結果的にまた生産と方法上が一般的な工学によりＴＰＯの生産品を認可する ことに発展した。しかし、ＴＰＯを簿るこの手法にあうでは、また制限された量 と高価格のみに役立ち、そして一般的な工学によって得られた自然甲状腺ペルオ キシダーゼの同一性、特に抗原的特性に関しては、あらゆるケースについては保 証できない。

更なる困難がＴＰＯの抗原的特性を化学的な影響によって非常に大きく損ねると いう事実から生じ、特にもし、その結果、３次元的構造は変換及び／またはその ジスルフィドの積構造が壊れたような場合である（Ｐ、　Ｃａｒｏｙｏｎによる 論説の記載参照）。しかし、ＴＰＯを用いることが可能とするために抗体法によ る古典的な方法における標識された抗体、その標識はＴＰＯに化学的に結合させ なければならない。純粋なＴＰＯを得ることの困難に加え、このような状態には リスクがあり、標識と連合させる反応の結果として、ＴＰＯの抗原的特性はもは や自然ＴＰＯに一致しないことにより影響されるであろうし、自己抗体を決定す るための抗原として適当な大きさの範囲でない。例えば、分離操作により変換が 引き起こされ及び／ｌたはＴＰＯのＷ識はこの方法におけるＴＰＯ８ｌｌｊａと ただいくつかのポリクローナルなＴＰＯｇ己抗体との反応が起こり得る。

少なくともいくつかの問題を避けるには分離操作とＴＰＯの標識とを連合するこ とであり、試験におけるＴＰＯに高純度化しない粗の状態のＴＰＯが、抗原の分 析のための最初に記述されたサントイフチ試験の変法と同じような発達した固定 化抗原が使用される。この試験にあっては、しかしながら、固定化された粗ＴＰ Ｏはやはりめる抗体より他の抗体の固定化に導くところの抗原的特性を有する他 の物体を含む可能性についての危険性があり、そしてそれらは標識することに続 いて起こり、相関的に二重抗体法またはプロティンＡ標識による非特殊性標識と 虚偽の明確な結果を与えるであろう。

実際的な観点からすると、特に要求される作業と決定を性格に達成することに関 して、自己抗体の決定における更なる問題は、ｇ己免疫の疾患が存在する時、生 物学的液体中に非常に大量にそれが見出されることであり、特別の患者の血清で ある。例えば、人の自己抗体２０μｇは血清２０μｌの試料の液量中から予期さ れる。それによれば決定が可能となり、特に被覆管技法または微量滴下プレート 技法によって、それは結果的に患者の血清をいくつかの液体に薄めることが通常 必要となり、それは労働強化と時間消費と誤差の加入源となる。

既知の免疫疾患の分析方法による自己免疫の決定における困難性の開示について は、生物学的液体中の免疫疾患性自己抗体のために斬新な方法が緊急に必要とさ れ、生物学的液体中の抗体の安全な質的決定を認め、その結果として適当な測定 と方法のパラメーターの最適条件は、抗体の信頼できる正確な決定のために適当 なものであり、血清を希釈しないで用いることが可能であり、また決定するべき 抗体のために高純度な抗原の意味のある量を用いることを不要とすることである 。

本発明の目的はそのような方法を提供することにある。

この目的は請求の範囲１項に記載されたような免疫学的分析方法により達成され る。

好適な実施態様はその他の請求項中に含まれている。

本発明による分析方法にあっては、抗体（Ａｋ）を決定するための手続きが採用 され、特に自己抗体について、最初の固定化抗体（Ａｋｉ■ｌ）のサンドインチ 複合体の構造を妨害すること、抗原（Ａｇ）、特に粗抗原の添加、そして検出可 能な標識を運ぶ更なる抗体（Ａｋ町が検出されること、この妨害は生物学的液体 中に検出するべき抗体（Ａｋ）が存在するためである。前述の形式のサンドイワ ナ複合体の妨害物は、固相に標識抗体（Ａｋ’ｋ）が結合していると減少される ことが明らかである。抗原または決定すべき自己抗原（Ａ　ｋ）によるサントイ フチ構造の妨害と試料中の存在についてこの原理ではサンドイッチ構造の合成の ために各々の唯一の結合部位、または両方を同時に起こすことが可能である。自 己抗原のように振舞う物体及び自己抗体に対抗するのが可能な構造は、概して大 きな分子量の複合体であり、一般的に自然蛋白質で、それは少なくとも２つの領 域または抗体結合内に包含されたエピトープを有しており、その抗体の構造はポ リクローナルである。抗体の選択によって固定化または標識された抗体が選ばれ 、その結果として興なるタイプのサントイ、チ複合体の構築が可能で、その結合 まで包含されまたそれについての妨害が関係し、自己抗体（Ａｋ）の存在に基づ いて非常に異なった振舞をするであろう。そのサンドイッチと同様な構造と正確 な自己抗体（Ａｋ）の検出のための適宜な原理を仕立てることが可能で、特に固 定化抗体（ＡｋｉＩ１票）と標識抗体（Ａｋ’ｋ）の両方が適当なモノクローナ ル抗体の時である。自己抗体と考慮するＴＰＯの決定の場合、この抗原が存在す るエピトープは相関的に都合良い特徴づけがあり、また様々なモノクローナル抗 体がこれに向けて対抗する特有のエピトープの抗原が役立てられる。この結合に 関しては上述した論説（Ｐ、　Ｃａｒ＋ｖｙｏｎら、　Ｅｎｄａｃｒｉｎｏｌｏ ｇｙ、　Ｖｏｌｕ＋＋ｅ　１２５．　Ｎｏ、３．１２１１−１２１８頁）が参考 となる。

もし同様な抗体、特にモノクローナル抗体、そしてそれはＴＰＯに対する自己抗 体における領域中に結合するＴＰＯが、ＴＰＯに対する固定化抗体のように選択 されて結合され、そしてもしその標識抗体Ａｋ本が自己抗体によって影響されな いその結合によって選択され、サンドイッチの構造の妨害は、抗原−標識抗体と の複合体（Ａｇ−Ａｋ＊）により決定すべき抗体Ａｋと固定化抗体Ａｋｉ−■の 間の競合のためにあり、間接的に標識された抗原のように見なせるであろう。も し、その反対の接触が採用され固定化された抗体Ａｋｉ１ｍが、決定べき抗体（ Ａｋ）により妨害されることのない抗原に結合されることによってそれが選択さ れ、その間に標識された抗体Ａｋ＊が、領域或いは抗体又は決定するべき自己抗 体がやはり結合する抗原のエピトープに結合すると、間接的に固定化された抗原 にょるＡｋ”とＡｋとの間の競合のために標識された抗体Ａｋ＊を含むサンドイ ッチの構造の妨害が起こる。もし、抗体Ａｋｌ■■とＡｋ”間の結合する抗原の それらの領域に自己抗体（Ａｋ＞がやはり結合したなら、同様の自己抗体（Ａｋ ）が存在する結果としてサントイフチ構造の二重損耗とその固定化とそれ故に感 度強化の同上が与えられるであろう。

本発明に従う方法の非常に意味のある有利性は、今日までに知られる分析方法の ような高純度の状態の抗原Ａｇを必要とせず、粗抗原のようなもの、例えば臓器 抽出物のような状態のものを使用し得ることである。二重抗原の特異性は、困難 なく除去され得る粗抗原とともに分析の中に導入されるところの異質な複合体に より試験を非特異的に妨害する標識手段を含むサントイフチの構造のために要求 され、サンドイッチ構造とすることは免疫学的な結合対を要することに制限され る。上述したケースにあっては、その粗抗原は付随の基質とともに固定化されて おり、固定化抗原に対する抗体ばかりでなく、粗抗原中の固相に結合されまた＊ ｍされた他の抗原性物質の免疫学的結合対も存在する危険性があるが、同様の妨 害は本発明による方法では起こり得ない。適当な臓器抽出物の状態である粗抗原 を用いることは、抗原のための比較的温和な回復方法を使用すること及び抗原の 自然な構成が攻撃される純化工程を省くことによる更なる有利性を有している。

その抗原はそれゆえ、生体中にその抗原が存在していることをより一層正確に表 現することができるとともに、それは免疫学的な結合スペクトルを完全なものに する。試験により検出されるであろう生体中に形成された自己抗体がごく少量で あることによる危険性は、このようにより小さいものとなる。

一方、適当に選択されたモノクローナルな抗体を試験に用いると、それはまた、 試験の応答が非常に特異的な唯一の確実な自己抗体を保証するのが可能であり、 またより優れた選択力を得ることができる。もし、例えば、免疫疾徹に連合した 確実な徴候は生体により形成されたポリクローナルな自己抗体の非常に特殊なり ローンであると見なすことができ、同様の自己抗体りａ−ンを決定する方法は、 モノクローナル又は任意の遺ばれたポリクローナル抗体を使用することによりそ の特異性を得る事ができる。

本発明による方法においては、予期された高い自己抗体濃度を粗抗原より問題な く提供する、例えば粗ｆｉＴＰｏは、自己抗体の量に比較して十分な量を使用す ることができ、過度に高価な試験とすることが無い。粗抗原を使用することが可 能であるので、本発明による方法では２つの添加抗体（Ａｋ１ｍ組Ａｋ＊）が必 要であ６が、唯一の抗体でも高純度の抗原が作用する方法に比較してコスト上昇 を与える不利益がないので、コストの点において有利である。

本発明による分析方法はまた、予期される量の抗原Ａｇ又は標識抗体Ａｋ”又は 固定化抗体Ａｋｌ■園が入る広い範囲の試験条件に適合させることによる選択の 要求に基づいて最適化するために非常に適している。これは重要な問題を無くす る可能性があり、その良好な有用性により、また粗抗原の低価格に関した自然の 抗原を使用した。その抗原の量は予期され又は自己抗体の量の可能性と直接に対 応させることができ、それは生物学的液体と同じ手段であり、即ち、特に血清を 希釈せずに使用し得る。

使用する免疫学的反応体に関しては、当業者にとって自明であるように、添加す べき抗原の量は、決定すべき全ての抗体Ａｋと、全ての標識された抗体Ａｋ本又 は飽和されそして抗原によりそれらの間にいくらかの特有な競合がもはや存在し ない全ての固定化抗体Ａｋｉｍｓの両方について非常に大きくすることはないで あろう。同様なケースにおいて、固定化の意味のある状態である標識されたサン トイフチ状は確かな状況中で抑えることができ、そして定量的な決断でない自己 抗体のおよその実際量が試料中に存在する可能性が有る。

もし不足するもの、例えば、標識された抗体Ａｋ町よ、加えられた抗原の量に関 連して用いられ、抗原の僅かな量が免疫複合体Ａｇ−Ａｋ本の状態で標識される ように、その標識されたＡｋ本の量は、複合体の最終的な結合の量が小さいため に、それが固定化抗体Ａｋｉｌ曹により無標識の抗原と競合するので、当然極端 に小さくしてはならない。別に開示された変法においては、固定化抗体Ａ　ｋ　 １ｍｌの置として類似の状況に適合させる。

抗原Ａｇの濃縮は、固定化抗体Ａｋｉ■−と標識された抗体Ａｋ＊とに要求され 、又は決定することができる確実な試験によって最も効果的であり、決定すべき 抗体Ａｋの予期される量を考慮しながら、例えば抗原の添加する量を経て、試験 （検量ＩＩ）の選択性を変えることによって操作過程の最適化における重要な困 難を取り除く。

本発明による方法において使用され得る抗体は、本質的には免疫学的な分析方法 に遺している全ての抗体であろう。それらの親和力の定数は通常１０１２〜１０ ８１／諺０１の範囲とされる。

固定化抗体Ａ　ｋ　ｂａｇのために使用可能な固体基質と、免疫学的な反応条件 （ｐＨが４〜９、緩衝液である；０℃〜約５５℃の温度中；反応時間）に関して 、その操作は、他の通常の免疫学的な分析方法と基本的に翼なっていない。その 免疫学的な反応は、届けられた全ての反応物の間に平衡が保たれるような条件の 下で実行することが可能である。しかし、それは原則としてまた早い予備検査時 間で反応を停止すること及びその比率をより早い時間で決定することが可能であ る。

本発明による方法は、以下の詳細な説明と実施態様では、人の甲状腺ベルオキ７ ダーゼ（ｈ　ＴＰ　Ｏ）に相対する自己免疫の決定に関するとともにそれに用い られるｈＴＰｏに相対する２つの添加されるモノクローナル抗体及び添加される 抗原のような人の甲状腺からの抽出物の状態にある粗ｈＴＰｏに関しており、ま たその効力は、同様の自己免疫の決定のための周知の方法と比較される。

図面の詳細 第１図は本発明による方法の箪ｌの変形の概要図で、固定化抗体Ａ　ｋ　ｉｍｍ が抗原Ａｇの領域に結合され、それが抗体Ａｋによってまた認識され、それが検 出され、またそれはむしろましな抗体であり、抗原と固相の表面に固定されたそ れを干渉することにより抗体Ａｋは固定化抗体Ａｋ＋■■と競合する；その妨害 は抗体Ａｋがここに表現されまた以下の第２図及び第３図に象徴されるように抗 体Ａｋの間に入る運動により引き起こされ、実質上当該技術分野で明確であって も、挙行された妨害は抗原による競合のためである。

第２図は本発明による方法の更なる変形を示すもので、ここでは検出すべき抗体 Ａｋと標識された抗体Ａｋ＊が抗原Ａｇの領域のために競合し、それはＡｋｉｎ −を経た間接的な固定化であり、またそれは自己抗体Ａｋにより認識される。

第３図は本発明による方法の系３の変形であり、ここでは固定化された抗体Ａｋ １■■と標識された抗体Ａｋ＊の双方が抗原Ａｇの領域に結合され、自己抗体Ａ ｋによって同様に認識され、試料中の抗体Ａｋが存在するように２重の妨害が引 き起こされる。

第４図は、抗原に用いる（粗ｈＴＰｏ）の量の作用のように、人の甲状腺ペルオ キシダーゼ（ｈＴＰｏ）に対する人の自己免疫の検出のための分析における標準 曲線を表すグラフを示す。

実施例 以下の実施例は、本発明による方法を実現する分析操作とその原理的な冑効性を 記載しており、人の甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰｏ）に対する人の自己抗体 の検出に関係する好適な実施態様に関する。

ｌ、固相表面へのモノクローナル抗−ｈＴＰｏ抗体（Ａｋｉ■■）の固定化ｈＰ Ｏに対する人の自己抗体により認識されるｈＴＰｏの領域に結合する純粋なモノ クローナル抗体は、固相に結合する抗体のように選択された。その純粋なモノク ローナル抗体は、モノクローナルなマウスの抗−ｈＴＰｏ抗体が用いられ、それ はｐ、（Ｂａｙｏｎの文献中：　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１ ２５．　Ｎｏ−３，１２１２頁、左欄の下行、右橋上段に開示されたプロセスに よりＩＩ！［され、そして選択基準に従って選択することについて同じ文献に、 領域中のｈＴＰｏを認定するためのものとして同じ（人の抗−ｈＴＰｏ自己抗体 により認識することが開示されている。

そこに述べられたモノクローナルなマウスの抗−ｈＴｐｏ抗体と試験管の壁中に 形成された固相とのカブプリングは以下のような既知の方法で実施される。

試験管（ＮＵＭＣＩＩ　５ＴＡＲＴｕｂｅｓ　１２ｘ］５ａｍ、カタクグＮｏ、 　４７０／３１９）に１ｕＫの抗−マウス−ｒｇＧ（シグマ社製、カタログＮｏ 、　ＭＡ　ａ６４２）の入った３００μｌのｐＨ７，８の水系緩衝液を入れ、そ の緩衝液はｌＯ寵■ｏｌのトリス塩酸と１０龍ｏ１のＮａ１ｊの濃度を有する。

ついで室温下で２０時間インキュベートしその試験管を２度洗浄した。その試験 管は０．５％のＢ　Ｓ　Ａ　（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；シ グマ社製、カタログＮｏ、＾３２９４）の溶液を十分に浸漬させ、即ちその試験 １に浸漬液を入れ、室温下で２時間インキ１ベートし、ついで中身を他に移した 。それに続く系３の工程においては、加えられたモノクローナルなマウスの抗− ｈＴＰｏ抗体はその述べられたモノクローナル抗原から免疫的な抽出物により固 相に結合され、上述した緩衝液の３００μ夏中に０．２μｇの量を後者は含有し 、この操作によれば室温下で２０時間のインキコベーシ謄ンが実行される。その 後、その試験管を洗浄し、上記と同一の浸漬液を用いて最終的な浸漬が実行きれ る。その試験管に含有される固定化そツクローナル抗体はそれから凍結乾燥され る。

２、人の甲状腺のｈＴＰｏ抽出物の処理凍結された人の甲状Ｍｌ　（６０’　ｇ ）を細かく砕き、緩衝液（２００ｍ１のリン酸塩性緩衝液、ＰＢＳ）を加え、ホ モジナイザー（１ＫＡ　ｆａｒｋｅ製ｕｔｔｒａｔｕｒｒａｘ）を用いてホモジ ナイズを実行した。１０万Ｇで１時間の遠心分離を実行し、ついでその上清を分 離し、また得られた塊状物を細片化した甲状腺と同じように再度ホモジナイズし た。これについて次にさらに１０万Ｇで１時間遠心分離した。ここで得られた塊 状物は再度Ｐ　Ｂ　Ｓ　（２ＧＯｍｌ）中にその上に洗剤として、ＰＩＥＲＣＥ 社製０５％トリトンＸ１００（カタログＪｉｏ、　２８３１４）を含んだ液中で ホモジナイズし、４℃で１時間攪拌を実行した。最後に、得られたホモジネート を１０万Ｇで２時間遠心分離した。その結果得られた上清はｆｉＴＰｏ抽出物で あり、それはｈＴＰｏに対する自己抗体の決定のための本発明による方法におけ る粗自然抗原Ａｇとして使用されるものである。

３、化学発光体標識により標識された抗−ｆｉＴＰｏ抗体（Ａｋりの調整モノク ローナルなマウスの抗−ｈＴＰｏ抗体は、上記１．の下部に記載したモノクロー ナル抗体と一致するような同じ方法による原理において得られた。しかし、それ を選択することはその領域の外部にｈＴＰｏが結合することによって、既知の方 法によりアクリジニウムエステルとともに標識されるｈＴＰｏに対する人の自己 免疫によりやはり認識される。この目的のために、純粋なモノクローナル抗体（ Ｆ　Ｂ　Ｓ　１００μ工中に１００μｇ）がアクリジニウムエステル（アセトニ トリル２μ！中に２μｇ）と室温下、１０分間反応せしめられる。アクリジニウ ムエステルとともに標識される抗体は、次にＨＰＬＣにより反応しなかった遊離 のアクリジニウムエステルから分離される。

４、、ｈＴＰＯに対する人の自己抗体の決定ａ）ｈ、ＴＰｏに対する人の自己抗 体の決定のために、本例における標識された抗体Ａｋ率が最初に反応せしめられ 、ｌ：ｌのモル比で、抗原ＡｇとしてｆｉＴＰ。

抽出物を用いた。その反応は緩衝液中、４℃で２０時間行なわれ、その緩衝液（ ＝次の組成二Ｓｏ　ｍｍｏｌのリン酸ナトリウム、ａ、　ｔｆｒ量％のＴｒｉｔ ｏｎ　ＸＳＯ，２重量％のＥＤＴ＾、０．３％のＢＳ＾（ｂｏｖｉｎａ　ｓｅｒ ｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）　、１００μｇのマウスｘｇａ（シグマ社製、、　ｉｏ 、　ｌ　５３８１）とｌ０ｇｇ／ｍｌのボビン１ｇＧ（シグマ社製、ＮＯ，５５ ０６）のものを用いた。その緩衝液のｐＨは７，６であった。

ｔ＋）ｈＴＰｏに対する人の自己抗体の検出のため又はその測定のため、次の操 作を各々用いた。

１、検査するべき試料２０μｇ１又は標準品、又は血清を、試験管内に注入した 。

この試験管は上記１項に開示されたプロセス工程により、萱壁面にコートしたマ ウスの抗−ｈＴＰｏを有している。

２、上記４ａ）により調製した混合体３００μ！と、人の甲状腺から抽出した状 態の抗原ｈＴＰｏを含んでおり、また反応された標識マウス抗−ＴＰＯのそれぞ れをピペットで移送した。

３、その添加が終了した後、振り混ぜながら室温下で３時間、インキ１ベートし 、その反応混合物を搏た。その試験管は、それから洗浄し、そして試験管の壁に 結合したアクリジニウムエステルのトレーサの量を、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ａｕｔ ｏｃｌｊｎｉｌｕ幽ａｔＬＢ　９５２／１６により周知の光反応の手段により測 定した。

第４図は、検査するべき試料又は用いた標準品における自己抗体の量の変化によ り得られた測定曲線であり、人の甲状腺抽出物の状態にある添加抗原（ｆｉＴＰ Ｏ）の量を変えて分析し、その’　ＴＰＯ希釈”のデータは上記２項の記載にあ る甲状腺膜の抽出物に関係している。第４図から明らかなように、曲線の形状と それゆえの感度の測定法は使用した抗原の量（ｆｉＴＰｏの量）を変化させるこ とにより変えることが可能であることを示している。

５、臨床データ 臨床的研究において、開示された新規な方法で得られた結果は、ｈＴＰｏに対す る自己抗体の決定のための現存の免疫学的な分析方法を用い、陽性反応の患者２ ９名によって得られたそれらの結果と比較した。

その結果は表１に要約される。

自己抗体　Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ 標準グループ　ａｌｌ　ｎｅｇ、　ａｌｌ　ｎａｇ、　ａｌｌ　ｎａｇ、　ａｌ ｌ　ｎｅｇ。

患者Ｎｏ。

本：比較方法の結果 この表１において、ａ）　、ｂ）及びＣ）項は、以下に詳述する従来技術の分析 方法の結果に関し、またｄ）項は上述したような新規方法を実施して得られた結 果を示している。

比較の方法として用いた従来技術の方法と本発明による方法を比較した場合の特 徴を述べると、 ａ）は固相上に抗−ｈＴＰＯ抗体を用いた方法である。放射性標識と純粋なｈＴ ＰＯは人の自己抗体により固相から置換される。この試験には、出願人のＤＹＮ Ｏｔａｓｔ　Ａｒ＋ｔｉ−ＴＰＯのように有用な市販の市販試験品を用いた。

ｂ）の試験は、プロティンＡが固相上に固定化されている。試料中の抗体は固相 に結合されて検出され、またそれに続き標識され純化されたｈＴＰｏの助力によ り検出される。特有のケースにあっては、放射性沃素−標識ｈＴＰｏが出願人の ＩＭＭＬＩｔｅｓｔ　Ａｎｔｉ−ＴＰＯ中のものを用いた。

Ｃ）の試験では、粗ＴＰＯ（いわゆるミクロゾーム抗原のような）が固相上に固 定化された状態で用いた。結合抗体の結合と検圧は、標識されたプロティンＡの 助力により実行された。その比較試験は出願人のＰＲＯ１４ＡＩ　ａｓｓａｙで ある。

表１における比較結果より明らかなように、比較試験ａ）　（トレーサとして純 粋な標識ｆｉＴＰｏ）と、比較試験ｂ）（固相上にプロティンＡ、　トレーサと して純粋な標識ｈＴＰＯ）の各ケースは、Ｃ）の分析方法と本発明による新規方 法ｄ）に比べて低い値となっている。即ち、分析方法ａ）は、個々の患者試料（ 患者？、１６．２１１）によって他の方法より実質的に低い値が与えられ、分析 方法ｂ）は他の試験によりわずかに陽性（患者１．２９）の一定の患者に陰性の 結果を与え、また他の分析方法より低い値を一定の患者（患者４．８．１１．１ ２．１７．１！、２０．２７）に与えた。それについて指摘せねばならず、患者 １．２９のケースについて、それら試料は分析方法ｂ）により自己抗体がないも のと誤って一様に検出されたものである。患者７．２８のケースについて分析方 法ａ）では極端に微量な陽性でしかないが、それらは他の方法では強い陽性であ る。

方法Ｃ）はｈＴＰｏに対する抗体の添加において不利益があり、付随の蛋白質に 対する多数の別の自己免疫が測定され、それが読み取られ、例えば、患者ｌＯで はｈＴＰｏに対する自己抗体が検出されているが、別の全ての方法によれば、ｈ ＴＰＯに対する自己抗体が無いものとぎれている。

本発明による方法での原理は、最初に詳細に説明したように、多くの関係の中で 変化し易いことに基づかれている。抗原が標識されて以来、標識化のためにいく つかの現用の既知の標識を用いることが可能である。抗原（粗ｈＴＰｏ）と標識 された抗体との上述した反応に変えて、開示されたような特有のケースでは、そ れはまた同時に反応するような方法を実行する可能性があり、即ち、粗抗原（ｔ ｔＴＰｏ）に代えて、調査するべき試料の添加に先だって、間接的に予備標識さ れたものと標識された抗体を分離する工程があり、そのイン亭１ベージ１ンは次 のように実行される。

自己抗体を調査するべき試料は、第１のピペット移送で固定化された抗体が被覆 された試験管内に移され、その標識された抗体Ａｋ”はその時に添加され、また 最終的な抗原溶液＜ｈｒｐｏＨ液）が添加され、その結果反応が始められる。

そのような手続は結合状態が人の自己抗体のようにやはり影響を及ぼし、また標 識された抗体Ａｋ’にとその抗原Ａｇ　（ｈＴＰｏ）の間の相互作用が弱くなる 時に有効であり、第３図による組立てと相似的である。

他のピペット移送の組立ては同じく可能である。例えば、試験容器内に固相と一 緒にＡｋｉ龍によるバインダーを配置しそしてその時にピペット移送する間の分 析手続までに第１の抗体Ａｋｉ會■を固定化しないこともまた可能であり、例え ば、Ａｋｌ■■とＡｋ＊の混合物に、抗原Ａｇを添加することにより反応を最終 的に始動させることである。

試料は予備希釈の必要を欠いているけれども、それは本発明による方法の重要な 有効性であり、それはまた当然の可能性として、予備希釈された状態の試料を用 いることにより試験が変化することが要求される。

最初に述べているように、その方法の新規な原理はｈＴＰｏに対する自己抗体の 決定にのみ限定されることはない。類似の有効性は、膜連合物や他の自己抗原に 対して形成されるところの他の自己抗体の決定においてもまた予想される。この 情況において、それは、ニコチン様式のアセチルコリンレセプターに対する自己 抗体の決定について言及する可能性があり、その発生は重症自己免疫疾患の筋無 力症に特有のものであると一般的に信じられている。

しかし本発明による方法は、自己抗体ではなく、また生物学的液体中に自己抗体 に比べて非常に低い濃度で発生するであろうその抗体の決定のためにも当然に使 用できる。ここでまた、本発明による方法は、純粋な状態でやっと入手可能な抗 原が粗の状態で使用可能であり及び／又は敏感な抗原の直接標識及び／又は標識 することを避けることがてきる困難性のある個々のケースにおいて有利な点を持 たせることができる。

第１図 第２図 第３図 第４図 Ｂ／８０＜％） ＴＰＯ使用量に関する標準曲線の依存性

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的液体が、 ８）決定きれる抗体（Ａｋ）に対する量が予備決定された抗原（Ａｇ）、と、ｂ ）抗体結合を含み固相又は微小固相により固定化された状態にある抗原（Ａｇ） の確定領域Ｒ１により特異的である抗体（Ａｋｉｍｍ）、と反応され、 そして上記固相は次に液相から分離され、そして該固相に抗原（Ａｇ）を経て結 合され或いは液相中に残存する標識の量が次に決定され、そしてその存在又は生 物学的試料中の決定するべき抗体の量が、質的な評価により又は検量線を用いて 得られた結果の算定的な評価によって次に決定される、生物学的液体中の抗体（ Ａｋ）を決定する免疫学的分折方法において、上記抗原（Ａｇ）は無標識状態の ものが使用され、そして検出可能な標識部を有し該抗原（Ａｇ）に結合する第３ の抗体（Ａｋ＊）が分折中に存在し、そしてその存在及び／又は決定するべき抗 体の量が、調査するべき生物学的液体について固相に結合された標識された抗体 （Ａｋ＊）の割合の減少に基づいて、固相上に結合され又は液相中に残存する標 識きれた抗体（Ａｋ＊）の量を、決定するべき抗体（Ａｋ）が除かれた生物学的 液体の試料を用い又は標準ブランク試料を用いて比較することにより決定される ことを特徴とする生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法。
2. ２．上記固定化抗体（Ａｋｉｍｍ）及び／又は標識された抗体（Ａｋ＊）がモノ クローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の生物学的液体中 の抗体を決定する免疫学的分折方法。
3. ３．上記標識された抗体（Ａｋ＊）が、ａ）加えられた抗原（Ａｇ）の、固定化 抗体（Ａｋｉｍｍ）に結合している抗原（Ａｇ）に影響を及ぼさない他の領域Ｒ ２に結合するもの、又は ｂ）加えられた抗原（Ａｇ）の領域Ｒ３に結合するもので、抗原（Ａｇ）に結合 しているものは、 ｂ１）固定化抗体（Ａｋｉｍｍ）及び／文は、ｂ２）決定される抗体（Ａｋ）及 び／又は抗原（Ａｇ）に固定化抗体（Ａｋｉｍｍ）が結合しているとことにより その結合が減少するもの、との複合物（Ａｇ−Ａｋ＊）の形成により減少される ようなもの、の一方であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の 生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分折方法。
4. ４．決定される抗体が自己抗体であり、自己免疫疾患の診断を決定するものであ ることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の生物学的液体中 の抗体を決定する免疫学的分析方法。
5. ５．決定される抗体が、甲状腺ベルオキシダーゼ（ＴＰＯ）に対する自己抗体で あることを特徴とする請求の範囲第４項記載の生物学的液体中の抗体を決定する 免疫学的分析方法。
6. ６．上記抗原（Ａｇ）が高純化処理していない粗自然抗原であることを特徴とす る請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の生物学的液体中の抗体を決 定する免疫学的分折方法。
7. ７．上記粗自然抗原が人又は動物の器官抽出物であることを特徴とする請求の範 囲第６項記載の生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法。
8. ８．上記抗原（Ａｇ）が、粗自然ＴＰＯであることを特徴とする請求の範囲第６ 項記載の生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分折方法。
9. ９．抗原とする上記粗自然ＴＰＯが、破砕した人甲状腺の抽出物の状態で使用さ れることを特徴とする請求の範囲第８項記載の生物学的液体中の抗体を決定する 免疫学的分折方法。
10. １０．上記標識された抗体（Ａｋ＊）が、固定化モノクローナル抗体（Ａｋｉｍ ｍ）が結合する領域とは異なる抗体結合が包含された抗原（Ａｇ）の領域に結合 するモノクローナル抗体であり、そして上記モノクローナル抗体及び／又は抗原 を、固定化抗体（Ａｋ＊）と決定するべき抗原が、抗原と標識きれた抗体との複 合体（Ａｇ−Ａｋ＊）により競合するような−定量で用いることを特徴とする請 求の範囲第２項ないし第９項のいずれかに記載の生物学的液体中の抗体を決定す る免疫学的分折方法。
11. １１．上記標識された抗体（Ａｋ＊）が、抗原（Ａｇ）の同様の領域に結合する モノクローナル抗体であり、それは抗原（Ａｇ）と標識された抗体との複合体（ Ａｇ−Ａｋ＊）の状態で結合している抗体に包含きれ、そして決定するべき抗体 （Ａｋ）が分折混合物中に存在する時に固相上に固定化された抗体（Ａｋｉｍｍ ）に結合するこの複合体（Ａｇ−Ａｋ＊）を可能な限り減少させることを特徴と する請求の範囲第２項ないし第９項のいずれかに記載の生物学的液体中の抗体を 決定する免疫学的分析方法。
12. １２．上記生物学的液体が、特に人の血清の状態であり、抗体（Ａｋ）の存在を 検査するものであり、特に自己抗体の存在のためであり、該分折方法中では希釈 しない状態で使用することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１１項のいず れかに記載の生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法。
13. １３．上記標識された抗体（Ａｋ＊）の検出可能な標識部結合が、放射性同位体 、酵素、蛍光体又は化学発光体標識、或いは酵素的検出反応のための基質、又は 免疫学的分折方法で使用される他の既知標識であることを特徴とする請求の範囲 第１項ないし第１２項のいずれかに記載の生物学的液体中の抗体を決定する免疫 学的分析方法。
14. １４．上記Ａｋｉｍｍ，Ａｇ，Ａｋ＊及び試料の個別の対が包含される決定操作 が上記分折混合物を調整するための次のいずれかの手順：ａ）検査するべき試料 と、ｂ）標識されたＡｋ＊と抗体Ａｇを、連続的に又はＡｋ＊とＡｇの両方を混 ぜて収容する状態のいずれか一方により、Ａｋｉｍｍとともに固相が収容される 試験容器内に連続的にピペット移送する；又はａ）試料、ｂ）抗体Ａｋｉｍｍと Ａｋ＊の混合物と、ｃ）抗原Ａｇとを、固定化きれるＡｋｉｍｍの結合剤ととも に固相が収容きれる試験容器内に連続的にピペット移送する、 により行われることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれかに 記載の生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分折方法。
15. １５．請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれかに記載の分折方法を実施する キットであって、抗体Ａｋｉｍｍが固定化されているか或いは分折操作の間に固 定化される固相、標識された抗体Ａｋ＊を含んだ溶液、及び抗原を含んだ溶液又 はＡｋ＊とＡｇとを含んだ溶液を少なくとも含むことを特徴とするキット。
16. １６．抗体として人甲状腺の細片より抽出された状態の粗自然ＴＰＯを含み、自 己抗体の抗ＴＰＯを分析することを特徴とする請求の範囲第１５項のキット。