JP3061418B2 - リムルス試薬反応性物質の測定方法 - Google Patents
リムルス試薬反応性物質の測定方法Info
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- JP3061418B2 JP3061418B2 JP7514959A JP51495994A JP3061418B2 JP 3061418 B2 JP3061418 B2 JP 3061418B2 JP 7514959 A JP7514959 A JP 7514959A JP 51495994 A JP51495994 A JP 51495994A JP 3061418 B2 JP3061418 B2 JP 3061418B2
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、リムルス・アメボサイト・ライセート試
薬（以下、リムルス試薬という）を用いて、エンドトキ
シン、（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下、β−グル
カンと略称する）などのリムルス試薬反応性物質を測定
する測定方法に関する。
薬（以下、リムルス試薬という）を用いて、エンドトキ
シン、（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下、β−グル
カンと略称する）などのリムルス試薬反応性物質を測定
する測定方法に関する。
背景技術 エンドトキシンが混入した血液、輸液、注射液を体内
に注入すると、強い発熱やショックなどの副作用を引き
起こすことがあるので、輸液、注射液などの医薬品の製
造工程においては、エンドトキシンの混入を防ぐため
に、その都度エンドトキシン量を測定しなければならな
い。
に注入すると、強い発熱やショックなどの副作用を引き
起こすことがあるので、輸液、注射液などの医薬品の製
造工程においては、エンドトキシンの混入を防ぐため
に、その都度エンドトキシン量を測定しなければならな
い。
リムルス・アメボサイト・ライセートが、エンドトキ
シンを反応してゲル化する現象が見出され、従来より兎
発熱試験に代わるエンドトキシンの測定方法として、こ
の現象を応用した測定方法が実施されている。
シンを反応してゲル化する現象が見出され、従来より兎
発熱試験に代わるエンドトキシンの測定方法として、こ
の現象を応用した測定方法が実施されている。
この測定方法としては、ゲル化にともなう反応液（検
体溶液とリムルス試薬を含有する反応混合液）の濁りの
程度を客観的に判定する目的で、反応液に特定の光線を
照射し、時間の経過とともに透過光量の減少（吸光度の
増加）を検知して、初期値との比率を求め、この比率が
一定値に到達するまでの時間をゲル化時間と判定してエ
ンドトキシン濃度測定の指標とする測定方法が知られて
いる（反応速度法により比濁法リムルステストの一種；
比濁時間分析法；特公平５−31744号公報参照）。
体溶液とリムルス試薬を含有する反応混合液）の濁りの
程度を客観的に判定する目的で、反応液に特定の光線を
照射し、時間の経過とともに透過光量の減少（吸光度の
増加）を検知して、初期値との比率を求め、この比率が
一定値に到達するまでの時間をゲル化時間と判定してエ
ンドトキシン濃度測定の指標とする測定方法が知られて
いる（反応速度法により比濁法リムルステストの一種；
比濁時間分析法；特公平５−31744号公報参照）。
このような光学的な測定法法においては、光源として
波長660nm程度の光線を放射する発光ダイオードが使用
され、光量検出器としてフォト・ダイオード、光電セル
などが使用されている。
波長660nm程度の光線を放射する発光ダイオードが使用
され、光量検出器としてフォト・ダイオード、光電セル
などが使用されている。
また、β−グルカンも、リムルス・アメボサイト・ラ
イセートをゲル化させることが知られている。
イセートをゲル化させることが知られている。
このような従来の光学的な測定法法においては、光源
から照射される光線の波長が、ゲル化して行く反応液の
透過度または吸光度の検知に適した波長であるか否かに
ついて考慮されていなかった。また、従来の比濁法リム
ルステストでは単波長の光線を用いた測定しか行われて
いなかった。
から照射される光線の波長が、ゲル化して行く反応液の
透過度または吸光度の検知に適した波長であるか否かに
ついて考慮されていなかった。また、従来の比濁法リム
ルステストでは単波長の光線を用いた測定しか行われて
いなかった。
また、検体溶液中に着色物質、タンパク、核酸等の妨
害物質が存在しても、測定値が安定し、かかる実用に供
し得る感度を有することが必要であるにもかかわらず、
従来の測定法法においては、このような条件を満たして
いるとは言えなかった。
害物質が存在しても、測定値が安定し、かかる実用に供
し得る感度を有することが必要であるにもかかわらず、
従来の測定法法においては、このような条件を満たして
いるとは言えなかった。
そこで、この発明の測定法法は、比濁法リムルステス
トによって、エンドトキシンまたはβ−グルカン等のリ
ムルス試薬反応性物質を測定する際に、妨害物質の影響
を受けることなく、高感度、高精度に測定できる２種の
光線の波長（測定波長および対照波長）を決定すること
を目的として考えられたものである。
トによって、エンドトキシンまたはβ−グルカン等のリ
ムルス試薬反応性物質を測定する際に、妨害物質の影響
を受けることなく、高感度、高精度に測定できる２種の
光線の波長（測定波長および対照波長）を決定すること
を目的として考えられたものである。
発明の開示 この発明のリムルス試薬反応性物質の測定法法は、検
体溶液にリムルス試薬を作用させ、ゲル化を起こさせて
ゲル化に伴う反応液の濁度の上昇に基づく透過光の吸光
度値の変化を検知して、検体中のリムルス試薬反応性物
質を測定する測定方法において、反応液に照射する光線
として測定波長460〜550nmおよび対照波長650〜800nmと
異なる２種の光線を使用し、両光線における各吸光度値
の差を求め、この差をリムルス試薬反応性物質の濃度に
対応させるものである。
体溶液にリムルス試薬を作用させ、ゲル化を起こさせて
ゲル化に伴う反応液の濁度の上昇に基づく透過光の吸光
度値の変化を検知して、検体中のリムルス試薬反応性物
質を測定する測定方法において、反応液に照射する光線
として測定波長460〜550nmおよび対照波長650〜800nmと
異なる２種の光線を使用し、両光線における各吸光度値
の差を求め、この差をリムルス試薬反応性物質の濃度に
対応させるものである。
また、リムルス試薬反応性物質としては、エンドトキ
シンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンが挙げられ
る。
シンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンが挙げられ
る。
図面の簡単な説明 第１図は、この発明のリムルス試薬反応性物質の測定
法法で使用する濁度測定装置の一例を示す側面図、 第２図は、測定波長が490nmであるとき、対照波長
と、２波長測定による吸光度値の差（（ａ）は吸光度値
の差の比率；（ｂ）は吸光度値の差）との関係を示す特
性曲線図、 第３図は、測定波長が520nmであるとき、対照波長
と、２波長測定による吸光度値の差（（ａ）は吸光度値
の差の比率；（ｂ）は吸光度値の差）との関係を示す特
性曲線図、 第４図は、反応液の吸光度値の差の変化率と、リムル
ス試薬反応性物質（エンドトキシン）の濃度との関係を
示す特性曲線図、 第５図は、反応液の吸光度値がある閾値に到達するま
での時間と、リムルス試薬反応性物質（エンドトキシ
ン）の濃度との関係を示す特性曲線図、 第６図は、反応液の吸光度値がある閾値に到達するま
での時間と、リムルス試薬反応性物質（β−グルカン）
の濃度との関係を示す特性曲線図である。
法法で使用する濁度測定装置の一例を示す側面図、 第２図は、測定波長が490nmであるとき、対照波長
と、２波長測定による吸光度値の差（（ａ）は吸光度値
の差の比率；（ｂ）は吸光度値の差）との関係を示す特
性曲線図、 第３図は、測定波長が520nmであるとき、対照波長
と、２波長測定による吸光度値の差（（ａ）は吸光度値
の差の比率；（ｂ）は吸光度値の差）との関係を示す特
性曲線図、 第４図は、反応液の吸光度値の差の変化率と、リムル
ス試薬反応性物質（エンドトキシン）の濃度との関係を
示す特性曲線図、 第５図は、反応液の吸光度値がある閾値に到達するま
での時間と、リムルス試薬反応性物質（エンドトキシ
ン）の濃度との関係を示す特性曲線図、 第６図は、反応液の吸光度値がある閾値に到達するま
での時間と、リムルス試薬反応性物質（β−グルカン）
の濃度との関係を示す特性曲線図である。
発明を実施するための最良の形態 この発明で使用するリムルス試薬とは、リムルス・ポ
リフェムス（Limulus polyphemus）、タキプレウス・ト
リデンタツス（Tachypleus tridetatus）、タキプレウ
ス・ギガス（T.gigas）、カルシノスコルピウス・ロツ
ンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）等のカ
ブトガニ血リンパ液から、通常の方法（例えば、Journa
l of Biochemistry,80,1011−1021（1976）参照）によ
り調製した血球抽出物（リムルス・アメボサイト・ライ
セート）またはその加工物であり、エンドトキシンおよ
び／またはβ−グルカンがこれに作用してゲル化する試
薬である。
リフェムス（Limulus polyphemus）、タキプレウス・ト
リデンタツス（Tachypleus tridetatus）、タキプレウ
ス・ギガス（T.gigas）、カルシノスコルピウス・ロツ
ンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）等のカ
ブトガニ血リンパ液から、通常の方法（例えば、Journa
l of Biochemistry,80,1011−1021（1976）参照）によ
り調製した血球抽出物（リムルス・アメボサイト・ライ
セート）またはその加工物であり、エンドトキシンおよ
び／またはβ−グルカンがこれに作用してゲル化する試
薬である。
上記加工物とは、例えば、リムルス・アメボサイト・
ライセートをクロロホルム等の有機溶媒で抽出処理した
り、界面活性剤を添加してエンドトキシンに対する感受
性を向上させたものが挙げられる。また、リムルス・ア
メボサイト・ライセートには、通常エンドトキシン感受
性因子（Ｃ因子）およびβ−グルカン感受性因子（Ｇ因
子）の両方が含まれるが、上記加工物としては、デキス
トラン硫酸、スルホプロピル基等を結合した担体等を用
いてリムルス・アメボサイト・ライセートを処理し、上
記Ｃ因子またはＧ因子の何れか一方の因子を分画もしく
は除去して、エンドトキシンまたはβ−グルカンの一方
のみに作用するように加工されたものが挙げられる。
ライセートをクロロホルム等の有機溶媒で抽出処理した
り、界面活性剤を添加してエンドトキシンに対する感受
性を向上させたものが挙げられる。また、リムルス・ア
メボサイト・ライセートには、通常エンドトキシン感受
性因子（Ｃ因子）およびβ−グルカン感受性因子（Ｇ因
子）の両方が含まれるが、上記加工物としては、デキス
トラン硫酸、スルホプロピル基等を結合した担体等を用
いてリムルス・アメボサイト・ライセートを処理し、上
記Ｃ因子またはＧ因子の何れか一方の因子を分画もしく
は除去して、エンドトキシンまたはβ−グルカンの一方
のみに作用するように加工されたものが挙げられる。
さらに、リムルス・アメボサイト・ライセートに、例
えば（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位が特定個
数結合したポリグリコシドを共存させることによって、
Ｇ因子の活性化を阻害し、エンドトキシンにのみ反応す
るように加工したものも上記加工物に包含される。な
お、リムルス試薬は液体、粉末、固形物等のいずれの形
態であってもよい。
えば（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位が特定個
数結合したポリグリコシドを共存させることによって、
Ｇ因子の活性化を阻害し、エンドトキシンにのみ反応す
るように加工したものも上記加工物に包含される。な
お、リムルス試薬は液体、粉末、固形物等のいずれの形
態であってもよい。
この発明において、リムルス試薬反応性物質を測定す
べき検体溶液は、特に限定されるものではなく、血液、
尿、髄液、輸液、注射液、水等が例示される。
べき検体溶液は、特に限定されるものではなく、血液、
尿、髄液、輸液、注射液、水等が例示される。
検体溶液を、必要に応じて前処理（酸処理、アルカリ
処理、加熱処理、界面活性剤処理等）し、適当な反応容
器中でリムルス試薬を作用させ、ゲル化を起こさせてゲ
ル化に伴う濁度の上昇を、反応液に対して波長の異なる
２種の光線（測定波長460〜550nmおよび対照波長650〜8
00nm）を照射し、それぞれの吸光度を測定し、両光線に
おける各吸光度値の差を算出する。そして、既知濃度の
リムルス試薬反応性物質を含む溶液について同様に測定
して作成した検量線と、検体溶液について測定した値と
を比較して検体溶液中のリムルス試薬反応性物質を定量
することができる。吸光度値の差の算出、および、検量
線と測定した値との比較は、予め作成されたプログラム
に従って自動的に行なうこともできる。
処理、加熱処理、界面活性剤処理等）し、適当な反応容
器中でリムルス試薬を作用させ、ゲル化を起こさせてゲ
ル化に伴う濁度の上昇を、反応液に対して波長の異なる
２種の光線（測定波長460〜550nmおよび対照波長650〜8
00nm）を照射し、それぞれの吸光度を測定し、両光線に
おける各吸光度値の差を算出する。そして、既知濃度の
リムルス試薬反応性物質を含む溶液について同様に測定
して作成した検量線と、検体溶液について測定した値と
を比較して検体溶液中のリムルス試薬反応性物質を定量
することができる。吸光度値の差の算出、および、検量
線と測定した値との比較は、予め作成されたプログラム
に従って自動的に行なうこともできる。
検体溶液にリムルス試薬を作用させるには、検体溶液
とリムルス試薬とを混合して反応液とし、30〜50℃、好
ましくは35〜45℃において15分〜３時間、好ましくは30
分〜90分間反応させればよい。
とリムルス試薬とを混合して反応液とし、30〜50℃、好
ましくは35〜45℃において15分〜３時間、好ましくは30
分〜90分間反応させればよい。
吸光度の測定方式は、反応を停止した後、測定する方
式（エンドポイント法）、または反応させながら測定す
る方式（反応速度法；カイネティック法）の何れであっ
てもよい。反応速度法としては、反応液の吸光度（透過
光量）が一定の値に達するまでの時間をゲル化時間とす
る方式（比濁時間分析法）、反応液の吸光度の変化率を
測定する方式などが挙げられる。
式（エンドポイント法）、または反応させながら測定す
る方式（反応速度法；カイネティック法）の何れであっ
てもよい。反応速度法としては、反応液の吸光度（透過
光量）が一定の値に達するまでの時間をゲル化時間とす
る方式（比濁時間分析法）、反応液の吸光度の変化率を
測定する方式などが挙げられる。
なお、反応容器は、通常のリムルステストに使用され
る容器であればよく、実質的に光の透過に影響を及ぼさ
ない材質および形状の容器が適用される。例えば、ガラ
ス、プラスチック等の試験管またはマイクロプレートが
好適である。
る容器であればよく、実質的に光の透過に影響を及ぼさ
ない材質および形状の容器が適用される。例えば、ガラ
ス、プラスチック等の試験管またはマイクロプレートが
好適である。
この発明を実施するための形態で使用する吸光度測定
装置は、例えば、マイクロプレートを反応容器とした場
合、第１図に示すように、キャリア５に載せられ、検体
および試薬よりなる反応液14を入れる複数のウエル11を
設けた測定用マイクロプレート１と、電球などの発光体
31、スリット32、モータなどの回転装置35によって選定
された特定波長の光線を透過させる２種のフィルタ33
a、33bよりなる光源３と、２種のフィルタ33a、33bで選
定された光線を測定用マイクロプレート１のウエル11の
列数に分割する光学繊維34と、反応液14を透過した光線
の強度を電気信号に変換する光電変換素子４などよりな
る光学系を備えている。なお、マイクロプレート１の底
面に設けられた孔21を有するアルミ板２は、温度分布を
均一化するためのものである。
装置は、例えば、マイクロプレートを反応容器とした場
合、第１図に示すように、キャリア５に載せられ、検体
および試薬よりなる反応液14を入れる複数のウエル11を
設けた測定用マイクロプレート１と、電球などの発光体
31、スリット32、モータなどの回転装置35によって選定
された特定波長の光線を透過させる２種のフィルタ33
a、33bよりなる光源３と、２種のフィルタ33a、33bで選
定された光線を測定用マイクロプレート１のウエル11の
列数に分割する光学繊維34と、反応液14を透過した光線
の強度を電気信号に変換する光電変換素子４などよりな
る光学系を備えている。なお、マイクロプレート１の底
面に設けられた孔21を有するアルミ板２は、温度分布を
均一化するためのものである。
［発明を実施するための形態1:エンドポイント法による
エンドトキシンの測定］ この発明のリムルス試薬反応性物質の測定方法におい
て、検体溶液中に存在する可能性のあるタンパク、色素
等の妨害物質の影響を受けない光線の最適な波長を求め
るために、次の実験を行なった。
エンドトキシンの測定］ この発明のリムルス試薬反応性物質の測定方法におい
て、検体溶液中に存在する可能性のあるタンパク、色素
等の妨害物質の影響を受けない光線の最適な波長を求め
るために、次の実験を行なった。
市販のリムルス試薬（Associates of Cape Cod社製
造、生化学工業株式会社が「パイロテル」という名称で
販売している試薬）1mlをガラス試験管に採り、大腸菌0
111:B4株由来のエンドトキシン溶液（0.25EU/ml:EUは、
Endotoxin Unitの略）1mlを加え、37℃で30分間反応さ
せた後、10％トリフルオロ酢酸0.02mlを添加して反応を
停止させた。
造、生化学工業株式会社が「パイロテル」という名称で
販売している試薬）1mlをガラス試験管に採り、大腸菌0
111:B4株由来のエンドトキシン溶液（0.25EU/ml:EUは、
Endotoxin Unitの略）1mlを加え、37℃で30分間反応さ
せた後、10％トリフルオロ酢酸0.02mlを添加して反応を
停止させた。
次いで、 （条件Ａ）上記反応物に対して、タンパクとして25％ヒ
ト血清アルブミン（HSA）製剤（ミドリ十字株式会社
製）を終濃度で0.5％となるように添加し、 （条件Ｂ）上記反応物に対して、黄色色素として5mMの
パラニトロアニリン（pNA）を終濃度で0.5mMとなるよう
に添加し、 （条件Ｃ）上記反応物に対して、蒸留水（DW）を条件Ａ
および条件Ｂの水溶液と同量添加して、 ３種の検体溶液を作り、これら３種の検体溶液に対し
て、測定波長範囲200〜890nmおよび対照波長範囲210〜9
00nmの光線を10nm間隔で照射し、各波長における吸光度
値を測定し、両吸光度値の差を求めた。そして、条件Ｃ
（DW）における２波長測定の吸光度値の差に対する条件
Ａ（HSA）または条件Ｂ（pNA）における２波長測定の吸
光度値の差の比が1.0±0.05を示し、かつ、各測定条件
における２波長測定の吸光度値の差が0.2以上を示す測
定波長と対照波長の組み合わせを解析した。その結果、
測定波長として460〜550nm、対照波長として650〜800nm
の波長の組み合わせを選択した。
ト血清アルブミン（HSA）製剤（ミドリ十字株式会社
製）を終濃度で0.5％となるように添加し、 （条件Ｂ）上記反応物に対して、黄色色素として5mMの
パラニトロアニリン（pNA）を終濃度で0.5mMとなるよう
に添加し、 （条件Ｃ）上記反応物に対して、蒸留水（DW）を条件Ａ
および条件Ｂの水溶液と同量添加して、 ３種の検体溶液を作り、これら３種の検体溶液に対し
て、測定波長範囲200〜890nmおよび対照波長範囲210〜9
00nmの光線を10nm間隔で照射し、各波長における吸光度
値を測定し、両吸光度値の差を求めた。そして、条件Ｃ
（DW）における２波長測定の吸光度値の差に対する条件
Ａ（HSA）または条件Ｂ（pNA）における２波長測定の吸
光度値の差の比が1.0±0.05を示し、かつ、各測定条件
における２波長測定の吸光度値の差が0.2以上を示す測
定波長と対照波長の組み合わせを解析した。その結果、
測定波長として460〜550nm、対照波長として650〜800nm
の波長の組み合わせを選択した。
その一例として測定波長490nmにおける吸光度値から
対照波長範囲500〜900nmの各吸光度値を差し引いて得た
データを解析した結果を第２図の（ａ）および（ｂ）に
示す。
対照波長範囲500〜900nmの各吸光度値を差し引いて得た
データを解析した結果を第２図の（ａ）および（ｂ）に
示す。
すなわち、横軸に対照波長（500〜900nm）をとった第
２図の（ａ）において、黒丸の特性曲線は、「エンドト
キシン水溶液を用いて２波長測定した吸光度値の差
（Ａ）」に対する「エンドトキシンをパラニトロアニリ
ン（pNA）水溶液に溶解した溶液を用いて２波長測定し
た吸光度値の差（Ｂ）」の比較（B/A）を示し、白丸の
特性曲線は、縦軸に「エンドトキシン水溶液を用いて２
波長測定した吸光度値の差（Ａ）」に対する「エンドト
キシンをヒト血清アルブミン（HSA）に溶解した溶液を
用いて２波長測定した吸光度値の差（Ｃ）」の比較（C/
A）を示す。
２図の（ａ）において、黒丸の特性曲線は、「エンドト
キシン水溶液を用いて２波長測定した吸光度値の差
（Ａ）」に対する「エンドトキシンをパラニトロアニリ
ン（pNA）水溶液に溶解した溶液を用いて２波長測定し
た吸光度値の差（Ｂ）」の比較（B/A）を示し、白丸の
特性曲線は、縦軸に「エンドトキシン水溶液を用いて２
波長測定した吸光度値の差（Ａ）」に対する「エンドト
キシンをヒト血清アルブミン（HSA）に溶解した溶液を
用いて２波長測定した吸光度値の差（Ｃ）」の比較（C/
A）を示す。
また、第２図の（ｂ）において、白三角の特性曲線
は、縦軸に「エンドトキシン水溶液を用いて２波長測定
した吸光度値の差（Ａ）」を示し、黒丸の特性曲線は、
縦軸に「エンドトキシンをパラニトロアニリン（pNA）
水溶液に溶解した溶液を用いて２波長測定した吸光度値
の差（Ｂ）」を示し、白丸の特性曲線は、縦軸に「エン
ドトキシンをヒト血清アルブミン（HSA）に溶解した溶
液を用いて２波長測定した吸光度値の差（Ｃ）」をそれ
ぞれ示す。
は、縦軸に「エンドトキシン水溶液を用いて２波長測定
した吸光度値の差（Ａ）」を示し、黒丸の特性曲線は、
縦軸に「エンドトキシンをパラニトロアニリン（pNA）
水溶液に溶解した溶液を用いて２波長測定した吸光度値
の差（Ｂ）」を示し、白丸の特性曲線は、縦軸に「エン
ドトキシンをヒト血清アルブミン（HSA）に溶解した溶
液を用いて２波長測定した吸光度値の差（Ｃ）」をそれ
ぞれ示す。
同様に、上記３種の反応液に対して、測定波長520nm
における吸光度値から対照波長範囲530〜900nmの各吸光
度値を差し引いて得たデータを解析した結果を、第３図
の（ａ）および（ｂ）に示す。
における吸光度値から対照波長範囲530〜900nmの各吸光
度値を差し引いて得たデータを解析した結果を、第３図
の（ａ）および（ｂ）に示す。
これらの測定結果より、タンパク共存状態（条件A:HS
A）、色素共存状態（条件B:pNA）のいずれの条件でも、
蒸留水（条件C:DW）と殆ど変わらず（２波長測定の差の
比率が、ほぼ１）、かつ、高い吸光度を呈する波長範囲
は、測定波長が460〜550nm、対照波長が650〜800nmであ
ることが明らかになった。
A）、色素共存状態（条件B:pNA）のいずれの条件でも、
蒸留水（条件C:DW）と殆ど変わらず（２波長測定の差の
比率が、ほぼ１）、かつ、高い吸光度を呈する波長範囲
は、測定波長が460〜550nm、対照波長が650〜800nmであ
ることが明らかになった。
［発明を実施するための形態2:反応速度法によるエンド
トキシンの測定］ 「パイロテル」0.05mlを96穴マイクロプレート（生化
学工業株式会社から発売されているトキシペットプレー
ト96F）のウェルに採り、大腸菌UKT−Ｂ株由来のエンド
トキシン溶液の0.005〜100EU/mlの範囲内で濃度が異な
る５種類のもの各0.05mlを加えた。それらに対して、 （条件A1）タンパクとして25％ヒト血清アルブミン（HS
A）製剤を終濃度で0.5％となるように添加し、 （条件A2）タンパクとして25％ヒト血清アルブミン（HS
A）製剤を終濃度で0.1％となるように添加し、 （条件Ｂ）黄色色素として5mMのパラニトロアニリン（p
NA）を終濃度で0.5mMとなるように添加し、 （条件Ｃ）蒸留水（DW）を条件A1、条件A2、条件Ｂの各
水溶液と同量添加して、 20種（＝５種類×４条件）の反応液を作り、マイクロ
プレートの各ウエルに採り、恒温槽を備えたマイクロプ
レートリーダー（生化学工業株式会社から発売されてい
るウエルリーダーSK601）にセットし、攪拌した後、37
℃で反応させながら、測定波長490nmの光線Ａおよび対
照波長660nmの光線Ｂを15秒間隔で照射し、波長が異な
る２種の光線Ａ、Ｂにおける吸光度値（ａ、ｂ）を測定
し、２つの吸光度値の差（ａ−ｂ）を反応液ごとに算出
した。
トキシンの測定］ 「パイロテル」0.05mlを96穴マイクロプレート（生化
学工業株式会社から発売されているトキシペットプレー
ト96F）のウェルに採り、大腸菌UKT−Ｂ株由来のエンド
トキシン溶液の0.005〜100EU/mlの範囲内で濃度が異な
る５種類のもの各0.05mlを加えた。それらに対して、 （条件A1）タンパクとして25％ヒト血清アルブミン（HS
A）製剤を終濃度で0.5％となるように添加し、 （条件A2）タンパクとして25％ヒト血清アルブミン（HS
A）製剤を終濃度で0.1％となるように添加し、 （条件Ｂ）黄色色素として5mMのパラニトロアニリン（p
NA）を終濃度で0.5mMとなるように添加し、 （条件Ｃ）蒸留水（DW）を条件A1、条件A2、条件Ｂの各
水溶液と同量添加して、 20種（＝５種類×４条件）の反応液を作り、マイクロ
プレートの各ウエルに採り、恒温槽を備えたマイクロプ
レートリーダー（生化学工業株式会社から発売されてい
るウエルリーダーSK601）にセットし、攪拌した後、37
℃で反応させながら、測定波長490nmの光線Ａおよび対
照波長660nmの光線Ｂを15秒間隔で照射し、波長が異な
る２種の光線Ａ、Ｂにおける吸光度値（ａ、ｂ）を測定
し、２つの吸光度値の差（ａ−ｂ）を反応液ごとに算出
した。
そして、上記吸光度値の差（ａ−ｂ）の変化率を各エ
ンドトキシン濃度に対して、それぞれ対数プロットした
ところ、第４図示す特性を得ることができた。
ンドトキシン濃度に対して、それぞれ対数プロットした
ところ、第４図示す特性を得ることができた。
第４図の特性曲線図より、タンパク共存状態（条件
A1,A2:HSA）、黄色色素共存状態（条件B:pNA）でも、蒸
留水（条件C:DW）とほぼ同値を呈し、かつ、吸光度値の
差（ａ−ｂ）の変化率が、エンドトキシン濃度と正比例
し、妨害物質が存在しても良好な直線性と再現性が得ら
れることが明らかになった。
A1,A2:HSA）、黄色色素共存状態（条件B:pNA）でも、蒸
留水（条件C:DW）とほぼ同値を呈し、かつ、吸光度値の
差（ａ−ｂ）の変化率が、エンドトキシン濃度と正比例
し、妨害物質が存在しても良好な直線性と再現性が得ら
れることが明らかになった。
さらに、吸光度値の差（ａ−ｂ）が、一定の閾値（吸
光度が0.006）に到達するまでの時間（ゲル化時間）ｔ
を、各エンドトキシン濃度に対して、それぞれ対数プロ
ットしたところ、第５図に示す特性を得ることができ
た。
光度が0.006）に到達するまでの時間（ゲル化時間）ｔ
を、各エンドトキシン濃度に対して、それぞれ対数プロ
ットしたところ、第５図に示す特性を得ることができ
た。
第５図の特性曲線図より、タンパク共存状態（条件
A1,A2:HSA）、黄色色素共存状態（条件B:pNA）でも、蒸
留水（条件C:DW）とほぼ同値を示し、かつ、吸光度値の
差（ａ−ｂ）が一定の閾値に到達するまでの時間ｔと、
エンドトキシン濃度とが反比例し、妨害物質が存在して
も、良好な直線性および再現性が得られることが明らか
になった。
A1,A2:HSA）、黄色色素共存状態（条件B:pNA）でも、蒸
留水（条件C:DW）とほぼ同値を示し、かつ、吸光度値の
差（ａ−ｂ）が一定の閾値に到達するまでの時間ｔと、
エンドトキシン濃度とが反比例し、妨害物質が存在して
も、良好な直線性および再現性が得られることが明らか
になった。
上記発明を実施するための形態１の測定結果に基づい
て設定した条件（測定波長が460〜550nm、対照波長が65
0〜800nm）の下で、上記条件A1,A2,B,Cについて、上記
実際のエンドトキシンによる濁度変化を反応速度法によ
り解析し、２波長の全組み合わせについて各エンドトキ
シン濃度に対して上記と同様に検量線を作成したとこ
ろ、タンパク共存下（条件A1,A2）、色素共存下（条件
Ｂ）のいずれの妨害物質存在下でも安定した濁度測定が
可能であることが明らかになった。
て設定した条件（測定波長が460〜550nm、対照波長が65
0〜800nm）の下で、上記条件A1,A2,B,Cについて、上記
実際のエンドトキシンによる濁度変化を反応速度法によ
り解析し、２波長の全組み合わせについて各エンドトキ
シン濃度に対して上記と同様に検量線を作成したとこ
ろ、タンパク共存下（条件A1,A2）、色素共存下（条件
Ｂ）のいずれの妨害物質存在下でも安定した濁度測定が
可能であることが明らかになった。
［発明を実施するための形態3:反応速度法によるβ−グ
ルカンの測定］ 市販されているリムルス試薬（Associates of Cape C
od社製造、生化学工業株式会社「パイロテル−Ｔ」とい
う名称で販売している試薬）0.05mlをトキシペットプレ
ート96Fのウェルに採り、β−グルカンとしてパキマン
溶液（0.1N NaOHに溶解後DWで希釈）の0.01〜1.0ng/ml
の範囲内で濃度が異なる３種類のもの各0.05mlを加え
た。それらに対して、 （条件Ａ）タンパクとして25％ヒト血清アルブミン（HS
A）製剤を終濃度で0.5％となるように添加し、 （条件Ｂ）黄色色素として5mMのパラニトロアニリン（p
NA）を終濃度で0.5mMとなるように添加し、 （条件Ｃ）蒸留水（DW）を条件Ａ、条件Ｂの各水溶液と
同量添加して、 ９種（＝３種類×３条件）の反応液を作り、測定波長
500nmおよび対照波長700nmの各光線を使用したほかは発
明を実施するための形態２と同様に操作した。
ルカンの測定］ 市販されているリムルス試薬（Associates of Cape C
od社製造、生化学工業株式会社「パイロテル−Ｔ」とい
う名称で販売している試薬）0.05mlをトキシペットプレ
ート96Fのウェルに採り、β−グルカンとしてパキマン
溶液（0.1N NaOHに溶解後DWで希釈）の0.01〜1.0ng/ml
の範囲内で濃度が異なる３種類のもの各0.05mlを加え
た。それらに対して、 （条件Ａ）タンパクとして25％ヒト血清アルブミン（HS
A）製剤を終濃度で0.5％となるように添加し、 （条件Ｂ）黄色色素として5mMのパラニトロアニリン（p
NA）を終濃度で0.5mMとなるように添加し、 （条件Ｃ）蒸留水（DW）を条件Ａ、条件Ｂの各水溶液と
同量添加して、 ９種（＝３種類×３条件）の反応液を作り、測定波長
500nmおよび対照波長700nmの各光線を使用したほかは発
明を実施するための形態２と同様に操作した。
そして、吸光度値の差が、一定の閾値に到達するまで
の時間（ゲル化時間）ｔを各β−グルカン濃度に対し
て、それぞれ対数プロットしたところ、第６図に示す特
性を得ることができた。
の時間（ゲル化時間）ｔを各β−グルカン濃度に対し
て、それぞれ対数プロットしたところ、第６図に示す特
性を得ることができた。
第６図の特性曲線図より、β−グルカンの測定におい
ても、妨害物質が共存しても、その影響を受けることな
く、良好な直線性と再現性が得られることが明らかにな
った。
ても、妨害物質が共存しても、その影響を受けることな
く、良好な直線性と再現性が得られることが明らかにな
った。
産業上の利用可能性 以上の発明を実施するための形態の説明から明らかな
ように、この発明のリムルス試薬反応性物質の測定法法
では、リムルス試薬反応性物質としてエンドトキシンま
たはβ−グルカンを用いた比濁法リムルステストにより
測定する方法において、460〜550nmの光線を測定波長と
し、650〜800nmの光線を対照波長とする２波長測定方法
によると、マイクロプレート等の反応容器による物理的
干渉（歪、傷など）を抑制することができ、かつ、共存
タンパクや共存色素の妨害を受けることなく安定で高感
度、高精度の測定が可能になる。
ように、この発明のリムルス試薬反応性物質の測定法法
では、リムルス試薬反応性物質としてエンドトキシンま
たはβ−グルカンを用いた比濁法リムルステストにより
測定する方法において、460〜550nmの光線を測定波長と
し、650〜800nmの光線を対照波長とする２波長測定方法
によると、マイクロプレート等の反応容器による物理的
干渉（歪、傷など）を抑制することができ、かつ、共存
タンパクや共存色素の妨害を受けることなく安定で高感
度、高精度の測定が可能になる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/579
Claims (4)
- 【請求項１】検体溶液にリムルス試薬を作用させ、ゲル
化を起こさせてゲル化に伴う反応液の濁度の上昇に基づ
く透過光の吸光度値の変化を検知して、検体中のリムル
ス試薬反応性物質を測定する測定方法において、反応液
に照射する光線として測定波長460〜550nmおよび対照波
長650〜800nmと異なる２種の光線を使用し、両光線にお
ける各吸光度値の差を求め、該差をリムルス試薬反応性
物質の濃度に対応させることを特徴とするリムルス試薬
反応性物質の測定方法。 - 【請求項２】リムルス試薬反応性物質が、エンドトキシ
ンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンであることを特
徴とする請求項１に記載のリムルス試薬反応性物質の測
定方法。 - 【請求項３】測定波長における吸光度値ａと対照波長に
おける吸光度値ｂを測定し、２つの吸光度値の差（ａ−
ｂ）を算出し、該差の変化率を求め、該変化率をリムル
ス試薬反応性物質の濃度に対応させることを特徴とする
請求項１記載のリムルス試薬反応性物質の測定方法。 - 【請求項４】測定波長における吸光度値ａと対照波長に
おける吸光度値ｂを測定し、２つの吸光度値の差（ａ−
ｂ）を算出し、該差が予め設定した閾値に到達するまで
の時間を求め、該時間をリムルス試薬反応性物質の濃度
に対応させることを特徴とする請求項１記載のリムルス
試薬反応性物質の測定方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-314027 | 1993-11-22 | ||
| JP31402793 | 1993-11-22 | ||
| PCT/JP1994/001974 WO1995014932A1 (fr) | 1993-11-22 | 1994-11-22 | Procede de dosage d'une substance reagissant avec un reactif de limulus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3061418B2 true JP3061418B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
ID=18048334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7514959A Expired - Lifetime JP3061418B2 (ja) | 1993-11-22 | 1994-11-22 | リムルス試薬反応性物質の測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0731354A4 (ja) |
| JP (1) | JP3061418B2 (ja) |
| WO (1) | WO1995014932A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006253478B2 (en) * | 2005-05-30 | 2012-03-29 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Test method for endotoxin |
| EP1872854A1 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-02 | PerkinElmer, Inc. | Improved multi-well assay plate |
| EP2081024A4 (en) * | 2006-09-25 | 2013-10-16 | Kowa Kabushiki Kaisha | DEVICE FOR GELATINE DETERMINATION AND SAMPLE CELL |
| US8394602B2 (en) * | 2007-11-12 | 2013-03-12 | Hiroshima University | Luminescent method for measuring endotoxin |
| KR20120001755A (ko) * | 2009-03-13 | 2012-01-04 | 코와 가부시키가이샤 | 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 방법, 그것을 실행하기 위한 프로그램, 및 생물 유래의 생리 활성 물질의 측정 장치 |
| JP5489680B2 (ja) * | 2009-12-02 | 2014-05-14 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法、それを実行するためのプログラム及び、生物由来の生理活性物質の測定装置 |
| JP5421622B2 (ja) * | 2009-03-13 | 2014-02-19 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| US8969092B2 (en) * | 2010-10-18 | 2015-03-03 | Toru Obata | Gel particle measurement reagent and measurement method using same |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4038029A (en) * | 1976-01-20 | 1977-07-26 | Worthington Biochemical Corporation | Limulus lysate turbidity test for pyrogens |
| JPS589050A (ja) * | 1981-07-10 | 1983-01-19 | Japan Organo Co Ltd | エンドトキシン含有量の測定方法および装置 |
| JPS61159162A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-18 | Wako Pure Chem Ind Ltd | エンドトキシンの測定方法 |
| DE3586075D1 (de) * | 1984-06-27 | 1992-06-25 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Verfahren zur bestimmung von endotoxin. |
| JPS6111641A (ja) * | 1984-06-27 | 1986-01-20 | Wako Pure Chem Ind Ltd | エンドトキシンの測定方法および装置 |
| JP2957251B2 (ja) * | 1990-09-28 | 1999-10-04 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの測定法 |
-
1994
- 1994-11-22 JP JP7514959A patent/JP3061418B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-22 EP EP95900934A patent/EP0731354A4/en not_active Withdrawn
- 1994-11-22 WO PCT/JP1994/001974 patent/WO1995014932A1/ja not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0731354A1 (en) | 1996-09-11 |
| EP0731354A4 (en) | 1997-12-17 |
| WO1995014932A1 (fr) | 1995-06-01 |
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