CN104479022B - 抗s‑腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合物、胶体金试纸、试剂盒及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性结合S‑腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体301或者其抗原结合部分、产生其的杂交瘤、包含该单克隆抗体301或者其抗原结合部分的组合物或试剂盒，试纸条。与此同时，本发明还提供了使用上述单克隆抗体301或者其抗原结合部分、其组合物或试剂盒来检测S‑腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或者其水平的非治疗或诊断目的的方法和其用途。该细胞株及其产品第一次使得免疫方法检测生命代谢活动过程中甲基化指数(即S‑腺苷蛋氨酸和S‑腺苷同型半胱氨酸的比值)成为可能。本发明中获得的抗S‑腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体细胞株将有很大的实用性和应用前景。

Description

抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合物、胶 体金试纸、试剂盒及用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明主要涉及可特异性识别和结合S-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体或其功能性片段、其杂交瘤、组合物、试剂盒及用途。

背景技术

1.S-腺苷同型半胱氨酸

蛋氨酸分子含有硫(S)甲基，在与ATP作用生成-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)后，可通过各种转甲基作用为体内已知的约50多种具有重要生理活性的物质(DNA，RNA，蛋白，磷脂，激素，神经递质等等)提供甲基。SAM是这些生命活动中重要生理活性物质甲基化调控中唯一的甲基提供者。S腺苷蛋氨酸在甲基转移酶作用下将甲基转移至另一物质后，生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosyl-L-homocysteine,SAH)，后者进一步脱去腺苷，生成同型半胱氨酸(Hcy)。而同型半胱氨酸则可通过N5甲基四氢叶酸转甲基酶(EC1.1.1.68)及其辅酶维生素B12的催化作用，接受N5甲基四氢叶酸提供的甲基，重新生成蛋氨酸。而此过程又是已知的体内能利用N5甲基四氢叶酸的唯一反应。另外，同型半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(EC4.2.1.22)催化下也可与丝氨酸缩合生成胱硫醚，后者近一步生成半胱氨酸和α酮丁酸。

2.生物体的甲基化指数

生物体中甲基化指数被定义为SAM和SAH的比值。甲基化指数是一个能够客观地反应人体甲基化程度的指标。从以上可以看出SAH和Hcy是连接提供甲基给生命活性物质和从甲基四氢叶酸回收甲基给活性甲基供体的SAM之间的重要桥梁。他们含量的高低将会直接决定或反映一碳代谢和蛋氨酸循环过程正常与否的重要指标。因此，找到准确定量SAH和Hcy的方法，甚至定量所有参与一碳代谢和蛋氨酸循环的物质的含量，将具有很大的实际意义。研究表明，SAH升高能导致血管内皮细胞的损伤，且这种作用与整体基因组甲基化水平有关，SAH可能是动脉粥样硬化形成过程中的潜在生物标志分子。

目前S-腺苷同型半胱氨酸主要的检测方法是高效液相(HPLC)方法，荧光偏振免疫检测(FPLA)方法以及LC-MS/MS。研发SAH特异性的单克隆抗体从而使免疫检测成为可能，为测量生物体内的甲基化指数开辟了实际而可行的途径，已有研究表明，甲基化指数能够比较准确地反映人体内甲基化状态(与生命过程中重要的过程直接相关，涉及到出生，衰老，癌变，退化等等)，而且它与疾病和健康又很大的相关性。因而，本发明具有较大的实用意义。

3.现有技术中的SAH单克隆抗体

在勾宏霞等人发表于2005年的论文(中华检验医学杂志，2005年1月，第28卷第1期，第92-95页)中指出，通过制备SAH-BSA偶联物和SAH单克隆抗体，建立了同型半胱氨酸(Hcy)的免疫学测定方法。其中制备的SAH-BSA偶联物的克分子比为3～5，结果显示SAH单克隆与腺苷、半胱氨酸、蛋氨酸等无交叉反应，但是与S-腺苷蛋氨酸(SAM)存在交叉反应。据此作者认为其制得了SAH的单克隆抗体，但是作者也指出该单抗对SAM表现出一定的交叉反应。该文实际上不是定量SAH，而是定量Hcy的含量。因此，按照此方法，无法得到生物体的甲基化指数。

除此之外，美国abcam公司有兔抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体出售。该抗体与类似物(S-腺苷蛋氨酸，腺苷，同型半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，胱硫醚)的交叉反应较小。但是该兔抗SAH单抗的检测下限高于260nM，这一检测下限较高，限制了需要高灵敏高的检测情况。该抗体无法用于测定血浆样品，在竞争性酶联免疫吸附试验中，我们观察到了非特异性抑制反应，使得该株抗体无法用于EDTA抗凝的血浆样品。因此，这种市售单克隆抗体由于灵敏度较低的限制和不适用于血浆样品，也不适合用于测量甲基化指数。

4.单克隆抗体技术

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，选择性表达出不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个表达不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

单克隆抗体技术自从上世纪70年代发明以来，技术已经非常成熟。应用于许多领域，作为有用的检测或治疗工具。用于检测小分子的单克隆抗体，由于小分子的特性不同，抗体制备有一定的技术难点和特殊性。一般而言，小分子的抗原需要耦联合适的大分子载体，作为免疫原，才能在动物体内引起足够强的免疫反应，从而产生抗体。

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠)，杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100到1000倍。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种特异性更高、灵敏度也更高的单克隆抗体，从而为SAH的检测提供更好的工具。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immuno logicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature342：878-883的定义，其均以全文结合于此作为参考。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，ERCC1)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，RavenPress，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)，其以全文结合于此作为参考)。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述，其以全文结合于此作为参考。

在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994)，其以全文结合于此作为参考)。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。

如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。

如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

在本发明的一个方面，提供了一种特异性结合S-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体301或者其抗原结合部分，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株301产生；并且所述的杂交瘤细胞株301保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为：CCTCC C2014178，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株SAH301，保藏日期为2014年9月15日。

在本发明的另一个方面，提供了一种杂交瘤，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为：CCTCC C2014178，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株SAH301，保藏日期为2014年9月15日。

在本发明的另一个方面，提供了一种组合物，其包含前文所述的单克隆抗体或者其抗原结合部分。

在本发明的另一个方面，提供了一种酶联免疫检测试剂盒，其包含前文所述的抗体或其抗原结合部分；优选地，所述的试剂盒还含有：20倍浓缩洗涤液、酶标包被板、酶标抗体稀释液、酶标抗体、样品稀释液、显色液A液、显色液B液、终止液和封板膜。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试纸，其特征在于所述的试纸包括前文所述的单克隆抗体301或者其抗原结合部分。

在本发明的另一个方面，提供了一种检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：(1)前文所述的快速胶体金检测试纸；和(2)使用说明。

一种检测S-腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或者其水平的非治疗或诊断目的的方法，其包括使用前文所述的抗体或者其抗原结合部分、前文所述的组合物、前文所述的酶联免疫检测试剂盒、前文所述的快速胶体金检测试纸或者前文所述的快速胶体金检测试剂盒来进行检测；优选地，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品；进一步优选地，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。

在本发明的另一个方面，提供了前文所述的抗体或者其抗原结合部分、前文所述的杂交瘤、前文所述的组合物或者前文所述的快速胶体金检测试纸在制备用于检测生物体的甲基化指数的试剂盒中的用途，所述的试剂盒用于检测样品中的SAH水平；优选地，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品；进一步优选地，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。

在本发明一个优选的方面，所述的试剂盒用于辅助诊断抑郁症、巴金森氏、脑出血、脑栓塞、脑动脉粥样硬化病和肝炎等。

在本发明的另一个方面，提供了前文所述的抗体或者其抗原结合部分、前文所述的组合物、前文所述的酶联免疫检测试剂盒、前文所述的快速胶体金检测试纸或者前文所述的快速胶体金检测试剂盒的非治疗或诊断目的的用途，其用于检测S-腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或其水平；优选地，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品；进一步优选地，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。

本发明还提供了以下的技术方案：

本发明提供了抗原SAH-BSA的制备方法，具体地为：将5mg SAH、28.8mg BSA、14.96mg EDC.HCl、5.3mg N羟基丁二酰亚胺和5mL(pH7.4)PBS缓冲液依次加入反应瓶中，并在磁力搅拌下反应6个小时。将反应产物装透析袋，对pH7.4，10mM的PBS透析24小时，期间换液2-3次。定量，备用。

本发明还提供了杂交瘤和单克隆抗体的制备方法，其包括以下的步骤：以每只小鼠100ug的剂量加弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔3周，同样剂量加不完全佐剂乳化，再同样注射一次，以后隔周同样剂量加不完全佐剂乳化，加强免疫2次，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠，融合前3天用抗原水剂加强，3天后做融合试验。

本发明与现有技术相比，做出了大量的改进和革新，并且得到了有益的技术效果，例如：

1.与勾宏霞等人发表于2005年的论文(中华检验医学杂志，2005年1月，第28卷第1期，第92-95页)相比：

1)2005发表的文章用的分子比是SAH：BSA＝4.47-4.9:1,本发明是用的SAH：BSA＝35-40:1。除了牛血清白蛋白，还尝试了使用其它载体蛋白，例如多聚赖氨酸和KLH，各种分子比SAH：载体蛋白＝20-600：1均尝试过，有些融合细胞的上清和腹水的抗SAH抗体的效价非常高，但是在竞争反应中表现不佳。而最有用的抗体应该是在设计好的竞争性酶联免疫吸附实验中能够很好的抑制游离SAH小分子抗原，并且抑制程度和所加入的游离SAH抗原成正相关。我们还尝试了多种来源的SAH作为免疫原。其中包括Sigma-Aldrich的SAH，国内公司合成的SAH和我们公司定制的SAH钠盐。免疫原的纯度均为98％以上。

2)免疫小鼠的过程不同。

详见实施例2的方法部分。

3)筛选，鉴定单抗细胞的方法不同。

文献中提到的竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)，其标准曲线是同型半胱氨酸，通过酶学反应将同型半胱氨酸转变成S-腺苷同型半胱氨酸，作为反应产物的S-腺苷同型半胱氨酸与包被在酶联板上的SAH竞争SAH单克隆抗体。我们的方法是直接使用SAH更稳定的标准品SAH钠盐和SAH分子直接竞争抗SAH抗体。这样结果稳定性好，SAH的量控制得准确，不受酶学反应多变性的限制。方法更现实可靠，因而结果就更加更可靠。

4)抗体的特性有不同–特异性(交叉反应)，亲和力等。

我们根据SAH结构，分别设置了鼠抗SAH单克隆抗体(来源于本发明的细胞株，301或简称301)跟S-腺苷蛋氨酸，腺苷，同型半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，胱硫醚的交叉反应。而2005年的文章仅做了S-腺苷蛋氨酸，腺苷，半胱氨酸和蛋氨酸的交叉反应，其实蛋氨酸的交叉反应没有必要做，最应该做的是同型半胱氨酸和S-腺苷蛋氨酸，因为这两个分子在结构上与SAH最接近。为什么2005年那篇文献没有做同型半胱氨酸的交叉反应？因此，2005年得到的鼠抗SAH单克隆抗体很有可能跟同型半胱氨酸存在交叉反应的。如果是与同型半胱氨酸存在交叉反应，那么按照那篇文章的技术路线和得到的最终细胞株未必是真正意义上的高特异性的抗SAH的单克隆抗体。

5)抗SAH单克隆抗体用途不同。

2005年文献的目的是测定样品中同型半胱氨酸的含量，将未知样品或者标准品同型半胱氨酸在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的作用下转变成S-腺苷同型半胱氨酸，用SAH抗体与该反应的产物S-腺苷同型半胱氨酸特异地结合。但是，如上边4)所述，2005年那株抗SAH单克隆抗体有可能跟原料同型半胱氨酸有交叉反应，试验设计中没有考虑到没有完全反应的同型半胱氨酸对结果的影响，也没有实验数据证明反应是否完全。本发明的抗SAH单克隆抗体就是用来定量SAH含量的。我们采用的是较稳定的SAH钠盐做标准品，摈弃了酶学反应的不足之处，因为酶学反应容易受其它因素的影响。本发明也有实验数据证明我们所验证过的三个来源的SAH标准品得到的结果是一致的。

6)设计了更为严格的验证试验。

在2005年文献(见《中华检验医学杂志》2005年1月第28卷第1期第93页表1)中，没有计算出其抗体特异性即交叉反应的具体数值，SAM的交叉反应还是可以看出较明显的竞争抑制，但是交叉反应大于本发明的抗SAH单抗克隆抗体301。该项试验有以下几个问题：(1)该报道的交叉反应试验设计存在较大的问题，由于细胞培养上清分泌的抗体的量不可能一样，也不能准确估计其准确的含量，所以很难确定那些竞争性ELISA试验条件足够准确地得出可靠的结论。因为竞争性ELISA反应中抗体和竞争抗原的相对含量需要在比较合适的情况下，才能看出竞争性抑制。用上清做竞争交叉得出的结论很不可靠。(2)竞争性游离抗原应该用跟SAH一样的浓度或高于SAH浓度才能安全地准确地得出与SAH抗体没有交叉反应的结论，而那个表2的腺苷用的浓度为0.05mM,SAH为0.1mM,腺苷浓度明显低于SAH的浓度，结果不能排除该SAH抗体与腺苷存在交叉反应的可能。

7)此外，2005年文献中提到的鼠抗SAH单克隆抗体，OD450值很低，充分反映了该株抗体的亲和力和特异性都不好。

以上特异性，亲和力，效价都是反映单抗是否有用的重要指标。我们得到的301单克隆抗体细胞株在以上各个方面都优于2005年发表文章中提到的鼠抗SAH单克隆抗体。与此同时，由于本发明的单克隆抗体301的以上特性，可以用于测量生物体内的甲基化指数，这是2005年论文中的单克隆抗体所无法实现的。

2.美国abcam公司有兔抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体出售。与之相比较，本发明中的鼠抗SAH单抗有如下优越之处：

我们的鼠抗SAH单克隆抗体在免疫检测中(如竞争性ELISA)的检测灵敏度明显高于兔抗SAH单抗的(兔抗SAH单抗的检测下限260nM,我们的鼠抗SAH单抗的检测下限是15-30nM)。由于正常人血浆中SAH含量很低，这就对检测方法的灵敏度有较高的要求，在免疫检测中，单克隆抗体的特殊性质是决定检测灵敏度最重要的因素。因而我们可以说我们的细胞株有其独特的特性。

本发明的技术方案还带来了以下的技术进步：

(1)本发明的单克隆抗体301与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的特异性，与类似物交叉反应很小，可以忽略不计。具体地参见本发明中的数据部分。

(2)本发明的单克隆抗体301与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的灵敏度。具体地，本发明的鼠抗SAH单克隆抗体301对SAH的检测下限是15-30nM，比现有的兔源抗SAH单克隆抗体的灵敏度高10倍以上，对于低浓度下SAH含量检测有重大意义，否则无法知道不同样品中SAH到底有多低。尤为重要的是，用LC-MS/MS方法检测正常血浆中SAH含量在20-80nM,现有兔抗SAH单克隆抗体无法分开正常人和SAH含量低于260nM的病人样品。这表明，本发明的单克隆抗体301率先使用单克隆抗体法实现了LC-MS/MS方法的灵敏度，得到了灵敏度高且特异性强的单克隆抗体和使用该抗体的免疫检测方法，并由此开发了快速简易的免疫检测产品。

(3)该细胞株及其产品第一次使得免疫方法检测生命代谢活动过程中甲基化指数(即S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的比值)成为可能。免疫学方法已经被公认是非常灵敏，特异，精确，快速，简单而通用的实验技术，能够以较低的花费在临床应用中普及。因而，本发明中获得的抗SAH单克隆抗体细胞株将有很大的实用性和应用前景。

(4)直接性竞争酶联免疫吸附试验比间接性竞争酶联免疫吸附试验结果更稳定，检测灵敏度更高。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1抗SAH鼠单抗301做间接法竞争性酶联免疫吸附试验的结果。S-腺苷同型半胱氨酸标准品(SAHNa),S-腺苷蛋氨酸(SAM),腺苷(Ade),同型半胱氨酸(H-Cys),左旋半胱氨酸(L-Cys),谷胱甘肽(GST),胱硫醚(L-CTT)和适当稀释的抗SAH单克隆抗体，孵育后，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，孵育后加入TMB底物显色。A为加了竞争抗原孔在450nm波长下的OD值，A0是零竞争孔在450nm波长下的OD值。

图2本发明中的鼠抗SAH单克隆抗体和兔抗SAH单克隆抗体灵敏度比较的图。

图3本发明中的抗SAH单克隆抗体301-1与S-腺苷蛋氨酸(SAM,Sigma目录号A2408，即对苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸)的交叉反应率测定结果。该曲线的纵坐标是LnP，其中P＝(A/A0)/(1-A/A0)。横坐标是LogM，其中M是游离SAH竞争物的摩尔浓度。

图4abcam的兔抗SAH单克隆抗体与S-腺苷蛋氨酸(SAM)的交叉反应率测定的结果。该曲线的纵坐标是LnP，其中P＝(A/A0)/(1-A/A0)。横坐标是LogM，其中M是游离SAH竞争物的摩尔浓度。

图5 A，用301抗体在健康乳腺组织中做免疫组织化学结果的图，棕色区域表明在细胞核和胞浆有SAH强阳性染色；B:用301抗体在乳腺癌组织中做免疫组织化学，胞浆和细胞核区域显示为SAH阴性(或弱背景染色)；C:用301抗体在健康肾脏组织中做免疫组织化学，棕色区域表明在细胞核和胞浆有SAH强阳性染色；D:用301抗体在肾癌组织中做免疫组织化学，胞浆和细胞核区域显示为SAH阴性(或弱背景染色)。

图6流式细胞术分析的对照图，其中肝细胞系L02和肝癌细胞系Hep G2做空白染色，没有加抗SAH抗体。

图7肝细胞系L02和肝癌细胞Hep G2用抗SAH单克隆抗体(301-1)染色结果比较图，其中Hep G2细胞系染色后的荧光信号比L02细胞系的荧光信号低，表明癌变会导致细胞内SAH浓度下降。

图8A中显示了正常人血清中SAM的含量结果，横坐标是血清SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共82例)。

图8B中显示了正常人血清中SAH的含量，横坐标是血清SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共82例)。

图8C中显示了正常人血清甲基化指数，横坐标是血清甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共82例)。

图9A中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清中SAM的含量，横坐标是血清SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图9B中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清中SAH的含量，横坐标是血清SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图9C中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清甲基化指数，横坐标是血清甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共20例)。

图10A中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清中SAM的含量，横坐标是血清SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图10B中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清中SAH的含量，横坐标是血清SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图10C中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清甲基化指数，横坐标是血清甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共20例)。

图11A中显示了正常人血浆中SAM的含量，横坐标是血浆SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共310例)。

图11B中显示了正常人血浆中SAH的含量，横坐标是血浆SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共310例)。

图11C中显示了正常人血浆甲基化指数，横坐标是血浆甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共310例)。

图12A中显示了肝炎病人血浆中SAM的含量，横坐标是血浆SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共24例)。

图12B中显示了肝炎病人血浆中SAH的含量，横坐标是血浆SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共24例)。

图12C中显示了肝炎病人血浆甲基化指数，横坐标是血浆甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共24例)。

图13是胶体金试纸条测定尿液中SAH含量的结果的图，A：是阴性对照(PBS)，B:尿液用PBS进行100稀释尿液后上样，C:尿液用PBS进行10稀释尿液后上样，D:未经稀释的尿液上样。

具体实施方式

实施例1：抗原SAH-BSA的制备

本实施例中所使用的化学试剂和材料购买途径如下：

SAH购自成都诺维生物科技有限公司；BSA，牛血清蛋白，购自SIGMA公司；EDC.HCl购自SIGMA公司；N羟基丁二酰亚胺购自SIGMA公司；透析袋截留小孔径为8000-12000，购自北京博奥拓达科技有限公司；以及10mM PBS磷酸盐缓冲液(pH为7.4)为自行配制。

在反应瓶中顺序加入5mg SAH、28.8mg BSA、14.96mg EDC.HCl、5.3mg N羟基丁二酰亚胺和5mL(10mM，pH7.4)PBS，并在磁力搅拌下反应6个小时。反应物装透析袋对pH 7.4，10mM的PBS透析24小时，期间换液3次。透析完毕，确定体积，浓度，分装，冻存备用，从而制备得到BSA-SAH水剂。

实施例2：杂交瘤和单克隆抗体的制备

所使用的8周龄雌性BALB/C小鼠，购自中国科学院动物所。

所使用的试验试剂：弗氏完全佐剂，购自SIGMA公司；BSA，牛血清蛋白，购自SIGMA公司；BSA-SAH水剂，按照实施例1制备；RPMI 1640液，购自GIBCO公司；PEG 4000，购自北京拜尔迪生物公司；SP2/0骨髓瘤细胞，购自上海研域生物科技有限公司；多聚赖氨酸-SAH偶联抗原，购自Sigma公司；酶联板，购自北京拜尔迪公司；羊抗鼠-HRP二抗，其购自南京生兴生物；HAT选择培养液，其购自SIGMA公司；矿物油，购自SIGMA公司；牛血清白蛋白偶联的SAH，购自Sigma公司。

试验仪器：酶标仪Multiskan FC酶标仪，购自热电科学仪器公司。

取一组6只8周龄雌性BALB/C小鼠，每只小鼠分多点皮下注射前文所述的接种试剂，接种按照表1进行。每次接种0.3mL的接种试剂，其中含有BSA-SAH 100微克。

表1 BALB/C小鼠接种抗原SAH-BSA的接种方案

第0天每只小鼠给予100ug的剂量(弗氏完全佐剂乳化)(皮下注射，总量为100微克/只)

第21天每只小鼠给予100ug的剂量(不完全佐剂乳化)(皮下注射，总量为100微克/只)

第36天每只小鼠给予100ug的剂量(不完全佐剂乳化)(皮下注射，总量为100微克/只)

第50天每只小鼠给予100ug的剂量(不完全佐剂乳化)(皮下注射，总量为100微克/只)

第55天断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠

第65天用抗原水剂加强

第68天取脾，与SP2/0融合

第80天阳性细胞做亚克隆

第86天筛选亚克隆细胞上清，阳性单克隆孔细胞转24孔板培养

其中，第0天接种到小鼠的弗氏完全佐剂乳化接种试剂(Sigma)按照以下方法来制备：取1mL按照实施例1制备的BSA-SAH水剂，加入1mL弗氏完全佐剂，并使用高速分散器充分乳化，得到待注射的接种试剂。

其中，第55天，用免疫检测方法筛选上清是否有抗SAH的单克隆抗体。其测抗体效价的方法如下：取1微克/mL的多聚赖氨酸-SAH偶联抗原，按100微升/孔加入到酶联板中进行包被，在4度下孵育过夜，并洗板。随后使用130微升/孔的0.5％BSA-PBS进行封闭，随后甩干。

在孔中加入每种融合细胞的培养基上清液100微升，37度下孵育60分钟，并进行洗板。并在每孔中加入100微升/孔的羊抗鼠-HRP二抗，并在37度反应30分钟，随后洗板。最终进行底物(TMB)显色，终止反应并置于酶标仪上进行读数。

其中，第65天用于加强免疫的抗原是牛血清白蛋白偶联的SAH，没有佐剂。

其中，第68天，取脾，与SP2/0融合的步骤是按照如下的方法完成的：

A脾细胞制备：

a)取免疫血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈处死小白鼠；b)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾；c)把脾放入5ml RPMI 1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球；d)用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中；e)直立小试管3分钟，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中；f)以RPMI1640充满离心管，并以400g离心5分钟(与此同时应开始制备骨髓细胞)；g)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮；h)重复f,g步骤；i)计算细胞数。

B骨髓瘤细胞制备：

SP2/0骨髓瘤细胞提前5天复苏，增殖、传代。取约2×10⁷对数生长期的骨髓瘤细胞，在室温离心(400g)5分钟，沉淀以RPMI 1640液再悬浮并计数。

C饲养细胞：

取小鼠胸腺细胞做饲养细胞，其步骤如下：1)拉颈处死小鼠；2)70％酒精浸泡消毒10分钟；3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出胸腔；4)用剪刀取下胸腺，制成细胞悬液，加RPMI1640洗涤；5)1000RPM离心6分钟；6)弃上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。使每毫升含10万个活细胞；7)将饲养细胞按每孔100微升加入96孔培养版，放入CO₂培养箱培养，即可供细胞融合之用。

D细胞融合：

1)取小鼠脾细胞悬液，将1×10⁸小鼠脾细胞与2×10⁷SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000RPM离心5分钟；2)弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴(一小烧杯中)，准备融合；3)将37℃水浴中保温的50％PEG1.0毫升用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇离心管，使细胞保存在混匀状态；4)加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置60秒钟，立即在2-4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基(37℃)，开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用，注意尽可能不搅动细胞；5)再经1000rpm离心5分钟。弃去上清液，加60毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装到6块已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔100微升；6)将培养板放在水蒸汽饱和CO₂孵箱中，37℃孵育，CO₂含量为5％；7)第7天，取得培养板中的上清，并且用ELISA方法筛选上清。随后，将ELISA方法中表现为阳性孔中的细胞转入24孔板培养。长满后再次筛选，阳性孔细胞转入培养瓶，改用HT培养基(购自SIGMA公司)。

其中，步骤7)的ELISA方法如下：取1微克/mL的多聚赖氨酸-SAH偶联抗原，按100微升/孔加入到酶联板中进行包被，在4度下孵育过夜，并洗板。随后使用130微升/孔的0.5％BSA-PBS进行封闭，随后甩干。在孔中加入每种融合细胞的培养基上清液100微升，37度下孵育60分钟，并进行洗板。并在每孔中加入100微升/孔的羊抗鼠-HRP二抗，并在37度反应30分钟，随后洗板。最终进行底物(TMD)显色，终止反应并置于酶标仪上进行读数。

第80天，阳性细胞做亚克隆；

第86天，筛选亚克隆细胞上清，阳性单克隆孔细胞转24孔板培养，其方法如下：

E.杂交瘤细胞的克隆化；

将前一个步骤中得到的阳性孔细胞转移到转24孔板，2天后重复筛选，方法同上。按照前文同样的方法将阳性的细胞转瓶，并换HT培养基。二天后复筛，方法同上。将阳性细胞做亚克隆，融合阳性细胞冻存保种。继续培养，细胞数到10⁶后，接种小鼠腹腔(小鼠为BALB/C小鼠，小鼠提前1周腹腔注射矿物油，0.5mL/只)，10天后收获腹水鉴定。其中，所述的阳性细胞亚克隆包括步骤：将细胞浓度稀释到10个/Ml，按100微升/孔细胞悬液加入到96板培养。6天后按上述方法筛选上清，挑选阳性单个克隆的孔，将细胞转到24孔板培养(培养基为含20％胎牛血清的RPMI1640)，长满后转入培养瓶培养，

F.单克隆抗体的检定；

G单克隆抗体的大量制备；

H杂交瘤细胞的大量繁殖：6天后筛选亚克隆细胞上清，阳性单克隆孔细胞(方法同前)，转24孔板培养(培养基为含20％胎牛血清的RPMI1640)，长满后转瓶。

取BALB/C小鼠，提前1周腹腔注射矿物油(购自SIGMA公司)，0.5ML/只。接种量1X10⁶/只接种小鼠腹腔，制备腹水。测腹水的抗体效价，具体步骤如下：将1微克/mL多聚赖氨酸-SAH偶联抗原按照100微升/孔加入酶联板中在包被酶联板，4度过夜进行包被，并洗板。随后按照130微升/孔加入0.5％BSA-PBS进行封闭，并随后甩干。将腹水上清按照1:1000稀释，然后再稀释到1:10000。将最终稀释液，取按照100微升/孔加入酶联板中，在37℃下孵育60分钟，并进行洗板，再按照100微升/孔加入羊抗鼠-HRP二抗，并且在37℃下反应30分钟，洗板并进行底物显色和终止反应，在酶标仪上读数(具体操作方法按照二抗说明书进行)。将OD值高于阴性对照孔2倍的对应孔腹水稀释倍数，作为腹水最高效价。

融合试验的具体步骤如下：见第6天后筛选检测上清，取多聚赖氨酸-SAH偶联抗原1微克/ML，按照100微升/孔包被酶联板，4度过夜，洗板。加入130微升/孔0.5％BSA-PBS封闭，甩干并取融合细胞上清100微升，在37℃下孵育60分钟后洗板，加100微升/孔的羊抗鼠-HRP二抗，并且在37℃下反应30分钟，洗板，进行底物显色，终止反应并进行酶标仪读数(具体操作方法按照二抗说明书进行)。

实施例3：单克隆抗体301的交叉反应试验

本实施例中所使用的化学试剂的来源如下：

S-腺苷同型半胱氨酸标准品(SAHNa)：购自Sigma-Aldrich公司；S-腺苷蛋氨酸(SAM)：购自购自Sigma-Aldrich公司；腺苷(Ade)：购自购自Sigma-Aldrich公司；同型半胱氨酸(H-Cys)：购自购自Sigma-Aldrich公司；左旋半胱氨酸(L-Cys)：谷胱甘肽(GST)：购自购自Sigma-Aldrich公司；胱硫醚(L-CTT)：购自购自Sigma-Aldrich公司；BSA-SAH抗原：按照实施例1的方法制备；HRP偶联的羊抗鼠IgG抗体：1:2000稀释的抗SAH单克隆抗体：按照实施例2的方法制备的抗SAH单克隆抗体稀释得到。

将96孔板用0.5μg/ml BSA-SAH抗原包被(BSA-SAH溶于50mM碳酸盐缓冲液,pH9.6中，加100ul到96孔板中，4℃过夜)，方法与实施例2中的包被方法相同。

在96孔板中加入连续稀释(具体稀释浓度见表2所示)的S-腺苷同型半胱氨酸标准品(SAHNa),S-腺苷蛋氨酸(SAM),腺苷(Ade),同型半胱氨酸(H-Cys),左旋半胱氨酸(L-Cys),谷胱甘肽(GST),胱硫醚(L-CTT)和1:2000稀释的抗SAH单克隆抗体301，用HRP偶联的羊抗鼠IgG抗体显色。A为加了竞争抗原孔在450nm波长下的OD值，A0是零竞争孔在450nm波长下的OD值。测量结果见图1。

表2是301单克隆抗体交叉反应试验的结果，其中表中数据为各个浓度下的OD450数值,即酶联仪读取96孔板样品反应后在450纳米波长下的光密度值。可以看出，SAH小分子钠盐(不同来源的SAH已被证实得到过同样的结果)能在竞争性酶联免疫吸附试验中在较低剂量时明显抑制抗体与酶联板上包被的SAH结合，因而OD450值降低(即是抑制)，而其它类似物未能抑制抗SAH抗体与酶联板上的SAH结合，OD450较高。

表2：鼠单克隆抗体301与SAH及其类似物的竞争抑制反应

浓度(nM)	SAHNa	SAM	H-Cys	L-Cys	Ade	GST	L-CTT
								0.545	1.6355	1.7060	1.7089	1.8497	1.7278	1.7995	1.8097
5.45	1.5484	1.6159	1.7078	1.7760	1.6811	1.7676	1.7635
								54.5	1.5035	1.5907	1.6586	1.7391	1.6976	1.7407	1.7608
545	0.9159	1.5433	1.6452	1.7690	1.6734	1.7079	1.7058
								5450	0.1199	1.4930	1.6586	1.7101	1.6648	1.6891	1.7228
17985	0.0608	1.3450	1.6250	1.6596	1.6199	1.6623	1.6877
								54500	0.0430	1.1450	1.5714	1.6399	1.6198	1.6259	1.6960

以上数据标明，本发明的单克隆抗体对S-腺苷同型半胱氨酸具有明显的特异结合，而对其他的SAH类似物，几乎没有交叉反应。对于SAM，直到5450nM以上才出现可观测的竞争抑制。由此可见，本发明的单克隆抗体具有特异性好，假阳性反应少的优点。

实施例4：单克隆抗体301灵敏度测量

美国abcam公司有兔抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体出售。

本实施例中所使用的酶标仪Multiskan FC酶标仪购自热电科学仪器公司。与之相比较，本发明中的鼠抗SAH单抗有优越之处。

如前述方法，用本发明的单克隆抗体和abcam兔抗体在同一块酶联板上分别做标准曲线(间接法竞争性ELISA)。结果算出本发明的单克隆抗体检测下限大约为62.5nM,而兔单抗的检测下限大约为250nM(见表3，也见图2)。在图2中，以前面图1所述方法用301-1(系从克隆301进一步亚克隆得到的杂交瘤细胞株或该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体)和abcam兔抗体在同一块酶联板上分别做标准曲线(间接法竞争性ELISA)。结果算出301-1抗体检测下限为62.5nM,而兔单抗的检测下限是250nM。把辣根过氧化物酶标记到301-1上，用直接法做竞争性ELISA测定SAH的含量,检测下限则为15nM(参见表3)。

表3 鼠SAH单抗301和兔SAH单抗的在间接竞争性ELISA中标准曲线

SAHNa(nM)	301标曲	301标曲	301标曲	abcam标曲	abcam标曲	abcam标曲
							0	1.7687	1.7633	1.8171	1.7213	1.7250	1.7124
62.5	1.6395	1.5558	1.7000	1.7778	1.7715	1.7448
							125	1.5254	1.4440	1.5292	1.6749	1.6317	1.7196
250	1.3488	1.3158	1.3423	1.6443	1.6309	1.6857
							500	1.1438	1.0739	1.1513	1.5012	1.5624	1.5742
1000	0.8432	0.8699	0.8321	1.3908	1.3536	1.8631
							2000	0.5330	0.5206	0.5249	1.1513	1.0944	1.1560
空白	0.0579	0.0523	0.0504	0.0488	0.0484	0.0512

把辣根过氧化物酶直接标记到本发明的单克隆抗体上，用直接法竞争性ELISA测定SAH的含量,检测下限则大约为15nM(见表4-1和4-2)。

表4-1 用301单抗以直接法竞争性ELISA检测灵敏度计算

表4-2 用301单抗以直接法竞争性ELISA检测更敏感

SAHNa(nM)	301-HRP(1:1000	301-HRP(1:1000)	抑制率
				0	1.0685	1.0274	0％
15.625	0.8368	0.9083	14.16％
				31.25	0.8701	0.8734	17.86％
62.5	0.7413	0.7357	31.37％
				125	0.6036	0.6376	43.33％
250	0.4761	0.5052	56.50％
				500	0.3587	0.3708	69.27％
空白	0.0672	0.0559

曲线的最低检测下限(即灵敏度)，是零竞争OD450减去其2倍标准差(95％可信区间)得到的OD450带入曲线方程求出的浓度就是该曲线的最低检测下限。如以上表4-1所示，2倍标准差为0.0675，平均零竞争OD450是0.8697，减去0.0675等于0.8022，与15.625nM标准品的OD450即0.8098很接近，15.625nM时的抑制率是6.88％。该实验中，虽然7.8125nM浓度时抑制率为10.22％，但考虑到实验误差，认为最低检测下限为15.625nM左右，但是不排斥有时可以达到大约8nM左右。如果由于实验操作误差，如果平行不太好，标准差较大，超过合理值的时候，可以用抑制率界定，根据众多实验的总结，我们认为抑制率7-10％时的OD450与零竞争OD450减去2倍方差得到的OD450相一致，所以也可以用抑制率在7-10％的OD450带入曲线方程求出的浓度推算最低检测下限，即灵敏度。这个灵敏度值是反复多次实验的结果。与包被抗原浓度，抗体用量有一定的关系。

表4-2结果显示标准品在15.625nM时抑制率为14.16％进一步证明灵敏度可能低于15nM，在8-15M之间。

由以上的数据可见，我们的鼠抗SAH单克隆抗体在免疫检测中(如竞争性ELISA)的检测灵敏度明显高于兔抗SAH单抗的(参考文献的兔抗SAH单抗的检测下限260nM,我们的鼠抗SAH单抗的检测下限是15nM)。由于正常人血浆中SAH含量很低，这就对检测方法的灵敏度有较高的要求，在免疫检测中，单克隆抗体的特殊性质是决定检测灵敏度最重要的因素。因而我们可以说我们的细胞株有其优异的特性。

实施例5：单克隆抗体301与abcam兔SAH单克隆抗体的特异性比较

交叉反应试验是鉴定抗体特异性的重要一环。与类似物交叉反应越小，该抗体的特异性越好。反之，与类似物交叉反应越大，该抗体的特异性越差。交叉反应而言，本发明的鼠单抗301和兔单抗均比2005年文献发表的那株鼠单抗要低，就是说本发明所产生的抗SAH单抗的特异性非常好。如以上所述，2005年文献描述的鼠抗SAH单抗极有可能与腺苷，同型半胱氨酸，甚至S-腺苷蛋氨酸都存在较大的交叉反应。特异性不好的抗体或单克隆抗体杂交瘤细胞株都是不可取的，将没有什么实际用途。

在本实施例中，参见图3和图4及其说明，在出现50％抑制时，P＝1,那么，LnP＝0,即y＝0。根据图3和图4的标准曲线，算出相应的横坐标X值(见表5)。由于X＝LogM,从X可以算出M,即标准品抗原浓度。交叉反应率的测定方法是通过标准曲线分别算出游离的SAHNa和SAM分别抑制50％的一定量的301鼠抗体或abcam的兔单抗与酶联板上包被的SAH的结合的情况时，所需竞争物的浓度之比(见表5)。

表5 鼠SAH单抗和兔SAH单抗的在竞争性ELISA中50％抑制时的浓度和交叉反应

实施例6竞争性ELISA测定血浆SAH含量

本发明中的301单克隆抗体能够有效而特异性地识别血清，血浆，尿液和人体组织中的SAH小分子物质(包括游离型SAH小分子)，而参考文献中的兔抗SAH单抗非特异地与血浆中一些不明物质结合或其它因素干扰，导致无法测出血浆中SAH的含量。

使用参考文献中的兔单克隆抗体对常见生物样品进行了竞争性ELISA检测。以下表6中的结果显示所有血浆样品，均存在非特异性的过度抑制(OD450显色值地表示竞争抑制)，因此，该兔抗SAH单克隆抗体不能用于测定血浆中SAH的含量。

其中，以下生物样品的取得途经为：

血样2-6表示那几排加样孔加的都是EDTA抗凝的血浆样品(来源于血站资源献血者)。同样的样品，用本发明中的301单抗，检测结果见表7。

表6 用兔抗SAH抗体的竞争性ELISA测定血浆样品的结果

SAHNa(nM)	标准曲线1	标准曲线2	标准曲线3	血样2	血样3	血样4	血样5	血样6
									0	2.7022	2.6268	2.4897	0.0961	0.0647	0.0717	0.0767	0.0643
200	2.5435	2.4290	2.3955	0.0818	0.0607	0.0883	0.0775	0.0722
									400	2.2895	2.1410	2.1543	0.0698	0.0630	0.0814	0.1294	0.1019
800	2.1034	1.9980	1.9415	0.0729	0.0652	0.0710	0.1314	0.1050
									1600	1.6939	1.5769	1.6688	0.1114	0.0670	0.0796	0.0674	0.1629
3200	1.3570	1.2130	1.1829	0.1115	0.0629	0.0753	0.0640	0.1687
									空白	0.0509	0.0462	0.0591	0.1408	0.1276	0.0669	0.0899	0.0711

表7 用鼠抗SAH抗体(301-1)的竞争性ELISA测定血浆样品的结果

SAHNa(nM)	标准曲线1	标准曲线2	标准曲线3	血样2	血样2	血样3	血样3	血样4
									0	1.3506	1.4103	1.4945	0.6753	0.7617	0.6388	0.7291	0.6325
62.5	1.1059	1.2977	1.2492	0.6301	0.7562	0.5905	0.6530	0.5662
									125	0.9746	1.1846	1.0755	0.5499	0.6634	0.5947	0.6539	0.5962

250	0.9361	0.9971	0.9406	0.5964	0.7009	0.6282	0.6599	0.5638
									500	0.6520	0.8102	0.7329	0.6019	0.7014	0.5682	0.6098	0.5246
1000	0.4452	0.5409	0.4607	0.5504	0.6561	0.6318	0.6804	0.4663
									2000	0.2957	0.3712	0.3028	0.6537	0.7889	0.6102	0.6313	0.5645
空白	0.0886	0.1214	0.0846	0.6096	0.7308	0.6224	0.6100	0.6203

从上述比较可以看出，兔抗SAH抗体呈现非特异性抑制(OD450很低)，提示该兔抗SAH抗体受血浆中的某些成分影响较大。但是本发明中阐述的鼠抗SAH单克隆抗体301-1不受血浆中特殊因素的影响，能够测出血浆中的SAH的含量。

实施例7单克隆抗体301用于免疫组化检测、流式细胞术分析、酶联免疫检测，快速 胶体金检测

该细胞株产生的抗SAH单克隆抗体还被证实用于病理切片检测，流式细胞技术，酶联免疫检测，快速胶体金技术等实际应用领域。

1.免疫组化或免疫细胞染色实验

免疫组化或免疫细胞染色实验方法如下(实验结果显示在图5中)：

细胞涂片固定后或组织病理(乳腺癌，肾癌及其癌旁组织)切片脱蜡后，用1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，然后加入1:20的鼠抗SAH单克隆抗体约60分钟。以TBST(50mM的Tris盐酸pH 7.6,150mM氯化钠,0.05％吐温-20)洗2次。切片用辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG孵育(美国Southern Biotech,AL)2小时。用TBST洗2次，加入底物显色。最后切片在用苏木精染色，脱水，封片，显微镜(Olympus CX41-72C02)下观察并照相。

2.流式细胞术

流式细胞术分析步骤(其试验结果显示在图6和图7中)：

本发明所使用的流式细胞仪为Becton Dickinson流式细胞仪。

1)收集1x10⁶正常肝细胞株L-02和肝癌细胞株Hep G2细胞作为一个样品，并且在1200rpm下离心8分钟；2)将细胞使用1X PBS洗涤两次；3)加入4％的多聚甲醛1ml，混匀并且在4摄氏度下孵育1小时进行固定；4)将细胞使用1X PBS洗涤两次；5)破膜：加入0.5mL的破膜液(0.2％丙酮)在4摄氏度下孵育15分钟；6)将细胞使用1X PBS洗涤两次；7)在室温下向每个样品中加入山羊血清(美国Southern Biotech,Burmingham,AL)；8)加入本发明的单抗，在4摄氏度下过夜，所使用的单抗为1:400稀释的(800微升的山羊血清中加入2微升的单克隆抗体)；9)将细胞使用1X PBS洗涤两次；10)加入1:500稀释的二抗(美国SouthernBiotech,Burmingham,AL)每孔500微升，并且在室温下孵育40分钟；11)将细胞使用TBST(50mM的Tri s盐酸pH 7.6,150mM氯化钠,0.05％吐温-20)和PBST洗涤两次；12)在细胞中加入1％多聚甲醛，每孔400微升，完成样品的制备。

随后进行细胞的流式细胞法分析，其操作方法按照仪器说明书为准。

3.胶体金快速分析法

胶体金快速分析法的方法如下，实验结果显示在图13中。

(1)煮金

材料为：10％氯金酸10ml(其制备方法为：取1g氯金酸，溶于10ml水中，4℃保存)；4ml柠檬酸钠溶液(称取一定量的柠檬酸钠，溶于4ml水中，充分混匀，得到1％的柠檬酸钠溶液)。

仪器设备为电热套。

操作步骤包括：1)向圆底烧瓶中加入1.2L水及搅拌子，加热煮沸5min；2)向烧瓶中加入4.8ml 10％氯金酸溶液，煮沸10min；3)向烧瓶中迅速加入现配的柠檬酸钠溶液，煮沸10min后冷却，RT保存。

(2)金标抗体的制备

材料为按照前文所述的方法所制备的胶体金、本发明的单克隆抗体301、50ml0.2M K₂CO₃(称取1.382g K₂CO₃，用水定容至50ml)、50ml 10％BSA(称取5g BSA，用水定容至50ml)、1000ml洗液(称取5.37g磷酸氢二钠，0.78g磷酸二氢钠，2g BSA和0.4g酪蛋白，加入到1000ml洁净烧杯中，充分混匀，用洁净的量筒量取1000ml去离子水加入烧杯中，充分搅拌混匀，然后一边搅拌一边依次加入1g PVP-360，1g PEG-20000，5g叠氮钠和3ml Tween-20，充分搅拌至完全溶解(可过夜)，装入试剂瓶中4℃保存)、悬浮液(称取25g蔗糖，10g BSA，0.2g酪蛋白，加入500ml烧杯中，将干粉混匀之后再加入500ml去离子水，充分搅拌混匀，然后一边搅拌一边依次加入0.5g PEG-20000，0.5g PVP-360，1.45g氢氧化钠，3.03g Tris，3.2g柠檬酸，0.5g叠氮钠和25ml吐温20，搅拌过夜使其充分溶解，然后装入试剂瓶中4℃保存)。

使用仪器：超声波细胞粉碎机(上海豫明仪器有限公司)，高速冷冻离心机(济南博鑫生物技术有限公司)。

操作步骤包括：1)取5ml胶体金溶液加入10ml离心管中，加适量K₂CO₃，调节pH至抗体的等电点，充分混匀(颠倒摇匀20次以上)；2)向离心管中加入适量抗体，使胶体金溶液(5ml)中的抗体浓度为12μg/ml，迅速混匀(颠倒摇匀20次以上)，静置20min；3)向离心管中加入100μl 10％BSA溶液，迅速混匀(颠倒摇匀20次以上)，静置15min；4)12000rpm离心40min，弃上清液；5)加入3ml洗液，超声混匀(30％功率，5-10次)6)12000rpm离心40min，弃上清液；7)加入1.5ml悬浮液，超声混匀，4℃保存。

注意事项如下：

1)使用不同批次的胶体金和不同抗体需要加入K₂CO₃的量都不同，可通过预实验确定具体使用量，加入抗体后不严重变色即可。一般用量在20-60μl之间，如果加入K₂CO₃的量太大，很可能会影响抗体的标记，因此在保证不严重变色的情况下，要尽量选择较少的K₂CO₃使用量。

2)加入抗体和BSA后，需尽快混匀，避免小范围内抗体或BSA浓度过高，影响标记结果。

(3)制条

材料包括：包被液1000ml(1000ml 0.1M磷酸缓冲液(PB)中加入10g牛血清白蛋白(BSA)和50g海藻糖，充分搅拌混匀，然后装入试剂瓶中4℃保存)、划线抗体、PVC板、硝酸纤维膜(NC膜)、无纺布、玻璃纤维、吸水纸、样品垫处理液1000ml(称取6.057g Tris溶于1000mL去离子水中，用盐酸(6M)调节pH至9.0，配成0.05M Tris-HCl溶液，再加入2g酪蛋白(Casein)，充分搅拌混匀后装入试剂瓶中4℃保存)。

仪器设备：烘箱，切纸机，三维平面点膜喷金仪(上海金标生物科技有限公司)，微电脑自动斩切机。

操作：1)将划线抗体用包被液稀释成一定浓度，一般情况下双抗夹心用1mg/ml，竞争法用0.2-0.3mg/ml；2)将无纺布切成0.5布切成3的窄条作为金垫，每条无纺布均匀涂上500μl金标抗体，50℃烘干12-24h；3)将硝酸纤维膜(NC膜)贴在PVC板的中间位置，用点膜喷金仪在硝酸纤维膜上划线(1μl/cm),50℃烘干1h；4)在PVC板较窄的一侧贴上吸水纸(5较窄的一侧)，较宽的一侧贴上涂金后烘干的无纺布和样品垫(玻璃纤维膜，5，较宽的一)；5)用来检测尿液的试纸条，样品垫需要用样品垫处理液(10mM PBS,pH7.4,2％BSA,1％吐温-20,2.5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮)浸泡、烘干后使用，以保证抗原抗体反应时的pH不会过低；6)将贴好的PVC板用斩切机切成4mm宽的试纸条。

注意事项：为避免金垫烘干后返潮，4)及5)需在干燥室操作。烘干的金垫或做好的试纸条需放在干燥器中保存。

完成以上的金试纸条制备后，按照图13的实验设计，将做好的试纸条分别浸入PBS和各自的样品孔中，结果显示在图13中。图13胶体金试纸条测定尿液中SAH含量的结果这批胶体金试纸条是经过SAH系列标准品测试表明，SAH在500nM左右能完全抑制底部的试验条带。试纸条上边的条带是质控线，这条线应该出现，以表示试验系统正常A：是阴性对照(PBS)，B:尿液用PBS进行100稀释尿液后上样，C:尿液用PBS进行10稀释尿液后上样，D:未经稀释的尿液上样。可以看出未经稀释的尿样能够完全抑制试验线，说明尿样中SAH含量超过500nM,10倍稀释的尿样可以看见非常浅的条带，说明竞争抑制较明显，100倍稀释的试验线较明显，但也呈现一定程度的竞争抑制，因为比阴性对照的试验线浅。

实施例8含单克隆抗体301的酶联免疫检测试剂盒

本发明还提供了以下酶联免疫检测试剂盒：

本试剂盒仅供研究使用。

包装：96个试验

检测范围：15.625nM-1000nM

本试剂盒用于测定相关液体样本中S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)含量。

实验原理：

本试剂盒用直接竞争法测定标本中S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)水平。用偶联的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)抗原包被微孔板，制成固相抗原，再向包被偶联抗原的微孔板中依次加入竞争S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，与HRP标记的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)抗体(ant i-SAH)。使偶联的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)固相抗原与竞争S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)竞争HRP标记的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)抗体(ant i-SAH)的结合位点。经过洗涤后加TMB底物显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D值)，通过标准曲线计算样品中的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)的浓度。

表8：试剂盒组成

标本要求：

1、样本采集全程控制温度在4℃，采集的样本应去除沉淀，采集后应尽快进行试验。若不能马上试验，应将样本放于-20℃保存，避免反复冻融。

2、不能检测含有NaN₃的样本，NaN₃抑制辣根过氧化酶(HRP)活性。

3、本检测对于某些样本ELISA检测基质效应较大，可用样本稀释液稀释后再检测，或用样本基质稀释标准品再进行检测。

操作步骤：

1、将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上,每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

2、加样：分别设空白孔(空白对照孔只加入样本稀释液不加入酶标抗体，其余步骤相同)、标准孔、待测样本孔。在酶标包被板上复孔加标准品每孔50ul，待测样品每孔50ul。

3、加入酶标抗体：用酶标抗体稀释液500倍稀释抗体，混合均匀之后每孔加入酶标抗体50ul，空白孔除外。

4、将微孔板在震荡器上，震荡片刻后用封板膜将板孔盖好，置于37℃水育箱中温育1小时。

5、洗涤：小心揭掉封板膜，小心吸出或倒出反应液后，加入洗涤液，静置30秒后弃去洗涤液，反复洗涤3次，洗涤液量每次每孔不少于300ul，吸出或倒出洗涤液后拍干。也可用洗板机洗涤。

6、显色：将显色液A液与B液按1:1比例混匀，每孔加入100ul显色液，轻微震荡混匀，用封板膜将板孔盖好，置于37℃避光孵育15分钟。

7、终止：每孔加入终止液50ul，终止反应。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD450值)。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果计算：

将所有得到吸光度值A减去空白孔的吸光度值A_空。

标准品或样本的结合律等于标准品或样本的吸光度值的平均值(复孔)除以零竞争的吸光值A_S0(即S0标准品的吸光值)，即结合律＝A/A_S0。

A标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A_S1标准品的吸光值平均吸光度值

标准曲线绘制：以标准品结合律为纵坐标，对应的标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。用二次多项式拟合曲线方程(R²>0.99)，将样本结合律代入曲线方程，计算样本浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

注意事项

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD450值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

4、在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

5、每次测定标准曲线及样本，最好做复孔。标准曲线推荐用二次多项式拟合方程(R²>0.99)，QC质控品浓度应在浓度范围内。

6、样品如基质效应较大，出现OD450高于零竞争标准品OD450则应10倍以上稀释样本再次检测样本。如稀释后无法检测出样本含量，可用检测样本同样基质稀释标准品，再检测。

1、浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

2、封板膜只限一次性使用，避免交叉污染。

3、底物请避光保存。

4、反应终止液为稀硫酸，避免接触皮肤。

保存条件及有效期

试剂盒保存：2-8℃，有效期：6个月

实施例9：包含单克隆抗体301的快速胶体金检测的试剂盒

本发明还提供了用于快速胶体金检测的试剂盒，其中使用本发明的单克隆抗体301制备成的胶体金试纸来检测待测样品中是否含有SAH。

本发明的胶体金试纸试剂盒包括以下的组件：

(1)按照实施例7制备的胶体金试纸；

(2)样品垫处理液，其组成为：10mM PBS,pH7.4,2％BSA,1％吐温-20,2.5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮)；

(3)使用说明(使用方法参见实施例8)。

实施例10：使用单克隆抗体301生命代谢活动过程中甲基化指数

很多研究表明，甲基化指数，即SAM/SAH，在很多疾病或状态(癌症，肝炎，肝硬化，维生素B12和叶酸缺乏，神经变形性疾病如抑郁症，巴金森氏病，老年痴呆等，艾滋病伴发的肺囊虫肺炎等等)的发生，发展，治疗，预后中都有非常有指导意义的改变。对于一些疾病的诊断，预测，指导治疗都有指导意义。本发明同时也制备了鼠抗SAM的单克隆抗体。我们用直接竞争性酶联免疫吸附试验，同时测定肝炎病人，巴金森和抑郁症病人的血浆和血清样品的SAM和SAH含量，进而算出甲基化指数。

血浆样品样品收集方法：病人或正常受试者需要禁食至少8小时。采集大约5毫升静脉血到EDTA抗凝管，摇匀后马上放到含有冰水混合物的容器中。在采血后的30分钟内，做以下步骤：预先将离心机冷却到4摄氏度，将采血管直接放到合适的转头中，以2850-4100g离心10-15分钟。迅速将血浆全部转移到Eppendorf管中，然后标记，分装,置于-20℃或-80℃冻存。

血清样品样品收集方法：病人或正常受试者需要禁食至少8小时。采集大约5毫升静脉血到试管，放置到4℃冰箱2小时左右，待血液自然凝集后，吸出上清(如分离不好，可以在4℃，以2000-4100g速度离心10分钟，再吸取上清)。迅速将血清全部转移到Eppendorf管中，然后标记，分装,置于-20℃或-80℃冻存。

图8A中显示了正常人血清中SAM的含量结果，其试验方法如下：用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.05μg/ml多聚赖氨酸偶联的S-腺苷蛋氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00201)包被酶联板，洗板，封闭后，加入S-腺苷蛋氨酸标准品(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号AST00201)25ul(以混合正常人血浆为基质来稀释标准品和样品),1:12000的HRP标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号MAH00201)75ul，于37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血清SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共82例)。

图8B中显示了正常人血清中SAH的含量，其使用用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.5μg/ml牛血清白蛋白偶联的-腺苷同型半胱氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00301)包被酶联板，洗板，封闭后，加入S-腺苷同型半胱氨酸标准品(ArthusBiosystems,Richmond,CA.目录号AST00301)50ul(以混合正常人血浆为基质来稀释标准品和样品),1:500的HRP标记的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体(301)50ul，于37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血清SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共82例)。

图8C中显示了正常人血清甲基化指数，用直接竞争性酶联免疫吸附试验同时测定血清中SAM和SAH含量，计算甲基化指数(SAM/SAH是血清甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共82例)。

图9A中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清中SAM的含量，其用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.05μg/ml多聚赖氨酸偶联的S-腺苷蛋氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00201)包被酶联板，洗板，封闭后，加入血清样品25ul(以混合正常人血浆为基质来稀释标准品和样品),1:12000的HRP标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体(ArthusBiosystems,Richmond,CA.目录号MAH00201)75ul，于37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血清SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图9-B中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清中SAH的含量，其用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.5μg/ml牛血清白蛋白偶联的S-腺苷同型半胱氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00301)包被酶联板，洗板，封闭后，加入血清样品50ul(以混合正常人血浆为基质来稀释标准品和样品),1:500的HRP标记的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体(301)50ul，于37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血清SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图9-C中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清甲基化指数，用直接竞争性酶联免疫吸附试验同时测定血清中SAM和SAH含量，计算甲基化指数。横坐标是血清甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共20例)。

图10-A中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清中SAM的含量用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.05μg/ml多聚赖氨酸偶联的S-腺苷蛋氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00201)包被酶联板，洗板，封闭后，加入血清样品25ul(以混合正常人血浆为基质来稀释标准品和样品),1:12000的HRP标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号MAH00201)75ul，于37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血清SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图10-B中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清中SAH的含量，其用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.5μg/ml牛血清白蛋白偶联的S-腺苷同型半胱氨酸(ArthusBiosystems,Richmond,CA.目录号ACT00301)包被酶联板，洗板，封闭后，加入血清样品50ul(以混合正常人血浆为基质来稀释标准品和样品),1:500的HRP标记的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体(301)50ul，在37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血清SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共20例)。

图10-C中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清甲基化指数，用直接竞争性酶联免疫吸附试验同时测定血清中SAM和SAH含量，计算甲基化指数。横坐标是血清甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共20例)。

把以上图8-10中的甲基化指数总结起来，见表9：

表9 血清甲基化指数(M/H)(用混合很多例正常人灭活血浆作为稀释样品和标准品基质)

从比较以上图8和图9结果可以看出，抑郁症和巴金森氏病患者的血清甲基化指数(75％病例小于1，最高的不超过1.9，最低0.03)，明显比正常人的(89％病例的甲基化指数大于1，最高的达到9，最低0.3)低。这提示甲基化指数降低与抑郁症和巴金森氏病有关系，也从另一个各方面给口服SAM有效治疗抑郁症和巴金森氏病等神经变性性疾病提供理论基础。可以认为，检测患者的甲基化指数对于抑郁症和巴金森氏病正确用药有较大的指导意义。

从比较以上图8和图10结果可以看出，脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化患者的血清甲基化指数(35％病例小于1，60％病例在1-2之间，最高的不超过2，最低约0.2)，明显比正常人的(89％病例的甲基化指数大于1，23％病例的甲基化指数在1到2之间，11％病例的甲基化指数小于1，最高的达到9，最低0.3)低。这提示甲基化指数降低与脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化有相关性。

以下是测定的血浆样品正常人和肝炎病人甲基化指数。

图11A中显示了正常人血浆中SAM的含量用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.05μg/ml多聚赖氨酸偶联的S-腺苷蛋氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00201)包被酶联板，洗板，封闭后，加入S-腺苷蛋氨酸标准品(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号AST00201)25ul,标准品和样品稀释液是以磷酸盐缓冲液为基质，即是0.5％BSA-PBST(10mM磷酸缓冲液,150mM氯化钠,0.1％吐温-20,pH 7.4),1:12000的HRP标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号MAH00201)75ul，在37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血浆SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共310例)。

图11B中显示了正常人血浆中SAH的含量用间接竞争性酶联免疫吸附试验：0.5μg/ml牛血清白蛋白偶联的-腺苷同型半胱氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00301)包被酶联板，洗板，封闭后，加入S-腺苷同型半胱氨酸标准品(ArthusBiosystems,Richmond,CA.目录号AST00301)50ul,标准品和样品稀释液是以磷酸盐缓冲液为基质，即是0.5％BSA-PBST(10mM磷酸缓冲液,150mM氯化钠,0.1％吐温-20,pH 7.4),1:500的HRP标记的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体(301)50ul，在37℃孵育90min后，洗涤三次后，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，在37℃孵育40分钟，洗涤三次后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血浆SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共310例)。

图11C中显示了正常人血浆甲基化指数用竞争性酶联免疫吸附试验同时测定血浆中SAM和SAH含量，计算甲基化指数。横坐标是血浆甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共310例)。

图12A中显示了肝炎病人血浆中SAM的含量，其用直接竞争性酶联免疫吸附试验：0.05μg/ml多聚赖氨酸偶联的S-腺苷蛋氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00201)包被酶联板，洗板，封闭后，加入S-腺苷蛋氨酸标准品(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号AST00201)25ul,标准品和样品稀释液是以磷酸盐缓冲液为基质，即是0.5％BSA-PBST(10mM磷酸缓冲液,150mM氯化钠,0.1％吐温-20,pH 7.4),1:12000的HRP标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号MAH00201)75ul，37℃孵育60min后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血浆SAM含量(nM),纵坐标是样品例数(总共24例)。

图12B中显示了肝炎病人血浆中SAH的含量，其用间接竞争性酶联免疫吸附试验：0.5μg/ml牛血清白蛋白偶联的-腺苷同型半胱氨酸(Arthus Biosystems,Richmond,CA.目录号ACT00301)包被酶联板，洗板，封闭后，加入S-腺苷同型半胱氨酸标准品(ArthusBiosystems,Richmond,CA.目录号AST00301)50ul,标准品和样品稀释液是以磷酸盐缓冲液为基质，即是0.5％BSA-PBST(10mM磷酸缓冲液,150mM氯化钠,0.1％吐温-20,pH7.4),1:500的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体(301)50ul，在37℃孵育90min后，洗涤三次后，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，在37℃孵育40分钟，洗涤三次后，加入TMB底物显色，在450nm波长下测定OD450值。横坐标是血浆SAH含量(nM),纵坐标是样品例数(总共24例)。

图12C中显示了肝炎病人血浆甲基化指数用竞争性酶联免疫吸附试验同时测定血浆中SAM和SAH含量，计算甲基化指数。横坐标是血浆甲基化指数,纵坐标是样品例数(总共24例)。

把以上图11-12中的甲基化指数总结起来，见表10：

表10 血浆甲基化指数(M/H)(用作为稀释样品和标准品的基质)

样品来源	例数	<0.5(％)	0.5-1(％)	>1(％)	最高值	最低值
							正常人	310	63	28	8	2.5	0.07

肝炎

24

92

8

0

1.3

0.02

图8，图9，图10是用正常人混合血浆做为基质测定血清样品，而图11和图12则是用磷酸缓冲液为基质定量血浆中SAM和SAH的含量。从图11和图12可以看出，标准品和样品用抗原稀释液(10mM磷酸缓冲液，0.5％BSA，0.1％吐温-20)为基质定量时，所测到的SAH含量比用正常人混合血浆做为基质时所测得的值偏高，而SAM含量比用正常人混合血浆做为基质时所测得的值偏低，因而用磷酸缓冲液为基质测定甲基化指数的值就比用正常人混合血浆做为基质时所测得的值偏低。但是对于将要比较的正常人和肝炎病人样品，由于样品收集以及SAM和SAH的检测条件一致，因而还是有可比性的。因为正常样品来源于自愿献血者，血样采集后没有马上处理并冻存，置于4度时间有2-3个小时，停留时间较长，SAM很有可能部分降解，在这样的条件下，63％病例的甲基化指数小于0.5(如果样品采集更严格的话，比例有可能会小于63％)；而肝炎病人则92％病例甲基化指数小于0.5。

综上所述，使用本发明的单克隆抗体301，可以测量得到待测样品中的甲基化指数，并且进一步地作为疾病诊断的依据。

Claims (14)

1.特异性结合S-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体301或者其抗原结合部分，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株301产生；并且所述的杂交瘤细胞株301产生保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014178，保藏日期为2014年9月15日。

2.一种杂交瘤，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014178，保藏日期为2014年9月15日。

3.一种组合物，其包含权利要求1的抗体或者其抗原结合部分。

4.一种酶联免疫检测试剂盒，其包含权利要求1的抗体或其抗原结合部分。

5.权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有：20倍浓缩洗涤液、酶标包被板、酶标抗体稀释液、酶标抗体、样品稀释液、显色液A液、显色液B液、终止液和封板膜。

6.一种用于检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试纸，其特征在于，所述的试纸包括权利要求1所述的单克隆抗体301或者其抗原结合部分。

7.一种检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(1)权利要求6所述的快速胶体金检测试纸；和(2)使用说明。

8.权利要求1所述的抗体或者其抗原结合部分、权利要求2所述的杂交瘤、权利要求3所述的组合物或者权利要求6所述的快速胶体金检测试纸在制备用于检测生物体的甲基化指数的试剂盒中的用途，所述的试剂盒用于检测样品中的SAH水平。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于诊断抑郁症、脑出血、脑栓塞、脑动脉粥样硬化病或者肝炎。

12.权利要求1所述的抗体或者其抗原结合部分、权利要求3所述的组合物、权利要求4或5所述的酶联免疫检测试剂盒、权利要求6所述的快速胶体金检测试纸或者权利要求7所述的快速胶体金检测试剂盒的非治疗或诊断目的的用途，其用于检测S-腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或其水平。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。