JPS589050A - エンドトキシン含有量の測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生体内に微量に存在しても発熱を呈し生体体温を上昇せ
しめる原因物質を一般に発熱性物質（）臂イロジエン）
と称しているが、その解明は未だ充分になされていない
。しかしながら、発熱性物質の代表的表一つとして細菌
性内毒素（以下エンドトキシンという）が近時認識され
て来ておシ、このエンドトキシンによシ汚染された血液
、輸液、注射薬が生体内に入ると発熱やシヨ、りなどの
重篤な副作用を惹起することが判明している。このため
、注射液やアングル洗浄水の製造に際し、原料水中の微
量エンドトキシンを検出測定する技術が命中必要不可欠
となっている。

エンドトキシンと反応してグル化させる試薬の一つとし
て、Ｌｌｍａｌｔｓｓ　Ａｍ５ｂｏｓｙｔ＊　Ｌｙｉａ
ｔ　（ＬＡＬ　：カブトガニ血球抽出成分）が極微量の
エンドトキシンと反応してグル化することが見出されて
から、前記ＬＡＬをエンドトキシンの超微量検出試薬と
する測定方法が既に開発されている。すなわち、従来公
知のエンドトキシンの微量検出方法は、工Ｘトドキシン
とＬＡＬ試薬との反応によりグル化現象を呈することを
利用するものであシ、エンドトキシンを含むと思われる
検体試料的０，２１とＬＡＬ試薬約０．２　ｄとを反応
試験管に入れて混合抜一定温度（一般的には３７℃）で
一定時間（６０分）放置しておくと、エンドトキシン含
有の程度によってグル化の程度、したがって粘性の程度
が異なり、反応試験管を１８０°反転すると、第１図（
ａ）に示すように落ちない固いグルの場合や、第１図（
ｂ）に示すように、まだ固いグルが形成されず流れ落ち
る場合岬が現象として知見される。これと予めエンドト
キシンが定量されている検体について行ガったＬＡＬ試
薬との反応試験の結果とを対比することによって、検体
試料中のエンドトキシン含有量を陽性（＋）の程度や陰
性（−）の程度として大まかな判定を行なっていた。表
おエンドトキシングル化試薬としては、前記ＬＡＬ試薬
の外に最近は合成エンドトキシングル化試薬も試用され
ている。

上記の如き従来のエンドトキシン測定方法は、微量の検
体試料のグル化状態をみることによって行なわれ、専ら
グル化にともなう粘性の程度を目視感覚で判別するもの
であっ九から、これにはかなシ熟練度を必要とし、かつ
個人差をともなうものであった。さらには、目視判別に
資する定常なグル化状態に至るには長時間を要していた
。かかる事情から、微量な検体試料のグル化状態を自動
的に測定判別することは難しく、個人差をともなう目視
による不安定なグル化状態の程度からするエンドトキシ
ンの有無の判別は屡々検出ｖ４ｈを招き、ましてや検体
試料中のエンドトキシンの定量的な存在量の検出は事実
上不可能とされていた。

本発明は、以上説明した従来のエンドトキシン測定方法
における種々な欠点に艦みてなされたもので、本発明者
等の研究の結果、ＬａＬ試薬などのようなエンドトキシ
ングル化試薬とエンドトキシンの反応によシグル化する
際、白濁を呈し、その白濁程度がエンドトキシンの存在
量と定量的外関係にあることを光学的な実験結果よシ知
呪したことに基づくものである。

すなわち、第一番目の方法発明状、一定温度のもとでエ
ンドトキシンを含む一定量の検体試料と一定量のエンド
トキシングル化試薬とを混合して当該混合液を光学セル
中に充填し、蚊光学セルに光を通過させてまず白濁化反
応の進行過程の初期段階に於てブランクの吸光度を測定
し、次いで前記一定温度に保持して適轟時間放置すると
とによジエントドキシンとエンドトキシングル化試薬の
白濁化反応を進行させて濁りを生じせしめ、当該濁度の
液入〕光学セルに同じように光を通過させて再度吸光度
を測定し、当該吸光度と前記ブランクの吸光度との差か
らエンドトキシンの含有量を定量することを特徴゛とす
るものであり、また第二番目の発明は、第一番目の方法
発明の実施に直接使用する丸めの装置発明であって、エ
ンドトキシングル化試薬を容れた容器、採取チューブを
通して常時検体試料を取シ入れかつ排出チューブを通し
て余分の検体試料を常時溢流排出するようＫした検体試
料採取用容器、洗浄液を容れた容器およびエンドトキシ
ンフリーの洗浄水を容れた容器を載置した容器載置台と
、前記各容器に関して相対的に移動しかつ各容器内の缶
液を選択的に採取し得る吸引ノズルを備えた吸引ノズル
機構と、前記吸引ノズルに接続されそれぞれ定量採取し
たエンドトキシングル化試薬と検体試料とを混合しかつ
脱泡し得るようにした混合脱泡器と、該混合脱泡器に接
続され混合済みの採取液を受入れゐようＫした光学セル
と、該光学セル中の採取液の濁度を測定すゐための光源
および受光素子を含む吸光度測定器と、前記混合脱泡器
、光学セルおよび吸光度測定器を収容する恒温室と、前
記混合脱泡器および前記光学セルにそれぞれ切換弁を介
して接続され前記混合脱泡器および光学セルに前記缶液
を選択的に供給しかつ排出するようになされたサンプリ
ングポンプとからなシ、検体試料中のエンドトキシンの
含有量を繰返し連続定量しうるようにしたことを特徴と
するものである。

本発明は、前記したようにＬＡＬ試薬などのようなエン
ドトキシングル化試薬どエンドトキシンの反応によりｒ
ル化する際白濁を呈しその白濁程度がエンドトキシンの
存在量と定量的な関係にあることの知見を基−にしてお
ル、測定すべき検体試料中のエンドトキシンを定量する
には、第２図に示す標準検量線図を用いるものである。

この標準検量線図は、予め既知の量例えばエンドトキシ
ン０．０５　ｎｌｉ／ＩＩＪ、　　０．１０　ｍｌ／Ｉ
Ｉｊ、　　０．１５　ｍｌ／―および０．２０　ｎｌ／
ｗＪを含有する検体試料ｏ、２５ｍとたとえばＬＡＬ試
薬を０．２５１１７とを混合して、３分間昇温と脱泡を
行々り九後内径２■、セル長２０箇の光学セルに充填し
、２分経過後（混合直後から５分経過後、この時点での
混合液をブランクという、）光学セルに波長５６０ｎｇ
の光を通過させてその吸光度を測定し、次に２５分間温
度３７℃に保持したｔま放置した後（混合直後から３０
分経過後）再び同じ光を通過させてその吸光度を測定し
、これら両測定値の差をプロットしたものである。

例えば図中の点Ａはエンドトキシン含有量が０ｆ）５ｎ
Ｊ　／ｄに対応している。このよう１ｌｃｆ口、トシタ
点Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは一つの連続した標準検量線をな
している。

一方上記標準検量線を用い、本発明にしたがって検体試
料中のエンドトキシンを定量するには次のようにして行
表われる。

まず、ＬＡＬ試薬０．２５−と検体試料０．２５１１７
を採取し、これらをインキュベーターに導入して混合し
、３分間液温度を３７℃に上昇せしめると共に脱泡し、
内径２■、光路長２０■の光学セルに導入充填する。混
合充填済みの採取液は混合直後よシ白濁化が進行するが
、混合直後よシ５分経過後の混合液（ブランク）につい
て前記標準検量線をつくるときと同条件でその吸光度を
測定し、引続いて２５分間放置した後（混合直後よシ３
０分後）、再び吸光度を測定し、これら両測定値の差を
求める。この値を前記標準検量線図の縦軸上にとシ、対
応する標準検量線上の点の横軸上の値を読みとれば、検
体試料中のエンドトキシンの含有量を知ることができる
。

本発明方法により、ブランクについての吸光度を差引く
ことは、光源の劣化、光学セル窓の汚れ、集光機器の性
能の変化および吸引ノズルよシ光学セルまでの系“の洗
浄不十分やエンドトキシングと化試薬の添加や幽骸試薬
の変化などをすべて消去して、エンドトキシンによる正
しい吸光度を得る点で極めて重要である。なお、本発明
において前記標準検量線をつくる場合と、検体試料につ
いて測定を行危う場合とでは、すべて′の条件が同じで
あればよ（、ＬＡＬ試薬や検体試料等の量、光学セルの
内径やセル長、測定温度、測定時間および用いる光の波
長等は上記実施例に示す数値に限られるものではない、
ｉた実施段階において、前記した吸光度の差の検出結果
を直ちにエンドトキシン含有量として指示もしくは記録
したシ、所定量以上のエンドトキシン含有量を検知した
時には警報したシする機器類を併せ用い得ることは勿論
である。また前記ブランクについての吸光度が異常に大
なる時は、その時点で直ちに警報を発するようにするこ
とも可能である。

次に第３図を参照して、本発明による。エンドトキシン
の測定方法を実施する具体的装置につき詳細に説明する
。第３図は本発明の装置全体を模式的に示すもので、同
図中１は水平に移動可能な容器載置台で、骸載置台１上
にはＬＡＬ試薬を容れた試薬容器２、検体試料採取容器
３、アルカリ洗浄液を容れた洗浄試薬容器４およびエン
ドトキシンフリー水を容れた洗浄水容器５が並べて載置
されている。試薬容器２社例えばＬＡＬ試薬２〇−人の
市販試薬瓶をそのまま使用することができる。検体試料
採取容器３は試料溢流力ｙ　ｆ　３　ｍと外槽３ｂとか
らなシ、溢流力、　７”　３　ｍは、可撓性の検体試料
採取チューブ６を介して例えばエンドトキシンフリー水
の造水工程中の送水管７に接続され約ｌ　ｍ／ｍｉ　！
１の割合で常時検体試料を採取できるようになされ、余
分の検体試料社外槽３ｂに溢流し、排出チー−プ８を経
て捨てられるようになうている。

載置台１は、駆動機構９によって横に移動可能に構成さ
れ、載置台ｌ上の容器２．３．４および５を、それぞれ
必要に応じ載置台１の上方におがれた吸引ノズル１０お
よびその上下駆動機１０ｍからなる吸引ノズル機構の真
下に正対させ得るようになされている。したがりて吸引
ノズル１０ｍ）。

通して試薬、検体試料、洗浄液等を定量吸引し、後記す
る建キシングインキペーターへ送シ出すことができる。

なお、前記載置台上の諸容器を円形に配置し、載量台を
回転させて移動させ九シ、マ九載置台は固定しておいて
吸引ノズルの方を回転させて移動させる機構としてもよ
い。

吸引ノズルｌＯは、可撓性チ、−プ１１およびミキシン
グインキ、ベーター１２を介して、混合脱泡器１３に接
続されている一該混合１脱泡器１３の上方は、チューブ
１４および三方切換弁１５を介して二連式Ｏサンプリン
グＩ７７＃１６の吸込みロ１６ａＫ接続され、伺じく混
合脱泡器１３の下方は、混合済みの採取液を受入れる光
学セル１７、チューブ１８および三方切換弁１９を介し
て前記サンブリングポンプ１゛６の吸込みロ１６ｂＫ接
続されている。二連式サンブリングポンプ１６の吸込み
口１６ｍは吐出口１６ａに通じ、排出チ、−ｆ２０を経
て廃液溜２１に排出するようＫなされ、同じく吸込み口
１６ｂは吐出口１６４に通じ、排出チューブ２２を経て
前記廃液溜２１に排出するようになされている。なお三
方切換弁１５或い社１９に替えて三方切換弁をそれぞれ
２個づつ用いてもさしつかえない。

前記光学セル１７は、例えば内径２■、セル長２０■の
密閉容器体で、その前後に配置されたタングステン２ン
グ等の光源２３および受光素子２４とともに吸光度測定
器を構成するものであるＯすなわち、光源２３からの光
れ光学セル１７中の試料を通過する際、その濁度に応じ
て吸光され、受光素子２４に達し、既知の表示或は記録
機器等を用いてデジタル表示威は記録をなすことができ
、ま九必要に応じ警報を発するようにすることができる
。また混合直後３０分後の吸光度から混合直後５分後の
吸光度の差を既知のデータ処理機によって差引いた値を
既知の表示或は記録機器等を用いてデジタル表示威は記
録、警報することができる。また、混合直後５分後のブ
ランクについての吸光度が例えばエンドトキシン０．１
ｎｌ／ｌｌｊ以上相当の値を示した時は既知の機器を用
いて異常警報を発したり、異常指示灯に点灯するなどを
行う仁と４できる。

以上説明した構成からなる本発明装置の作用効果につい
て以下説明する。

まず、装置の各部はエンドトキシンフリーの純水で充分
洗浄されているものとして測定操作を開始するが、まず
吸引ノズル１０をＬＡＬ試薬容１ｆ！２中に下降させ、
三方切換弁１５．１９の経路切換とサンプリング４ンｆ
１６の作動によりＬＡＬ試薬を０．２５−採取し、次い
で吸引ノズル１０の上下動および載置台ｌの横移動等を
行ない、検体試料採取容器３の溢流力、ゾ３ａから前記
と同様に検体試料を０．２５１１１採取する。採取され
たＬＡＬ試薬と検体試料とは、恒温室２５内におかれた
ミキシングインキ、ベータ１２を経て混合脱泡容器１３
内にブランクとして一時貯溜される。而してこの間に混
合液は温度３７℃に保たれ、且つ完全に脱泡される。

脱泡されたブランクは、三方切換弁１９を介して行表わ
れるサンプリングポンｆ１６の吸引によシ光学セル１７
中に充填され、吸光度測定の準備が完了する。

ＬＡＬ試薬と検体試料が混合されてから５分経過後、ブ
ランクの吸光度を測定する。次いで前記一定温度３７℃
に保持し九まま更に２５分間放置しておき、その時間経
過後に再度吸光度を測定する０検体試料中にエンドトキ
シンが含有されていればその含有量に応じて濁度の程度
を異にする濁）が生ずるので、最初の吸光度の測定値と
二度目の吸光度の測定値の差を知れば、その値を予めつ
くられている標準検量線図と対比することによジエント
ドキシンの定量をすることができる。表お、受光素子２
４以降の線示記録および警報等の賭機器については特に
図示していないが、これらはすべて既知の機器類を用い
るものであシ、必要に応じて表示、記録および検出警報
までのすべての操作を自動的に行なうことができる。

１回の検体試料の測定が終れば、次回の測定に備えて本
装置の全系統を洗浄する必要がある・この場合、まず吸
引ノズルｌＯによシ洗浄液容器４からたとえば力性ソー
ダ溶液のようなアルカリ溶液を吸引し、系統の洗浄を行
ない、特に光学セル中の付着残液を洗浄する。なお洗浄
液としてはアルカリ溶液の他にアルコール、クロム酸混
液、各種洗剤を用いることができる。次いで洗浄水容器
５からエンドトキシンフリーの純水を吸引し、全系統を
完全に洗浄し、最後には光学セルに純水を満たした状態
で待機する。或いは、洗浄終了時に吸引ノズルｌＯを洗
浄水容器５の水中に挿入したｔまとして、全系統に純水
を満たした状態で待機することもできる。而して、測定
、洗浄および待機からなる測定周期は必ｌ！に応じて１
時間、２時間・・・等任意に設定することができる。

以上の説明から明らかなように、本発明の方法および装
置によれば、従来ＬＡＬ試薬とエンドトキシンの反応に
よるｒル化状態を目視感覚でとらえ、陽性や陰性の判別
をしてい九ＯＫ比較して、測定時間の大幅な短縮が図ら
れると同時に正確な定量が可能とな−）た、また本装置
はすべてこれを自動化し得るので、エンドトキシン７り
一水の造水装置に付設することによ）ｌＩ著な効果を奏
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の目視によるｒル化判定法の説明図、第２
図は本発明の測定方法に用いゐ標準検量線図、第３図は
本発明によるエンド）４シン含有量測定装置の模式図で
ある。 １・・・載置台　　　　　２・・・ＬＡＬ試薬容器３・
・・検体試料採取容器　４・・・洗浄液容器５・・・洗
浄水容器　　　　６・・・検体試料採取チューシフ・・
・送水管　　　　　８・・・排出チューブ９・・・Ｖ動
機構　　　　ｌＯ・・・吸引ノズル１１．１４．１８，
２０．２２・・・チューブ１２・・・ミキシングインキ
ュベータ １３・・・混合脱泡器　　　１５．１９・・・三方切換
弁１６・・・二連式サンプリングＩンプ １７・・・光学セル　　　２１・・・廃液溜２３・・・
タングステンランゾ２４・・・受光素子２５・・・恒温
室

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一定温度のもとでエンドトキシンを含む一定量の検
   体試料と一定量のエントドキシ／ダル化試薬とを混合し
   て当該混合液を光学セル中に充填し、諌光学セルに光を
   通過させてまずブランクの吸光度を測定し、次いで前記
   一定温度に保持して適当時間放置することによジエント
   ドキシンとエンドトキシンダル化試薬を反応させて濁シ
   を生じせしめ、当該濁度の液入シ光学セルに同じように
   光を通過させて再度吸光度を測定し、当該吸光度と前記
   ブランクの吸光度との差からエンドトキシンの含有量を
   定量することを特徴とするエンドトキシン含有量の測定
   方法。 λ　工／１’）キシングル化試薬を容れた容器、採取チ
   ューブを通して常時検体試料を取シ入れかつ排出チュー
   ブを通して余分の検体試料を常時溢流排出するようにし
   た検体試料採取用容器、洗浄液を容れた容器、およびエ
   ンドトキシンフリーの洗浄水を容れた容器を載置した容
   器載置台と、前記各容器に関して相対的に移動しかつ各
   容器内の缶液を選択的に採取し得る吸引ノズルを備えた
   吸引ノズル機構と、前記吸引ノズルに接続されそれぞれ
   定量採取した工／トドキシングル化試薬と検体試料とを
   混合しかり脱泡し得るようにした混合脱泡器と、該混合
   脱泡器に接続され混合済みの採取液を受入れるようにし
   た光学セルと、該光学セル中の採取液の濁度を測定する
   ための光源および受光素子を含む吸光度測定器と、前記
   混合脱泡器、光学セルおよび吸光度測定器を収容する恒
   温室と、前記混合脱泡器および前記光学セルにそれぞれ
   切換弁を介して接続され前記混合脱泡器および光学セル
   に前記缶液を選択的に供給しかつ排出するようになされ
   丸すンゾリンダーンデとからなシ、検体試料中のエンド
   トキシンの含有量を繰返し連続定量しうるようにしたこ
   とを特徴とするエンドトキシン含有量測定装置。