KR20180100107A - 접촉 시스템 활성화의 평가를 위한 프로테아제 저해제를 함유하는 진공 채혈관 - Google Patents
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Abstract
액체 형태의 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 진공 채혈관 및 대상체에서의, 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준, 치료 동안 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물의 내인성 수준 및/또는 이러한 약물의 면역원성을 포함하는, 접촉 시스템과 연관된 특징을 평가하기 위한 이의 용도가 본 명세서에 개시되어 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2015년 8월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/204,644호 및 2015년 9월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/214,308호의 출원일의 이익을 주장한다. 이 언급된 출원의 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
환자 혈장을 사용한 접촉 시스템 활성화의 생체내 수준의 정확한 측정은 혈액 수집 동안 생체외 활성화에 대한 경향으로 인해 도전적이다. 접촉 시스템과 연관된 소정의 질환, 예를 들어 유전성 혈관부종을 갖는 환자로부터의 혈액은 경로의 천연 저해제인 C1 저해제가 결핍되므로 특히 생체외 접촉 시스템 활성화가 되기 쉽다. 결과적으로, 경로 특이적 바이오마커(예를 들어, 2-사슬 고분자량 키니노겐)의 측정은, 혈액이 조심스럽게 수집되고 가공되지 않으면, 환자 내에 존재하는 접촉 시스템 활성화의 정도를 과대평가할 수 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 혈액 수집 동안 접촉 시스템의 생체외 활성화를 저해하는, 액체 제제 중의 프로테아제 저해제 혼합물(칵테일)을 함유하는 비유리 진공 채혈관(evacuated blood collection tube)의 개발에 기초한다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 진공 채혈관은 환자, 특히 이 경로의 천연 저해제(예를 들어, C1 저해제)가 결핍된 환자의 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준의 정확한 측정을 허용한다.
따라서, 본 개시내용의 일 양태는 수용액에서 안정한 프로테아제 저해제를 실질적으로 함유하지 않을 수 있는 프로테아제 저해제의 혼합물을 포함하는 액체 제제를 포함하는 진공 채혈관을 특징으로 한다. 관은 비유리 관일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 관은 플라스틱이다. 몇몇 실시형태에서, 진공 채혈관은 사용 시 10배로 희석될 수 있는 여기에 기재된 임의의 액체 제제의 0.5㎖를 함유한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 진공 채혈관 내의 프로테아제 저해제의 혼합물은 적어도 1종의 세린 프로테아제 저해제(예를 들어, 혈장 칼리크레인 저해제) 및 적어도 1종의 시스테인 프로테아제 저해제를 포함한다. 일 예에서, 프로테아제 저해제의 혼합물은 바이오티닐화될 수 있는 EPI-KAL2 및 류펩틴을 포함한다. EPI-KAL2의 양은 이를 함유하는 액체 제제 중에 5 내지 15μM의 범위일 수 있다. 대안적으로 또는 부가하여, 류펩틴의 양은 액체 제제 중에 200 내지 300μM의 범위일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 프로테아제 저해제의 혼합물은 적어도 2종의 세린 프로테아제 저해제를 포함할 수 있고, 이들 중 적어도 1종은 트립신 저해제, 예를 들어 대두 트립신 저해제이다. 몇몇 예에서, 프로테아제 저해제의 혼합물은 벤즈아미딘, 대두 트립신 저해제, 류펩틴 및 AEBSF를 포함한다. 몇몇 예에서, 진공 채혈관 내의 액체 제제는 80 내지 120mM의 벤즈아미딘, 1 내지 3㎎/㎖의 대두 트립신 저해제, 200 내지 300μM의 류펩틴, 및/또는 10 내지 30mM의 AEBSF를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 진공 채혈관 내의 액체 제제는 폴리브렌 및 EDTA를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 액체 제제는 4 내지 6(예를 들어, 4.5)의 pH를 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 대상체로부터의 혈액을 본 명세서에 기재된 임의의 진공 채혈관으로 수집하는 단계; (ii) 혈액을 가공 처리(processing)하여 혈장 샘플을 생성하는 단계; 및 (iii) 혈장 샘플에서의 접촉 시스템 활성화의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 측정 단계(단계 (iii))는 접촉 시스템 활성화를 나타내는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 바이오마커는 프리칼리크레인, 활성 혈장 칼리크레인(pKal), α2M-pKal 복합체, 활성 인자 XII, 활성 인자 XI, 고분자량 키니노겐(HMWK), 및/또는 브래디키닌 대사물질을 포함할 수 있다. 일 예에서, 하나 이상의 바이오마커는 절단된 HMWK 및/또는 온전한 HMWK를 포함한다.
더욱 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 접촉 시스템을 표적화하는 약물의 수준을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 대상체로부터의 혈액을 본 명세서에 기재된 바와 같은 진공 채혈관으로 수집하는 단계(여기서, 대상체는 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물이 투여됨); (ii) 혈액을 가공 처리하여 혈장 샘플을 생성하는 단계; 및 (iii) 혈장 샘플에서의 약물의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 접촉 시스템을 표적화하는 약물의 면역원성을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 대상체로부터의 혈액을 본 명세서에 기재된 바와 같은 진공 채혈관으로 수집하는 단계(여기서, 대상체는 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물이 투여됨); (ii) 혈액을 가공 처리하여 혈장 샘플을 생성하는 단계; 및 (iii) 혈장 샘플에서의 약물에 결합하는 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은, 단계 (iii) 전에, 혈장 샘플로부터 약물에 결합하는 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 항-약물 항체(anti-drug antibody: ADA)는 고상 추출 및 산 해리(solid phase extraction and acid dissociation: SPEAD) 검정에 의해 단리될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 대상체는, 몇몇 경우에,
접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물(예를 들어, 혈장 칼리크레인), 예를 들어 혈장 칼리크레인(예를 들어, 혈장 칼리크레인의 활성 형태)을 특이적으로 표적화하는 약물(예를 들어, 항체)에 의해 치료될 수 있는, 인간 환자일 수 있다. 몇몇 예에서, 혈액은 접촉 시스템과 연관된 질환, 예를 들어 유전성 혈관부종(hereditary angioedema: HAE) 또는 특발성 혈관부종을 갖는 인간 환자로부터 유래한다. 몇몇 경우에, 인간 환자는 일반 C1-저해제(C1-INH)를 갖는 HAE를 가진다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 진공 채혈관은 대상체로부터의 혈액에 의해 충전된 제1 관이 아닐 수 있다. 대안적으로 또는 부가하여, 공정 단계[단계 (ii)]는 혈액 수집 단계[단계 (i)] 후 1시간 내에 수행될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세내용은 하기 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이익은 하기 도면 및 몇몇 실시형태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구항으로부터 명확할 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 소정의 양태를 추가로 나타내도록 포함되고, 이 개시내용은 본 명세서에 제시된 구체적인 실시형태의 상세한 설명과 조합되어 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 양호하게 이해될 수 있다.
도 1은 SCAT169 및 SCAT153 관이 2-사슬 웨스턴 블롯 검정에서 측정된 바와 같은 접촉 활성화를 방지한다는 것을 보여주는 사진이다. 10% 엘라그산이 혈장에 첨가될 때, 접촉 시스템은 활성화되어서, 2-사슬 HMWK로의 1-사슬 HMWK의 전환을 발생시킨다(시트르산나트륨 혈장 참조). 반대로, SCAT169 및 SCAT153 혈장은 엘라그산의 첨가 전 및 후에 동일한 양의 1-사슬 HMWK를 함유한다.
도 2는 건강한 대상체로부터의 혈장에서의 샘플 수집 방법에 기초한 키니노겐 절단의 변동(퍼센트 2-HMWK/cHMWK)을 보여주는 그래프이다. K2EDTA(EDTA), 시트르산나트륨, SCAT169 또는 P100을 포함하는, 임상 수집 부위 및 수집에 사용된 관의 유형이 표시된다. 데이터 점의 그룹화는, 왼쪽으로부터 오른쪽으로, 부위 1: EDTA, 부위 2: 시트레이트; 부위 3: 시트레이트, 부위 4: 시트레이트, 부위 1: SCAT169, 부위 2: SCAT169, 부위 4: SCAT169, 부위 5: SCAT169, 및 부위 4: P100에 상응한다.
도 3은 상이한 임상 부위로부터의 건강한 대상체로부터 SCAT 169 관에 수집된 혈장에서의 키니노겐 절단(퍼센트 2-HMWK/cHMWK)을 보여주는 그래프이다. 데이터 점의 그룹화는, 왼쪽으로부터 오른쪽으로, 부위 1: 상업 판매자, 부위 4, 부위 5, 및 부위 4 및 5에 상응한다.
도 4는, I형 또는 II형 HAE, nC1-INH HAE 및 특발성 혈관부종(AE)을 갖는 대상체와 비교하여, 건강한 대상체에서의 키논겐 절단(퍼센트 2-HMWK/cHMWK)을 보여주는 그래프이다. 데이터 점의 그룹화는, 왼쪽으로부터 오른쪽으로, 건강한 대상체, HAE I/II 기저, HAE I/II 발작, HAE(nC1-INH) 기저, HAE(nC1-INH) 발작, 특발성 AE 기저 및 특발성 AE 발작에 상응한다.
도 5는 건강한 대상체 및 HAE를 갖는 환자로부터의 혈장에서의 2-사슬 HMWK 수준을 보여주는 그래프이다. a: 건강한 대상체로부터의 혈장 2-사슬 HMWK 수준의 백분율을 보여준다. 그래프에 표시된 바대로, 임상 부위 C는 SCAT169 혈장의 수집 전에 초기 폐기 관을 사용하지 않았다. b: HAE를 갖는 환자로부터의 혈장 2-사슬 HMWK 수준의 백분율을 보여준다.
도 1은 SCAT169 및 SCAT153 관이 2-사슬 웨스턴 블롯 검정에서 측정된 바와 같은 접촉 활성화를 방지한다는 것을 보여주는 사진이다. 10% 엘라그산이 혈장에 첨가될 때, 접촉 시스템은 활성화되어서, 2-사슬 HMWK로의 1-사슬 HMWK의 전환을 발생시킨다(시트르산나트륨 혈장 참조). 반대로, SCAT169 및 SCAT153 혈장은 엘라그산의 첨가 전 및 후에 동일한 양의 1-사슬 HMWK를 함유한다.
도 2는 건강한 대상체로부터의 혈장에서의 샘플 수집 방법에 기초한 키니노겐 절단의 변동(퍼센트 2-HMWK/cHMWK)을 보여주는 그래프이다. K2EDTA(EDTA), 시트르산나트륨, SCAT169 또는 P100을 포함하는, 임상 수집 부위 및 수집에 사용된 관의 유형이 표시된다. 데이터 점의 그룹화는, 왼쪽으로부터 오른쪽으로, 부위 1: EDTA, 부위 2: 시트레이트; 부위 3: 시트레이트, 부위 4: 시트레이트, 부위 1: SCAT169, 부위 2: SCAT169, 부위 4: SCAT169, 부위 5: SCAT169, 및 부위 4: P100에 상응한다.
도 3은 상이한 임상 부위로부터의 건강한 대상체로부터 SCAT 169 관에 수집된 혈장에서의 키니노겐 절단(퍼센트 2-HMWK/cHMWK)을 보여주는 그래프이다. 데이터 점의 그룹화는, 왼쪽으로부터 오른쪽으로, 부위 1: 상업 판매자, 부위 4, 부위 5, 및 부위 4 및 5에 상응한다.
도 4는, I형 또는 II형 HAE, nC1-INH HAE 및 특발성 혈관부종(AE)을 갖는 대상체와 비교하여, 건강한 대상체에서의 키논겐 절단(퍼센트 2-HMWK/cHMWK)을 보여주는 그래프이다. 데이터 점의 그룹화는, 왼쪽으로부터 오른쪽으로, 건강한 대상체, HAE I/II 기저, HAE I/II 발작, HAE(nC1-INH) 기저, HAE(nC1-INH) 발작, 특발성 AE 기저 및 특발성 AE 발작에 상응한다.
도 5는 건강한 대상체 및 HAE를 갖는 환자로부터의 혈장에서의 2-사슬 HMWK 수준을 보여주는 그래프이다. a: 건강한 대상체로부터의 혈장 2-사슬 HMWK 수준의 백분율을 보여준다. 그래프에 표시된 바대로, 임상 부위 C는 SCAT169 혈장의 수집 전에 초기 폐기 관을 사용하지 않았다. b: HAE를 갖는 환자로부터의 혈장 2-사슬 HMWK 수준의 백분율을 보여준다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 접촉 시스템 활성화를 방지하는 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 진공 채혈관의 개발에 기초한다. 환자 또는 건강한 지원자에서의 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 정확히 평가하기 위해, 혈액이 조심스럽게 수집되고 가공 처리되는 것이 중요하다. 하기 주의 중 하나 이상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 접촉 시스템과 연관된 특징의 정확한 평가를 보장하도록 취해질 수 있다:
(ⅰ)
본 명세서에 기재된 진공 채혈관은 혈액에 의해 충전된 제1 관이 아닌 것이 바람직함(이는 침에 의한 혈관 천자 후 국소 외상으로 인해 접촉 시스템 활성화의 상승을 나타낼 수 있음);
(ⅱ)
혈액은 유리와 접촉하지 않을 수 있음(플라스틱 관 또는 카테터 사용);
(ⅲ)
혈액은 수집 후 짧은 시간 기간(예를 들어, 약 1시간) 내에 혈장으로 가공 처리될 수 있음; 및/또는
(ⅳ)
채혈관 내의 프로테아제 저해제의 사용은 내인성 환자 상태의 정확한 결정을 마스킹하는, 생체외 접촉 활성화에 대해 혈장을 안정화시킬 수 있음.
본 명세서에 기재된 진공 채혈관의 이점은 적어도 (1) 표준화되고 단순화된 혈액 수집을 위한 진공 비유리(예를 들어, 플라스틱) 관의 사용; (2) 가수분해를 최소화하기 위한 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 액체 제제의 사용; (3) 수용액 중에 불안정한 프로테아제 저해제(예를 들어, PPACK II, H-D-Phe-Phe-Arg-클로로메틸 케톤으로도 공지됨)의 임의의 생략; 및 (4) 면역검정을 이용한 활성화된 혈장 칼리크레인의 검출을 허용하는 시약을 포함하는 관의 능력을 제공하는, 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 저해제, 예컨대 (바이오티닐화될 수 있는) EPI-KAL2의 포함을 포함한다. 예를 들어, WO 제95/21601호(이의 관련 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다.
이 연구로부터의 예상치 못한 관찰은 액체 형태의 프로테아제 저해제 칵테일의 사용이 용혈을 방지하거나 감소한다는 것이다. 혈액이 프로테아제 저해제의 동결건조된 제제를 함유하는 진공 관으로 수집될 때, 이것은 주로 용혈되고, 이는 소정의 분석물질 측정을 방해할 수 있다. 그러나, 혈액이 동일한 프로테아제 저해제 혼합물의 용액을 함유하는 진공 관으로 수집될 때, 이것은 용혈되지 않았다.
결과적으로, 본 명세서에 기재된 진공 관에 수집된 혈액 샘플로부터 가공 처리된 혈장 샘플에서의 접촉 시스템 활성화의 정도를 평가하는 것에 관한 측정은 상이한 질환을 갖는 환자로부터의 더 정확한 평가 수준을 제공한다. 접촉 활성화의 정확한 예측치를 얻는 것은 이 경로에 의해 잠재적으로 매개되고 따라서 접촉 시스템의 저해제에 의한 치료에 수정 가능한 질환 또는 상이한 질환을 갖는 환자의 하위집단의 확인을 허용할 수 있다.
추가로, 본 명세서에 기재된 진공 채혈관의 사용은 접촉 시스템에서의 단백질의 활성화된 형태(예를 들어, 혈장 칼리크레인, FXIIa 및 2-사슬 키니노겐)에 대한 치료학적 분자에 대한 약물 수준의 정확한 결정 및/또는 면역원성 평가가 수월하게 할 수 있다. 관은 활성화된 표적(예를 들어, FXIa 및 FIXa)의 생성에 칼슘을 요하지 않을 수 있는 접촉 시스템 활성화의 하류에서 활성화된 단백질에 표적화된 치료학적 분자에 대해 유사한 이점을 제공할 수 있다. 사용된 PK 및 면역원성 검정이 통상적으로 결합 부위(예를 들어, 치료학적 항체의 경우에 이디오타입)를 인식하는 면역검정이므로, 이 관의 이점은 주로 생물학적 치료학적 분자에 적용된다. 치료학적 표적이 생체외 활성화되면, 이것은 혈장에 존재하는 생물물질에 결합하고, 이로써 PK 및 면역원성 면역검정에서 검출을 마스킹할 수 있다. 관 내의 프로테아제 저해제는 표적 활성화를 방지할 수 있다. 액체 제제의 사용은 용혈을 방지하고, 이는 소정의 실험실 검정을 방해할 수 있다.
액체 제제에서의 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 진공
채혈관
진공 채혈관은 다양한 용도에 대해 혈액 샘플을 수집하기 위한 의학 실행에서 흔히 사용된다. 본 명세서에 기재된 관은 프로테아제 저해제의 혼합물(프로테아제 저해제 칵테일)을 포함하는 액체 제제를 포함하는 비유리 관일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로테아제 저해제 칵테일은 적어도 1종의 세린 프로테아제 저해제 및 적어도 1종의 시스테인 프로테아제 저해제를 포함할 수 있다. 적어도 1종의 세린 프로테아제 저해제는 혈장 칼리크레인 저해제일 수 있다. 이러한 프로테아제 저해제 칵테일은 다수(예를 들어, 2종, 3종, 4종 또는 5종)의 세린 프로테아제 저해제를 포함할 수 있고, 이들 중 적어도 1종은 트립신 또는 인간 플라스민 저해제일 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 프로테아제 저해제 칵테일은 수용액 중에 불안정한 프로테아제 저해제를 실질적으로 함유하지 않고, 즉 수용액 중에 불안정한 프로테아제 저해제의 활성은 프로테아제 칵테일의 총 저해 활성에 비해 비실질적이다 몇몇 경우에, 수용액 중에 불안정한 프로테아제 저해제의 양은 칵테일 중의 총 프로테아제 저해제의 5% (w/w) 미만, 예를 들어 2% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만일 수 있다. 몇몇 경우에, 프로테아제 저해제 칵테일은 수용액(예를 들어, 4 내지 6의 pH를 갖는 수용액) 중에 불안정한 프로테아제 저해제를 완전히 함유하지 않는다. 수용액 중에 안정하지 않은 프로테아제 저해제의 일 예는 H-D-Phe-Phe-Arg-클로로메틸 케톤으로도 공지된 PPACK II이다.
하기 표 1은, 본 명세서에 기재된 프로테아제 저해제 칵테일을 제조하기 위해 사용될 수 있는, 예시적인 세린 프로테아제 저해제, 시스테인 프로테아제 저해제 및 트립신 프로테아제 저해제를 수록한다.
몇몇 예에서, 진공 채혈관을 만드는 데 사용하기 위한 프로테아제 저해제 칵테일은, 적어도 1종(예를 들어, 1종, 2종 또는 3종)의 트립신/플라스민 저해제, 및 적어도 1종(예를 들어, 1종, 2종 또는 3종)의 시스테인 프로테아제 저해제를 포함할 수 있는, 적어도 1종(예를 들어, 1종, 2종 또는 3종)의 세린 프로테아제 저해제를 포함한다. 이러한 프로테아제 저해제 칵테일은 3종의 세린 프로테아제 저해제(예를 들어, 벤즈아미딘, AEBSF 및 트립신/플라스민 저해제, 예컨대 대두 트립신 저해) 및 1종의 시스테인 프로테아제 저해제(예를 들어, 류펩틴)를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 프로테아제 저해제 칵테일은 적어도 1종의 세린 프로테아제 저해제(예를 들어, 혈장 칼리크레인 저해제) 및 적어도 1종의 시스테인 프로테아제 저해제(예를 들어, 류펩틴)를 포함할 수 있다. 혈장 칼리크레인 저해제는 EPI-KAL2(Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp; 서열 번호 1)일 수 있고, 이것은, 예를 들어 관이 면역검정을 이용한 활성화된 혈장 칼리크레인의 검출을 허용하는 시약을 함유하는 능력을 제공하는, 재조합 프로테아제 저해제인 특이적 혈장 칼리크레인이다.
임의의 프로테아제 저해제 칵테일은 액체 제제를 형성하기에 적합한 용액 중에 용해될 수 있다. 적합한 용액은 트라이시트르산나트륨, 시트르산 및 덱스트로스를 포함할 수 있는 산-시트레이트-덱스트로스 용액일 수 있다. 용액은 약 4 내지 6, 4 내지 5, 4.5 내지 5.0, 또는 4.2 내지 4.7, 예를 들어 4.5의 pH 값을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0의 pH 값을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 용액은 약 4.5의 pH 값을 가진다. 액체 제제는 양이온성 중합체, 예컨대 헥사다이메트린 브로마이드 분자(폴리브렌(polybrene)(등록상표))를 추가로 포함할 수 있고, 이것은 메탈로프로테아제를 저해할 수 있는 음으로 하전된 표면 샌드 킬레이트제(예를 들어, EDTA)와의 상호작용에 의해 접촉 시스템 활성화를 감소시킬 수 있다.
칵테일에서의 프로테아제 저해제의 농도는, 실제로 희석 배수에 따라, 상응하는 프로테아제를 저해하는 데 있어서 사용하기 위한 이러한 저해제의 최종 농도보다 5배 또는 10배 더 높을 수 있다. 특정한 상업적인 프로테아제 저해제의 최종 농도는 당해 분야에 공지되어 있고, 제조사의 프로토콜로부터 얻어질 수 있다. 몇몇 예에서, EPI-KAL2의 농도는 5 내지 15μM(예를 들어, 5 내지 10μM, 7 내지 12μM, 또는 10 내지 15μM)의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, EPI-KAL2의 농도는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 약 15μM이다. 몇몇 예에서, 류펩틴의 농도는 200 내지 300μM(예를 들어, 200 내지 250μM, 240 내지 270μM, 또는 250 내지 300μM)의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 류펩틴의 농도는 약 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 약 300μM이다. 몇몇 예에서, 대두 트립신 저해제의 농도는 1 내지 3㎎/㎖(예를 들어, 1 내지 2㎎/㎖ 또는 2 내지 3㎎/㎖)의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대두 트립신 저해제의 농도는 약 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 약 3.0㎎/㎖이다. 몇몇 예에서, 벤즈아미딘의 농도는 80 내지 120mM(예를 들어, 80 내지 100mM 또는 100 내지 120mM)의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벤즈아미딘의 농도는 약 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 약 120mM이다. 몇몇 예에서, AEBSF의 농도는 10 내지 30mM(예를 들어, 10 내지 20mM 또는 20 내지 30mM)의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, AEBSF의 농도는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 약 30mM이다.
펩타이드 기반 프로테아제 저해제(예를 들어, EPI-KAL2)가 사용될 때, 이것은 종래의 방법론 후 바이오티닐화될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 저해제는 하기한 바대로 바이오티닐화될 수 있다. 간단히, 펩타이드 저해제는 적합한 용액, 예컨대 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에 용해될 수 있다. 새로 제조된 설포-NHS-LC-바이오틴은 펩타이드 저해제 용액에 첨가되고 적합한 시간 기간 동안 항온처리될 수 있다. 과도한 미반응 바이오틴 및 가수분해된 바이오틴은 스핀 탈염 칼럼을 이용하여 제거될 수 있다. 펩타이드 저해제의 표지는 ELISA에 의해 확인될 수 있고, 단백질 농도는 예를 들어 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 액체 제제는 일상적 방법, 예를 들어 적합한 용액으로 적절한 성분을 용해시키고 바람직하게는 비유리인 진공 채혈관에 위치시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 관은 -20℃에서 저장될 수 있고, 사용 전에 적합한 시간 기간 내에 얼음에서 또는 냉장 온도(예를 들어, 약 4℃)에서, 예컨대 냉장고에서 해동될 수 있다.
액체 형태의 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 진공
채혈관의
유용성
본 명세서에 기재된 임의의 진공 채혈관은, 접촉 시스템 활성화의 수준, 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물의 혈청 수준, 및/또는 이러한 약물의 면역원성(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 접촉 시스템과 연관된 내인성 특징을 분석하는 데 사용하기 위해, 대상체로부터 혈액 샘플을 수집하기 위해 사용될 수 있다. (예를 들어, 침에 의한 혈관 천자 후 국소 외상에 의한) 접촉 시스템의 생체외 활성화를 감소시키기 위해, 본 명세서에 기재된 진공 채혈관은 대상체로부터 혈액을 수집할 때 혈액에 의해 충전된 제1 관이 아닐 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 초기 혈액은 제1 관에 수집될 수 있고, 이것은 폐기될 수 있고, 이후 진공 채혈관은 후속하는 혈액 샘플을 수집하기 위해 사용되고, 이것은 분석에 사용될 수 있다. 제1 관은 일상적 실행에 사용되는 정기적인 채혈관일 수 있다.
혈액 수집 후, 혈액 샘플은 적합한 시간 기간(예를 들어, 1시간 이하) 내에 혈장 샘플을 생성하도록 가공 처리될 수 있다. 혈장 샘플은 초기 혈액 샘플이 얻어지는 대상체의 접촉 시스템과 연관된 특징을 평가하기 위해 추가의 분석으로 처리될 수 있다.
혈액 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같은 분석을 요하는 대상체로부터 수집될 수 있다. 몇몇 경우에, 대상체는 접촉 시스템과 연관된 질환을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 가질 위험에 있을 수 있는 인간 환자이다. 예를 들어, 인간 환자는 이전의 HAE 발생을 가질 수 있거나, HAE의 위험에 있을 수 있다. 인간 환자는, C1-INH가 결핍되거나 비통상적인 C1-INH를 생성하는, I형 또는 II형 HAE를 가질 수 있다. 대안적으로, 인간 환자는 C1-INH 결핍증과 연결되지 않은 III형 HAE를 가질 수 있다. 다른 예에서, 인간 환자는 이전의 특발성 혈관부종 발생을 가질 수 있거나, 특발성 혈관부종의 위험에 있을 수 있다. 이러한 인간 환자는 이전에 치료되거나, 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물(예를 들어, pKal 또는 FXIIa 또는 고분자량 키니노겐)에 의한 치료의 과정에 있을 수 있다.
ⅰ. 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준의 평가
일 양태에서, 본 명세서에 기재된 혈장 샘플은, 접촉 시스템과 연관된 질환(예를 들어, HAE 또는 특발성 혈관부종)을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 가질 위험에 있을 수 있는 인간 환자일 수 있는, 대상체의 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 평가하기 위해 분석될 수 있다. 이러한 인간 환자는 질환의 치료, 예를 들어 pKal 저해제(예를 들어, 항-pKal 항체)를 동반한 치료에 있을 수 있다. 다른 경우에, 이러한 인간 환자는 이러한 치료가 없을 수 있다. 대안적으로, 인간 대상체는 이러한 질환을 가지지 않는 건강한 대상체일 수 있다.
혈장 샘플의 접촉 시스템 활성화의 수준은 접촉 시스템 활성화를 나타내는 하나 이상의 바이오마커를 측정함으로써 결정될 수 있다.
혈장 칼리크레인(pKal)은 순환 시 1차 브래디키닌을 생성하는 효소이다. pKal의 활성화는 접촉 시스템 또는 XIIa 인자를 통해 발생할 수 있고, 이들 둘 다 유전성 혈관부종(HAE)과 연관된 질환 병리학과 연관된다. 혈장 칼리크레인은, 이의 기질 고분자량 키니노겐(HMWK)에 대부분 결합된, 프리칼리크레인이라 불리는 불활성 지모겐으로서 순환한다. 자극에 대한 반응에서, 프리칼리크레인은 절단되어 활성 혈장 칼리크레인을 형성한다. 칼리크레인의 이 활성화는 예를 들어 FXIIa로의 FXII의 활성화 후 XIIa 인자에 의해 또는 접촉 케스케이드의 이펙터에 의해 매개될 수 있다. 순환하는 프리칼리크레인의 대략 75 내지 90%는 HMWK의 도메인 6과의 비활성 부위 상호작용을 통해 HMWK에 결합되고, 이것은 절단된 HMWK 및 브래디키닌을 생성하도록 HMWK의 추가 분자를 가수분해할 것이다. 활성 혈장 칼리크레인은 2개의 부위에서 HMWK를 절단하여서, 통증, 염증, 부종 및 혈관신생의 중요한 매개자인 브래디키닌을 방출시킨다. 절단된 키니노겐인 다른 절단 생성물은 다이설파이드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산 사슬을 포함한다. Cugno et al., Blood (1997) 89:3213-3218.
환자 혈액 샘플에서 접촉 시스템 활성화의 수준을 평가하기(이에 따라 환자가 접촉 시스템의 수준 및/또는 활성의 상승, 예를 들어 pKal의 수준 또는 활성의 상승을 갖는지를 결정) 위해 사용될 수 있는 예시적인 바이오마커는 하기 표 2에 제공된다:
접촉 시스템 활성화를 나타내는 하나 이상의 바이오마커는 관례 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 정성적으로, 반정량적으로 또는 정량적으로 검출하기 위한 검정의 하나의 특히 적합한 유형은 면역검정이다. 면역검정은, 표적 분자(예를 들어, 접촉 시스템 활성화와 연관된 바이오마커 분자)가 표적 분자에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합제를 사용함으로써 검출되고/되거나 정량화되는 임의의 검정이다. 결합제는 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있는 항체일 수 있다. 면역검정은 경쟁적 또는 비경쟁적 면역검정일 수 있고, 균일한 또는 불균일한 면역검정일 수 있다. 예를 들어, 접촉 시스템 바이오마커를 검출하기 위한 면역검정은 효소 면역검정(enzyme immunoassay: EIA), 방사선면역검정(radioimmunoassay: RIA), 형광면역검정(fluoroimmunoassay: FIA), 화학발광 면역검정(chemiluminescent immunoassay: CLIA), 카운팅 면역검정(counting immunoassay: CIA), 면역효소측정 검정(immunoenzymometric assay: IEMA), 효소 연결 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 축면 유동 면역검정(lateral flow immunoassay), 샌드위치 면역검정, 이뮤노-PCR 검정, 근접성 결찰 검정(proximity ligation assay), 웨스턴 블롯 검정 또는 면역침전 검정일 수 있다. 본 명세서에 제공된 바이오마커를 검출하기 위한 추가의 적합한 면역검정은 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다. 그러나, 본 개시내용이 면역검정으로 제한되지 않고, 항체 또는 항원 결합 항체 단편에 기초하지 않은 검출 검정, 예컨대 질량 분광법이 본 명세서에 제공된 바와 같은 접촉 시스템 바이오마커의 검출 및/또는 정량화에 또한 유용하다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다.
본 명세서에 제공된 것과 같은 접촉 시스템 바이오마커의 검출 및/또는 정량화에 사용된 검출 검정의 유형은 몇몇 매개변수 중에 검정이 사용되는 특정한 상황(예를 들어, 임상 또는 조사 분야), 및 검출되는 바이오마커의 종류 및 수, 및 동시에 실행되는 환자 샘플의 종류 및 수에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 절단된 키니노겐(2-사슬 키니노겐)의 수준의 상승은 웨스턴 블롯 검정을 이용한 급성 HAE 삽화 동안 HAE 환자 또는 건강한 대상체로부터 수집된 혈장 샘플에서 검출될 수 있다. 웨스턴 블롯 검정이 복수의 샘플에서 접촉 시스템 바이오마커의 동시 분석을 허용하지만, 이것은 동시에 평가될 수 있는 바이오마커의 수에서 제한된다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 복수의 접촉 시스템 바이오마커이 단일 샘플 또는 다수의 샘플에서 분석될 때, 이러한 다중 분석에 적합한 검정이 바람직하다. 이러한 검정의 예는, 제한 없이, 펩타이드 마이크로어레이 및 랩-온-칩(lab-on-a-chip) 검정을 포함하고, 이것은 덜 확장 가능한 면역검정, 예컨대 웨스턴 블롯에 대안적인 높은 출력의 다중 준비를 제공하도록 설계된다.
몇몇 예에서, 혈장 샘플은 pKal 저해제 및/또는 접촉 시스템 활성인자의 존재 또는 부재 하에 다중웰 마이크로플레이트에 위치할 수 있다. 혼합물은 적합한 시간 기간(예를 들어, 2분) 동안 pKal의 라벨링된 펩타이드 기질의 존재 하에 얼음에서 배양될 수 있고, 옥수수 트립신 저해제(corn trypsin inhibitor: CTI)는 활성화 반응을 중지시키도록 혼합물에 첨가될 수 있다. 혼합물은 필요한 경우 희석될 수 있고, 단백질분해 활성은 형광성 펩타이드 기질의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 검정으로부터 얻은 결과는 혈장 샘플이 얻어지는 대상체의 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 결정하는 것에 의존될 수 있다. 이것은 또한, 사용되는 경우, pKal 저해제의 저해 활성을 결정하는 것에 의존할 수 있다.
ⅱ. 접촉 시스템을
표적화하는
약물의 내인성 수준의 평가
본 개시내용의 또 다른 양태는 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물의 수준의 결정을 위한 본 명세서에 기재된 진공 채혈관의 용도에 관한 것이다. 약물 수준은 약동학적 매개변수를 평가하는 데 필요하다. 예를 들어, 접촉 시스템이 혈장에서 혈장 칼리크레인 저해제(예를 들어, DX-2930)의 양의 결정을 위해 수집되는 혈장 샘플에서 생체외 활성화되면, 과량의 활성화된 혈장 칼리크레인은 약물에 결합하고, 이로써 검정에서 이의 검출을 마스킹할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 진공 채혈관은 예를 들어 대상체로부터 수집된 샘플에서 약물 수준을 더 정확히 예상하도록 사용될 수 있다.
이 방법을 실행하기 위해, 접촉 시스템의 성분(예를 들어, pKal)을 표적화하는 약물에 의해 치료된 대상체(예를 들어, 인간 환자)로부터 유래한 혈장 샘플은 본 명세서에 또한 기재된 방법에 따라 본 명세서에 기재된 진공 채혈관에 수집된 혈액 샘플로부터 제조될 수 있다. 혈장 샘플에서의 약물의 수준은 일상적 실행에 따라 측정될 수 있다. 몇몇 경우에, 약물 수준은 면역검정, 예를 들어 본 명세서에 기재된 것에 의해 측정될 수 있다.
ⅲ. 접촉 시스템을
표적화하는
약물의 면역원성의 평가
본 개시내용의 또 다른 양태는 접촉 시스템의 성분(예를 들어, pKal)에 대해 생물학적 저해제의 면역원성의 결정을 위한 진공 채혈관의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 순환의 혈장에서 과량의 약물의 존재 하에 약물에 대한 항체("ADA")를 측정할 수 있는 면역원성 검정을 개발하는 것이 흔한 실행이다. ADA를 측정할 수 있는 면역원성 검정에 대한 이 요건은 확실히, 수주의 반감기 및 순환에서 높은 약물 수준을 가질 수 있는, 치료학적 단일클론 항체에 대한 경우이다. 샘플에서 과량의 약물로 인한 방해를 극복하기 위해, 약물로부터 항-약물 항체를 분리하기 위한 기법을 수행한다. 이러한 항-약물 항체는 고상 추출 및 산 해리(SPEAD)에 의해 단리될 수 있고, 이것은 연장된 시간 기간 동안(보통 밤새) 혈장 샘플과의 약물의 바이오티닐화 형태의 항온처리, 이어서 스트렙타비딘 코팅된 플레이트를 사용한 항-약물 항체에 결합될 수 있는 바이오티닐화 약물의 단리가 수반된다. 이후, 플레이트를 산에 의해 처리하여 항-약물 항체를 방출한다. 방출된 항체를 검출을 위해 또 다른 검정 플레이트에서 직접적으로 코팅할 수 있다. 채혈관에서의 프로테아제 저해제의 부재 하에, 접촉 시스템은 생체외 활성화될 수 있어서, 활성 혈장 칼리크레인을 생성시킨다. 상기 기재된 산 방출 및 재코팅 단계 후, 활성 pKal 및 항-약물 항체 둘 다는 플레이트의 표면에 결합할 것이다. 항-약물 항체는 통상적으로 표지된 약물을 사용하여 검출되고, 이것은 또한 존재하는 경우 활성 pKal에 결합할 수 있어서, ADA 검정에서 거짓 양성 신호를 생성한다. 본 명세서에 기재된 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 진공 채혈관의 사용은 이 거짓 양성 신호를 방지할 수 있다.
일반 기법
본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않은 한, 당해 분야의 지식 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 완전히 설명되어 있다.
추가 노력 없이, 당해 분야의 숙련자가, 상기 설명에 기초하여, 본 발명을 이의 가장 완전한 정도로 이용할 수 있다고 생각된다. 따라서, 하기 구체적인 실시형태는 단지 예시적이고, 무엇이든 어떤 방식으로도 본 개시내용의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 인용된 모든 공보는 본 명세서에 언급된 목적 또는 대상을 위해 참고로 포함된다.
실시예
1
: 접촉 시스템 활성화를 방지하는 프로테아제 저해제 칵테일의 제조
접촉 시스템 활성화를 방지하는 프로테아제 저해제 칵테일을 개발하였다.
표준화되고 단순화된 혈액 수집에 진공 플라스틱 관을 사용하였다.
하기 2개의 프로테아제 저해제 칵테일은 가수분해를 방지하기 위해 액체 제제에 포함되었다:
1)
10X 프로테아제 저해제 칵테일 A: SCAT169
산-시트레이트-덱스트로스(100mM의 트라이시트르산나트륨, 67mM의 시트르산 및 2% 덱스트로스(pH 4.5)) 중에 용해된, 100mM의 벤즈아미딘, 400㎍/㎖의 폴리브렌, 2㎎/㎖의 대두 트립신 저해제, 20mM의 EDTA, 263μM의 류펩틴 및 20mM의 AEBSF(4-(2-아미노에틸) 벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드)를 함유하는(0.5㎖), 진공 5㎖의 총 용적 플라스틱 관.
2)
10X 프로테아제 저해제 칵테일 B: SCAT153
산-시트레이트-덱스트로스(100mM의 트라이시트르산나트륨, 67mM의 시트르산 및 2% 덱스트로스(pH 4.5)) 중에 용해된, 10μM의 바이오티닐화 EPI-KAL2, 400㎍/㎖의 폴리브렌, 20mM의 EDTA 및 263μM의 류펩틴을 함유하는(0.5㎖), 진공 5㎖의 용적 플라스틱 관.
바이오티닐화 EPI-KAL2는 프로테아제 저해제 칵테일 B(SCAT153)에 포함되었다. SCAT169(특수 응고 검정 관, 제제 169) 및 SCAT153(특수 응고 검정 관, 제제 153) 관을 2 내지 8℃에서 저장하였다.
실시예
2
:
SCAT169
및
SCAT153
관은 2-사슬
웨스턴
블롯
검정에 의해 표시된 바와 같이 접촉 시스템 활성화를
방지한다
SCAT169 또는 SCAT153 관에 수집된 혈장은, 웨스턴 블롯 분석에 의해 2-사슬 HMWK로의 1-사슬의 전환에 의해 측정된 바대로, 널리 공지된 접촉 시스템 활성인자인 엘라그산의 생체외 첨가에 의해 유도된 접촉 시스템 활성화를 차단하였다(도 1).
시트르산나트륨 관(응고 측정을 위해 임상 화학 실험실에서 사용된 표준 관), SCAT169 관 및 SCAT153 관의 3개의 상이한 채혈관에 수집된 혈장 샘플 사이에 관찰된 엘라그산 유도된 접촉 시스템 활성화를 비교하였다.
1-사슬 HWMK는 시트르산나트륨 관에서 엘라그산에 의해 활성화된 샘플에서 본질적으로 완전히 소모되고, 2-사슬 HMWK의 출현이 관찰되었다.
반대로, 1-사슬 HMWK는 SCAT169 및 SCAT153 관으로부터의 엘라그산 활성화된 혈장에서 보존되었다.
이 결과는 SCAT169 및 SCAT153 관이 혈장 샘플 수집 및 가공 처리 동안 발생할 수 있는 생체외 접촉 시스템 활성화를 방지하는 데 있어서 효과적이라는 증거를 제공하였다.
실시예
3
:
SCAT169
및
SCAT153
프로테아제 저해제 칵테일은 혈장 응고 시간을
증가시킨다
3개의 개별 공여자 샘플(표 1)에 대해 시트르산나트륨 관, SCAT169 관 및 SCAT153 관의 3개의 상이한 채혈관에서 처리된 샘플에서 혈장 응고 시간을 측정하였다.
프로트롬빈 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴을 통해 보이는 것처럼, 응고 시간은 시트르산나트륨과 비교하여 SCAT159 및 SCAT153을 갖는 샘플에서 증가하였다. 결과는 하기 표 3에 제공된다.
실시예
4
: 인간
대상체에서의
접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 평가하기 위한 진공
채혈관의
용도
접촉 시스템 활성화의 혈장 바이오마커의 조사는 혈액 수집 및 가공 처리 동안 우연한 활성화로 인해 도전적이다. 이 연구에서, 건강한 대상체 및 I/II형 유전성 혈관부종(HAE), 특발성 혈관부종 또는 정상 C1-INH를 갖는 HAE(HAEnC1, nC1-INH라고도 칭함)를 갖는 사람으로부터의 혈장에서의 절단된 고분자량 키니노겐(cHMWK)의 수준을 평가하는 데 있어서의 특수 채혈관(SCAT159 및 SCAT153)의 유용성은 하기와 같이 조사되었다.
혈액 샘플링 동안 접촉 경로의 인공 활성화를 피하기 위해, 연구는 프로테아제 저해제를 함유하는 맞춤 관 및 표준화된 혈액 수집 기법을 이용하였다. 건강한 대상체 및 상기 기재된 질환 대상체로부터 (질환 정지 및 폭발의 기간 동안) 혈액 샘플을 수집하여, 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 cHMWK의 백분율을 평가하였다. 버터플라이형 침형 시스템을 갖는 카테터를 사용하여 혈액 샘플을 SCAT159 또는 SCAT153 관(5㎖ 총 용적, 0.5㎖의 10X 프로테아제 저해제 칵테일)에 위치시켰다. 이후, 혈액 샘플을 가공 처리하여 혈액 수집 후 1시간 내에 혈장 샘플을 생성하였다.
SCAT 관 혈장 샘플을 심플 웨스턴(SBHD) 및 웨스턴 블롯(TGA)에 의해 분석하여, 예를 들어 WO 2015/061183에 개시된 방법에 따라 혈장 샘플 내의 절단된 키니노겐(2-사슬 키니노겐)의 수준을 결정하였다.
혈장으로 가공 처리하기 전에 다양한 항응고제, 프로테아제 저해제 또는 단백질 안정화제를 함유하는 플라스틱 채혈관으로 임상 부위 1 내지 5에서 건강한 대상체로부터 혈장을 수집하였다. 구체적으로, 관의 유형은 K2EDTA, 시트르산나트륨, SCAT169 또는 P100(BD Biosciences)이었다. 도 2에 도시된 바대로, 생체외 접촉 시스템 활성화를 최소화하는 것으로 밝혀진 관은 프로테아제 저해제를 함유하고, P100 관 또는 SCAT169 관이었고, 이것은 산-시트레이트-덱스트로스(100mM의 트라이시트르산나트륨, 67mM의 시트르산 및 2% 덱스트로스(pH 4.5)) 중에 용해된, 100mM의 벤즈아미딘, 400㎍/㎖의 폴리브렌, 2㎎/㎖의 대두 트립신 저해제, 20mM의 EDTA, 263μM의 류펩틴 및 20mM의 AEBSF의 0.5㎖의 10X 농축 혼합물을 함유하는 5㎖의 용적 플라스틱 진공 채혈관이다. 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 관을 사용한 수집 방법은 건강한 지원자 혈장이 평가될 때 cHMWK의 상승을 방지하였다.
이 연구로부터 얻은 결과는, 건강한 대상체에서, cHMWK의 수준이 커스텀 관으로부터의 혈액 수집 후 적어도 24시간 동안 실온(RT)에서 안정하지만(<5%), cHMWK의 수준은 상업 판매자로부터 얻은 혈장 샘플에서 상승한다(12%)는 것을 보여주어서, 접촉 경로 활성화를 조사할 때 혈액 수집 기법을 최적화하는 것의 중요성을 입증한다. 프로테아제
2개의 상이한 임상 부위(부위 4 및 5) 및 상업 판매자(부위 1)로부터의 건강한 대상체로부터의 SCAT169 관에 수집된 혈장에서의 키니노겐 절단의 효과를 또한 평가하였다(도 3). 상업 판매자는 초기 폐기 관이 없는 SCAT 169 관으로 직접적으로 혈액 샘플을 수집하였다.
혈관부종의 유형(I/II형 HAE, nC1-INH HAE 및 특발성 AE)을 갖는 대상체로부터의 SCAT169 관에 수집된 혈액 샘플에서 키니노겐 절단을 또한 평가하였다. 다양한 질환 상태에서 cHMWK의 양을 측정하기 위해 정지 상태(기저) 및 발작(발작) 동안 둘 다에서 혈관부종의 다양한 유형을 갖는 대상체 또는 건강한 대상체로부터 혈장을 수집하였다. 특발성 혈관부종(n=4) 또는 HAEnC1(n=5)을 갖는 대상체로부터의 혈장에서가 아니라 건강한 대조군(n=26)과 비교하여 HAE를 갖는 대상체(n=21)에서의 기저에서 cHMWK 백분율은 명확히 상승하여서(도 4), 이 장애에서의 급성 발작 동안의 접촉 경로 활성화의 역할을 배제하지 않더라도 제한된 혈장 칼리크레인 활성을 제안한다.
cHMWK의 검출에 평가된 혈장은 수집 방법 및 관에 의해 자극된 접촉 시스템 활성화가 되기 쉽다. 종합하면, 이 연구는 생체외 HMWK의 절단을 방지하는, 접촉 시스템 활성화의 평가를 위한 혈장 샘의 수집을 위한 개선된 방법을 제공한다.
실시예
5
: 인간
대상체에서의
접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 평가하기 위한 진공
채혈관의
용도
건강한 대상체 및 I/II형 유전성 혈관부종(HAE)을 갖는 사람으로부터의 혈장 내의 절단된 고분자량 키니노겐(cHMWK)의 수준을 평가하는 데 있어서의 유용성에 대해 특수 채혈관(SCAT159 및 SCAT153)을 평가하였다.
간단히 말하면, 질환 정지(기저) 및 폭발(발작)의 기간 동안 건강한 대상체 및 HAE를 갖는 환자로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 혈장 내의 2-사슬 HMWK의 백분율을 검출하였다. 30, 100, 300 또는 400㎎의 근접 그룹 또는 위약에서 0일 및 15일에 2 피하 용량의 항-pKal 항체(DX-2930)를 받은 HAE I/II형을 갖는 무작위화된 환자의 1b상 다기관, 이중 맹검 연구로부터 혈장 샘플을 수집하였다. 1일, 8일, 22일, 64일, 92일 및 120일에 항-pKal 항체(DX-2930) 전에 및 후에 혈액 샘플을 얻었다.
도 5a에 도시된 바대로, 3개의 상이한 임상 부위(A, B 및 C)로부터 수집된 건강한 대상체로부터의 샘플 내의 혈장 2-사슬 HMWK 수준의 백분율은 사용된 관의 유형 및 수집 방법에 따라 변했다. 시트르산나트륨 관을 사용한 샘플은, SCAT169 관 내의 샘플에 비해, 더 높은 수준의 2-사슬 HMWK를 가졌다. 특히, SCAT169 관으로 직접적으로 수집되고, 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 관 이전에 폐기 관을 사용하지 않은, 임상 부위 C에서 수집된 샘플은, 폐기 관을 사용한 샘플과 비교하여, 더 높은 수준의 2-사슬 HMWK를 가졌다.
유사하게, 도 5b에 도시된 바대로, HAE로부터의 샘플 내의 혈장 2-사슬 HMWK 수준의 백분율은, 아마도 혈장 수집 및 가공 처리과 연관된 접촉 시스템의 외인성 활성화로 인해, SCAT169 관에 수집된 혈장과 비교하여 시트르산나트륨 관에서 더 높았다.
이 연구는 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 채혈관을 사용하는 것의 이점을 입증하고, 접촉 시스템 활성화의 평가를 위한 혈장 샘플의 수집을 위한 개선된 방법을 제공하고, 이것은 (예를 들어, HMWK의 절단에 의해 나타난) 생체외 비정상 접촉 시스템 활성화를 방지한다.
실시예
6
: 혈장 약물 수준을 평가하기 위한 진공
채혈관의
용도
일상적 실행에 의해 DX-2930에 의해 치료된 HAE 환자 및 건강한 대조군으로부터 혈액을 수집하고 채혈관에 위치시켰다. 1개의 또는 다수의 채혈관에서 초기 혈액 샘플을 위치시킨 후, 5㎖의 하기 혈액 샘플을 SCAT159 또는 SCAT153 관에 위치시켰다. 이후, 혈액 샘플을 가공 처리하여 혈액 수집 후 1시간 내에 혈장 샘플을 생성하였다.
SCAT 혈장 샘플에서의 DX-2930의 양을 표준 면역검정, 예를 들어 ELISA에 의해 측정하였다. 간단히, DX-2930에 대한 항이디오타입 단일클론 항체의 Fab 버전을 밤새 96웰 플레이트의 표면에 코팅하고, 플레이트를 수회 세척함으로써 비결합된 항이디오타입 Fab 분자를 제거하였다. 이후, SCAT 혈장 샘플을 플레이트에 첨가하고, 이것을 2 내지 3시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 수회 세척하고, DX-2930에 대한 항이디오타입 단일클론 항체의 바이오티닐화 IgG 버전을 플레이트에 첨가한 후, 항온처리 단계 및 세척 단계가 후행하였다. 이후, 겨자무과산화효소 접합된 스트렙타비딘을 플레이트에 첨가하였다. 30' 항온처리 후, 플레이트를 다시 세척하고, 염료에 의해 방출된 신호에 대해 조사하였다. 신호의 강도는 혈장 샘플 내의 DX-2930의 양에 상응한다.
실시예
7
: 약물 면역원성을 평가하기 위한 진공
채혈관의
용도
DX-2930에 의해 치료된 HAE 환자로부터의 혈장 샘플을 상기 개시된 바대로 SCAT159 또는 SCAT153 관에 수집된 혈액 샘플로부터 제조하였다. 혈장 샘플에서의 항-DX-2930 항체를 고상 추출 및 산 해리(SPEAD)에 의해 단리하였다.
간단히 말하면, 혈장 샘플을 바이오티닐화 DX-2930과 항온처리하고 밤새 항온처리하였다. 이후, 혼합물을 스트렙타비딘에 의해 코팅된 플레이트에 위치시켜 바이오티닐화 DX-2930을 포획하고, 이것은 있다면 혈장 샘플에서 항-DX-2930 항체에 결합한다. 이후, 항-DX-2930 항체를 산 처리에 의해 방출시키고, Meso Scale Discovery(MSD) 플레이트에 직접적으로 코팅하였다. 루테늄 표지된 DX-2930을 MSD 플레이트에 첨가하고, 항-DX-2930 항체의 존재를 검출하도록 전기화학발광 신호를 측정하였다.
다른 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 대안적인 특징에 의해 대체되어 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공할 수 있다. 따라서, 달리 명확히 기재되지 않은 한, 개시된 각각의 특징은 오직 동등한 또는 유사한 특징의 총체적 시리즈의 유일한 예이다.
상기 설명으로부터, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 필수적인 특징을 쉽게 확신할 수 있고, 이의 사상 및 범위를 벗어남이 없이, 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 다양한 용법 및 조건에 적용하도록 이것을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시형태가 또한 청구범위 내에 있다.
균등물 및 범위
당해 분야의 당업자는 단지 일상적인 것에 지나지 않는 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 개시내용의 구체적인 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확신할 수 있을 것이다. 본 개시내용의 범위는 상기 설명을 제한하는 것으로 의도되지 않고, 오히려 첨부된 청구범위에 기재되어 있다.
청구항에서 "일", "하나" 및 "이것"과 같은 관사는, 반대를 표시되지 않는 한 또는 그렇지 않으면 문맥으로부터 명확하지 않은 한, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이의 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은, 반대를 표시되지 않는 한 또는 그렇지 않으면 문맥으로부터 명확하지 않은 한, 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 소정의 생성물 또는 방법에 존재하거나, 이들에서 사용되거나, 그렇지 않으면 이들과 관련되는 경우 충족되는 것으로 생각된다. 본 개시내용은 정확하게 그룹 구성원 중 하나가 소정의 생성물 또는 방법에 존재하거나, 이들에서 사용되거나, 그렇지 않으면 이들과 관련되는 실시형태를 포함한다. 본 개시내용은 그룹 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 소정의 생성물 또는 방법에 존재하거나, 이들에서 사용되거나, 그렇지 않으면 이들과 관련되는 실시형태를 포함한다.
더욱이, 본 개시내용은 하나 이상의 기재된 청구항으로부터의 하나 이상의 제한, 부재, 조항 및 설명적 용어가 또 다른 청구항으로 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속하는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 부재가 예를 들어 마쿠쉬 그룹 포맷으로 목록으로 제시되는 경우, 부재의 각각의 하위그룹이 또한 개시되고, 임의의 부재(들)는 그룹으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 양상이 특정한 부재 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 개시내용의 소정의 실시형태 또는 본 개시내용의 양상이 이러한 부재 및/또는 특징으로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 단순함의 목적을 위해, 이 실시형태는 본 명세서에 다른 말로 구체적으로 기재되어 있지 않다. 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적이고 부가적인 부재 또는 단계의 포함을 허용하는 것으로 의도된다는 것에 또한 주목한다. 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되지 않는 한 또는 그렇지 않으면 문맥 및 당해 분야의 당업자의 이해로부터 명확하지 않은 한, 범위로서 표시된 값은, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한, 범위의 하한의 단위의 10/1까지, 본 개시내용의 상이한 실시형태에서 기술된 범위 내의 임의의 특정한 값 또는 하위범위를 취할 수 있다.
본원은 다양한 등록 특허, 공개 특허 출원, 저널 논문 및 다른 공보(이들 모두 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 관한 것이다. 임의의 도입된 참조와 본 명세서 사이에 상충이 있는 경우, 명세서가 우세해야 한다. 또한, 선행 기술 내에 해당하는 본 개시내용의 임의의 특정한 실시형태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백히 배제될 수 있다. 이러한 실시형태가 당해 분야의 당업자에게 공지된 것으로 생각되므로, 이들은 본 명세서에 배제가 명백히 기재되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 특정한 실시형태는 선행 기술의 존재와 관련되든 또는 관련되지 않든, 임의의 이유로, 임의의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
당해 분야의 당업자는 단지 일상적인 것에 지나지 않는 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 특정한 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확신할 수 있을 것이다. 본 명세서에 기재된 본 실시형태의 범위는 상기 설명을 제한하는 것으로 의도되지 않고, 오히려 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 당해 분야의 당업자는 이 설명에 대한 다양한 변경 및 변형이 하기 청구항에 정의된 바대로 본 개시내용의 사상 또는 정신으로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Dyax Corp.
<120> EVACUATED BLOOD COLLECTION TUBES CONTAINING PROTEASE INHIBITORS
FOR THE ASSESSMENT OF CONTACT SYSTEM ACTIVATION
<130> WO2017/027771
<140> PCT/US2016/046681
<141> 2016-08-12
<150> US 62/204,644
<151> 2015-08-13
<150> US 62/214,308
<151> 2015-09-04
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 1
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala
1 5 10 15
Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu
20 25 30
Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu
35 40 45
Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp
50 55
Claims (48)
- 프로테아제 저해제의 혼합물을 포함하는 액체 제제를 포함하는, 진공 채혈관(evacuated blood collection tube).
- 제1항에 있어서, 상기 관은 비유리 관인, 진공 채혈관.
- 제2항에 있어서, 상기 관은 플라스틱 관인, 진공 채혈관.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 저해제의 혼합물은 적어도 1종의 세린 프로테아제 저해제 및 적어도 1종의 시스테인 프로테아제 저해제를 포함하는, 진공 채혈관.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 1종의 세린 프로테아제 저해제는 혈장 칼리크레인 저해제를 포함하는, 진공 채혈관.
- 제5항에 있어서, 상기 프로테아제 저해제의 혼합물은 EPI-KAL2 및 류펩틴을 포함하는, 진공 채혈관.
- 제6항에 있어서, 상기 액체 제제는 5 내지 15μM의 EPI-KAL2 및 200 내지 300μM의 류펩틴을 포함하는, 진공 채혈관.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 EPI-KAL2는 바이오티닐화된, 진공 채혈관.
- 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 저해제의 혼합물은 적어도 2종의 세린 프로테아제 저해제를 포함하고, 이들 중 적어도 1종은 트립신 저해제인, 진공 채혈관.
- 제9항에 있어서, 상기 프로테아제 저해제의 혼합물은 벤즈아미딘, 대두 트립신 저해제, 류펩틴 및 AEBSF를 포함하는, 진공 채혈관.
- 제10항에 있어서, 상기 액체 제제는 80 내지 120mM의 벤즈아미딘, 1 내지 3㎎/㎖의 대두 트립신 저해제, 200 내지 300μM의 류펩틴 및 10 내지 30mM의 AEBSF를 포함하는, 진공 채혈관.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 제제는 폴리브렌 및 EDTA를 추가로 포함하는, 진공 채혈관.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 제제는 4 내지 6의 pH를 갖는, 진공 채혈관.
- 제13항에 있어서, 상기 액체 제제는 4.5의 pH를 갖는, 진공 채혈관.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관은 0.5㎖의 액체 제제를 함유하는, 진공 채혈관.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 저해제의 혼합물은 수용액 중에 불안정한 프로테아제 저해제를 실질적으로 함유하지 않는, 진공 채혈관.
- 대상체에서 접촉 시스템 활성화의 내인성 수준을 평가하는 방법으로서,
(i) 대상체로부터의 혈액을 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 진공 채혈관으로 수집하는 단계;
(ii) 상기 혈액을 가공 처리(processing)하여 혈장 샘플을 생성하는 단계; 및
(iii) 상기 혈장 샘플에서의 접촉 시스템 활성화의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서, 단계 (i)에서, 상기 진공 채혈관은 상기 대상체로부터의 혈액에 의해 충전된 제1 관이 아닌, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 단계 (ii)는 단계 (i) 후 1시간 내에 수행되는, 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 인간 대상체는 상기 접촉 시스템과 연관된 질환을 갖는 인간 환자인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 질환은 HAE 또는 특발성 혈관부종인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 인간 환자는 정상 C1-INH를 갖는 HAE를 갖는, 방법.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 상기 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물에 의해 치료되는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 접촉 시스템의 성분은 혈장 칼리크레인인, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 약물은 활성 혈장 칼리크레인을 저해하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 약물은 활성 혈장 칼리크레인에 결합하는 항체인, 방법.
- 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)는 접촉 시스템 활성화를 나타내는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정함으로써 수행되는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 프리칼리크레인, 활성 혈장 칼리크레인(pKal), α2M-pKal 복합체, 활성 인자 XII, 활성 인자 XI, 고분자량 키니노겐(HMWK) 및 브래디키닌 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오마커는 절단된 HMWK 및/또는 온전한 HMWK를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 접촉 시스템을 표적화하는 약물의 수준을 평가하는 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 진공 채혈관으로 대상체로부터의 혈액을 수집하는 단계이되, 상기 대상체는 상기 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물이 투여되는, 상기 수집하는 단계;
(ii) 상기 혈액을 가공 처리하여 혈장 샘플을 생성하는 단계; 및
(iii) 상기 혈장 샘플에서의 상기 약물의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제31항에 있어서, 단계 (i)에서, 상기 진공 채혈관은 상기 대상체로부터의 혈액에 의해 충전된 제1 관이 아닌, 방법.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 단계 (ii)는 단계 (i) 후 1시간 내에 수행되는, 방법.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인간 대상체는 상기 접촉 시스템과 연관된 질환을 갖는 인간 환자인, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 질환은 HAE인, 방법.
- 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 활성 혈장 칼리크레인을 저해하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 약물은 활성 혈장 칼리크레인을 저해하는 항체인, 방법.
- 접촉 시스템을 표적화하는 약물의 면역원성을 평가하는 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 진공 채혈관으로 대상체로부터의 혈액을 수집하는 단계이되, 상기 대상체는 상기 접촉 시스템의 성분을 표적화하는 약물이 투여되는, 상기 수집하는 단계;
(ii) 상기 혈액을 가공 처리하여 혈장 샘플을 생성하는 단계; 및
(iii) 상기 혈장 샘플에서의 상기 약물에 결합하는 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제39항에 있어서, 단계 (i)에서, 상기 진공 채혈관은 상기 대상체로부터의 혈액에 의해 충전된 제1 관이 아닌, 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 단계 (ii)는 단계 (i) 후 1시간 내에 수행되는, 방법.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 인간 대상체는 상기 접촉 시스템과 연관된 질환을 갖는 인간 환자인, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 질환은 HAE인, 방법.
- 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 활성 혈장 칼리크레인을 저해하는, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 약물은 활성 혈장 칼리크레인에 결합하는 항체인, 방법.
- 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii) 전에, 상기 혈장 샘플로부터 상기 약물에 결합하는 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 항체는 고상 추출 및 산 해리(solid phase extraction and acid dissociation: SPEAD) 검정에 의해 단리된, 방법.
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