CN103743912A - 一种b因子测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种医疗器材的技术领域，具体地说，涉及一种用于测定B因子含量的B因子测定试剂盒及其制备方法，包括试剂R和参考校准品，所述试剂R包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1~5g/l结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水。试剂为单一试剂，节约试剂位，内含的抗体效价高，亲和力好，特异性强，稳定性好，批间差小，有效期长，试剂在2-8℃密闭避光可稳定贮存18个月，且灵敏度高，检测精度高。

Description

一种B因子测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗器材的技术领域，具体地说，涉及一种用于测定B因子含量的B因子测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
B因子是一种β1球蛋白，主要是由肝脏合成，是参与补体旁路活化的重要成分，参与机体防御，在组织和细胞损伤和炎症过程中均起重要作用。B因子以及其它补体成分的代谢率很高，正常人血浆内的补体每天约有1/2更新。合成率与血浆中补体水平明显相关，血浆补体值反映了合成和分解之间的平衡。在炎症时合成率增加，使补体值增高，而当某些疾病补体利用增加时，可使补体降低至正常范围以下。临床表明患肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、慢性肝炎、肝硬化、荨麻疹、风湿性心脏病，由于AP的激活，使B因子消耗，血清B因子含量低于正常人。而患妊娠高血压综合症、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进症等的患者B因子水平高于正常水平。反复呼吸道感染急性阶段，其含量也明显升高。因此，人体血浆中B因子的测定对于了解旁路系统功能、肾小球肾炎的变化及分类、肝病、恶性肿瘤等皆有较大的价值，不仅如此，还可广泛用于各种病原微生物，如病毒、细菌、真菌、支原体、立克次氏体、衣原体、螺旋体等及其抗体的检测和疾病诊断，本发明介绍了一种灵敏度高，方便快捷易操作，效价高，亲和力好的B因子测定试剂盒及其制备方法。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是，提供一种灵敏度高，检测精度高，应用范围广的B因子测定试剂盒及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用这样一种B因子测定试剂盒：包括试剂R和参考校准品，所述试剂R包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1~5g/l结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水。
本发明与现有技术中的B因子测定试剂盒相比，具有以下优点：试剂为单一试剂，节约试剂位，内含的抗体效价高，亲和力好，特异性强，稳定性好，批间差小，有效期长，试剂在2-8℃密闭避光可稳定贮存18个月，且灵敏度高，检测精度高。
作为优选，所述结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的纳米微球直径为50-150nm，成本较低，较为常见。
为解决上述技术问题，本发明采用这样一种B因子测定试剂盒的制备方法：它包括以下步骤：1）、试剂R的制备，在5~300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2~10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和B因子抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液，在第一乳胶中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25%，形成成品试剂R；2）、参考校准品的制备，根据需要的浓度将5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
本发明与现有技术中的B因子测定试剂盒的使用方法相比，具有以下优点：样本中的B因子和试剂中特异性的抗人B因子抗体多克隆抗体结合，形成抗原抗体复合物而产生浊度，其浊度高低与样本中B因子含量成正比，通过测定特定波长的吸光度值，参照标准曲线即可计算出样本中B因子的含量。操作简单，适用于手工和自动化生化仪。采用多浓度校准品，定值可靠，使用方便，测定结果更可靠。对肝病患者检测B因子比检测C_4比C_3更优越，精度度好，批内CV≤10.0%，批间CV≤10.0%。
作为设置，所述封闭液包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液和1%的牛血清白蛋白。
作为进一步设置，所述第二乳胶包括下述原料：5-300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水。
作为优选，所述抗人B因子抗体多克隆抗体包括羊抗抗人B因子抗体多克隆抗体或兔抗抗人B因子抗体多克隆抗体或鼠抗抗人B因子抗体多克隆抗体，成本较低，较为常见。
附图说明：
图1是本发明的一种B因子测定试剂盒的实施例一的样本曲线图；
图2是本发明的一种B因子测定试剂盒的实施例二的样本曲线图；
图3是本发明的一种B因子测定试剂盒的实施例三的样本曲线图；
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的一种B因子测定试剂盒，包括试剂R和参考校准品，所述试剂R包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1~5g/l结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水；
所述参考校准品包括下述原料：5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水。
所述结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的纳米微球直径为50-150nm。
本发明的一种B因子测定试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：1）、试剂R的制备，在5~300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2 ~10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和B因子抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液，在第一乳胶中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25%，形成成品试剂R；2）、参考校准品的制备，根据需要的浓度将5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
参考校准品实际为一种用来与样本比较，进行结果计算的B因子溶液，包括5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂以及根据浓度要求确定的一定量的重组人B因子纯品，其余为纯化水；将重组人B因子纯品加入上述溶液中，获得所需浓度的B因子参考校准品(该B因子参考校准品为添加重组人B因子纯品的人血清或其它类似血清基质的液体)。B因子参考校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。这里没有特别的限制，只要制得的B因子参考校准品能够与样本比较，能够测定样本中B因子的含量即可。
实施例一：
在100mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2的聚苯乙烯胶乳颗粒和B因子抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液（所述封闭液包括下述原料：100mmol/l磷酸盐缓冲液和1%的牛血清白蛋白），在第一乳胶中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳（所述第二乳胶包括下述原料：100mmol/l磷酸盐缓冲液、16mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水），用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25%，形成成品试剂R；根据需要的浓度将100mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160mmol/l乙二胺四乙酸二钠、5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得B因子的测定值与对照试剂盒(ELISA法)测定值进行比较(参见图1，并进行回归分析)；获得相关性r2=0.9999；显示出本实施例与对照试剂盒(ELISA法)具有良好的相关性。
实施例二：
在300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和B因子抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液（所述封闭液包括下述原料：300mmol/l磷酸盐缓冲液和1%的牛血清白蛋白），在第一乳胶中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳（所述第二乳胶包括下述原料：300mmol/l磷酸盐缓冲液、10mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水），用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25%，形成成品试剂R；根据需要的浓度将200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得B因子的测定值与对照试剂盒(ELISA法)测定值进行比较(参见图2，并进行回归分析)；获得相关性r2=0.9994；显示出本实施例与对照试剂盒(ELISA法)具有良好的相关性。
实施例三：
在200mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:3的聚苯乙烯胶乳颗粒和B因子抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液（所述封闭液包括下述原料：200mmol/l磷酸盐缓冲液和1%的牛血清白蛋白），在第一乳胶中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳（所述第二乳胶包括下述原料：200mmol/l磷酸盐缓冲液、12mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水），用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25%，形成成品试剂R；根据需要的浓度将150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、4mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
采用本实施例对样本进行测定，所得B因子的测定值与对照试剂盒(ELISA法)测定值进行比较(参见图3，并进行回归分析)；获得相关性r2=0.9997；显示出本实施例与对照试剂盒(ELISA法)具有良好的相关性。
用对照试剂盒测出标本的值作为预期浓度值，本发明的试剂盒测定的值作为测定浓度值，共测定若干标本，用这若干标本的2组测定数据做散点图，即本发明涉及的三个附图。
本发明的测定条件及步骤：
Figure 201310747985X100002DEST_PATH_IMAGE001
结果的计算：
Bf(g/l)=ΔAT/ΔAs×Cs(g/l)
ΔAT：测定管相对空白管吸光度值
ΔAs：校准管相对空白管吸光度值
Cs：校准品浓度值。

Claims (7)

1.一种B因子测定试剂盒，包括试剂R和参考校准品，其特征在于，所述试剂R包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠、0.1~5g/l结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水；
所述参考校准品包括下述原料：5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种B因子测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R包括下述原料：80~250mmol/l磷酸盐缓冲液、5~10mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5g/l结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水；所述参考校准品包括下述原料：30-150mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、165-170mmol/l乙二胺四乙酸二钠、3~4mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水。
3.根据权利要求1所述的一种B因子测定试剂盒，其特征在于，所述结合有抗人B因子抗体多克隆抗体的纳米微球直径为50-150nm。
4.一种B因子测定试剂盒的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：1）、试剂R的制备，在5~300mmol/l磷酸盐缓冲液中依次加入质量比为10:2~10:4的聚苯乙烯胶乳颗粒和抗人B因子抗体多克隆抗体，混合均匀，并在室温下振荡1小时，形成第一胶乳，此间配制好封闭液，在第一乳胶中加入封闭液封闭1小时，然后离心去上清，形成半成品试剂R，配制好第二胶乳，用第二胶乳稀释半成品试剂R至浓度为0.25%，形成成品试剂R；2）、参考校准品的制备，根据需要的浓度将5-200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液、160-180mmol/l乙二胺四乙酸二钠、2~5mmol/l广谱杀菌剂、重组人B因子纯品和纯化水混合均匀即可形成成品参考校准品。
5.根据权利要求4所述的一种B因子测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭液包括下述原料：5~300mmol/l磷酸盐缓冲液和1%的牛血清白蛋白。
6.根据权利要求4所述的一种B因子测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第二乳胶包括下述原料：5-300mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~16mmol/l乙二胺四乙酸二钠浓度为0.1%的脱脂奶粉、浓度为0.9%的叠氮化钠和纯化水。
7.根据权利要求4所述的一种B因子测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗人B因子抗体多克隆抗体包括羊抗抗人B因子抗体多克隆抗体或兔抗抗人B因子抗体多克隆抗体或鼠抗抗人B因子抗体多克隆抗体。
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