CN110514826A - 一种稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,涉及生物技术领域。所述检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:所述试剂R1由复合缓冲液、无机盐离子、PEG8000、表面活性剂和防腐剂组成;所述试剂R2由复合缓冲液、环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒、表面活性剂和防腐剂组成,环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒采用72nm、126nm、280nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用。本发明能够进一步提高灵敏度和稳定性,并且线性范围宽。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外检测技术领域,具体涉及一种稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
背景技术
抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)是环状聚丝蛋白的多肽片对心肌损伤的诊断有显著的特异性片段,是以IgG型为主的抗体,对类风湿性关节炎(RA)具有很好的敏感性和特异性,且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。有学者认为抗CCP抗体对RA诊断敏感性为50%~78%,特异性为96%,早期患者阳性率可达80%。此外,抗CCP抗体不仅是RA早期诊断诊断指标,还是鉴别侵袭性和非侵袭性RA的灵敏指标,其抗体阳性患者比抗体阴性的患者易发展更严重的关节骨质破坏。因此,抗环瓜氨酸多肽抗体的检测对与RA的诊断具有重要意义。
目前,测定抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体常用的方法有放射免疫学分析法、ELISA法、免疫比浊法等。其中,放射免疫学分析法检测耗时长,而且有放射性元素的污染,其使用受到限制;ELISA法操作繁琐,灵敏度低,检测结果多为定性;免疫比浊法操作简单、使用方便,但现有的免疫比浊法检测试剂盒存在灵敏度和稳定性较差,线性范围比较窄的缺点。
发明内容
本发明提供一种能够进一步提高灵敏度和稳定性,并且线性范围宽的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
为解决上述技术问题,本发明提供技术方案如下:
本发明提供一种稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,其中:
所述试剂R1的成分和含量如下:
所述试剂R2的成分和含量如下:
所述环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法如下:
步骤1:将72nm羧基胶乳颗粒、126nm羧基胶乳颗粒、280nm羧基胶乳颗粒按体积比为3:2:1的比例进行混匀;
步骤2:向步骤1得到的溶液中加入AMPD缓冲液,振荡混匀,然后20000rpm离心65min,弃上清;之后再次加入AMPD缓冲液,进行超声重悬;
步骤3:向步骤2得到的溶液中加入EDC溶液,在20℃温度下振荡反应45分钟;
步骤4:向步骤3得到的溶液中加入环瓜氨酸抗原,混匀,在30℃温度下振荡反应5小时;
步骤5:向步骤4得到的溶液中加入封闭剂,在25℃温度下封闭24小时。
步骤6:对步骤5得到的溶液进行20000rpm离心60min,弃上清,然后加入缓冲液,进行超声重悬5分钟,再次20000rpm离心60min,去除上清,所得沉淀即为环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒。
进一步的,所述缓冲液为25℃,pH为7.8-8.2的CAPSO-ADA复合缓冲液。
进一步的,所述表面活性剂的成分和含量如下:
月桂基羧甲基钠型味唑啉乙酸盐 15g/L
芥酸酰胺丙基甜菜碱 10g/L
聚乙二醇双硬脂酸酯 20g/L。
进一步的,所述环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法中,所述步骤2中的AMPD缓冲液的浓度为3mM,PH值为5~6;所述步骤6中的缓冲液为TABS缓冲液。
进一步的,所述防腐剂为二羟甲基脲。
进一步的,所述无机盐离子为氯化钾、氯化钠、氯化镁中的一种或多种。
进一步的,所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1)本发明采用胶乳增强免疫比浊法,通过试剂R1和试剂R2采用复合缓冲液,并优化各组分的配比,显著改善了试剂的稳定性。
2)本发明采用月桂基羧甲基钠型味唑啉乙酸盐、芥酸酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇双硬脂酸酯三种新型表面活性剂的复配表面活性剂溶液,可以促进并维持抗体稳定,防止体系浑浊,显著增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。
3)本发明通过优化环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法,并且采用72nm、126nm、280nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用,大大增强了试剂的反应灵敏度和线性范围,并且试剂的重复性和抗干扰能力更强。
综上所述,本发明的检测试剂盒操作简便快速,适用于自动化分析,是一种更加稳定、灵敏、线性范围宽的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,试剂盒的准确度和稳定性良好,抗干扰性强,使用方便,完全可以满足临床需要。
附图说明
图1为本发明的试剂盒与对比例的试剂盒的稳定性对比曲线图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。
实施例1:
本实施例的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法如下:
步骤1:将72nm羧基胶乳颗粒、126nm羧基胶乳颗粒、280nm羧基胶乳颗粒按体积比为3:2:1的比例进行混匀;
步骤2:取1mL步骤1得到的溶液,并加入6mL的PH值为5.2、浓度为3mM的AMPD缓冲液,振荡混匀,然后20000rpm离心65min,弃上清;之后再次加入5mL的PH值为5.2、浓度为3mM的AMPD缓冲液,进行超声重悬;
步骤3:向步骤2得到的溶液中加入0.5mg的EDC溶液,在20℃温度下振荡反应45分钟(转速150rpm);
步骤4:向步骤3得到的溶液中加入6.5mg的环瓜氨酸抗原,混匀,在30℃温度下振荡反应5小时(转速150rpm);
步骤5:向步骤4得到的溶液中加入1mL的封闭剂Blockmaster溶液,在25℃温度下封闭24小时。
步骤6:对步骤5得到的溶液进行20000rpm离心60min,弃上清,然后加入10mL的TABS缓冲液,进行超声重悬5分钟,再次20000rpm离心60min,去除上清,所得沉淀即为环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒。
表面活性剂的成分和含量如下:
月桂基羧甲基钠型味唑啉乙酸盐 15g/L
芥酸酰胺丙基甜菜碱 10g/L
聚乙二醇双硬脂酸酯 20g/L。
检测方法:采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪(如日立7180全自动分析仪、OLYMPUS AU640等),利用重点发进行测定。将试剂R1和R2按照体积比为3:1的比例放置到对应的试剂位上,在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本,操作如表1所示:
计算:抗环瓜氨酸肽抗体含量(U/mL)=(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准。
实施例2:
本实施例的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,换瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒和表面活性剂的制备方法和成分与实施例1相同。
检测方法同实施例1的检测方法。
实施例3:
本实施例的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,换瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒和表面活性剂的制备方法和成分与实施例1相同。
检测方法同实施例1的检测方法。
对比例1:
本对比例的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒包试剂R1和试剂R2,其中,试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒在制备时,只采用72nm羧基胶乳颗粒,其余与实施例1的环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒的制备方法相同。
检测方法同实施例1的检测方法。
对比例2:
本对比例的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒在制备时,只采用126nm羧基胶乳颗粒,其余与实施例1的环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒的制备方法相同。
检测方法同实施例1的检测方法。
对比例3:
本对比例的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒在制备时,只采用280nm羧基胶乳颗粒,其余与实施例1的环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒的制备方法相同。
检测方法同实施例1的检测方法。
精密度试验:
取具有溯源性的高值质控物(靶值55U/mL)和低值质控物(靶值12U/mL)各一份,分别用实施例1-3和对比例1-3对应的试剂盒进行对照检测,对每份质控物进行20次检测,将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。检测结果见表2和表3。
表2高值质控物精密度试验结果
表3低值质控物精密度试验结果
从表2和表3中可以看出,实施例1-3对应的试剂盒检测的数值更接近靶值,标准偏差和变异系数明显小于对比例1-3对应的试剂盒,具有更高的批内精密度,这说明本发明通过优化环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法,采用72nm、126nm、280nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用;并且添加月桂基羧甲基钠型味唑啉乙酸盐、芥酸酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇双硬脂酸酯三种新型表面活性剂的复配表面活性剂溶液,优化了反应体系,极大的提高了试剂盒的批内精密度。
准确度试验:
取具有溯源性的高值质控物(靶值55U/mL)、低值质控物(靶值12U/mL)各一份,分别用实施例1-3和对比例1-3对应的试剂盒进行对照检测,各检测5次,计算平均值,与质控物靶值进行对照,检测结果如表4和表5所示。
表4高值质控物准确度试验结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
最大值 | 55.18 | 55.15 | 55.13 | 54.28 | 54.38 | 57.84 |
最小值 | 54.83 | 54.90 | 54.78 | 52.39 | 50.71 | 52.86 |
平均值 | 55.06 | 55.11 | 55.13 | 52.90 | 52.64 | 56.93 |
表5低值质控物准确度试验结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
最大值 | 12.30 | 12.18 | 12.11 | 11.28 | 11.30 | 11.38 |
最小值 | 11.84 | 11.74 | 11.82 | 10.47 | 10.34 | 10.57 |
平均值 | 12.13 | 12.10 | 12.06 | 10.74 | 10.47 | 10.70 |
从表4和表5中可以看出,实施例1-3对应的试剂盒检测数值更接近靶值,平均值与靶值的差值在0.15以内,远高于对比例1-3对应的试剂盒,具有更高的准确度。
稳定性试验:
对实施例1-3和对比例1-3对应的试剂盒,分别均匀分装13组,每组的试剂量为:R1为18mL,R2为6mL。放置到2-8℃冰箱中,每月的同一天取出一组试剂检测抗环瓜氨酸肽抗体质控品(靶值为55U/mL),检测结果如图1所示。从图1中可以看出,实施例1-3对应的试剂盒在2-8℃储存条件下比对比例1-3对应的试剂盒更加稳定。
由图1可知,在保存13个月时,对比例1-3对应的试剂盒检测数值为42.71-44.78U/mL,与靶值相差10.22-12.29U/mL,并且检测值随储存时间延长呈现明显的降低趋势;而实施例1-3对应的试剂盒检测数值为54.39-56.04U/mL,与靶值相差0.61-1.04U/mL,远低于对比例1-3对应的试剂盒。这表明实施例1-3对应的试剂盒拥有更高的稳定性。
灵敏度试验:
取具有溯源性的校准品由低到高稀释出7个浓度样本,分别用实施例1-3和对比例1-3对应的试剂盒进行对照检测,将检测结果与理论浓度相比较,结果见表6所示。
表6灵敏度对比试验结果
理论浓度 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
0.1U/mL | 0.11 | 0.09 | 0.11 | 0.02 | 0.03 | 0.02 |
0.5U/mL | 0.53 | 0.50 | 0.54 | 0.40 | 0.41 | 0.39 |
1U/mL | 1.05 | 1.08 | 1.01 | 0.97 | 0.92 | 0.93 |
40U/mL | 41.30 | 41.34 | 41.28 | 40.24 | 40.26 | 40.65 |
60U/mL | 62.05 | 62.07 | 61.96 | 61.94 | 61.98 | 61.93 |
80U/mL | 82.44 | 82.45 | 82.47 | 77.40 | 76.55 | 73.40 |
100U/mL | 103.22 | 103.04 | 103.27 | 87.66 | 86.85 | 84.58 |
从表6中可以看出,在样本浓度低至0.1U/mL时,对比例1-3对应的试剂盒检测值为0.02-0.03U/mL,而实施例1-3对应的试剂盒检测值为0.09-0.11U/mL,仍可以检测出样本的准确值;并且与对比例1-3相比,实施例1-3对应的试剂盒检测接近线性下限的低值样本(0-1U/mL)时的准确度更高。另外,在样本浓度在线性上限100U/mL时,对比例1-3对应的试剂盒检测值在84.58-87.66U/mL之间,明显偏低,而实施例1-3对应的试剂盒检测值在103.04-103.27U/mL之间,仍可以检测出样本的准确值,这表明实施例1-3对应的试剂盒拥有更高的分析灵敏度。
综上所述,本发明通过优化环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法,采用72nm、126nm、280nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用;并且添加月桂基羧甲基钠型味唑啉乙酸盐、芥酸酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇双硬脂酸酯三种新型表面活性剂的复配表面活性剂溶液,优化了反应体系,极大的提高了试剂的准确度、稳定性、分析灵敏度和线性范围。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1和试剂R2,其中:
所述试剂R1的成分和含量如下:
所述试剂R2的成分和含量如下:
所述环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法如下:
步骤1:将72nm羧基胶乳颗粒、126nm羧基胶乳颗粒、280nm羧基胶乳颗粒按体积比为3:2:1的比例进行混匀;
步骤2:向步骤1得到的溶液中加入AMPD缓冲液,振荡混匀,然后20000rpm离心65min,弃上清;之后再次加入AMPD缓冲液,进行超声重悬;
步骤3:向步骤2得到的溶液中加入EDC溶液,在20℃温度下振荡反应45分钟;
步骤4:向步骤3得到的溶液中加入环瓜氨酸抗原,混匀,在30℃温度下振荡反应5小时;
步骤5:向步骤4得到的溶液中加入封闭剂,在25℃温度下封闭24小时。
步骤6:对步骤5得到的溶液进行20000rpm离心60min,弃上清,然后加入缓冲液,进行超声重悬5分钟,再次20000rpm离心60min,去除上清,所得沉淀即为环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒。
2.根据权利要求1所述的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为25℃,pH为7.8-8.2的CAPSO-ADA复合缓冲液。
3.根据权利要求1所述的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂的成分和含量如下:
月桂基羧甲基钠型味唑啉乙酸盐 15g/L
芥酸酰胺丙基甜菜碱 10g/L
聚乙二醇双硬脂酸酯 20g/L。
4.根据权利要求1所述的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法中,所述步骤2中的AMPD缓冲液的浓度为3mM,PH值为5~6;所述步骤6中的缓冲液为TABS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为二羟甲基脲。
6.根据权利要求1至5中任一所述的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述无机盐离子为氯化钾、氯化钠、氯化镁中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的稳定、灵敏的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
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