CN112834758A - B因子的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及B因子的检测试剂盒。所述试剂盒包含第一试剂、第二试剂和任选的校准品。所述第一试剂包含：Tris‑HCl缓冲液、氯化钠、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇4000、叠氮钠；所述第二试剂包含：Tris‑HCl缓冲液、氯化钠、叠氮钠、B因子抗体；所述校准品包含：B因子、磷酸缓冲液、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠。本申请的试剂检测结果准确、灵敏度高。

Description

B因子的检测试剂盒
技术领域
本申请涉及体外诊断的技术领域，具体涉及了一种用于检测B因子含量的试剂盒。
背景技术
B因子是补体旁路途径中的重要因子，又被称为C3激活剂前体，参与机体的非特异性免疫功能，对于炎症应答、细胞溶解、促进B细胞增殖有重要意义。正常情况下，C3自发水解产生低浓度的C3b，不断消耗B因子形成C3bBb，使旁路途径保持低水平持续激活状态，但C3bBb衰变很快，不会进一步激活补体旁路途径。
B因子主要由肝脏补充，它在血清中的含量反映了合成与消耗之间的平衡，因此B因子的合成和消耗速率对其血清浓度的影响很大。
临床结果表明，肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、慢性肝炎、肝硬化会激活补体旁路途径，进而消耗大量B因子而使其浓度降低，检测B因子含量可为以上疾病的诊断提供参考。
B因子的检测对探究补体旁路途径与部分自身免疫疾病的关系也有着重要意义。但现有技术对异常样本检出率低，或高血脂样本偏差较大，只能在特定生化仪上使用，无法在各医疗诊所普及。
鉴于此，本领域仍需要提供一种受血脂干扰小、高灵敏度的B因子含量检测方法。
发明内容
根据一些实施方案，提供了一种用于检测B因子含量的试剂盒，所述试剂盒包含第一试剂、第二试剂和校准品。
在一些实施方案中，第一试剂包含：
20mmol/L至100mmol/L Tris-HCl缓冲液、
质量体积比0.5％至1.5％的氯化钠、
质量体积比0.5％至1.5％的聚氧乙烯月桂醚、
质量体积比1％至3％的聚乙二醇4000、
质量体积比0.05％至0.2％的防腐剂。
在一些实施方案中，所述第二试剂包含：
20mmol/L至100mmol/L Tris-HCl缓冲液、
质量体积比0.5％至1.5％的氯化钠、
质量体积比0.05％至0.2％的防腐剂、
4.2g/L至4.8g/L B因子抗体。
在一些实施方案中，校准品包含：
已知浓度的B因子、
50mmol/L至150mmol/L磷酸缓冲液、
质量体积比0.5％至1.5％的氯化钠、
质量体积比0.05％至0.2％的乙二胺四乙酸二钠、
质量体积比0.05％至0.2％的防腐剂。
在一些实施方案中，Tris-HCl缓冲液的pH为6至8；优选7.5。
在一些具体的实施方案中，第一试剂包含：50mmol/L Tris-HCl缓冲液、质量体积比0.9％氯化钠、质量体积比1％聚氧乙烯月桂醚、质量体积比2％聚乙二醇4000、质量体积比0.1％叠氮钠。
在一些具体的实施方案中，第二试剂包含：50mmol/L Tris-HCl缓冲液、质量体积比0.9％氯化钠、质量体积比0.1％叠氮钠、4.5g/L的B因子多克隆抗体。
在一些具体的实施方案中，校准品包含：已知浓度的B因子高值血清、100mmol/L磷酸缓冲液、质量体积比0.9％氯化钠、质量体积比0.1％的乙二胺四乙酸二钠、质量体积比0.1％叠氮钠。
在一些具体的实施方案中，聚氧乙烯月桂醚在第一试剂中的浓度是质量体积比0.5％至1.5％，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5％；具体是0.8％、1.0％、1.2％。
在一些具体的实施方案中，聚乙二醇4000在第一试剂中的浓度是质量体积比为1％至3％；例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0％；具体是1.0％、2.0％、3.0％。
在一些具体的实施方案中，聚氧乙烯月桂醚和聚乙二醇4000的质量比为1.5：1至1：6；例如1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2、1：2.1、1：2.2、1：2.3、1：2.4、1：2.5、1：2.6、1：2.7、1：2.8、1：2.9、1：3、1：3.1、1：3.2、1：3.3、1：3.4、1：3.5、1：3.6、1：3.7、1：3.8、1：3.9、1：4、1：4.1、1：4.2、1：4.3、1：4.4、1：4.5、1：4.6、1：4.7、1：4.8、1：4.9、1：5、1：5.1、1：5.2、1：5.3、1：5.4、1：5.5、1：5.6、1：5.7、1：5.8、1：5.9、1：6。具体是1：1至1：3；更优选1：2。
在一些实施方案中，所述B因子多克隆抗体中包含羊抗人B因子特异性抗体。
在一些实施方案中，所述B因子多克隆抗体是指识别B因子至少一个表位的多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述磷酸缓冲液的pH为7.5。
根据一些实施方案，提供了一种抗干扰组合物，其包含以下或由以下组成：聚氧乙烯月桂醚和聚乙二醇4000。
在一些实施方案中，所述聚氧乙烯月桂醚和所述聚乙二醇4000的质量比为1.5：1至1：6；优选1：1至1：3；更优选1：2。
在一些实施方案中，聚氧乙烯月桂醚的浓度为按质量体积比计0.5％至1.5％，优选1％。在一些实施方案中，聚乙二醇4000的浓度为按质量体积比计1％至3％；优选2％。
根据一些实施方案，提供了前述抗干扰组合物在改善检测试剂抗干扰性能中的用途，尤其改善待检样本中的脂肪干扰。
在一些实施方案中，样本选自：全血、血浆、血清、尿液、组织液、分泌物。
在一些具体的实施方案中，样本选自：全血、血浆、血清。
在一些具体的实施方案中，本申请的抗干扰组合物能够改善B因子检测试剂的抗脂肪干扰性能。
附图说明
图1：本申请试剂盒的校准品绘制的校准曲线。
图2：本申请试剂盒与对照试剂盒的对比图。
图3：本申请试剂盒在不同机型上检测值的相对偏差。
图4：本申请试剂盒对临床样本的检测结果。
图5：抗干扰组合物的抗干扰测试。
具体实施方式
为了方便本领域的技术人员更详细地了解本申请，下面通过实施例进一步讲解本申请，但讲解内容并非对本申请的限定。
实施例1.检测试剂盒的制备
用50mmol/L的Tris-HCl(pH7.5,25℃)溶解质量体积比为0.9％的氯化钠和0.1％的叠氮钠，制成缓冲液1；向缓冲液1中加入不同浓度的聚乙二醇4000和聚氧乙烯月桂醚，充分混匀、溶解，制成第一试剂；
按照表1向缓冲液1中加入不同质量体积比(1.0％、2.0％、3.0％)的聚乙二醇4000和不同质量体积比(0.5％、1.0％、1.5％)的聚氧乙烯月桂醚，充分混匀、溶解；制成9种不同质量体积比的聚乙二醇4000和不同质量体积比的聚氧乙烯月桂醚组合的抗干扰试剂R1-a至R1-i。
将缓冲液1与B因子多克隆抗体充分混匀，制成第二试剂，使B因子多克隆抗体的终浓度为4.5g/L。
表1.不同质量体积比的聚乙二醇4000和聚氧乙烯月桂醚组合
Figure BDA0002886831250000041
校准品：用B因子高值血清(质量浓度为560mg/L)，在100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,25℃)、质量体积比为0.9％的氯化钠、0.1％的乙二胺四乙酸二钠和0.1％的叠氮钠中，配制校准品；使得校准品中B因子终浓度为280mg/L、140mg/L、70mg/L。
将第一试剂、第二试剂和校准品组装成试剂盒。
实施例2.B因子检测方法
下述实施例中使用的试剂盒和仪器：
Properdin Factor B试剂盒：美国Beckman Coulter公司；
AU680生化分析仪：美国Beckman Coulter公司；
AU5800生化分析仪：美国Beckman Coulter公司；
日立7180生化分析仪：日本Hitachi公司；
Atellica CH930生化分析仪：德国Siemens公司。
在日立、贝克曼系列生化分析仪上，对本申请进行校准，得到校准曲线(图1)。本申请检测条件及步骤如下：
样本：R1：R2＝2：120：40；
波长(A)：主340nm，次700nm；
方法：FIXED；
定标类型：5AB；
公式：Spline。
第一试剂(对应R1-e抗干扰组合物)与样本混匀后在37℃孵育5min，读取吸光度A1后立即加入第二试剂，混匀孵育5min后，读取吸光度A2，计算△A＝A2-A1，△A代入校准曲线得到样本B因子测值。
以Properdin Factor B试剂盒为对照试剂盒，对样本进行检测。所得B因子检测值与对照试剂盒(速率散射比浊法)检测值进行比较(图2)，相关性R2＝0.9954，本实施例与对照试剂盒有显著的相关性。
在不同机型上检测样本，并对结果进行比对(图3)。用本申请试剂盒检测临床样本，可以看出正常组和对照组之间差异显著(图4)。
实施例3.抗干扰组合物的抗脂肪乳干扰性能
同一例样本加入质量体积比0.4％至0.8％Intralipid，制成高脂肪乳样本。
在贝克曼系列生化分析仪上，不同的第一试剂(对应抗干扰组合物R1-a至R1-i)分别与正常样本和高脂肪乳样本混匀后在37℃孵育5min，读取吸光度A1后立即加入第二试剂，混匀孵育5min后，读取吸光度A2，计算△A＝A2-A1，△A代入校准曲线得到样本B因子测值。
以Properdin Factor B试剂盒为对照试剂盒，对高脂样本和正常样本进行检测。以正常样本所得B因子检测值为对照，计算正常样本与高脂样本所得B因子检测值的相对偏差进行比较(图5)。可以看出抗干扰组合物R1-e的抗脂肪乳干扰性能最好；R1-d和R1-f次之。
对比例：将实施例1中的聚乙二醇4000替换为聚乙二醇800、2000、6000或8000，按照表1中的比例配制试剂，并测试其抗脂肪乳干扰性能。PEG2000时，对0.4％Intralipid的抗干扰性能尚可，但0.8％Intralipid时抗干扰性能则不如PEG4000。PEG800、PEG 6000或PEG 8000在0.4％、0.6％、0.8％Intralipid时均未显示出统计学上的显著改善(数据未显示)。发明人出乎意料地发现，抗脂肪乳干扰的性能与PEG聚合度以及和聚氧乙烯月桂醚的比例相关。

Claims (10)

1.一种B因子的检测试剂盒，其包含：第一试剂、第二试剂、任选地校准品；
所述第一试剂包含：
20mmol/L至100mmol/L Tris-HCl缓冲液、
质量体积比0.5％至1.5％的氯化钠、
质量体积比0.5％至1.5％的聚氧乙烯月桂醚、
质量体积比1％至3％的聚乙二醇4000、
质量体积比0.05％至0.2％的防腐剂；
所述第二试剂包含：
20mmol/L至100mmol/L Tris-HCl缓冲液、
质量体积比0.5％至1.5％的氯化钠、
质量体积比0.05％至0.2％的防腐剂、
4.2g/L至4.8g/L B因子抗体；
所述校准品包含：
已知浓度的B因子、
50mmol/L至150mmol/L磷酸缓冲液、
质量体积比0.5％至1.5％的氯化钠、
质量体积比0.05％至0.2％的乙二胺四乙酸二钠、
质量体积比0.05％至0.2％的防腐剂；
其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6至8；优选7.5。
2.根据权利要求1所述的B因子的检测试剂盒，其中所述聚氧乙烯月桂醚和所述聚乙二醇4000的质量比为1.5：1至1：6。
3.根据权利要求2所述的B因子的检测试剂盒，其中所述聚氧乙烯月桂醚和所述聚乙二醇4000的质量比为1：1至1：3；优选1：2。
4.根据权利要求3所述的B因子的检测试剂盒，其中所述磷酸缓冲液的pH为7.5。
5.根据权利要求1所述的B因子的检测试剂盒，其中：
所述B因子抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；
所述B因子抗体源自：小鼠、大鼠、灵长动物、兔、禽、骆驼科、羊、马、犬、重组抗体。
6.根据权利要求1所述的B因子的检测试剂盒，其中：
所述第一试剂包含：
50mmol/L Tris-HCl缓冲液pH7.5、
质量体积比0.9％的氯化钠、
质量体积比1％的聚氧乙烯月桂醚、
质量体积比2％的聚乙二醇4000、
质量体积比0.1％的叠氮钠；
所述第二试剂包含：
50mmol/L Tris-HCl缓冲液pH7.5、
质量体积比0.9％的氯化钠、
质量体积比0.1％的叠氮钠、
4.2g/L至4.8g/L的B因子抗体；
所述校准品包含：
已知浓度的B因子、
100mmol/L磷酸缓冲液pH7.5、
质量体积比0.9％的氯化钠、
质量体积比0.1％的乙二胺四乙酸二钠、
质量体积比0.1％的叠氮钠。
7.一种抗干扰组合物，其包含以下或由以下组成：
聚氧乙烯月桂醚、和
聚乙二醇4000；
所述聚氧乙烯月桂醚和所述聚乙二醇4000的质量比为1.5：1至1：6；优选1：1至1：3；更优选1：2。
8.根据权利要求7所述的抗干扰组合物，其中：
聚氧乙烯月桂醚的浓度为按质量体积比计0.5％至1.5％，优选1％；
聚乙二醇4000的浓度为按质量体积比计1％至3％；优选2％。
9.根据权利要求7或8所述的抗干扰组合物在改善检测试剂抗干扰性能中的用途，其中所述干扰是指待检样本中的脂肪干扰；
优选地，所述样本选自：全血、血浆、血清、尿液、组织液、分泌物；
更优选，所述样本选自：全血、血浆、血清。
10.根据权利要求9所述的用途，所述检测试剂是B因子的检测试剂。
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