CN102348984A - 来自生物的生理活性物质的测定方法、用于实施该测定方法的程序以及来自生物的生理活性物质的测定装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供在利用内毒素等来自生物的生理活性物质与LAL的反应来检测上述生理活性物质或测定其浓度时，可以获得更高的测定精度的技术。在判定来自生物的生理活性物质与LAL的鲎反应的起始时刻、由该反应起始时刻求出上述来自生物的生理活性物质的浓度时，为了消除与鲎反应的状态无关地发生的逐渐减少/升高的影响，检测来自测定样品与LAL的混合液的透射光或散射光的强度，对于透射率或凝胶粒子数，取得恒定时间的变化量(差异)，以该变化量(差异)超过阈值的时刻作为反应起始时刻。还可以不使取得上述差异时的时间间隔为恒定，将时间间隔用自测定开始的时间函数来定义，使其随时间变化，或预先准备时间间隔不同的多个系列。

Description

来自生物的生理活性物质的测定方法、用于实施该测定方法的程序以及来自生物的生理活性物质的测定装置

技术领域

本发明涉及用于检测含有来自生物的生理活性物质的样品中的该生理活性物质或测定其浓度的测定方法和测定装置，所述生理活性物质具有通过与LAL的反应而发生凝胶化的特性，如内毒素、β-B-葡聚糖。

背景技术

内毒素是存在于革兰氏阴性菌的细胞壁中的脂多糖，是最有代表性的致热原。如果被该内毒素污染的输液、注射药、血液等进入人体，则可能引起发热、休克等严重的副作用。因此，需要管理上述药物等以使其不被内毒素污染。

在鲎(カブトガニ)的血细胞提取物(以下也称为“LAL：鲎变形细胞溶解物”)中存在被内毒素激活的丝氨酸蛋白酶。并且在LAL与内毒素反应时，根据内毒素量而激活的丝氨酸蛋白酶产生酶级联，由此，存在于LAL中的凝固蛋白原被水解成凝固素，凝固素缔合生成不溶性的凝胶。利用该LAL的特性，可以高灵敏度地检测内毒素。

另外，β-D-葡聚糖是构成真菌中特征性细胞膜的多糖。通过测定β-D-葡聚糖，不仅在如念珠菌(Candida)、スペルギルス(Spergillus)、隐球菌(Cryptococcus)的一般临床中常见的真菌中，而且在也包含稀有真菌的广范围内对于真菌感染病的筛选等是有效的。

在β-D-葡聚糖的测定中，也利用鲎的血细胞提取成分通过β-D-葡聚糖凝固(凝胶凝固)的特性，可以高灵敏度地检测β-D-葡聚糖。

对这种内毒素、β-D-葡聚糖等可由鲎的血细胞提取成分检测的来自生物的生理活性物质(以下也称为规定生理活性物质)进行检测或浓度测定的方法有比浊法，其中将要进行规定生理活性物质的检测或浓度测定(以下也简称为“规定生理活性物质的测定”)的样品与LAL混合所得的混合液静置，LAL与规定生理活性物质的反应导致凝胶的生成，随时间测量伴随凝胶生成的样品浊度进行分析。

在通过上述比浊法进行规定生理活性物质的测定的情况下，在经干热灭菌处理的玻璃制测定池内生成测定样品与LAL的混合液。然后，从外部对混合液的凝胶化进行光学测定。但是，在比浊法中，特别是在规定生理活性物质的浓度低的样品中，存在LAL发生凝胶化需要很长时间的情况，因此，需要可进行规定生理活性物质的短时间测定的方法。

针对该需求，提出了激光散射粒子测量法(以下简称为光散射法)，该方法是用例如磁性搅拌子来搅拌测定样品与LAL的混合液，由此生成凝胶微粒，可在短时间内由凝胶粒子散射的激光强度、或者透过混合液的光强度测定样品中规定生理活性物质的存在；或者，提出了搅拌比浊法，该方法虽然是比浊法的一个方案，但是其搅拌测定样品，使混合液中凝胶化的状态均匀而促进反应。比浊法和搅拌比浊法是检测光透射率，光散射法是检测生成的粒子，在这点上它们有所不同，但它们均以阈值法作为判定的基础，该阈值法测量由混合液的透射光强度或散射光强度或峰数目求出的粒子数目超过阈值所需的时间。

另外，还有预先加入针对添加到试剂中的凝固酶的合成底物，对被凝固酶分解的合成底物显色、或者发出荧光、以及发光的现象进行测定的方法，利用显色的方法作为比色法、和作为规定生理活性物质定量法中的重要测定方法之一得到广泛应用。

上述测定法中观察到以下的现象：在比浊法和搅拌比浊法中，测定开始后即刻，与规定生理活性物质和LAL的反应(以下也称为鲎反应)的状态无关，透射光强度减少；在光散射法中，散射光强度或峰数目升高(以下将该现象也称为逐渐减少/升高)。该逐渐减少/升高对于上述测定方法中由透射光的强度或散射光的强度或峰数目求出的粒子数超过阈值所需的时间有影响，因此可能使上述测定方法的测定精度降低。上述测定方法中，规定生理活性物质的浓度越低，则由透射光的强度、或者散射光的强度或峰数目求出的粒子数超过阈值所需的测定时间越长，因此规定生理活性物质的浓度越低，越容易受逐渐减少/升高的影响，可能无法正确评价凝胶化或凝集开始的反应起始时刻。

如上所述，判定凝胶化或显色的手段是利用阈值法或微分法等，阈值法是以由于凝胶化或显色而变化的物理量达到预先设定的阈值以上或者超过阈值的时间点(以下简称为通过阈值的时间点)作为反应起始时间；微分法是以给定时间内光透射率或吸光度的变化量的大小为基准。采用阈值法时，已知样品中规定生理活性物质的量与反应起始时间的关系在双对数下是负斜率的直线关系。另外，光透射率或吸光度等由于凝胶化或显色而变化的物理量的时间变化曲线可近似于logistic 曲线。因此，与低浓度的规定生理活性物质反应时可见非常缓慢的变化，与高浓度规定生理活性物质反应时可见急剧的变化。因此，在任何反应中均采用同一阈值来确定反应起始时间时，阈值法的不便之处在于对低浓度样品的测定时间延长。

另一方面，在求出光透射率或吸光度的变化量的微分法中，这些变化量与所作用的规定生理活性物质的浓度的关系虽然可见直线关系，但可见的直线关系被限定在狭窄的浓度范围内，无法同时测定高浓度和低浓度。

为解决这些问题，提出了使用光透射率或吸光度的时间曲线的面积的面积法。在面积法中，记录各时刻的面积值，以该值达到预先设定的阈值以上或者超过阈值的时间点作为规定生理活性物质的反应起始时间(检测时间)。但是实际上如上所述，与LAL反应无关系地，可以观察到光透射率或吸光度以恒定的比例变化的“逐渐减少/升高”。图21是内毒素反应导致的光透射率随时间变化的一个例子。可知测定开始后至约18分钟期间发生逐渐减少现象，光透射率直线降低。这种情况下在面积法中，面积值与LAL反应无关系地呈线性增加，因此可能无法准确测定规定生理活性物质。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2004-061314号公报

专利文献2：日本特开平10-293129号公报

专利文献3：国际公开第WO2008/038329号小册子

专利文献4：日本特开2009-150723号公报。

发明内容

本发明针对上述问题点提出，其目的在于：在来自生物的生理活性物质的检测或浓度测定中，提供可以使测定精度更为提高的测定方法以及使用该测定方法的测定装置。

本发明的最大特征是，为了消除上述的规定生理活性物质测定中的逐渐减少/升高的影响，连续地取得测定样品与LAL的混合液中由于测定样品与LAL反应而变化的物理量的差异值，以该差异值达到阈值以上或者超过阈值的时刻作为反应起始时刻。

更具体地说，其特征在于：将鲎的血细胞提取物LAL与含有规定的来自生物的生理活性物质的样品混合，进行该混合后，将由于LAL与上述生理活性物质反应而变化的规定的物理量作为检测值连续地取得；一个取得时刻的检测值、与仅比上述一个取得时刻提前规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值达到阈值以上或超过阈值时，以该一个取得时刻作为反应起始时刻；根据上述反应起始时刻，检测上述样品中的上述生理活性物质或测定其浓度。

另外，本发明中，为了消除上述规定生理活性物质测定中的逐渐减少/升高的影响，可以由来自测定样品与LAL的混合液的透射光或散射光强度或峰数目取得透射率或凝胶粒子数的每一定时间的变化量(差异)，以该变化量(差异)超过阈值的时刻作为反应起始时刻。

这种情况下，更具体地说，来自生物的生理活性物质的测定方法是使存在于样品中的来自生物的生理活性物质与鲎的血细胞提取物LAL反应，检测上述样品中的上述生理活性物质或测定上述生理活性物质的浓度，该测定方法的特征在于：在上述样品与LAL混合后，在上述样品与LAL的混合液中入射光，同时取得该入射光中的透过上述混合液的光或被上述混合液散射的光的强度；以由上述取得的光强度得到的、按照规定时间间隔设定的取得时刻时的规定物理量作为检测值；以一个取得时刻的检测值、和在此之前的取得时刻的检测值的差或差的绝对值超过阈值的时刻作为反应起始时刻；根据上述反应起始时刻，检测上述样品中的上述生理活性物质或测定其浓度。

这里，可知在发生上述逐渐减少/升高时，透射光的强度或散射光的强度或峰数目与规定生理活性物质的浓度无关地随时间大致呈直线状变化。与此相对，本发明中，取得了来自上述混合液的透射光或散射光的强度。然后，将在按照规定时间间隔设定的取得时刻时取得的光的强度、或者根据目的将取得的光的强度在上述取得时刻进行加工的值作为检测值，以一个取得时刻的检测值与在此之前的取得时刻的检测值的差异(即，检测值在一定时间中的变化量)或差异的绝对值超过阈值的时刻作为反应起始时刻。由此，可以消除逐渐减少/升高对于规定生理活性物质测定的影响。

因此，根据本发明，可以精度更良好地判定样品中规定生理活性物质与LAL的反应起始时刻。结果可以精度更为良好地进行规定生理活性物质的检测或浓度的测定。

另外，本发明中，上述取得的光的强度是透过上述混合液的光的强度，上述检测值是以百分率表示的上述混合液的透射率，上述规定的时间间隔为约2分钟，可以以上述一个取得时刻的上述透射率与一取得时刻的上述透射率之差的绝对值超过1的时刻作为反应起始时刻。

这种情况下涉及比浊法，其中，在对规定生理活性物质和LAL的混合液中入射的光中，取得混合液的透射光，并取得透射率。如前所述，在比浊法中，规定生理活性物质与LAL的反应使混合液变混浊，混合液的透射率随时间降低。这里，比浊法中透射率降低曲线的形状根据规定生理活性物质的浓度而不同。例如，规定生理活性物质的浓度高时，透射率急剧降低。另一方面，规定生理活性物质的浓度低时，透射率缓慢降低。

规定生理活性物质的浓度高、透射率急剧降低时，如果将检测值的取得间隔设定为较长，则各检测值的每次降低幅度过大，无法确保充分的数据，因此难以进行高精度的测定。另一方面，规定生理活性物质的浓度低、透射率缓慢降低时，如果将检测值的取得间隔设定过短，则各检测值的每次降低幅度过小，无法以足够的精度检测差异。如此地，本发明中，优选根据测定对象样品中的规定生理活性物质的浓度来调节检测值取得的时间间隔。

与此相对，通过本发明人的深入研究可知，在以百分率表示透射率时、在使检测值(透射率)的取得间隔为2分钟左右时，本发明中，可以在更广的规定生理活性物质的浓度范围内高精度地获得透射率的降低曲线。并且，这种情况下可知，以2分钟内的透射率减少量超过1%的时刻作为反应起始时刻，由此可以高精度地测定规定的生理活性物质的浓度。

因此，本发明中，在取得来自规定生理活性物质与LAL的混合液的透射光、计算透射率、取得规定时间间隔下的透射率的差(变化量)时，使规定的时间间隔为2分钟左右，以2分钟内透射率的减少量超过1%的时刻作为反应起始时刻。由此，可以精度更良好地对更广泛的样品进行规定生理活性物质的检测或浓度测定。

另外，本发明中，上述取得的光的强度是被上述混合液散射的光的强度，上述检测值是根据上述散射的光的强度中规定的峰数目导出的、使入射到上述混合液中的光散射的粒子数，使上述规定的时间间隔为约100秒，以上述一个取得时刻的上述粒子数、与前一取得时刻的上述粒子数之差超过200的时刻作为反应起始时刻。

这种情况涉及光散射法，其中在向规定生理活性物质和LAL的混合液中入射的光中取得来自混合液的散射光，由散射光中的(满足用于提高测定精度的规定条件)的峰数目取得混合液中的(凝胶)粒子数。在如上所述的光散射法中，通过在规定生理活性物质与LAL反应时搅拌混合液，混合液中产生凝胶粒子，在反应进行的同时，凝胶粒子的大小和数目增加。因此，在反应进行的同时，在来自混合液的散射光中观察到的峰数目增加。

另外，光散射法中光散射的峰数目的增加曲线形状根据规定生理活性物质的浓度而不同。例如，规定生理活性物质的浓度高时，峰数目急剧增加，与之相对，规定生理活性物质的浓度低时，峰数目缓慢增加。因此，与比浊法的情形同样，关于光散射法，优选根据测定对象样品中规定生理活性物质的浓度来调节检测值取得的时间间隔。

与此相对，通过本发明人的深入研究得知，在光散射法中，检测值(散射粒子数)的取得间隔为100秒左右时，可以在更广的规定生理活性物质的浓度范围内更高精度地获得峰数目的增加曲线。并且这种情况下，以100秒内散射粒子数的增加量超过200的时刻作为反应起始时刻，由此，可以高精度地测定规定生理活性物质的浓度。

因此，本发明中，在取得来自规定生理活性物质与LAL的混合液的散射光、检测散射粒子数、取得规定时间间隔的散射粒子数的差(变化量)时，使规定的时间间隔为100秒左右，以100秒内散射粒子数的增加量超过200的时刻作为反应起始时刻。由此，可以精度更为良好地对更广泛的样品进行规定生理活性物质的检测或浓度的测定。

如上所述，本发明首先提出了后述的差异法，其中在各时刻记录分开一定时间间隔的2点的光透射率或光散射粒子数的差异值，以该值通过了预先设定的阈值的时间点作为检测时间。差异法与微分法不同，并不是变化量本身与规定生理活性物质的浓度有关联，而是通过阈值所需的时间与规定生理活性物质的浓度有关联，因此可以解决微分法中所见的可测定的浓度范围狭窄的问题。另外，即使对于与LAL反应无关系地发生的线性光透射率或吸光度的变化，通过取得差异值，该变化为常数，因此可容易地除去，可以使测定精度提高。

但是，在差异法中，在测定变化曲线的推移缓慢的低浓度的规定生理活性物质时，难以获得测定所需的大的差异值，测定变得困难。因此，强烈需求建立可以进行宽浓度范围的规定生理活性物质的测定、不受与LAL反应无关系的光透射率和吸光度等的变化的影响的、精度高的测定方法。

因此本发明中，为了在来自生物的生理活性物质的测定法中提供可获得更高测定精度的技术，可以采用以下手段，其中，所述测定法是以由鲎的血细胞提取物LAL与来自生物的生理活性物质的反应而变化的物理量通过阈值的时刻为基准。

这种情形下的本发明涉及差异法，即，连续地取得分开规定时间间隔的两个时刻下的、由于含有规定生理活性物质的样品与LAL反应而导致变化的物理量的差异值，将该值通过预先设定的阈值的时刻判定为反应起始时刻。本发明中最大的特征在于：上述两个时刻的时间间隔不是恒定的，可根据时刻进行变更，使其在低浓度样品的测定中也得到现实的反应起始时刻。

更具体地说，该来自生物的生理活性物质的测定方法如下进行：将鲎的血细胞提取物LAL与含有规定的来自生物的生理活性物质的样品混合，该混合后，连续地取得由于LAL与上述生理活性物质反应而变化的规定的物理量，以此作为检测值；一个取得时刻的检测值、与仅比上述一个取得时刻提前了规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值达到阈值以上或超过阈值时，以该一个取得时刻作为反应起始时刻；基于上述反应起始时刻，检测上述样品中的上述生理活性物质或测定其浓度；该方法的特征在于：根据上述一个取得时刻来改变上述规定时间间隔。

即，在规定生理活性物质的测定中，在观察到与LAL和规定生理活性物质的反应无关系地变化的逐渐增加/减少时，认为通过获取恒定时间间隔产生的检测值的差异，可以除去逐渐增加/减少的影响，实现规定生理活性物质测定精度的提高。但是，特别是在低浓度规定生理活性物质的测定中，检测值的变化量本身小，如果获取差异时的时间间隔窄，则无法获得充分的差异值，结果可能难以测定规定生理活性物质。

与此相对，本发明中，可以根据检测值的取得时刻来改变用于获取差异的时间间隔。即，在直至目前难以测定的、差异值非常小的情况下，通过将用于获取差异的时间间隔延长设定，可使上述差异至少在现实的时刻通过阈值。这样，不管测定样品中规定生理活性物质的浓度是高浓度还是低浓度，均可以高精度地进行规定生理活性物质的测定。

上述物理量可例举光透射率、吸光度、散射光强度、光散射粒子数、荧光强度、化学发光强度等光学强度，或样品的粘性和电导率等电气工程强度。

另外，本发明中，对上述LAL与上述样品的混合液入射光，同时连续地探测该入射光中透过上述混合液的光或者被上述混合液散射的光的强度，可以以由连续地探测的上述光的强度取得的光透射率、吸光度、散射光强度、光散射粒子数、荧光强度、化学发光强度中的任意一种作为检测值。

由此，可以通过非接触的方法，连续地取得在上述LAL与上述样品的混合后由于LAL和上述生理活性物质的反应而变化的物理量，可以更容易地、精度良好地进行规定生理活性物质的测定。

另外，本发明中，可以将上述规定时间间隔更延长，以便使上述一个取得时刻更推后。

即，将用于取得差异的时间间隔用自测定开始的经过时间的时间函数来定义。由此，在规定生理活性物质的浓度低、两个取得时刻取得的检测值的差异小、该差异值迟迟不通过阈值的情况下，通过延长时间间隔，可以使差异值相对增大。结果，即使在规定生理活性物质浓度低时，上述差异值也可容易地通过阈值，可以在现实的测定时间内获得测定开始时刻。

另外，本发明中，可以设置上述规定时间间隔设定为恒定值的取得时刻的多个系列，所述多个系列中该规定时间间隔互不相同，可根据上述一个取得时刻来切换所使用的系列。

这里，例如可设置规定时间间隔为1分钟的系列、和6分钟的系列、和30分钟的系列。然后，可根据上述物理量的取得时刻来切换所使用的取得时刻的系列。例如，规定生理活性物质的浓度低、在两个取得时刻取得的检测值的差异小、该差异值迟迟不通过阈值时，可以使用时间间隔长的系列。这样，可以使差异值相对增大。结果，规定生理活性物质浓度低时，上述差异值也可容易地通过阈值，可以在现实的测定时间内获得测定开始时刻。

另外，本发明中，上述所使用的系列可以是上述一个取得时刻的检测值、与仅比上述一个取得时刻提前规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值最大的系列。

即，在每次物理量的取得时刻，在多个系列中选择检测值的差异值最大的系列，对该系列的差异值和阈值进行比较。这样，在各取得时刻总是可以将最大的差异值与阈值进行比较。因此，可以尽量地缩短差异值通过阈值所需的时间。结果，可更更有效地测定规定生理活性物质，同时可以消除因为差异值未通过阈值而不能测定的问题。

另外，本发明中，改变取得时刻，取得多个上述一个取得时刻的检测值、与仅比上述一个取得时刻提前上述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值，以按大小顺序排列时处于规定等级(rank)的值作为基准差异值，当由上述差或差的绝对值中减去该基准差异值所得的值达到上述阈值以上或超过上述阈值时，可以以该一个取得时刻作为反应起始时刻。

这里，在测定开始后的物理量的检测值中，当发生逐渐减少/升高时，从上述一个取得时刻检测值与仅比上述一个取得时刻提前上述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值中减去测定开始后初期得到的差或差的绝对值，认为由此降低逐渐减少/升高对测定的影响。

但是，检测值、或者与检测值之差或差的绝对值小时，高精度地获得待减去的值本身是困难的，有时难以高精度地消除逐渐减少/升高的影响。因此，本发明中，改变取得时刻，取得多个一个取得时刻的检测值与仅比一个取得时刻提前规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值，以按照大小顺序排列时处于规定等级的值作为基准差异值，从上述差或差的绝对值中减去该基准差异值，将获得的值与阈值进行比较。

例如，可将过去得到的上述差或差的绝对值的值按照大小顺序排列，在后数5个数据中，以第3小的值作为基准差异值。这样，即使检测值、或者与检测值之差或差的绝对值小，也可以提高待减去值的可靠性，可以精度更良好地降低逐渐减少/升高对测定的影响。

另外，本发明中，上述来自生物的生理活性物质可以是内毒素或β-D-葡聚糖。

这样，可以更正确地进行最具代表性的致热原——内毒素的检测或浓度测定，可以抑制被内毒素污染的输液、注射药物、血液等进入人体而引发副作用。同样，可以更正确地进行β-D-葡聚糖的检测或浓度测定，不仅在如念珠菌、スペルギルス(Spergillus)、隐球菌的一般临床中常见的真菌中，而且在也包含稀有真菌的广范围内可以更正确地进行真菌感染症的筛选。

另外，本发明可以是来自生物的生理活性物质的测定装置，该测定装置设置以下设备：

混合液保持设备，其将含有规定的来自生物的生理活性物质的样品与鲎的血细胞提取物LAL的混合液保持可入射光，同时使该混合液中的反应进行；

搅拌设备，其对上述混合液保持设备中的上述混合液进行搅拌；

光入射设备，其对上述混合液保持设备中的混合液入射光；

受光设备，其接受上述入射光从上述混合液的透射光或散射光，并将其转换成电信号；

判定设备，其由在上述受光设备中转换的电信号来判定上述样品中的上述生理活性物质与LAL的反应起始时刻；

导出设备，其由预先确定的上述反应起始时刻与上述生理活性物质的浓度的关系导出上述样品中的上述生理活性物质的存在或浓度；

该装置的特征在于：上述判定设备在以规定的时间间隔设定的取得时刻中，以对上述电信号施加规定运算所得的信号或以上述电信号作为检测信号值，将一个取得时刻的检测信号值与在此之前的取得时刻的检测信号值之差或差的绝对值超过阈值的时刻判定为反应起始时刻。

根据本发明的规定生理活性物质的测定装置，受光设备接受来自规定生理活性物质与LAL的混合液的透射光或散射光，并将其转换成电信号。然后，在判定设备中，由转换的电信号判定混合液中的反应起始时刻。判定设备根据所得电信号以规定的时间间隔取得检测信号值，并将规定的时间间隔的检测信号值的变化量超过阈值的时刻判定为反应起始时刻。

根据本发明的测定装置，可以自动地消除逐渐减少/升高对规定生理活性物质的测定的影响。因此，可以更高精度地进行规定生理活性物质的检测或浓度测定。

另外，此时，在检测信号值是以百分率表示的混合液的透射率时，可以使规定时间间隔为约2分钟、阈值为1。另外，在检测信号值是使入射到混合液中的光散射的粒子数时，可以使规定的时间间隔为约100秒、阈值为200。这样，可以以更广范围内的规定生理活性物质的浓度作为对象，获得更高的测定精度。

另外，在本发明的规定生理活性物质的测定装置中，可以使规定时间间隔和/或阈值可变。这样，可以根据期望的规定生理活性物质的浓度，使检测信号值的取得时间间隔和用于反应起始时刻判定的阈值最佳化，对于期望的浓度，可以获得更高的测定精度。

另外，本发明还可以是来自生物的生理活性物质的测定装置，其设置以下设备：

混合液保持设备，其将含有规定的来自生物的生理活性物质的样品与鲎的血细胞提取物LAL的混合液保持可入射光，同时使该混合液中的反应进行；

搅拌设备，其对上述混合液保持设备中的上述混合液进行搅拌；

光入射设备，其对上述混合液保持设备中的混合液入射光；

受光设备，其接受上述入射光从上述混合液的透射光或散射光，并将其转换成电信号；

判定设备，其由在上述受光设备中转换的电信号来判定上述样品中的上述生理活性物质与LAL的反应起始时刻；

导出设备，其由预先确定的上述反应起始时刻与上述生理活性物质的浓度的关系导出上述样品中的上述生理活性物质的存在或浓度；

其中，上述判定设备在以规定的时间间隔设定的取得时刻中，以对上述电信号施加规定运算所得的信号或以上述电信号作为检测信号值，将一个取得时刻的检测信号值与在此之前的取得时刻的检测信号值之差或差的绝对值达到阈值以上或超过阈值的时刻判定为反应起始时刻。该装置的特征在于：上述判定设备可根据上述一个取得时刻对上述规定的时间间隔进行变更。

这种情况下，上述判定设备可以将上述规定的时间间隔延长至使上述一个取得时刻更推后。

另外，上述判定设备设置使上述规定时间间隔设定为恒定值的取得时刻的多个系列，所述多个系列的规定时间间隔互不相同，可根据上述一个取得时刻来切换所使用的系列。

另外，可以使上述所使用的系列是上述一个取得时刻的检测值、与仅比上述一个取得时刻提前规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值最大的系列。

另外，改变取得时刻，取得多个上述一个取得时刻的检测值、与仅比上述一个取得时刻提前上述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值，以按大小顺序排列时的规定等级的值作为基准差异值，由上述差或差的绝对值中减去该基准差异值，将所得值达到上述阈值以上或超过上述阈值的时刻判定为作为反应起始时刻。

另外，上述来自生物的生理活性物质可以是内毒素或β-D-葡聚糖。

另外，本发明还可以是用于实施上述来自生物的生理活性物质的测定方法的程序。

关于解决上述本发明的课题的设备，其可以尽可能地组合使用。

本发明中，利用内毒素和β-D-葡聚糖等来自生物的生理活性物质与LAL的反应来检测上述生理活性物质或测定其浓度时，可以获得更高的测定精度。另外在来自生物的生理活性物质的测定方法中可以获得更高的测定精度，其中，所述测定方法以由于来自生物的生理活性物质与LAL的反应而变化的物理量通过阈值的时刻作为基准。

附图说明

图1是表示本发明实施例1中的比浊测量装置的概略构成图。

图2是用于对本发明实施例1中的逐渐减少进行说明的、表示光透射率的时间性变化的图。

图3是表示由以往的阈值法得到的内毒素浓度与内毒素检测时间的关系的图。

图4是表示本发明实施例1中由差异法得到的内毒素浓度与内毒素检测时间的关系的图。

图5是表示本发明实施例2中光散射粒子测量装置的概略构成的图。

图6是用于对本发明实施例2中的逐渐升高进行说明的、表示检测粒子数的时间性变化的图。

图7是表示本发明实施例2中由阈值法和差异法得到的内毒素浓度与内毒素检测时间的关系的图。

图8是表示由通常的差异法取得的吸光度的时间性变化由于内毒素浓度而不同的图。

图9是表示由通常的差异法取得的吸光度差异值的时间性变化由于内毒素浓度而不同的图。

图10是表示本发明实施例4中由时间函数差异法取得的吸光度差异值的时间性变化由于内毒素浓度而不同的图。

图11是关于本发明实施例4的用于通过时间函数差异法进行内毒素测定的测定程序的流程图。

图12是关于本发明实施例4的测定程序中进行检测判定的子程序的流程图。

图13是表示本发明实施例5中通过多系列差异法取得的吸光度差异值的时间性变化由于内毒素浓度而不同的图。

图14是本发明实施例5中通过多系列差异法进行内毒素测定的测定程序2的流程图。

图15是对各种差异法中借助搅拌比浊法的内毒素测定的校准曲线线性进行比较的图。

图16是表示本发明实施例7的多系列差异法中、借助比色法的内毒素测定的校准曲线线性的图。

图17是表示本发明实施例8的多系列差异法中、借助搅拌比浊法的β-D-葡聚糖测定的校准曲线线性的图。

图18是表示本发明实施例9中、借助LAL珠法的内毒素测定中采用多系列差异法时内毒素测定的校准曲线线性的图。

图19是表示在本发明实施例10的多系列差异法中可见逐渐减少/升高时、对由各时刻的差异值减去的作为背景值的值实施动态更新时，内毒素测定的校准曲线线性的图。

图20是表示本发明实施例10中基准差异值计算子程序的流程图。

图21是表示可见逐渐减少/升高时内毒素反应导致的光透射率随时间变化的例子的图。

图22是对于内毒素或β-D-葡聚糖导致的LAL凝胶化过程及其检测方法进行说明的概略图。

具体实施方案

对LAL与内毒素反应、生成凝胶的过程进行了认真研究。即，如图22所示，内毒素与LAL中的丝氨酸蛋白酶——C因子结合，C因子激活形成活性C因子，活性C因子水解LAL中的另外的丝氨酸蛋白酶B因子，并使之激活，形成活化B因子。该活化B因子立即水解LAL中的凝固酶前体，形成凝固酶，并且，该凝固酶水解LAL中的凝固蛋白原，生成凝固素。然后，生成的凝固素互相缔合，进一步生成不溶性的凝胶，LAL全部牵涉其中，形成凝胶。

另外，同样地，β-D-葡聚糖与LAL中的G因子结合，G因子激活形成活性G因子，活性G因子水解LAL中的凝固酶前体，形成凝固酶。结果，与内毒素同LAL的反应同样，生成凝固素，生成的凝固素互相缔合，进一步生成不溶性的凝胶。

该一系列的反应与在哺乳动物中可见的克里斯马斯因子(Christmas factor)或凝血酶等丝氨酸蛋白酶介导的纤维蛋白凝胶生成过程类似。上述酶级联反应是：即使是极少量的激活因子，也会连锁发生之后的级联而进行活化，因此具有非常强的放大作用。因此，根据使用LAL的规定生理活性物质的测定法，可以检测亚皮克/mL级的极微量的规定生理活性物质。

关于用于对内毒素以及β-D-葡聚糖进行定量的试剂，使用以鲎的血细胞提取物(LAL：鲎变形细胞溶解物)为原料的鲎试剂、以及在鲎试剂中添加了被凝固酶水解而着色强度、荧光强度或化学发光强度中任一个增加的合成底物的试剂。另外，有时也使用鲎试剂中的C因子的重组体(重组C因子)与其合成底物(不论着色、荧光、化学发光等手段)的混合试剂等。并且，还可以使用鲎试剂中的G因子的重组体(重组G因子)与其合成底物(不论着色、荧光、化学发光等手段)的混合试剂等。

考虑各种用于对内毒素和β-D-葡聚糖进行定量的物理量。试剂的种类和测定装置的种类可以根据该物理量选择。上述物理量例如只要可检测样品的光透射率或浊度、散射光强度、光散射粒子数、吸光度、荧光强度、化学发光强度等光学物理量的变化，或者检测样品的凝胶化所伴随的样品的粘性、电导率等物理量的变化即可。这些物理量的检测可以使用浊度计、吸光光度计、光散射光度计、激光散射粒子测量仪、荧光计、光子计数仪等光学仪器，以及应用这些仪器的专用的测定装置。另外，也可以使用粘度计、电导率计和应用它们的专用的测定装置。

如上所述，可以对内毒素和β-D-葡聚糖等的规定生理活性物质进行定量的测定方法可举出以如前述的比浊法、搅拌比浊法、光散射法为首的各种方法。如图22所示，这些测定方法可以通过高灵敏度测定该LAL的酶级联反应生成的凝固素的缔合物来进行，前者是以样品的浊度进行检测，后者是以体系内生成的凝胶的微粒进行检测。

比浊法在不需要特别的试剂、以及可测定的规定生理活性物质的浓度范围广等方面被评价为容易在现场使用。但是另一方面，比浊法在测定低浓度的规定生理活性物质时存在需要非常长的时间的问题。这是由于，比浊法并不是观察蛋白酶级联的终产物——凝固素本身的生成量，而是观察它进一步缔合形成的凝胶导致的光透射率减少的过程。

即，凝固素的浓度如果未达到一定程度以上的浓度，则不发生凝胶化，因此在比浊法中，为了检测规定生理活性物质，必须要等到凝胶生成。因此，规定生理活性物质浓度高时，迅速地生成必要充分浓度的凝固素并开始凝胶化，因此测定时间变短，但如果规定生理活性物质浓度低，则达到凝胶化所必须的凝固素浓度需要时间，测定时间延长。从该点来讲，在搅拌比浊法中，通过将规定生理活性物质与LAL的混合液搅拌而促进两者的反应，从而谋求测定时间的缩短。

另外，在搅拌样品方面、以及通过激光而不是凝胶来检测粒子方面，光散射法相对于比浊法进行了改良，与比浊法相比可以大幅缩短测定时间。在比浊法和搅拌比浊法以及光散射法中，虽然所观察的物理量不同，但均是捕捉超过一定的阈值的时间点作为反应的起始点，在该点上它们是共通的(将该方法方便地称为阈值法)。

这里，在上述任一测定法中，自开始测定后即刻，在比浊法和搅拌比浊法中观察到混合液的光透射率减少，在光散射法中观察到混合液中的凝胶粒子数增加，即所谓的逐渐减少/升高的现象，这与鲎反应的状态无关。关于其原因尚未明确，例如将蛋白质变性等考虑为原因之一，所述变性是由于混合液中溶解了二氧化碳气体等，混合液的pH发生变化。

另外，搅拌比浊法和光散射法中，混合液通过内置于测定容器中的搅拌子搅拌，通过该搅拌使鲎反应的状态均匀，可促进反应。该搅拌时，在搅拌的旋转轴不适当、或测定容器的底面形状不适当的情况下，可见容易发生逐渐减少/升高的倾向，其原因尚在深入探究之中。

测定样品中的规定生理活性物质的浓度高时，在受到逐渐减少/升高的影响之前，混合液的凝胶化已经进行，凝集判定已经完毕，因此由于逐渐减少/升高的影响使测定精度降低的危险性比较小。但是，测定样品中的规定生理活性物质的浓度低时，浓度测定需要长时间，因此，由于逐渐减少/升高的影响，光透射率或凝胶粒子数的变化曲线比实际更早地超过了阈值，反应起始时刻的判定精度可能降低。

本实施方案中，在规定生理活性物质的检测或浓度测定中，并不采用在对于发生逐渐减少/升高的现象的准备中、基于样品与LAL的混合液的光透射率或凝胶粒子数本身超过阈值来判定反应起始时刻的方法。而是采用以下的新方法：以恒定时间间隔取得光透射率或凝胶粒子数，将该时间间隔中的光透射率或凝胶粒子数的变化量超过阈值的时刻判定为反应起始时刻。该阈值当然与以浊度或凝胶粒子数本身作为阈值进行比较的情形不同。由此，即使发生逐渐减少/升高，也可以消除其影响，可以更高精度地进行规定生理活性物质和LAL的反应起始时刻的判定。(将该方法方便地称为差异法)

另外，由此可以发现混合液的浊度或凝胶粒子数变化量急剧变化的时刻。因此，对于高浓度的样品当然可以提高测定精度，对于低浓度的样品也可以提高测定精度。另外，由此通过只改变规定生理活性物质测定时得到的数据的分析过程即可以消除逐渐减少/升高的影响。

以下详细给出本发明的实施方案，但本发明并不限于以下所示的方案。以下的实施方案中，对于规定生理活性物质为内毒素的情形进行说明，规定生理活性物质为β-D-葡聚糖时也可以考虑同样的方案。

这里，按照上述的各测定方法进行内毒素测定时的检测对象各有不同。在比浊法和搅拌比浊法中，内毒素与LAL试剂作用，检测混合液发生凝胶化或凝集时的混合液的浊度。因此，取得混合液的透射光，将混合液的光透射率低于预先设定的阈值的时刻判定为内毒素与LAL的反应起始时刻。

在比浊法和搅拌比浊法中，在可见与鲎反应的状态无关的混合液的光透射率减少的倾向时，首先，为了消除检测值的噪声而采取2分钟的移动平均数。接着，由于测定开始后即刻数据不稳定，因此以测定开始2分钟后的光透射率为100%。然后，取得预先设定的时间间隔ΔT处每10秒原始取得的光透射率(%)的差异，将其平方值连续3次超过1时的最初时刻采用为反应起始时刻。差异的时间间隔ΔT优选1分钟-5分钟，特别优选约2分钟。在低浓度样品的情况下，光透射率的变化量小，因此优选使时间间隔ΔT为5分钟。这里，将光透射率(%)的时间间隔ΔT的差异平方是由于，其可以使差异值为1左右时的变化增大从而提高分辨力。因此并不是必须将差异平方。

另一方面，光散射法与比浊法和搅拌比浊法同样地观察混合液发生凝胶化或凝集的过程，但不同之处在于取得被混合液中的凝集块(凝胶粒子)散射的光。即，在最初透明且不含有凝胶粒子的样品中混合鲎试剂，由此发生凝集，凝胶粒子的数目增加。该凝胶粒子的数目增加，则散射光中峰的发生频率提高，因此可以取得该散射光的峰数目作为凝胶粒子数。然后，对在一定时间内检测的凝胶粒子数的积分值设置阈值，将检测粒子数超过该阈值的时刻作为反应起始时刻。

在可见光散射法中检测的凝胶粒子数与鲎反应的状态无关地增加的倾向时，取得一定时间间隔ΔT的检测值(凝胶粒子数)的差异，即粒子增加数。关于鲎反应的反应起始时刻的判定，考虑噪声的影响，并以凝胶粒子数的差异连续10次超过阈值200的最初时刻采用为反应起始时刻。为了使差异的时间间隔ΔT可以响应于内毒素浓度高的样品，其优选30秒-200秒，特别优选约100秒。

上述测定中，内毒素浓度低时，需要将关于取得检测值的时间间隔ΔT的值设定为比较大，内毒素浓度高时需要将其设定得较小。这是由于，内毒素浓度越是低浓度，则样品与LAL试剂混合后的混浊和凝胶粒子数的变化量越少，因此，为了确保在时间间隔ΔT前后的检测值中足够大的差异，必须有充分的时间间隔。

另一方面，内毒素浓度高时，内毒素与LAL的鲎反应比较迅速地进行，因此认为在设定的时间间隔ΔT期间开始凝集。因此，通过依次检测混合液的浊度或凝胶粒子数的检测值的变化、早期地粗略估算出内毒素浓度是低浓度还是高浓度、根据该粗略估算值分情形改变时间间隔ΔT，可以精度更为良好地测定内毒素的浓度。因此，可以根据需要采取上述粗略估算法。

<制造例1>

在玻璃制的容器(外径Ф7 mm，长度50 mm，以下简称为小池)中加入不锈钢制搅拌子(Ф1 mm，长度5 mm)。将小池的开口部用铝箔覆盖，将20个小池共同用铝箔进一步覆盖，在250℃的温度下加热处理3小时，以对小池进行干热处理。由此，附着于小池的内毒素受热分解而失活。

[实施例1]

图1表示作为本实施例的内毒素测定装置的比浊测量装置1的概略构成。在本实施例的比浊测量装置1中，通过搅拌比浊法进行内毒素的测定。在本实施例中，将含有制备的稀释系列的内毒素的样品转移至制造例1中制造的作为混合液保持设备的小池2中。设置保温器5，使其包围小池2的周围。该保温器5的内部安置未图示的电热线，通过向该电热线通电，可以使小池2保温至约37℃。该小池2中安置不锈钢制的搅拌子3。该搅拌子3通过设置于小池2的下部的搅拌器4的作用在小池2中旋转。即，搅拌器4包含马达4a和设于马达4a的输出轴上的永久磁铁4b。然后，向马达4a通电以旋转永久磁铁4b。由于来自该永久磁铁4b的磁场旋转，因此不锈钢制的搅拌子3在旋转磁场的作用下旋转。该搅拌子3和搅拌器4相当于搅拌设备。本实施例中，使搅拌子3的旋转速度为1000 rpm。

比浊测量装置1中设置作为光入射设备的光源6和作为受光设备的受光元件9。由光源6出射的光通过光圈7后，通过设置于保温器5的入射孔5a入射到小池2中的样品上。透过小池2中的样品的光由设置于保温器5的出射孔5b射出，通过光圈8照射到受光元件9上。受光元件9中，输出与接受光的光强度相对应的光电信号。将该光电信号的输出输入到作为判定设备和导出设备的运算装置10中。运算装置10中，根据预先安装的程序(算法)，可进行反应起始时刻的判定和内毒素浓度的导出。除此之外，比浊测量装置1也可以包含显示导出的内毒素浓度的显示装置。

图2显示本实施例中观察到的逐渐减少。该逐渐减少是在图中所示的A部分显著出现的现象。这是与混合液中内毒素和LAL的反应状态无关、光透射率的基线自测定开始后即刻降低的现象。然后，随着内毒素与LAL的反应进行，确认其后经拐点后倾斜度进一步变大的状态。

在以往的搅拌比浊法中，以光透射率低于95%的时刻作为反应起始时刻。但是，发生逐渐减少时，由于该基线降低的影响，有时光透射率低于阈值95%的时刻异常早。或者，在光透射率的减少曲线到达拐点之前，有时光透射率的值低于阈值95%。这样，由于逐渐减少，可能使反应起始时刻的判定精度降低。

采用现有的阈值法，以内毒素浓度为横轴、以现有方法的低于阈值95%的时间为纵轴制图，结果如图3所示。已知如果采取双对数，则该图为直线。观察图3所示的结果中的相关系数，其绝对值为0.975。日本药典中规定“相关系数的绝对值必须为0.980以上”的条件，图3所示的结果未满足该条件。

图4显示采用本实施例的差异法的情形的结果。该情形的时间间隔ΔT为2分钟，用于反应起始时刻判定的阈值是光透射率(%)的变化量的绝对值超过1%时。由图可知，通过采用差异法，内毒素浓度与内毒素检测时间的关系的相关系数绝对值为0.987。即，通过采用差异法，得到具有更强的相关性的结果，线性提高，且且可以满足上述日本药典中的条件。如此，本实施例中，只是改变比浊测量装置1的运算装置10中的程序(算法)，即可以消除逐渐减少的影响，因此使比浊测量装置1的测定精度提高。

本实施例中，光透射率的值相当于检测值和检测信号值。另外，本实施例的比浊测量装置1中，时间间隔ΔT和阈值在装置中可调节。由此可更容易地实施上述粗略估算法。

[实施例2]

接着，作为实施例2，对于采用光散射法的测定进行说明。图5表示本实施方案中作为内毒素测定装置的光散射粒子测量装置11的概略构成。在光散射粒子测量装置11中使用的光源12采用激光光源，除此之外，也可以使用超高亮度LED等。由光源12照射的光在入射光学系统13中集中，并入射到样品池14中。该样品池14保有进行内毒素测定的样品和LAL试剂的混合液。入射到样品池14中的光被混合液中的粒子(凝固蛋白原单体、以及凝固蛋白原低聚物等的测定对象)散射。

样品池14的入射光轴侧部配置有出射光学系统15。出射光学系统15的光轴的延长线上配置受光元件16，该受光元件16接收被样品池14内的混合液中的粒子散射并被出射光学系统15集中的散射光，并将其转换成电信号。受光元件16与放大电路17、滤波器18、运算装置19和显示器20电学连接，其中，所述放大电路17将由受光元件16进行光电转换的电信号放大；滤波器18用于从由放大电路17放大的电信号中除去噪声；运算装置19由除去了噪声后的电信号的峰数计算凝胶粒子数，进一步判定反应起始时刻并导出内毒素的浓度；显示器20显示结果。

另外，样品池14中安置搅拌子21，该搅拌子21通过由外部施加电磁力而旋转，并搅拌作为样品的混合液，样品池14的外部安置搅拌器12。通过它们，可以进行搅拌或不搅拌，以及调节搅拌速度。

这里，样品池14是制造例1中制造的小池，其相当于本实施例的混合液保持设备。光源12和入射光学系统13相当于光入射设备。搅拌子21和搅拌器22相当于搅拌设备。出射光学系统15和受光元件16相当于受光设备。运算装置19相当于判定设备和导出设备。

图6表示使用光散射法时检测粒子数目的时间性变化的例子。在该例子中，在与搅拌比浊装置同样的样品搅拌状态下，在 37℃下保温并进行内毒素的测定。测定装置具体使用兴和制造的PA-200。由图6的B可知，在光散射法中，确认了检测(凝胶)粒子数与内毒素和LAL的反应状态无关地增加的现象。通过该反应，在本应检测的“粒子数的急剧增加”之前即超过阈值(检测粒子数200)，因此难以进行正确判定。

接着，对照于光散射法，对采用差异法的本实施例的测定方法进行说明。运算装置19中，首先每1秒地，由除去了噪声后的电信号制作1秒的峰的直方图数据。然后借助该直方图数据计算在1秒中检测的总粒子数。并且，为了使粒子数的变异平滑化，对每1秒计算的总粒子数进行10秒的移动累加。将移动累加得到的10秒钟的移动累加值与仅提前时间间隔ΔT(=100秒)时得到的移动累加值进行比较，将其差异(增加量)连续10次(10秒钟)超过阈值200时的最初的直方图数据取得时刻判定为反应起始时刻。

图7表示对光散射法应用阈值法和差异法，以内毒素浓度为横轴、以反应起始时刻为纵轴制图的结果。单纯地以粒子数为检测对象时，相关系数的绝对值为0.943，线性严重中断，与此相对，在使时间间隔ΔT为100秒、并以100秒中粒子增加量超过阈值200时作为反应起始时刻的情况下，相关系数的绝对值为0.999，因此得到强相关。由以上认为，以100秒中的粒子增加量作为检测对象的算法与以往的以粒子数作为检测对象的算法比较，是更稳定的算法。这样，本实施例中，仅变更光散射粒子测量装置11的运算装置19中的程序(算法)，即可以消除逐渐升高的影响，从而可以使光散射粒子测量装置11的测定精度提高。

本实施例中，检测粒子数(凝胶粒子数)的值相当于检测值和检测信号值。另外，本实施例的光散射粒子测量装置11中，时间间隔ΔT和阈值可在装置中进行调整。由此可以更容易地实施上述粗略估算法。

另外，本实施例中，如上所述，在运算装置19中，由直方图数据计算在1秒内检测的总粒子数，将该总粒子数进行10秒的移动累加，将10秒的移动累加值与仅提前时间间隔ΔT所得到的移动累加值进行比较，将其差异(增加量)连续10次(10秒钟)超过阈值时的最初的数据取得时刻判定为反应起始时刻。但是，该测定方法只是一个例子，直方图数据的检测时间、是否进行移动累加或移动累加时间、判定反应起始时刻时的差异(增加量)超过阈值的次数等并不限于本实施例的值，可以对它们进行适当变更。

[实施例3]

使用用于现有的比浊法的装置toxinometer (和光纯药株式会社制造)进行内毒素的测定。在不进行样品搅拌的toxinometer (比浊法)中，在光透射率的时间性变化中，可确认原因不明的基线的逐渐降低。因此，对于使用以超过95%的时间点作为反应起始时刻的阈值法的toxinometer，其测定结果也受逐渐减少的影响。因此，为了提高测定精度，同样地使用差异法进行再分析。结果，回归直线的线性增加，可以抑制由差异法的检测误差产生的对内毒素测定的影响，并观察到改善。

上述各实施例中，差异超过阈值并不一定意味着由差异比阈值小的状态向比阈值大的状态变化。例如，其当然也包含，具有减少倾向的差异由比阈值大的状态向比阈值小的状态变化。

但是，采用上述差异法时，使取得吸光度或凝胶粒子数的时间间隔为恒定时，如上所述，在吸光度或凝胶粒子数的变化曲线推移缓慢的低浓度规定生理活性物质的测定中，难以获得足够大的差异值，因此在现实的时间内有时难以测定。下面对于结合了该问题的对应方法的情形进行说明。

本发明中，在差异法中进一步根据取得时刻来改变取得吸光度或凝胶粒子数的差异时的时间间隔。更具体地说，将取得吸光度或凝胶粒子数的差异时的时间间隔定义为自测定开始的时间函数，使间隔随时间变化，或者预先准备时间间隔不同的多个系列。在以下的说明中如没有特别指定，以利用LAL与内毒素反应的内毒素测定为例进行说明。

在规定生理活性物质的测定中，未混入这些物质的试剂、制备用水以及未附着这些物质的试验器具的使用是不可缺的。在试剂的溶解或内毒素稀释系列的制备中，使用内毒素的混入量为极微量的注射用水(大塚制药制造)。另外，吸液管头等消耗品使用标示不含内毒素的个别包装的材料。另外，测定容器是玻璃制的，因此使用进行了常规的内毒素失活处理(干热处理)的容器。

<制造例2 (测定用玻璃容器)>

在测定用玻璃容器(Ф6 mm)中加入搅拌用的不锈钢制搅拌子(4.5 mm，粗0.7 mm)，将容器的开口部用铝箔覆盖。将汇集成束并进一步用铝箔覆盖的20个玻璃容器作为1个包装，汇集多个该包装并将其加入到金属制干热灭菌罐中，对干热灭菌罐盖盖并在250℃下进行3小时的干热处理。

以下，在差异法中，进一步对根据取得时刻来变更取得吸光度或凝胶粒子数的差异时的时间间隔的实施例进行说明。在以下的实施例中，作为由于LAL与规定生理活性物质的反应而变化的物理量，采用吸光度。但是，本发明并不限定为以下实施例所例举的测定对象物质、测定试剂、以及测定对象的物理量。另外，下文中，将上述的以由时间函数定义的时间间隔取得差异值的方法称为“时间函数差异法”，将使用具有不同的时间间隔的多个系列取得差异值的方法称为“多系列差异法”。

首先，本实施例中，为取得吸光度而使用的比浊测量装置是与图1所示的装置等同的装置。

<比较例(时间间隔为恒定的通常的差异法)>

本实施的方案中，首先，为了证实时间函数差异法以及多系列差异法的效果，作为比较对象，进行利用时间间隔恒定的通常的差异法的内毒素测定。鲎试剂使用和光纯药制造的鲎ES-II单一测试。制备内毒素的浓度为1.0、0.1、0.01、0.001 EU/mL浓度的稀释系列，并与鲎试剂在小池2中反应。使用比浊测定装置1 (吸光度测定装置(EX-100：兴和株式会社制造))，进行吸光度的记录和分析。

差异值的取得采用上述的使时间间隔为恒定的方法。使时间间隔为3分钟，随时间记录差异值，同时以吸光度差异值超过阈值的时刻作为反应起始时刻(检测时刻)。阈值使用0.003的值。各样品的吸光度变化曲线如图8所示，吸光度的差异值随时间变化的曲线如图9所示。

观察图9可知，在取得吸光度差异值的时刻的时间间隔不发生变化的通常的差异法中，内毒素浓度在1.0-0.001 EU/mL的浓度范围内则可以测定内毒素，在更低的浓度0.0001 EU/mL中，吸光度差异值不是足够大的数值且不超过阈值，因此不可能检测。

<实施例4 (时间函数差异法)>

下面，作为实施例4，对于将取得时间差异时的时间间隔用时间函数来定义的时间函数差异法进行说明。这里，使低浓度的内毒素与LAL反应时，吸光度的变化缓慢，因此必须使用时间间隔随时间扩大的函数。具体来说，时间间隔可以随自测定开始的时刻线性(一次函数)变化，也可以以二次函数或三次函数那样的单变量多项式定义而变化。或者也可利用指数函数、对数函数等。实际上，由比浊测定装置1得到的吸光度的数据例如大多是以1秒间隔等的固定时间间隔取样，因此，这种情况下，可以获取由上述例举的函数和装置固有的固定时间间隔结合得到的不连续的时间间隔函数。

这里，使用上述比较例中得到的各吸光度变化曲线数据，通过时间函数差异法求出吸光度的差异值变化。测定中使用的比浊测量装置1是以1秒的间隔输出数据的类型，因此无法将时间函数用连续函数定义。这里，用于计算差异值的时间间隔I (分钟)是以式(1)的不连续函数的形式定义。

I＝floor (T/10)+1              (1)

其中T是自测定开始经过的时间(分钟)。

另外，函数floor(X)表示floor函数(下取整函数)。另外，这里，使阈值是0.01的恒定值。在本条件下，通过时间函数差异法求出吸光度的差异值变化，结果，针对各稀释系列的样品的吸光度差异值随时间变化的曲线如图10所示。由图10可知，内毒素浓度为0.001 EU/mL、0.0001 EU/mL等低浓度时，吸光度差异值的曲线是比图9所示的比较例更大的值，两者均可以在现实的测定时间内判定反应起始时刻。

本实施例中，在测定初期，即LAL与内毒素反应中未出现逐渐减少/升高时，吸光度的差异值也大致为恒定值，因此，可以存储差异值的初始值，以此作为背景值由各时刻的差异值中减去。这样，可以降低逐渐减少/升高对测定的影响。

但是，本实施例中，时间间隔随时间函数变化，因此，即使逐渐减少/升高是线性变化，获得差异的时间间隔也逐渐扩大，由此，逐渐减少/升高导致的差异值也随时间函数扩大。因此，无法完全除去逐渐减少/升高对测定的影响。对此可以作如下处理：将反应早期初期的差异值作为背景值存储，以各取得时刻的时间间隔和初期的时间间隔之比作为系数，乘以背景值，将所得的值从各取得时刻所得的差异值中减去等。

另外，本实施例中的差异值的阈值可以使用常数，其如上述不依赖于自测定开始的时刻，也可以利用根据时间函数而变化的阈值。实际上，在使规定生理活性物质与LAL反应时，如果规定生理活性物质的浓度低，则吸光度的变化非常缓慢，因此，利用时间函数时，可以设定为阈值的绝对值随着时间而降低。此时的时间函数可以预期和利用一次函数、单变量多项式等。

或者，在预先求出如图9所示的各内毒素浓度下吸光度差异值随时间变化的图时，也可以将对于各内毒素浓度的曲线峰的例如20%的值连接，通过得到的曲线来定义阈值。这样，即使内毒素浓度低时，也可以更确实地使差异值超过阈值。另外，阈值也可以通过与自测定开始的经过时间成反比的曲线来定义。

图11表示用于通过上述时间函数差异法进行内毒素测定的测定程序的流程图。本程序是在测定开始的同时，通过运算装置10实施的程序。实施该程序时，首先在S101中进行初始化操作，重新设定自测定开始的时间——变量T的值。接着进入S102，将根据受光元件9接受的光强度的光电信号数据带入运算装置10。接着进入S103，通过式(1)，以现时间点的T值为基础，计算用于算出差异值的时间间隔I (分钟)。

接着，在S104中，判定现时间点是否为吸光度的初始值的存储时刻。本实施例中，吸光度的初始值的存储时刻设定为测定开始后的1秒后。在S104中进行了肯定判定时，进入S105。另一方面，在S104中进行了否定判定时，进入S106。在S105中，存储与受光元件9接受的光强度对应的光电信号数据初始值(基准光强度)。在S106中，判定现时间点是否为预先设定的取样时间。该取样时间的判定是通过对上述取样时间是否经过了在S103中计算出的取样间隔来判定。这里进行了肯定判定时，进入到S107。另一方面，在这里进行了否定判定时则返回S102处理之前。

S106中进行了肯定判定时，即，现时间点是取样时间时，在S107中，更新运算装置10内的存储器中的数据序列。即，将在S102中获得的数据作为最新数据收藏在存储器中。接着，在S108中，判定现时间点是否为预先设定的判定时刻。这里，预先设定的判定时刻是将最新数据与前次数据的差异值同预先设定的阈值进行比较、判定是否为反应起始时刻的时刻，该时刻可以与取样时刻同等地设定，也可以完全独立地设定。在S108中进行了否定判定时，返回S102处理之前。另一方面，在S108中进行了肯定判定时则进入S109。

在S109中计算光透射率或吸光度。光透射率可以通过在数据系列中将最新数据除以预先取得的没有样品状态下的数据来计算。另外，吸光度可以通过从1中减去计算的光透射率算出。接着，在S110中计算差异值。本实施例中，可以这样计算：从最新数据计算出的光透射率或吸光度的值中减去从数据序列中前一取样时间的数据计算的光透射率或吸光度的值。

在S111中计算基准差异值。本实施例中，基准差异值这样计算：从由测定开始后第2次取样时刻中取样的数据计算的光透射率或吸光度中，减去由第1次取样时刻取样的数据计算出的光透射率或吸光度。该基准差异值是用于消除本测定中的逐渐减少/升高的影响的背景值。

在S112中进行检测判定。这里，基本上判定从在S110中计算出的差异值中减去在S111中计算出的基准差异值所得的值是否比预先设定的阈值大，在判定其连续5次比阈值大时，则判定检测到反应起始时刻，在其为阈值以下时，则判定尚未检测到反应起始时刻。然后，在这里判定为检测到反应起始时刻时，将反应起始时刻的值和已检测的信息存储在运算装置10的存储器中。该处理的详细内容在下文描述。

在S113中更新计时器T的值。并且在S114中判定是否已检测到反应起始时刻。在S112中判定为已检测反应起始时刻以及对已检测的信息进行存储时，先结束本程序。另一方面，在S114中存储了尚未捡出的信息时，则返回S102处理之前。

接着，图12示出关于进行上述测定程序中的S112的检测判定的子程序。实施本子程序时，首先在S1001中，判定从S110中计算的差异值减去在S111中计算的基准差异值所得的值是否比预先设定的阈值大。这里进行了肯定判定时则进入到S1002。另一方面，进行了否定判定时则进入到S1007。

在S1002中，判定之前4次的判定中S1001的条件是否也满足。这里进行了肯定判定时则进入到S1003中。另一方面，进行了否定判定时则进入到S1007。即，在S1002中，判定在S110中计算的差异值减去在S111中计算的基准差异值所得的值比预先设定的阈值大的状态是否连续5次得到满足。

接着，在S1003中，判定检测到反应起始时刻。另一方面，在S1007中，判定未检测到反应起始时刻。在S1004中，以在S1003中判定检测到反应起始时刻时的时刻T作为检测时刻(反应起始时刻)，在显示该检测时刻的同时将其记录到运算装置10的存储器中。

在S1005中，从存储了预先取得的内毒素浓度和反应起始时刻的关系的图(相当于校准曲线)中计算内毒素浓度，显示该值，同时将其记录到运算装置10的存储器中。在S1006中，将检测判定完毕存储到运算装置10的存储器中。在S1008中，将检测判定未完毕存储到运算装置10的存储器中。S1006或S1008的处理结束时，本程序结束并进入到测定程序的S113处理中。

图11所示的测定程序的流程图和图12所示的子程序的流程图是用于进行本实施例的测定的程序的例子，并不意图使所述程序限于这些流程图中所示的程序。另外，在图12的S1002中，判定从在S110中计算的差异值中减去在S111中计算的基准差异值所得的值比预先设定的阈值大的状态是否连续5次满足，这是用于提高测定精度的处置，上述状态应当满足的次数除5次之外，例如当然也可以是1次。

<实施例5 (多系列差异法)>

接着，作为本实施方案的实施例5，对预先准备了实施间隔不同的多个系列的情形进行研究。这种情况下，系列数必须是2个以上。系列的数目没有上限，如果要对应更长时间的测定，通过准备更多的系列，可以进行更高精度的测定。实际上可准备的系列数目受到分析中使用的计算机存储区的大小和处理能力的限制。另外，如果可测定的装置的通道多，则必须同时准备这些系列。因此，系列数优选为每个通道30个以下，进一步优选10个以下。

对各个系列分配的时间间隔是任意的，实际上可以以5秒、10秒、15秒、20秒等的等间隔(一次函数)来分配，也可以分配成如1秒、3秒、10秒、30秒这样的指数函数性增加。在以上述时间间隔取得的差异值中，吸光度的变化不包含上述逐渐减少/升高时，期望测定开始初期的差异值为0。另外，吸光度的变化包含逐渐减少/升高时，各系列的取样间隔没有变化，因此各系列中，存储差异值的初始值，并可以将其作为背景值从各时刻的差异值中减掉。这样，在各系列中可以完全除去逐渐减少/升高对测定的影响。

本实施例中，使用比较例中得到的各吸光度变化曲线数据，通过多系列差异法求出吸光度差异值。使差异值的取得中使用的系列数为3个系列(系列名：S1、S2、S3)，各系列具有可保持60个数据的吸光度的序列。各系列的数据的取样间隔按照先进先出(FIFO：舍去序列内最旧的数据，新追加一个数据的方法)，在S1中每1秒、在S2中每6秒、在S3中每30秒进行吸光度的计算和数据的更新操作(最旧数据的删除和最新数据记录到序列中)。

吸光度的差异值ΔABS的计算如以下式(2)所示，通过在每个系列中计算序列两端的值的差异得到。

ΔABS=A[60]-A[1]                       (2)

其中，A[60]表示各系列所具有的序列中第60号(最新)的吸光度数据，A[1]表示各系列所具有的序列中第1号(最旧)的吸光度数据。根据式(2)，对S1-S3所有的系列计算吸光度的差异值。得到在各系列中首次得到的吸光度的初始值P1、P2、P3。取得的时刻是：P1是自开始1分钟，P2是自开始6分钟、P3是自开始30分钟的时间点。

在上述条件下取得的吸光度差异值多少都包含逐渐减少/升高，因此，随时间记录从各系列的各时刻下吸光度的差异值中减去吸光度的初始值所得的值，以任一系列的吸光度差异值超过阈值的时刻作为反应起始时刻(检测时刻)。各样品的吸光度差异值随时间的变化曲线如图13所示。由图13可知，内毒素的浓度为0.001 EU/mL、0.0001 EU/mL等低浓度时的吸光度差异值曲线是比图9所示比较例更大的值，两者均可以在现实的测定时间内判定反应起始时刻。

本实施例中，如上所述，差异值的阈值可以采用恒定值，其不依赖于自测定开始的时刻，也可以利用根据时间函数而变化的阈值。实际上，对于规定生理活性物质与LAL反应时的吸光度的变化，如果规定生理活性物质的浓度低则非常缓慢，因此利用时间函数时，可以设定为阈值的绝对值随时间减少。此时的时间函数可以预期和利用一次函数、单变量多项式等。

预先准备了时间间隔不同的多个系列时，每个系列超过阈值的时刻不同。这种情况下，判定反应起始时刻的方法采用最初通过的系列的时刻。或者考虑采取先通过的2个系列的平均值等的各种判定方法。但是，根据规定生理活性物质的浓度，认为只有1个系列超过阈值，因此，为了确实地检测，优选使用最初超过阈值的系列的值作为反应起始时刻。

本实施例中，各系列可以采用不同的阈值，例如对于系列S1，可定义为0.01，对于S2可定义为0.005，对于S3可定义为0.003等。由此，在内毒素浓度低的样品的测定中，差异值可以更确实地超过阈值。

图14表示通过上述多系列差异法进行内毒素测定的测定程序2的流程图。本程序是在测定开始的同时通过运算装置10实施的程序。实施本程序时，首先在S201中进行初始化动作，重新设定自测定开始的时间——变量T的值。接着进入S202，将与受光元件9接受的光强度对应的光电信号数据带入运算装置10。

接着，在S203中判定现时间点是否为S1、S2、S3中任一系列的初始值的存储时刻。这里，系列为S1时，初始值的存储时刻设定为测定开始后的1秒后。另外，系列为S2时，初始值的存储时刻设定为开始后的6秒后。这里，系列为S3时，初始值的存储时刻设定为开始后的30秒后。在S203中进行了肯定判定时，进入到S204。另一方面，在S203中进行了否定判定时则进入S205。

在S204中，存储各系列的光强度的初始值(基准光强度)。更具体地说，在S203中，判定为系列S1的初始值的存储时刻时，则在S204中存储对系列S1的基准光强度。在S203中，判定为系列S2的初始值的存储时刻时，则在S204中存储对系列S2的基准光强度。在S203中，判定为系列S3的初始值的存储时刻时，则在S204中存储对系列S3的基准光强度。

在S205中判定是否为用于S1的取样时间。该取样时间是通过对于上次的用于S1的取样时间，是否经过了预先设定的用于S1的取样间隔(1秒)来判定。这里进行了肯定判定时则进入S210，另一方面，这里进行了否定判定时则进入S206。

在S206中判定是否为用于S2的取样时间。该取样时间是通过对于上次的用于S2的取样时间，是否经过了预先设定的用于S2的取样间隔(6秒)来判定。这里进行了肯定判定时则进入S220，另一方面，这里进行了否定判定时则进入S207。

在S207中判定是否为用于S3的取样时间。该取样时间是通过对于上次的用于S3的取样时间，是否经过了预先设定的用于S3的取样间隔(30秒)来判定。这里进行了肯定判定时则进入S230，另一方面，这里进行了否定判定时则进入S208。

用于系列S1的取样时刻时所实施的S210-S215的处理、以及用于系列S2的取样时刻时所实施的S220-S225的处理、以及用于系列S3的取样时刻时所实施的S230-S235的处理与图11所示的测定程序的S107-S112的处理等同。因此，这些处理的详细说明在此省略。本程序中，在S211中进行了否定判定时以及完成S215的处理时，进入到S206的处理之前。另外，在S221中进行了否定判定时以及在S225的处理完成时，进入S207的处理之前。另外，在S231中进行了否定判定时以及在S235的处理完成时则进入到S240，计时器T的值被更新。

在S241中，系列S1-S3中，判定任一系列是否检测完毕。这里进行了肯定判定时则完成本程序。另一方面，进行否定判定时则返回S202的处理之前。

图14所示的测定程序S2的流程图是用于进行本实施例的测定的程序的例子，但并不意图将其限于这些流程图所示的流程。

<实施例6 (各差异法的比较)>

通过比较例和实施例4、5中记载的技术对同一测定数据进行分析，得到内毒素稀释系列水溶液样品的反应起始时刻。这里，对由这些方法得到的反应起始时刻进行比较，评价借助本实施方案的方法的有效性。已知内毒素浓度与反应起始时刻的关系用双对数图表示时，可近似直线。这里，如图15所示，将内毒素浓度(横轴)与反应起始时间(检测时间(纵轴))各进行对数制图。各图是以2次测定平均值表示。

在根据比较例的、不使时间间隔变化的通常的差异法中，内毒素浓度在1.0-0.001 EU/mL的浓度范围内可检测内毒素，但在其以下的浓度0.0001 EU/mL中，吸光度的差异值未达到足够大的数值，没有超越阈值，因此无法检测。另一方面，在本发明的时间函数差异法以及多系列差异法中，可在1.0-0.0001 EU/mL这样非常广范围的浓度下检测内毒素。由各种差异方法得到的图的线性(与近似式相关)如表1所示。

[表1]

由图15和表1表明，常规差异法的可测定范围的界限是：样品的内毒素浓度为0.001 EU/mL。另外，相关系数也比其它方法低。这得到图中、特别是在0.001 EU/mL的浓度时在近似式上方有较大偏离的支持。另一方面，关于本实施方案的两个差异法，图与近似式的偏离小，相关系数非常良好。特别是多系列差异法中可以说线性极为良好。

<实施例7 (比色法用鲎试剂的测定例)>

本实施例中，使用生化学バイオビジネス的パイオクラム作为比色用鲎试剂，采用上述实施例中使用的比浊测定装置1 (EX-100)，进行内毒素稀释系列(1.0-0.001 EU/mL)的测定。内毒素的检测采用多系列差异法。系列数、各系列的数据采样间隔、各系列所保有的序列的要素数、吸光度差异值的计算方法等条件利用与实施例5完全相同的条件。用两个数据数的平均值求出反应起始时间(检测时间)，将其与内毒素浓度的关系用双对数制图，结果如图16所示，得到了极高的线性。近似式由式(3)表示，相关系数(|r|)为0.9988。

Y=9.0266X^-0.2984                       (3)。

<实施例8 (通过β-D-葡聚糖测定试剂进行的β-D-葡聚糖测定例)

本实施例中，使用体外诊断用药物β-葡聚糖テストワコウ鲎试剂(和光纯药制造)，进行30-0.5 pg/mL浓度的β-D-葡聚糖稀释系列的测定。β-D-葡聚糖的检测可采用实施例5中使用的多系列差异法。系列数为3个系列，S1的取样间隔为每1秒，以下，S2为每6秒、S3为每15秒。结果，取得差异的差异间隔为：S1为1分钟、S2为6分钟、S3为15分钟。其它条件与实施例5中所示的测定同样进行。将β-D-葡聚糖浓度和测定得到的反应起始时刻(检测时间)的关系用双对数制图，如图17所示，可得到极高的线性。近似式如式(4)所示，相关系数(|r|)为0.9970。

Y=46.348X^-0.3852                       (4)。

<实施例9 (通过LAL结合珠法进行的内毒素测定例)>

本实施例中，使用LAL结合珠法(例如参照上述专利文献4)，进行1.0-0.001 EU/mL浓度的内毒素稀释系列的测定。在LAL结合珠法中，将LAL中所含的蛋白质与分散于预先准备的试剂液中的珠(微粒)吸附或结合，制作试剂。然后，使含有内毒素的样品与该试剂作用，使微粒之间缔合，早期生成大的凝集块，通过检测该凝集块的生成可以进行内毒素的测定。

内毒素的检测采用实施例5中使用的多系列差异法。系列数为3个系列，S1-S3系列中的取样间隔等分析条件与实施例5相同。另一方面，在使用LAL结合珠的测定中，样品中大量含有作为光散射体的珠，因此随着凝集，原本混浊的样品透明化。在该过程中，与获取吸光度的差异值相比，将光透射率的差异值用于凝集判定更为适当，因此，本实施例与实施例5不同，是以光透射率的差异值进行凝集判定。用于判定的阈值对S1-S3全部系列均为2.0。将内毒素浓度和测定得到的反应起始时刻(检测时间)的关系用双对数制图，如图18所示，可得到极高的线性。近似式如式(5)所示，相关系数(|r|)为0.9960。

Y=4.307X^-0.294                                (5)。

<实施例10 (使用比浊法用LAL试剂进行的内毒素测定例)

本实施例中，在使用比浊法用LAL试剂进行的内毒素测定中应用本发明。内毒素的检测采用实施例5中使用的多系列差异法。系列数为3个系列，S1-S3系列中的取样间隔等分析条件与实施例5相同。吸光度的变化包含逐渐减少/升高时，在各系列中，并不是从各时刻的差异值中减去作为背景值的差异值的初始值，而是将要减的值动态更新。

图19是使用比浊法用LAL试剂“パイロテル(注册商标，ケープコッド制造，生化学バイオビジネス销售)”进行的内毒素测定例。本实施例中，在1-0.001 EU/mL的范围内，使用上述3个系列的取样间隔，进行7个浓度的内毒素稀释系列的测定。

本实施例中，对每个取样时间测定吸光度差异值，将包含过去的取样时间得到的多个吸光度差异值按照每个系列、按大小顺序重排，更新并记录后数的5个数据。然后，将各系列中第3小的值作为各系列的基准值，从该时间点得到的吸光度差异值中减去。然后，通过该减去值是否超过阈值来进行反应起始时间的检测判定。关于阈值，取样间隔为1秒或6秒时(系列S1和S2中)为0.01，取样间隔为30秒时(系列S3中)为0.005。

将内毒素浓度和测定得到的反应起始时刻(检测时间)的关系用双对数制图，如图19所示，可得到极高的线性。パイロテル有使差异值的变动大的倾向，因此，在吸光度的变化包含逐渐减少/升高时，一边随时变更要从各时刻的差异值中减去的值，一边进行判定的本实施例方法可谓有效。近似式如式(6)所示，相关系数(|r|)为0.9955。

Y=11.191X^-0.239                            (6)。

图20对本实施例中的基准差异值计算子程序进行说明。该基准差异值计算子程序是在本实施例中、在实施图14所示的测定程序2时、在S214、S224、S234的处理中实施的子程序。实施本程序时，首先在S701中，对每个取样时间取得吸光度差异值。

在S702中判定吸光度的差异值数据是否为5个数据。这里进行了肯定判定时则进入到S703。另一方面，进行否定判定时则进入到S706。在S703中判定现时间点的吸光度差异值是否进入到后数5位。这里进行了肯定判定时则进入S704。另一方面，进行了否定判定时则进入S705。

在S704中，在后数的5个数据中加入新取得的数据，用以将后数的5个数据更新。S704处理结束，则进入S705。S705中，将该时间点的后数第3位数据设定为基准差异值。在S706中，将该时间点的最小数据设定基准差异值。S705或S706的处理结束，则进入S707，在S707中，决定基准差异值并存储，复原至测定程序2的主程序中。这里，图20所示的基准差异值计算子程序的流程图是用于进行本实施例的测定的程序的例子，并不意图将其限定为这些流程图所述的程序。

上述实施例中，对于将本发明用于通过比浊测定装置1的搅拌比浊法的例子进行了说明，本发明当然也可采用不以搅拌为前提的比浊法、搅拌比浊法以外的测定方法、测定仪器。另外，上述实施例中，对以吸光度等物理量超过阈值的时刻为反应起始时刻的例子进行了说明，也可以是以吸光度等物理量达到阈值以上的时刻作为反应起始时刻。或者以透光量、散射光量、光散射粒子数、荧光强度、化学发光强度等物理量超过阈值的时刻或达到阈值以上的时刻作为反应起始时刻。

另外，在上述实施例中以吸光度作为检测值时，将两个取得时刻中吸光度的差异超过阈值的时刻判定为反应起始时刻，例如以光透射率为检测值时，检测值随时间而降低，因此，这种情况下，也可以以两个取得时刻下的光透射率的差异绝对值超过阈值的时刻作为反应起始时刻。

另外，上述实施例中，一个取得时刻的检测值或差异值实际上可以使用该取得时刻前后的多个数据的平均值或中值。还可以进一步将数据按照大小顺序重排，使用指定等级的数值等。由此，可以降低噪声对各取得时刻的检测值或差异值的影响，可以进行精度更良好的测定。例如，可以将取得时刻前后的合计30-40个数据进行平均，作为该取得时刻的检测值或差异值。

另外，上述实施例中，判定差异值是否超过阈值时，可以将在多个取得时刻中差异值连续地超过阈值判定为超过了阈值。由此，可以降低噪声对反应起始时刻判定的影响，可以使内毒素的测定精度更确实地提高。

符号说明

1          比浊测量装置

2          玻璃制容器

3          搅拌子

4          搅拌器

4a        马达

4b        磁铁

5          保温器

5a        入射孔

5b       出射孔

6         光源

7         光圈

8         光圈

9         受光元件

10       运算装置

11        测定系统

12        光源

13        入射光学系统

14        样品池

15        出射光学系统

16         受光元件

17         放大电路

18         噪声除去滤波器

19         运算装置

20         显示器

21         搅拌子

22         搅拌器

Claims (22)

1. 来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：

将鲎的血细胞提取物LAL与含有规定的来自生物的生理活性物质的样品混合，在所述混合后，将由于LAL与所述生理活性物质反应而变化的规定的物理量作为检测值连续地取得；

在一个取得时刻的检测值、与仅比所述一个取得时刻提前规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值达到阈值以上或超过阈值时，以所述一个取得时刻作为反应起始时刻；

根据所述反应起始时刻，检测所述样品中的所述生理活性物质或测定其浓度。

2. 权利要求1的来自生物的生理活性物质的测定方法，所述测定方法通过使存在于样品中的来自生物的生理活性物质与鲎的血细胞提取物LAL反应来检测所述样品中的所述生理活性物质或测定所述生理活性物质的浓度，

所述测定方法的特征在于：

在所述样品与LAL混合后，对所述样品和LAL的混合液中入射光，同时取得所述入射的光中透过了所述混合液的光或被所述混合液散射的光的强度，

将由所述取得的光的强度得到的、以规定的时间间隔设定的取得时刻的规定物理量作为检测值，

以一个取得时刻的检测值和在前的取得时刻的检测值之差或差的绝对值达到阈值以上或超过阈值的时刻作为反应起始时刻。

3. 权利要求2的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：

所述取得的光的强度是透过所述混合液的光的强度，

所述检测值是以百分数表示的所述混合液的透射率，

使所述规定时间间隔为约2分钟，

以所述一个取得时刻的所述透射率与前一取得时刻的所述透射率之差的绝对值超过1的时刻作为反应起始时刻。

4. 权利要求2的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：

所述取得的光的强度是被所述混合液散射的光的强度，

所述检测值是基于所述散射的光强度中的规定峰数目导出的、使对所述混合液中入射的光散射的粒子数，

使所述规定时间间隔为约100秒，

以所述一个取得时刻的所述粒子数和前一取得时刻的所述粒子数之差超过200的时刻作为反应起始时刻。

5. 权利要求1的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：根据所述一个取得时刻来改变所述规定时间间隔。

6. 权利要求5的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：

对所述LAL与所述样品的混合液中入射光，同时连续地探测所述入射的光中透过所述混合液的光或被所述混合液散射的光的强度，

以由连续探测的所述光强度取得的光透射率、吸光度、散射光强度、光散射粒子数、荧光强度、化学发光强度中的任一种作为检测值。

7. 权利要求5或6的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：使所述规定时间间隔延长，以便所述一个取得时刻更为推后。

8. 权利要求5或6的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：

设置所述规定时间间隔设定为恒定的取得时刻的多个序列，所述多个序列的所述规定时间间隔互不相同，

根据所述一个取得时刻来切换所使用的系列。

9. 权利要求8的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：所述所使用的系列是所述一个取得时刻的检测值、与仅比所述一个取得时刻提前所述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值最大的系列。

10. 权利要求8的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：

改变取得时刻，取得多个所述一个取得时刻的检测值、与仅比所述一个取得时刻提前所述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值；将所述差或差的绝对值按照大小顺序排列时处于规定等级的值作为基准差异值；在从所述差或差的绝对值中减去所述基准差异值所得的值达到所述阈值以上或超过所述阈值时，以所述一个取得时刻为反应起始时刻。

11. 权利要求1-10中任一项的来自生物的生理活性物质的测定方法，其特征在于：所述来自生物的生理活性物质是内毒素或β-D-葡聚糖。

12. 来自生物的生理活性物质的测定装置，所述测定装置设置以下设备：

混合液保持设备，其使含有规定的来自生物的生理活性物质的样品与鲎的血细胞提取物LAL的混合液保持可入射光，同时使所述混合液中的反应进行；

搅拌设备，其对所述混合液保持设备中的所述混合液进行搅拌；

光入射设备，其对所述混合液保持设备中的混合液入射光；

受光设备，其接受所述入射光从所述混合液的透射光或散射光，并将其转换成电信号；

判定设备，其由在所述受光设备中转换的电信号来判定所述样品中的所述生理活性物质与LAL的反应起始时刻；

导出设备，其由预先确定的所述反应起始时刻与所述生理活性物质的浓度的关系导出所述样品中的所述生理活性物质的存在或浓度；

所述装置的特征在于：所述判定设备在以规定的时间间隔设定的取得时刻中，以对所述电信号施加规定运算所得的信号或以所述电信号作为检测信号值，将一个取得时刻的检测信号值与在前的取得时刻的检测信号值之差或差的绝对值达到阈值以上或超过阈值的时刻判定为反应起始时刻。

13. 权利要求12的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：

所述检测信号值是以百分数表示的所述混合液的透射率，

所述规定的时间间隔为约2分钟，

所述阈值为1。

14. 权利要求12的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：

所述检测信号值是使入射到所述混合液中的光散射的粒子数，

所述规定的时间间隔为约100秒，

所述阈值为200。

15. 权利要求12的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：使所述规定的时间间隔和/或所述阈值可变。

16. 权利要求12的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：所述判定设备根据所述一个取得时刻来改变所述规定的时间间隔。

17. 权利要求16的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：所述判定设备使所述规定的时间间隔延长，以便使所述一个取得时刻更为推后。

18. 权利要求17的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：

所述判定设备设置所述规定时间间隔设定为恒定的取得时刻的多个序列，所述多个序列的所述规定时间间隔互不相同，

根据所述一个取得时刻来切换所使用的系列。

19. 权利要求18的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：所述所使用的系列是所述一个取得时刻的检测值、与仅比所述一个取得时刻提前所述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值最大的系列。

20. 权利要求18的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：

改变取得时刻，取得多个所述一个取得时刻的检测值、与仅比所述一个取得时刻提前所述规定时间间隔的取得时刻的检测值之差或差的绝对值；将所述差或差的绝对值按照大小顺序排列时处于规定等级的值作为基准差异值；将从所述差或差的绝对值中减去所述基准差异值所得的值达到所述阈值以上或超过所述阈值的时刻为反应起始时刻。

21. 权利要求12-20中任一项的来自生物的生理活性物质的测定装置，其特征在于：所述来自生物的生理活性物质是内毒素或β-D-葡聚糖。

22. 程序，所述程序用于实施权利要求5-11中任一项的来自生物的生理活性物质的测定方法。

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