CN108135547B

CN108135547B - 用于评估接触系统激活的含有蛋白酶抑制剂的真空采血管

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Publication number: CN108135547B
Application number: CN201680047254.6A
Authority: CN
Inventors: D·J·塞克斯顿; 莱恩·福赛特
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2016-08-12
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2036-08-12
Also published as: EP3909509A1; CO2018002531A2; JP2021164678A; WO2017027771A1; AU2016306653A1; IL257209B; JP2023078232A; KR20180100107A; EP3334343B1; CN108135547A; EA201890478A1; EP3334343A1; JP6907188B2; AU2021215261B2; IL295914A; IL295914B1; US20210322972A1; ES2938089T3; MX2022014713A; IL257209A

Abstract

本文公开了包含液体形式的蛋白酶抑制剂混合物的真空采血管和其用于评估与受试者的接触系统相关的特征的用途，所述特征包括接触系统激活的内源水平、治疗期间靶向接触系统的组分的药物的内源水平和/或这样的药物的免疫原性。

Description

用于评估接触系统激活的含有蛋白酶抑制剂的真空采血管

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年8月13日提交的美国临时申请号62/204,644和2015年9月4日提交的美国临时申请号62/214,308的申请日的益处。这些引用的申请各自的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

由于采血过程中离体激活的倾向，使用患者血浆精确测量接触系统激活(contactsystem activation)的体内水平面临着挑战。来自患有与接触系统相关的某些疾病(例如，遗传性血管性水肿)的患者的血液尤其倾向于离体接触系统激活，因为其缺乏该途径的天然抑制剂——C1抑制剂。因此，测量途径特异性生物标志物(例如，2-链高分子量激肽原)可能高估了患者中存在的接触系统激活的程度，除非血液被小心收集和加工。

发明内容

本公开至少部分基于非玻璃真空采血管的开发，所述非玻璃真空采血管含有液体制剂中的蛋白酶抑制剂混合物(mixture)(混合物(cocktail))，其在采血过程中预防接触系统的离体激活。因此，本文所述的真空采血管允许精确测量患者(尤其缺乏该途径的天然抑制剂(例如，C1抑制剂)那些患者)的接触系统激活的内源水平。

因此，本公开的一个方面描述了一种真空采血管，其包含含有蛋白酶抑制剂的混合物的液体制剂，所述液体制剂可基本上不含在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂。所述管可以是非玻璃管。在一些实施方式中，所述管是塑料的。在一些实施方式中，真空采血管包含0.5ml的本文所述的任何液体制剂，其可在使用时被稀释10倍。

在一些实施方式中，本文所述的真空采血管中的蛋白酶抑制剂的混合物包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，血浆激肽释放酶抑制剂)和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在一个实施例中，蛋白酶抑制剂的混合物包含EPI-KAL2(其可以是生物素化的)和亮抑酶肽。EPI-KAL2的含量的范围可以是包含其的液体制剂中5至15μM。可选地或另外，液体制剂中亮抑酶肽的量的范围可以是200至300μM。

在一些实施方式中，本文所述的蛋白酶抑制剂的混合物可包含至少两种丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述两种丝氨酸蛋白酶抑制剂中的至少一种是胰蛋白酶抑制剂，例如，大豆胰蛋白酶抑制剂。在一些实施例中，蛋白酶抑制剂的混合物包含苄脒、大豆胰蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽和AEBSF。在一些实施例中，真空采血管中的液体制剂可包含80-120mM苄脒、1-3mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、200-300μM亮抑酶肽和/或10-30mM AEBSF。

本文所述的任何真空采血管中的液体制剂可进一步包含聚凝胺和EDTA。在一些实施方式中，本文所述的任何液体制剂的pH可为4-6(例如，4.5)。

在另一方面中，本公开提供了用于评估受试者的接触系统激活的内源水平的方法。该方法包括：(i)将受试者的血液采集至本文所述的任何真空采血管中；(ii)加工血液以产生血浆样品；和(iii)测量血浆样品中接触系统激活的水平。在一些实施方式中，测量步骤(步骤(iii))可通过测量指示接触系统激活的一种或多种生物标志物的水平来进行。这类生物标志物可包括前激肽释放酶、活性血浆激肽释放酶(pKal)、α2M-pKal复合物、活性因子XII、活性因子XI、高分子量激肽原(HMWK)和/或缓激肽代谢物。在一个实施例中，一种或多种生物标志物包括切割的HMWK和/或完整的HMWK。

在仍另一方面中，本公开提供了用于评估靶向接触系统的药物在受试者中的水平的方法。该方法包括：(i)将受试者的血液采集至如本文所描述的真空采血管中，其中所述受试者被施用靶向接触系统的组分的药物；(ii)加工血液以产生血浆样品；和(iii)测量血浆样品中药物的水平。

此外，本公开提供了用于评估靶向接触系统的药物的免疫原性的方法，该方法包括：(i)将受试者的血液采集至如本文所描述的真空采血管中，其中所述受试者被施用靶向接触系统的组分的药物；(ii)加工血液以产生血浆样品；和(iii)测量血浆样品中结合至药物的抗体的水平。这样的方法可进一步包括：在步骤(iii)之前，从血浆样品分离结合药物的抗体。在一些实施例中，可通过固相萃取和酸解离(SPEAD)测定分离抗药物抗体(ADA)。

在本文所述的任何方法中，所述受试者可以是人患者，在一些情况下，可用靶向接触系统的组分(例如，血浆激肽释放酶)的药物，例如特异性靶向血浆激肽释放酶(例如，活性形式的血浆激肽释放酶)的药物(例如，抗体)治疗所述人患者。在一些实施例中，血液来自患有与接触系统相关的疾病(例如，遗传性血管性水肿(HAE)或特发性血管性水肿)的人患者。在一些情况下，人患者患有具有正常C1-抑制剂(C1-INH)的HAE。

在本文所述的任何方法中，真空采血管可以不是装有来自受试者的血液的第一管。可选地或另外，处理步骤[步骤(ii)]可在血液收集步骤[步骤(i)]之后一小时内进行。

在下面的说明书中阐释本发明的一个或多个实施方式的细节。通过下述附图和对若干实施方式的详细说明以及通过所附的权利要求书，本发明的其他特征或优势将是显而易见的。

附图说明

下述附图形成本说明书的一部分并且被包括，以进一步阐释本公开的某些方面，通过参考这些附图的一幅或多幅结合本文呈现的具体实施方式的详细说明，本公开将被更好地理解。

图1是照片，显示SCAT169和SCAT153管防止接触激活，如在2-链蛋白质印迹测定中所测量的。当将10％鞣花酸添加至血浆时，接触系统被激活，导致1-链HMWK转变成2-链HMWK(见柠檬酸钠血浆)。相比之下，在添加鞣花酸之前和之后，SCAT169和SCAT153血浆包含相同量的1-链HMWK。

图2是显示激肽原切割的变化(2-HMWK/cHMWK百分数)的图表，其是基于从健康受试者进行的血浆样品采集方法。显示了采集的临床部位以及用于采集的管的类型，包括K₂EDTA(EDTA)、柠檬酸钠、SCAT169或P100。数据点的分组从左向右对应于部位1：EDTA；部位2：柠檬酸盐；部位3：柠檬酸盐；部位4：柠檬酸盐；部位1：SCAT169；部位2：SCAT169；部位4：SCAT169；部位5：SCAT169；和部位4：P100。

图3是显示从健康受试者的不同临床部位采集到SCAT 169管中的血浆中激肽原切割(2-HMWK/cHMWK百分数)的图。数据点的分组从左向右对应于部位1：商业销售商、部位4、部位5以及部位4和5。

图4是显示与患有I型或II型HAE、nC1-INH HAE和特发性血管性水肿(AE)的受试者相比，健康受试者中的激肽原切割(2-HMWK/cHMWK百分数)的图。数据点的分组从左向右对应于健康的受试者、HAE I/II基础(basal)、HAE I/II发作(attack)、HAE(nC1-INH)基础、HAE(nC1-INH)发作、特发性AE基础和特发性AE发作。

图5是显示来自健康受试者和患有HAE患者的血浆中2-链HMWK水平的图。A：显示来自健康受试者的血浆2-链HMWK水平的百分数。如在图中所显示，临床部位C在SCAT169血浆采集之前未使用初始丢弃的管。B：显示来自患有HAE的患者的血浆2-链HMWK水平的百分数。

发明详述

本公开至少部分基于真空采血管的开发，所述真空采血管包含防止接触系统激活的蛋白酶抑制剂混合物。为了精确评估患者或健康志愿者的接触系统激活的内源水平，血液被小心采集和加工是至关重要的。可采取一种或多种下述防范措施，以确保精确评估如本文所描述的与接触系统相关的特征：

(i)本文所述的真空采血管优选不是装有血液的第一管，该第一管由于针刺穿血管之后的局部创伤而可显示升高的接触系统激活；

(ii)血液可不与玻璃接触(使用塑料管或导管)；

(iii)采集之后，血液可在短时间(例如，～1小时)内被加工为血浆；和/或

(iv)采集管中蛋白酶抑制剂的使用可稳定血浆避免离体接触激活，所述离体接触激活妨碍对内源患者状况的精确测定。

本文所述的真空采血管的优势至少包括：(1)使用真空非玻璃(例如，塑料)管来标准化和简化血液采集；(2)使用包含蛋白酶抑制剂混合物的液体制剂来使水解最小化；(3)任选地省略了在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂(例如，PPACK II，也称为H-D-Phe-Phe-Arg-氯甲基酮)；和(4)在一些实施方式中包含血浆激肽释放酶抑制剂，比如EPI-KAL2(可以是生物素化的)，其使管有能力包含允许使用免疫测定检测激活的血浆激肽释放酶的试剂。见，例如，WO95/21601，其相关公开内容通过引用并入本文。

通过该研究意外地观察到，液体形式的蛋白酶抑制剂混合物的使用预防或减少了溶血作用。当将血液采集至包含蛋白酶抑制剂的冻干制剂的真空管中时，其大量溶血，这可干扰某些分析物测量。但是，当将血液采集至包含相同蛋白酶抑制剂混合物的溶液的真空管中时，其未溶血。

因此，针对评估由采集至本文所述的真空管中的血液样品加工的血浆样品中接触系统激活的程度的测量提供了患有不同疾病的患者的更精确的评估水平。获得对接触激活的精确评估可允许鉴定患有不同疾病的患者的疾病或子集，所述疾病潜在地由该途径介导，从而适于用接触系统的抑制剂治疗。

此外，本文所述的真空采血管的使用可利于精确测定药物水平和/或对抵抗接触系统中激活形式的蛋白质(例如，血浆激肽释放酶、FXIIa和2-链激肽原)的治疗性分子进行免疫原性评估。管可为靶向接触系统激活的下游的激活蛋白质的、不需要钙来产生激活的靶(例如，FXIa和FIXa)的治疗性分子提供类似的优势。这些管的优势主要适用于生物治疗性分子，因为PK和使用的免疫原性测定通常是识别结合位点(例如，在治疗性抗体的情况下，个体基因型)的免疫测定。如果治疗性靶被离体激活，其可结合血浆中存在的生物组分(biologic)，从而妨碍PK和免疫原性免疫测定中的检测。管中的蛋白酶抑制剂可防止靶激活。液体制剂的使用防止了溶血，溶血可能干扰某些实验室测定。

包含液体制剂中的蛋白酶抑制剂混合物的真空采血管

真空采血管在医学实践中是常用的，其用于采集血液样品，用于各种用途。本文所述的管可以是包含含有蛋白酶抑制剂的混合物(蛋白酶抑制剂混合物)的液体制剂的非玻璃管。在一些实施方式中，蛋白酶抑制剂混合物可包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂可以是血浆激肽释放酶抑制剂。这样的蛋白酶抑制剂混合物可包含多种(例如，2、3、4或5种)丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中至少一种可以是胰蛋白酶或人纤溶酶抑制剂。优选地，本文所述的蛋白酶抑制剂混合物基本上不含在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂，即，在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂的活性相对于蛋白酶混合物的总抑制活性是很小的。在一些情况下，在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂的量可小于混合物中总蛋白酶抑制剂的5％(w/w)，例如，小于2％、小于1％或小于0.5％。在一些情况下，蛋白酶抑制剂混合物完全不含在水溶液(例如，pH为4-6的水溶液)中不稳定的蛋白酶抑制剂。在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂的一个例子是PPACK II，也称为H-D-Phe-Phe-Arg-氯甲基酮。

下面表1列举了可用于制备本文所述的蛋白酶抑制剂混合物的示例性丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶蛋白酶抑制剂。

在一些实施例中，用于制造真空采血管的蛋白酶抑制剂混合物包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，1、2或3种)和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，1、2或3种)，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂可包括至少一种胰蛋白酶/纤溶酶抑制剂(例如，1、2或3种)。这样的蛋白酶抑制剂混合物可包含三种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，苄脒、AEBSF和胰蛋白酶/纤溶酶抑制剂，比如大豆胰蛋白酶抑制)和一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，亮抑酶肽)。

在其他实施例中，蛋白酶抑制剂混合物可包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，血浆激肽释放酶抑制剂)和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，亮抑酶肽)。血浆激肽释放酶抑制剂可以是EPI-KAL2(Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp GlyPro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys GluGlu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu GluCys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp；SEQ ID NO：1)，其是一种特异性血浆激肽释放酶重组蛋白酶抑制剂，其使管有能力包含允许使用例如免疫测定检测激活血浆激肽释放酶的试剂。

任何蛋白酶抑制剂混合物可溶于适当的溶液，以形成液体制剂。所述适当的溶液可以是酸-柠檬酸盐-右旋糖溶液，其可包含柠檬酸三钠、柠檬酸和右旋糖。溶液的pH值可以是大约4-6、4-5、4.5-5.0或4.2-4.7，例如4.5。在一些实施方式中，溶液的pH值是大约4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在一些实施方式中，溶液的pH值是大约4.5。液体制剂可进一步包含阳离子聚合物，比如海地美溴铵(hexadimethrine bromide)分子(聚凝胺

)，其可通过与带负电的表面和螯合剂(例如，EDTA)相互作用(这可抑制金属蛋白酶)而减少接触系统激活。

混合物中每种蛋白酶抑制剂的浓度可以是用于抑制相应蛋白酶的这种抑制剂的终浓度的5倍或10倍，这取决于实际的稀释倍数。具体的商售蛋白酶抑制剂的终浓度是本领域已知的，并且可从制造商的方案中获得。在一些实施例中，EPI-KAL2的浓度范围可以为5-15μM(例如，5-10、7至12μM，或10-15μM)。在一些实施方式中，EPI-KAL2的浓度是大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或大约15μM。在一些实施例中，亮抑酶肽的浓度范围可以是200-300μM(例如，200-250、240-270或250-300μM)。在一些实施方式中，亮抑酶肽的浓度是大约200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或约300μM。在一些实施例中，大豆胰蛋白酶抑制剂的浓度范围可以是1-3mg/ml(例如，1-2或2-3mg/ml)。在一些实施方式中，大豆胰蛋白酶抑制剂的浓度是大约1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或大约3.0mg/mL。在一些实施例中，苄脒的浓度范围可以是80-120mM(例如，80-100或100-120mM)。在一些实施方式中，苄脒的浓度是大约80、85、90、95、100、105、110、115或大约120mM。在一些实施例中，AEBSF的浓度范围可以是10-30mM(例如，10-20或20-30mM)。在一些实施方式中，AEBSF的浓度是大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或约30mM。

当使用基于肽的蛋白酶抑制剂(例如，EPI-KAL2)时，其可以根据常规的方法被生物素化。例如，肽抑制剂可以如下被生物素化。简言之，可将肽抑制剂溶于适当的溶液，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。可将新鲜制备的Sulfo-NHS-LC-生物素添加至肽抑制剂溶液中并且在冰上孵育适当的时间段。可使用spin-脱盐柱去除过多的未反应的、水解的生物素。可通过ELISA确认肽抑制剂的标记，并且可通过，例如Bradford测定确定蛋白质浓度。

可通过常规方法制备本文所述的任何液体制剂，例如，将适当的组分溶于适当的溶液中，并且置于真空采血管中，所述真空采血管优选是非玻璃的。可将管储存在-20℃，并且在使用之前可在冰上或冷藏温度(例如，约4℃)，比如在冰箱中解冻适当的时间段。

包含液体形式的蛋白酶抑制剂混合物的真空采血管的应用

本文所述的任何真空采血管可用于从受试者采集血液样品，以用于分析与接触系统相关的内源性特征，包括但不限于：接触系统激活的水平、靶向接触系统的组分的药物的血清水平和/或这类药物的免疫原性。为了减少(例如，由于针刺穿血管之后的局部创伤而导致的)接触系统的离体激活，当从受试者抽血时，本文所述的真空采血管可以不是装有血液的第一管。例如，来自受试者的初始血液可被采集在可以丢弃的第一管中，然后使用真空采血管采集随后的血液样品，其可用于分析。第一管可以是常规实践中使用的常规采血管。

在血液采集之后，可在适当的时间段(例如，不超过一小时)内加工血液样品以产生血浆样品。可进一步对血浆样品进行分析，以评估与受试者(从其获得初始血液样品)的接触系统相关的特征，。

可从需要如本文所描述的分析的受试者采集血液样品。在一些情况下，受试者是人患者，该人患者可患有与接触系统相关的疾病、疑似患有与接触系统相关的疾病或处在与接触系统相关的疾病的风险中。例如，人患者可能之前发生过HAE或可能处在HAE的风险中。人患者可患有I型或II型HAE，其缺乏C1-INH或产生非典型C1-INH。可选地，人患者可患有与C1-INH缺陷不相关的III型HAE。在其他实施例中，人患者可能之前发生过特发性血管性水肿或可处在特发性血管性水肿的风险中。这样的人患者可能先前已经接受过靶向接触系统的组分(例如，pKal或FXIIa或高分子量激肽原)的药物的治疗，或正在用靶向接触系统的组分(例如，pKal或FXIIa或高分子量激肽原)的药物进行治疗的过程中。

i.评估接触系统激活的内源水平

在一个方面中，可分析本文所述的血浆样品，以评估受试者的接触系统激活的内源水平，所述受试者可以是患有与接触系统相关的疾病(例如，HAE或特发性血管性水肿)、疑似患有与接触系统相关的疾病(例如，HAE或特发性血管性水肿)或处在与接触系统相关的疾病(例如，HAE或特发性血管性水肿)的风险中的人患者。这样的人患者可以处于疾病的治疗中，例如，涉及pKal抑制剂(例如，抗pKal抗体)的治疗。在其他情况下，这样的人患者可能没有进行这种治疗。可选地，人受试者可以是没有这种疾病的健康受试者。

可通过测量指示接触系统激活的一种或多种生物标志物来测定血浆样品的接触系统激活的水平。

血浆激肽释放酶(pKal)是循环中主要的产生缓激肽的酶。可经接触系统或经因子XIIa发生pKal的激活，所述接触系统和因子XIIa二者都与和遗传性血管性水肿(HAE)相关的疾病病理相关联。血浆激肽释放酶作为被称为前激肽释放酶的非活性酶原而循环，其通常结合其底物高分子量激肽原(HMWK)。响应刺激，前激肽释放酶被切割而形成活性血浆激肽释放酶。激肽释放酶的这种激活可例如，在FXII激活成FXIIa之后由因子XIIa介导，或由接触级联的效应子介导。大约75-90％的循环前激肽释放酶通过与HMWK的结构域6的非活性位点相互作用而结合HMWK，其将水解HMWK的另外的分子，以产生切割的HMWK和缓激肽。活性血浆激肽释放酶在两个位点切割HMWK，导致缓激肽的释放，所述缓激肽是疼痛、炎症、水肿和血管生成的一种关键介质。另一种切割产物(切割的激肽原)包含通过二硫键连接在一起的氨基酸链。Cugno等，Blood(1997)89:3213-3218。

可用于评估患者血液样品中接触系统激活的水平(从而确定患者是否具有升高水平的接触系统和/或接触系统的活性，例如，升高水平的pKal或pKal的活性)的示例性生物标志物提供在下面表2中：

表2.接触系统生物标志物

可使用常规方法分析指示接触系统激活的一种或多种生物标志物。一种用于定性、半定量或定量检测的、特别合适的测定类型是免疫测定。免疫测定是其中靶分子(例如，与接触系统激活相关的生物标志物分子)通过使用如本文所描述的特异性结合靶分子的结合剂而被检测和/或量化的任何测定。结合剂可以是抗体，其可以是全长抗体或其抗原结合片段。免疫测定可以是竞争性或非竞争性免疫测定，并且可以是均相或非均相免疫测定。例如，用于检测接触系统生物标志物的免疫测定可以是酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、计数免疫测定(CIA)、免疫酶测定分析(IEMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、侧流免疫层析法(lateral flow immunoassay)、夹心免疫测定、免疫-PCR测定、邻位连接测定、蛋白质印迹测定或免疫沉淀测定。用于检测本文提供的生物标志物的、另外的合适的免疫测定对于本领域技术人员是显而易见的。但是，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本公开不限于免疫测定，并且不基于抗体或结合抗原的抗体片段的检测测定(detection assay)(比如质谱)也可用于如本文提供的接触系统生物标志物的检测和/或量化。

用于检测和/或量化接触系统生物标志物(比如本文所提供的那些生物标志物)的检测测定的类型将取决于测定被应用的具体情况(例如，临床或研究应用)，并且取决于待检测的生物标志物的种类和数量，以及取决于待平行进行的患者样品的种类和数量，例如参数。例如，使用蛋白质印迹测定，在从HAE患者或急性HAE发作期间的健康受试者采集的血浆样品中可检测到升高水平的切割激肽原(2-链激肽原)。尽管蛋白质印迹测定允许同时分析多个样品中的接触系统生物标志物，但是它们可平行评估的生物标志物的数量有限。因此，在分析单个样品中或多个样品中的本文提供的多种接触系统生物标志物的一些实施方式中，优选适于这类多重分析的测定。这类测定的例子包括但不限于肽微阵列和芯片实验室(lab-on-a-chip)测定，其已经被设计来为较低扩展性的免疫测定(比如蛋白质印迹)提供一种高通量、多重就绪(multiplex-ready)的替代者。

在一些实施例中，在存在或不存在pKal抑制剂和/或接触系统活化剂的情况下，可将血浆样品置于多孔微板中。在存在pKal的标记的肽底物的情况下，可在冰上孵育混合物适当的时间段(例如，2分钟)，并且可将玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)添加至混合物，以终止激活反应。如果需要，可稀释混合物，并且可通过测量荧光肽底物的水平来确定蛋白水解活性。从这样的测定获得的结果可用于确定受试者(从其获得血浆样品)的接触系统激活的内源水平。如果使用，它们也可用于确定pKal抑制剂的抑制活性。

ii.评估靶向接触系统的药物的内源水平

本公开的另一方面涉及本文所述的真空采血管测定靶向接触系统的组分的药物的水平的用途。需要药物水平来评估药物代谢动力学参数。例如，如果在为了测定血浆中血浆激肽释放酶抑制剂(例如，DX-2930)的量而采集的血浆样品中接触系统被离体激活，则过多的激活血浆激肽释放酶可结合药物，从而妨碍其在测定中的检测。本文所述的任何真空采血管可用于(例如在从受试者采集的样品中)更精确地评估药物水平。

为了实施该方法，可按照本文所述的方法，由本文所述的真空采血管中采集的血液样品制备源自接受靶向接触系统的组分(例如，pKal)的药物治疗的受试者(例如，人患者)的血浆样品。可按照常规实践来测量血浆样品中的药物水平。在一些情况下，可通过免疫测定，例如，本文所述的那些免疫测定来测量药物水平。

iii评估靶向接触系统的药物的免疫原性

本公开的另一方面涉及真空采血管用于测定针对接触系统的组分(例如，pKal)的生物抑制剂的免疫原性的用途。例如，在循环的血浆中存在过多药物的情况下，开发能够测量针对药物的抗体(“ADA”)的免疫原性测定是常规实践。对于在循环中可具有多周的半衰期和高药物水平的治疗性单克隆抗体，对于可测量ADA的免疫原性测定的这种要求的确是这种情况。为了克服由于样品中过多药物的干扰，实施将抗药物抗体与药物分离的技术。可通过固相萃取和酸解离(SPEAD)分离这样的抗药物抗体，这涉及孵育生物素化形式的药物与血浆样品达一段延长的时间(通常过夜)，随后使用链霉抗生物素涂覆的板分离可结合至抗药物抗体的生物素化的药物。接着用酸处理板，以释放抗药物抗体。释放的抗体可被直接涂覆在另一测定板上，用于检测。在采集管中没有蛋白酶抑制剂的情况下，接触系统可成为离体激活的，导致活性血浆激肽释放酶的产生。在上述酸释放和再涂覆步骤之后，活性pKal和抗药物抗体二者会结合至板的表面。通常使用标记的药物检测抗药物抗体，所述标记的药物也可结合活性pKal(如果存在的话)，导致ADA测定中的假阳性信号。

本文所述的包含蛋白酶抑制剂混合物的真空采血管的使用可防止这种假阳性信号。

通用技术

本发明的实施，除非另外指出，否则将采用在本领域技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这类技术在下述文献中得到充分阐释，比如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编辑,1994)；Current Protocolsin Immunology(J.E.Coligan等编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)。

不需要进一步详细阐述，相信本领域技术人员基于上述说明可最大程度利用本发明。因此，下述具体的实施方式应仅仅解释为示例性的，并且决不以任何方式限制本公开的剩余部分。为了本文提到的目的或主题，将本文引用的所有出版物通过引用并入本文。

实施例1：防止接触系统激活的蛋白酶抑制剂混合物的制备

开发了防止接触系统激活的蛋白酶抑制剂混合物。真空塑料管用于标准化和简化血液采集。

在液体制剂中使用下述两种蛋白酶抑制剂混合物，以防止水解：

1)10X蛋白酶抑制剂混合物A：SCAT169

真空5mL总体积塑料管，其包含(0.5ml)：100mM苄脒、400μg/mL聚凝胺、2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、20mM EDTA、263μM亮抑酶肽和20mM AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐)，其溶于酸-柠檬酸盐-右旋糖(100mM柠檬酸三钠、67mM柠檬酸和2％右旋糖，pH4.5)中。

2)10X蛋白酶抑制剂混合物B：SCAT153

真空5ml总体积塑料管，其包含(0.5ml)：10μM生物素化的EPI-KAL2、400μg/mL聚凝胺、20mM EDTA和263μM亮抑酶肽，其溶于酸-柠檬酸盐-右旋糖(100mM柠檬酸三钠、67mM柠檬酸和2％右旋糖，pH 4.5)中。

生物素化的EPI-KAL2包含在蛋白酶抑制剂混合物B(SCAT153)中。将SCAT169(专用凝血测定管，配方(formulation)169)和SCAT153(专用凝血测定管，配方153)管储存在2-8℃。

实施例2：SCAT169和SCAT153管防止接触系统激活，如2-链蛋白质印迹测定所证明

采集到SCAT169或SCAT153管中的血浆阻断通过离体添加熟知的接触系统活化剂鞣花酸而诱导的接触系统激活(图1)，如经蛋白质印迹分析通过1-链向2-链HMWK的转化所测量的。

在被采集到以下3个不同采血管中的血浆样品之间比较观察到的鞣花酸诱导的接触系统激活：柠檬酸钠管(临床化学实验室中用于凝血测量而使用的标准管)、SCAT169管和SCAT153管。

在柠檬酸钠管中经鞣花酸激活的样品中，1-链HWMK基本上完全被消耗，并且检测到2-链HMWK的出现。

相比之下，在SCAT169和SCAT153管的鞣花酸激活的血浆中保留了1-链HMWK。

这些结果提供了证据，证明SCAT169和SCAT153管有效防止在血浆样品采集和加工期间可能发生的离体接触系统激活。

实施例3：SCAT169和SCAT153蛋白酶抑制剂混合物延长血浆凝结时间

对于三个单独的供体样品，测量了在下面3个不同的采血管中处理的样品中的血浆凝结时间：柠檬酸钠管、SCAT169管和SCAT153管(表1)。

如通过凝血素和活化部分促凝血酶原激酶所证明的，与柠檬酸钠相比，SCAT159和SCAT153的样品中的凝结时间增加。结果提供在下面表3中。

表3.蛋白酶抑制剂对血浆凝结时间的影响

实施例4：真空采血管评估人受试者的接触系统激活的内源水平的用途

接触系统激活的血浆生物标志物的检验面临着挑战，原因是血液采集和加工期间无意的激活。在该研究中，如下研究了专用采血管(SCAT159和SCAT153)在评估来自健康受试者和患有I型/II型遗传性血管性水肿(HAE)、特发性血管性水肿或具有正常C1-INH的HAE(HAEnC1，也称为nC1-INH)的那些受试者的血浆中切割的高分子量激肽原(cHMWK)水平中的用途。

为了避免在血液取样期间人工激活接触途径，该研究使用标准化的血液采集技术和包含蛋白酶抑制剂的定制管。从健康受试者和上述患病受试者采集血液样品(在疾病静止和爆发期间)，以利用蛋白质印迹测定评估cHMWK的百分数。使用具有蝶式针系统的导管，将血液样品置入SCAT159或SCAT153管中(5mL总体积，0.5mL 10X蛋白酶抑制剂混合物)。然后，加工血液样品，以在血液采集之后1小时内产生血浆样品。

按照例如WO 2015/061183中公开的方法，通过简单的免疫印迹(SBHD)和蛋白质印迹(TGA)分析SCAT管血浆样品，以确定血浆样品中切割的激肽原(2-链激肽原)的水平。

从健康受试者的临床部位1-5将血浆采集至包含各种抗凝血剂、蛋白酶抑制剂或蛋白质稳定剂的塑料采集管中，然后将其加工成血浆。具体而言，管的类型是K₂EDTA、柠檬酸钠、SCAT169或P100(BD Biosciences)。如图2中显示，发现使离体接触系统激活最小化的管包含蛋白酶抑制剂，并且是P100管或SCAT169管，其是5mL体积塑料真空采血管，包含以下成分的0.5mL 10X浓缩混合物：100mM苄脒、400μg/mL聚凝胺、2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、20mM EDTA、263μM亮抑酶肽和20mM AEBSF，其溶于酸-柠檬酸盐-右旋糖(100mM柠檬酸三钠、67mM柠檬酸和2％右旋糖，pH 4.5)中。当分析健康志愿者血浆时，使用包含蛋白酶抑制剂混合物的管的采集方法防止了cHMWK的升高。

从该研究获得的结果显示，在健康受试者中，在将血液采集至定制管之后，cHMWK的水平在室温(RT)稳定(<5％)至少24小时，但是从商业销售商获得的血浆样品中，cHMWK水平升高(12％)，表明在检验接触途径激活时，优化血液采集技术的重要性。蛋白酶

也评估了从健康受试者的两个不同的临床部位(部位4和5)以及从商业销售商(部位1)采集至SCAT169管的血浆中的激肽原切割的作用(图3)。商业销售商直接将血液样品采集至SCAT 169管中，而不使用初始丢弃管。

也评估了从患有各种类型血管性水肿(I型/II型HAE、nC1-INH HAE和特发性AE)的受试者采集至SCAT169管中的血液样品中的激肽原切割。从健康受试者或在静息状态(基础)和发作(发作)期间从患有各种类型血管性水肿的受试者采集血浆，以测量各种疾病状态下cHMWK的量。与健康对照(n＝26)相比，在患有HAE的受试者(n＝21)的基线处，cHMWK百分数明显升高，但是在来自患有特发性血管性水肿(n＝4)或HAEnC1(n＝5)的受试者的血浆中没有明显升高(图4)，表明有限的血浆激肽释放酶活性，但是不排除在这些病症急性发作期间接触途径激活的作用。

被评价以检测cHMWK的血浆容易遭受由采集方法和管刺激的接触系统激活。总之，该研究提供了用于采集血浆样品以评估接触系统激活的改良方法，其避免了HMWK的离体切割。

实施例5：真空采血管评估人受试者的接触系统激活的内源水平的用途

评价专用采血管(SCAT159和SCAT153)在评估来自健康受试者和患有I型/II型遗传性血管性水肿(HAE)的那些受试者的血浆中切割的高分子量激肽原(cHMWK)的水平中的用途。

简言之，从健康受试者和在疾病静止(基础)和爆发(发作)期间从患有HAE的患者采集血液样品。使用蛋白质印迹测定检测血浆中2-链HMWK的百分数。从1b期、多中心、双盲研究的随机化患者采集血浆样品，所述患者患有I型/II型HAE，其在第0天和第15天，以30、100、300或400mg的闭合组(close groups)，接受2次皮下剂量的抗pKal抗体(DX-2930)或安慰剂。在抗pKal抗体(DX-2930)之前或之后，在第1、8、22、64、92和120天，获得血液样品。

如图5A中显示，从健康受试者的三个不同临床部位(A、B和C)采集的样品中血浆2-链HMWK水平的百分数随着使用的采集方法和管的类型不同而改变。相对于SCAT169管中的样品，使用柠檬酸钠管的样品具有更高水平的2-链HMWK。值得注意的是，与使用丢弃管的样品相比，被直接采集至SCAT169管中并且在包含蛋白酶抑制剂混合物的管之前不使用丢弃管的、在临床部位C采集的样品，具有更高水平的2-链HMWK。

类似地，如图5B中显示，与SCAT169管中采集的血浆相比，来自HAE的样品中血浆2-链HMWK水平的百分数在柠檬酸钠管中更高，这可能是由于与血浆采集和加工相关的接触系统的外源激活。

该研究证明了如本文所述的、使用包含蛋白酶抑制剂混合物的采血管的优势，并且提供了用于采集血浆样品以评价接触系统激活的改良方法，其避免了异常的离体接触系统激活(例如，通过HMWK的切割所证明)。

实施例6：真空采血管评估血浆药物水平的用途

通过常规实践，从接受DX-2930治疗的HAE患者和健康对照抽血，并且置入采集管中。在将初始血液样品置入一个或多个采集管之后，将5ml的随后的血液样品置入SCAT159或SCAT153管中。然后，在血液采集之后1小时内，加工血液样品，以产生血浆样品。

通过标准免疫测定(例如，ELISA)，测量SCAT血浆样品中DX-2930的量。简言之，将针对DX-2930的Fab形式的抗个体基因型单克隆抗体包被在96-孔板的表面上过夜，并且通过多次洗涤板来去除未结合的抗个体基因型Fab分子。然后，将SCAT血浆样品添加至板，将板在室温孵育2-3小时。将板洗涤数次，并且将针对DX-2930的生物素化IgG形式的抗个体基因型单克隆抗体添加至板，随后进行孵育步骤和洗涤步骤。然后，将辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素添加至板。孵育30’之后，再次洗涤板并且检验染料释放的信号。信号的强度对应血浆样品中DX-2930的量。

实施例7：真空采血管评估药物免疫原性的用途

如上所述，从采集至SCAT159或SCAT153管中的血液样品制备来自接受DX-2930治疗的HAE患者的血浆样品。通过固相萃取和酸解离(SPEAD)，分离血浆样品中的抗DX-2930抗体。

简言之，将血浆样品与生物素化的DX-2930一起孵育并且孵育过夜。接着，将混合物置入包被链霉抗生物素的板，以捕获结合至血浆样品中的抗DX-2930抗体(如果存在的话)的生物素化的DX-2930。然后，通过酸处理释放抗DX-2930抗体，并且将其直接涂覆在Meso Scale Discovery(MSD)板上。将钌标记的DX-2930添加至MSD板，并且测量电化学发光信号，以检测抗DX-2930抗体的存在。

其他实施方式

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或相似目的的可替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等同或类似特征的通用系列的实例。

通过上面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求书的范围内。

等同原则和范围

仅仅使用常规的实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的本公开的具体实施方式的许多等同方案。本公开的范围不旨在限于上述说明书，而是如在所附的权利要求中阐释的。

在权利要求中，冠词比如“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”可指一种或多种，除非相反指出或以其他方式由上下文显而易见。除非相反指出或以其他方式由上下文显而易见，如果一个、大于一个或所有的组成员出现、采用或以其他方式与给定产品或方法相关，则认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书是满足的。本公开包括其中组的一个确切成员出现、采用或以其他方式与给出产品或方法相关的实施方式。本公开包括其中大于一个或所有的组成员出现、采用或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方式。

此外，本公开包括其中来自一个或多个列举的权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语被引入另一权利要求中的所有变型、组合和排列。例如，取决于另一权利要求的任何权利要求可被修饰，以包括在取决于相同基础权利要求的任何其他权利要求中出现的一个或多个限制。在要素作为列表出现的情况下，例如，以马库什组形式，也公开了要素的各个子组，并且可从组中去除任何要素(一种或多种)。一般而言，应理解，在本公开，或本公开的方面被称为包括具体的要素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方式或本公开的方面由或基本上由这样的要素和/或特征组成。为了简化的目的，那些实施方式未在本文中明确阐释。也注意到，术语“包括”和“包含”旨在是开放式的并且允许囊括其他要素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指出或另外从上下文显而易见并且本领域普通技术人员理解，表达为范围的值可假定本公开的不同实施方式中该叙述范围内的任何具体的值或子范围，至该范围下限的十分之一界限，除非上下文明确相反指出。

本申请引用各种公布的专利、公开的专利申请、期刊文献和其他出版物，其所有通过引用并入本文。如果在任何并入的参考文献和本说明之间存在冲突，以本说明书为准。另外，落入现有技术内的本公开任何具体的实施方式可明确从权利要求的任何一项或多项中排除。因为这样的实施方式视为是本领域普通技术人员已知的，他们可被排除，即使该排除未在本文中明确阐释。本公开任何具体的实施方式可从任何权利要求中排除，出于任何原因，无论时候与现有技术的存在相关。

仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确认本文所述的具体实施方式的许多等同方式。本文所述的实施方式的范围不旨在限于上面的描述，而是如在所附的权利要求中阐释的。本领域技术人员认识到可对该描述做出各种改变和修饰，而不背离如下述权利要求中限定的本公开的精神和范围。

序列表

<110> 戴埃克斯有限公司

<120> 用于评估接触系统激活的含有蛋白酶抑制剂的真空采血管

<130> D0617.70109WO00

<140> 尚未指定

<141> 同时附上

<150> US 62/214,308

<151> 2015-09-04

<150> US 62/204,644

<151> 2015-08-13

<160> 1

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala

1 5 10 15

Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu

20 25 30

Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu

35 40 45

Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp

50 55

Claims

1.含有蛋白酶抑制剂的混合物、聚凝胺和EDTA的液体制剂在制备用于评估受试者的接触系统激活的内源水平的真空采血管中的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含苄脒、大豆胰蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽和4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐AEBSF，其中所述真空采血管包含所述液体制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述真空采血管是非玻璃管。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述真空采血管是塑料管。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含80-120mM苄脒、1-3mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、200-300μM亮抑酶肽和10-30mM AEBSF。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含100mM苄脒、2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、263μM亮抑酶肽和20mM AEBSF。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述液体制剂包含400μg/mL聚凝胺和20mM EDTA。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述液体制剂的pH是4-6。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述液体制剂的pH是4.5。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述真空采血管包含0.5ml的所述液体制剂。

10.如权利要求1所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物基本上不含在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂。

11.如权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述人受试者是患有与所述接触系统相关的疾病的人患者。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述疾病是遗传性血管性水肿HAE或特发性血管性水肿。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述人患者患有具有正常C1-抑制剂C1-INH的HAE。

15.权利要求11所述的用途，其中所述人受试者用靶向所述接触系统的组分的药物治疗。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述接触系统的组分是血浆激肽释放酶。

17.如权利要求16所述的用途，其中所述药物抑制活性血浆激肽释放酶。

18.如权利要求17所述的用途，其中所述药物是结合活性血浆激肽释放酶的抗体。

19.如权利要求1-10中任一项所述的用途，其中通过测量指示接触系统激活的一种或多种生物标志物的水平来评估受试者的接触系统激活的内源水平。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述一种或多种生物标志物选自前激肽释放酶、活性血浆激肽释放酶pKal、α2M-pKal复合物、活性因子XII、活性因子XI、高分子量激肽原HMWK和缓激肽代谢物。

21.如权利要求20所述的用途，其中所述一种或多种生物标志物包括切割的HMWK和/或完整的HMWK。

22.含有蛋白酶抑制剂的混合物、聚凝胺和EDTA的液体制剂在制备用于评估靶向受试者的接触系统的药物的水平的真空采血管中的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含苄脒、大豆胰蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽和4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐AEBSF，其中所述真空采血管包含所述液体制剂。

23.如权利要求22所述的用途，其中所述真空采血管是非玻璃管。

24.如权利要求22所述的用途，其中所述真空采血管是塑料管。

25.如权利要求22所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含80-120mM苄脒、1-3mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、200-300μM亮抑酶肽和10-30mM AEBSF。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含100mM苄脒、2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、263μM亮抑酶肽和20mM AEBSF。

27.如权利要求22所述的用途，其中所述液体制剂包含400μg/mL聚凝胺和20mM EDTA。

28.如权利要求22所述的用途，其中所述液体制剂的pH是4-6。

29.如权利要求22所述的用途，其中所述液体制剂的pH是4.5。

30.如权利要求22所述的用途，其中所述真空采血管包含0.5ml的所述液体制剂。

31.如权利要求22所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物基本上不含在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂。

32.如权利要求22-31中任一项所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

33.如权利要求32所述的用途，其中所述人受试者是患有与所述接触系统相关的疾病的人患者。

34.如权利要求33所述的用途，其中所述疾病是遗传性血管性水肿HAE。

35.如权利要求22-31中任一项所述的用途，其中所述药物抑制活性血浆激肽释放酶。

36.如权利要求35所述的用途，其中所述药物是结合活性血浆激肽释放酶的抗体。

37.含有蛋白酶抑制剂的混合物、聚凝胺和EDTA的液体制剂在制备用于评估靶向接触系统的药物的免疫原性的真空采血管中的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含苄脒、大豆胰蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽和4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐AEBSF，其中所述所述真空采血管包含所述液体制剂。

38.如权利要求37所述的用途，其中所述真空采血管是非玻璃管。

39.如权利要求37所述的用途，其中所述真空采血管是塑料管。

40.如权利要求37所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含80-120mM苄脒、1-3mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、200-300μM亮抑酶肽和10-30mM AEBSF。

41.如权利要求40所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物包含100mM苄脒、2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、263μM亮抑酶肽和20mM AEBSF。

42.如权利要求37所述的用途，其中所述液体制剂包含400μg/mL聚凝胺和20mM EDTA。

43.如权利要求37所述的用途，其中所述液体制剂的pH是4-6。

44.如权利要求37所述的用途，其中所述液体制剂的pH是4.5。

45.如权利要求37所述的用途，其中所述真空采血管包含0.5ml的所述液体制剂。

46.如权利要求37所述的用途，其中所述蛋白酶抑制剂的混合物基本上不含在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂。

47.如权利要求37-46中任一项所述的用途，其中受试者是人受试者。

48.如权利要求47所述的用途，其中所述人受试者是患有与所述接触系统相关的疾病的人患者。

49.如权利要求48所述的用途，其中所述疾病是遗传性血管性水肿HAE。

50.权利要求37-46中任一项所述的用途，其中所述药物抑制活性血浆激肽释放酶。

51.如权利要求50所述的用途，其中所述药物是结合活性血浆激肽释放酶的抗体。

52.权利要求37-46中任一项所述的用途，其中通过从血浆样品分离结合所述药物的抗体评估靶向接触系统的药物的免疫原性。

53.如权利要求52所述的用途，其中通过固相萃取和酸解离SPEAD测定分离所述抗体。