CN103959068B - 基于纤溶酶原激活物抑制剂－1的流产、早产治疗药 - Google Patents

基于纤溶酶原激活物抑制剂－1的流产、早产治疗药 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种诊断早产或流产的发病风险的方法，其特征在于，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度。详细而言，涉及一种特征在于在纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度低于正常孕妇的活性或浓度时判断为引起早产或流产的危险性高的、诊断早产或流产的发病风险的方法、早产或流产的发病风险诊断用试剂盒、及含有纤溶酶原激活物抑制剂－1的用于预防早产或流产的药物组合物。

Description

基于纤溶酶原激活物抑制剂－1的流产、早产治疗药
技术领域
本发明涉及一种诊断早产或流产的发病风险的方法，其特征在于，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度。详细而言，涉及一种特征在于在纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度低于正常孕妇的活性或浓度时判断为引起早产或流产的危险性高的诊断早产或流产的发病风险的方法、早产或流产的发病风险诊断用试剂盒、及含有纤溶酶原激活物抑制剂－1的用于预防早产或流产的药物组合物。
背景技术
作为早产及流产的主要原因，已知有绒毛膜下血肿。目前，针对绒毛膜下血肿进行了基于超声波断层法的图像诊断，但未确立血液学的诊断方法、治疗方法。因此，一旦绒毛膜下血肿发生并进展，则无法避免早产及流产。
纤溶酶原激活物抑制剂－1(Plasminogenactivatorinhibitor－1(PAI－1))是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor(SERPIN))超家族中的一员，是尿激酶型纤溶酶原激活物及组织型纤溶酶原激活物的主要的生理性的控制因子。大量研究显示PAI－1的水平上升与动脉血栓(非专利文献1)、癌患者的预后不良(非专利文献2)等若干病态相关联，由于PAI－1缺损的病例数少，因此关于PAI－1缺损的知识仍有限。本发明人等近年来报告了对人进行了遗传学鉴定的完全PAI－1缺损的案例(非专利文献3)。所述患者显示出大出血的倾向，这是目前为止的报告中在PAI－1缺损患者中也被观察到的倾向(非专利文献4)。
可成为出血原因的基因的变化与妊娠中的并发症相关联。上述关联的最显著的实例是先天性的无纤维蛋白原血症、先天性凝固因子XIII(FXIII)缺损，它们若维持不治疗的状态，则引起生殖器出血、妊娠6～8周时的自然流产(非专利文献5及6)。
非专利文献1:SeminThrombHemost2009；35:468-77
非专利文献2:ImmunolLett2008；118:116-24
非专利文献3:JThrombHaemost2011；9:1200-6
非专利文献4:NEnglJMed1992；327:1729-33
非专利文献5:CurrDrugTargets2005；6:535-9
非专利文献6:ObstetGynecolSurv2007；62:255-60
发明内容
本发明的目的在于提供绒毛膜下血肿的简便且精度高的新型诊断方法及治疗绒毛膜下血肿的方法，通过上述方法早期诊断由绒毛膜下血肿引起的早产及流产的发病风险，从而预防早产及流产。
本发明人等发现PAI－1缺损症的患者若妊娠则绒毛膜下血肿发病而流产，以及若对所述患者给予含有PAI－1的新鲜冷冻血浆则阻止绒毛膜下血肿的进展，可维持妊娠(ThrombosisResearch129:4,e161-e163)。进而，本发明人等基于上述知识，发现能够基于PAI活性判定由绒毛膜下血肿引起的流早产的发病危险性，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下[1]～[14]。
[1]一种诊断早产或流产的发病风险的方法，其特征在于，测定从受试者分离的血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度。
[2]如[1]所述的方法，其中，以优球蛋白溶解时间作为指标，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂活性。
[3]如[2]所述的方法，其中，在优球蛋白溶解时间为500分钟以下时，判断为引起早产或流产的危险性高。
[4]如[2]或[3]所述的方法，其中，在优球蛋白溶解时间为350分钟以下时，判断为引起早产或流产的危险性高。
[5]如[2]～[4]中任一项所述的方法，其中，还包括在血浆中添加钙、测定优球蛋白溶解时间的工序及求出不添加钙的情况下的优球蛋白溶解时间与添加了钙的情况下的优球蛋白溶解时间的比率的工序，基于该比率判断为引起早产或流产的危险性高。
[6]如[1]所述的方法，其中，通过使用了与纤溶酶原激活物抑制剂－1结合的抗体的免疫学测定方法，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂浓度。
[7]如[6]所述的方法，其中，通过ELISA法测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂浓度。
[8]如[6]所述的方法，其中，通过AlphaLISA法测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂浓度。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，早产或流产是由绒毛膜下血肿引起的早产或流产。
[10]一种早产或流产的发病风险诊断用试剂盒，含有包含α－凝血酶、及钙离子或高岭土的水溶液。
[11]一种早产或流产的发病风险诊断用试剂盒，含有与纤溶酶原激活物抑制剂－1结合的抗体。
[12]如[10]或[11]所述的试剂盒，其中，早产或流产是由绒毛膜下血肿引起的早产或流产。
[13]一种用于预防早产或流产的药物组合物，含有纤溶酶原激活物抑制剂－1。
[14]如[13]所述的药物组合物，其中，早产或流产是由绒毛膜下血肿引起的早产或流产。
若使用本发明，则可利用血液学方法并且定量地诊断一直以来只能利用基于超声波断层法的图像诊断进行诊断的绒毛膜下血肿及早产或流产的发病风险。因此，能够早期诊断早产或流产的发病风险及提高早产或流产的发病风险的诊断精度。另外，通过本发明，即使在发生了绒毛膜下血肿的情况下也能够维持妊娠、防止流早产。
附图说明
[图1]图1表示在PAI－1缺损症患者的三次妊娠过程中观察到的生殖器出血(G.B.)(g)、给予了的新鲜冷冻血浆(FFP)(U：1U＝从200mL的血液中分离的血浆)、及血浆D－二聚体浓度(μg/mL)。黑箭头表示流产日，白箭头表示进行了紧急剖宫产的时间。
具体实施方式
1.定义
“纤溶酶原激活物抑制剂－1(Plasminogenactivatorinhibitor－1(PAI－1))”是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor(SERPIN))超家族中的一员，是尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator(uPA))及组织型纤溶酶原激活物(tissuetypeplasminogenactivator(tPA))的主要的生理性控制因子。
“纤溶酶原激活物抑制剂－2(Plasminogenactivatorinhibitor－2(PAI－2))”是SERPIN超家族中的一员，是uPA及tPA的生理性控制因子。PAI－2来自胎盘，在非妊娠时基本未发现。
本发明中，所谓“纤溶酶原激活物抑制剂活性”、“PAI活性”及“PAI的活性”，是指PAI－1及PAI－2具有的、使纤溶酶原激活物失活而抑制纤维蛋白溶解系统(纤溶系统)的活性，表示PAI－1及PAI－2具有的纤溶抑制活性的总和。虽然妊娠中由胎盘也分泌PAI－2，但纤溶抑制活性即使在孕妇中也以PAI－1活性为主，因此在本发明中测定的PAI活性表示主要由PAI－1引起的活性。需要说明的是，纤溶酶原激活物抑制剂活性越高，纤溶系统越被强烈地抑制。
所谓“绒毛膜下血肿”，是从妊娠初期至中期经常被见到的、在胎盘与蜕膜之间出现的血肿，其特征在于，沿胎盘的边缘而形成。妊娠初期见到的绒毛膜下血肿大多自然消退，但也有持续至妊娠中期的情况。绒毛膜下血肿持续的情况下，由于不能抑制子宫收缩、生殖器出血增加、子宫内感染等而导致胎盘功能不全、流早产的概率升高。
本发明中，所谓“早产”是指在妊娠22周以后不足37周时生产，所谓“流产”是指妊娠不足22周时妊娠丧失。另外，本说明书中，指早产及流产时，也记作“流早产”。
本发明中，所谓“早产或流产的发病风险”或“流早产的发病风险”，是指用于判断受试者是否流早产的检查判定基准。流早产的发病风险越高，判断为流早产的可能性越高，该流早产的发病风险越低，判断为流早产的可能性越低或是正常的妊娠。
2.判定早产或流产的发病风险的方法
本发明涉及判定早产或流产的发病风险的方法，其特征在于，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度。
(1)血浆的分离
就本发明中测定的试样而言，通常从受试者采集血液，由所采集的血液制备血浆进行使用。采血可使用本领域公知的方法，只要是本领域技术人员则可适宜选择，优选凝血系统因子的保存良好的、作为抗凝剂使用柠檬酸钠的方法。本发明可将末梢血用作试样。作为制备血浆的方法，可使用离心等本领域公知的方法。取得的血浆可以冷冻保存至测定。
(2)纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度的测定
本发明中，作为测定纤溶酶原激活物抑制剂活性的方法，可使用本领域技术人员公知的方法、即优球蛋白凝块溶解时间(euglobulinclotlysistime(ECLT))的测定方法。此处，所谓优球蛋白凝块溶解时间，是测定直至在血浆优球蛋白成分分离中所制作的凝块自然溶解为止的时间，总括地表示主要由PAI－1和tPA的平衡决定的血浆所具有的纤溶活性。但是妊娠中由于由胎盘也分泌纤溶酶原激活物抑制剂－2，所以孕妇的ECLT中得到的结果严密地来说是纤溶酶原激活物抑制剂－1的活性与纤溶酶原激活物抑制剂－2的活性的总和。但是就纤溶抑制活性而言，即使对于孕妇来说也是以纤溶酶原激活物抑制剂－1活性为主，因此，在本发明中使用ECLT测定的PAI活性表示主要由PAI－1引起的活性。
优球蛋白凝块溶解时间的测定方法是除去抗纤溶酶并测定纤维蛋白的溶解时间的方法，只要是本领域技术人员则可适宜实施。具体而言，将血浆用乙酸缓冲液稀释并静置后，离心采集沉淀，将该沉淀用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Trisbuffer)混合而得到优球蛋白成分。在含有α－凝血酶及钙离子或者高岭土的溶液中添加优球蛋白成分的样品，测定沉淀的溶解时间。本发明中，将该溶解时间作为PAI活性的指标。优球蛋白凝块溶解时间越短PAI活性越低，即，表示纤溶活性高。
本发明的一个方案中，也可以求出不添加钙离子而测定的优球蛋白凝块溶解时间(RegularECLT)、与添加钙离子而测定的优球蛋白凝块溶解时间(添加Ca的ECLT)的比率，将该比率作为PAI活性的指标。需要说明的是，不添加钙离子的情况下的优球蛋白溶解时间通过将与上述同样地制备的优球蛋白成分的样品添加至含α－凝血酶的溶液中，测定沉淀的溶解时间而求出。
作为测定纤溶酶原激活物抑制剂浓度的方法，可使用本领域技术人员公知的方法，即，使用了抗PAI－1抗体的免疫学测定方法。具体而言，可使用蛋白免疫印迹(Westernblotting)法、免疫沉淀法、酶免疫测定法(EIA)、酶联免疫测定法(ELISA法)、荧光免疫测定法(FIA)、放射免疫测定法(RIA)、及AlphaLISA法(注册商标、PerkinElmer)等。
Alphalisa法是利用下述发光信号的分析方法，所述发光信号仅在结合至供体微珠(donorbeads)的分子与结合至受体微珠(acceptorbeads)的分子进行生物学相互作用而使得两种微珠(beads)接近了的状态时被检出。具体而言，在抗原存在下将这两种微珠紧密接近，基于激光的供体微珠的激发引起单线态氧分子的释放，其与受体微珠内的甲状腺素衍生物反应而开始进行化学发光反应，由该反应产生的发光能量转移至存在于相同微珠内的荧光物质，由此光被释放。因此，本发明中，若使用结合了抗PAI－1抗体的供体微珠及受体微珠进行AlphaLISA法，则能够定量PAI－1浓度。另外，本发明中，可以使抗PAI－1抗体及uPA分别结合至供体微珠或受体微珠，制备结合了抗PAI－1抗体的供体微珠及结合了uPA的受体微珠、或结合了uPA的供体微珠及结合了抗PAI－1抗体的受体微珠，使用所述微珠实施AlphaLISA法。此时，由于仅样品中具有活性的PAI－1与供体微珠及受体微珠结合，因此作为结果可测定PAI－1活性。
纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度的测定不限于上述方法，可使用能够测定该活性或浓度的本领域技术人员公知的方法。另外，也可利用多种上述测定方法。
(3)流早产的发病风险的判定
本发明人等发现PAI－1缺损症患者若妊娠则绒毛膜下血肿发病而流产；以及，若对所述患者给予含有PAI－1的新鲜冷冻血浆则阻止绒毛膜下血肿的进展，可维持妊娠。另外，明确了在所述患者中由于PAI－1缺损导致血液的纤溶系统异常亢进，卵膜与子宫的粘合性降低，发生绒毛膜下血肿。进而，本发明人等基于上述知识发现基于PAI活性或浓度能够诊断绒毛膜下血肿、以及能够判定由绒毛膜下血肿引起的流早产的发病危险性。
基于上述知识，本发明中，在通过上述方法测定的纤溶酶原激活物抑制剂活性或浓度低于正常孕妇的标准值－标准误差的情况下，判断为存在绒毛膜下血肿发病的可能性、受试者的流早产的发病风险高。
具体而言，使用优球蛋白凝块溶解时间作为指标的情况下，PAI活性低于正常孕妇血浆的情况下，例如优球蛋白凝块溶解时间为约500分钟以下、约400分钟以下、约350分钟以下、或约200分钟以下时，判断为受试者的流早产的发病风险高。使用不添加钙离子测定的优球蛋白凝块溶解时间(RegularECLT)、与添加钙离子测定的优球蛋白凝块溶解时间(添加Ca的ECLT)的比率(RegularECLT/添加Ca的ECLT)作为指标的情况下，例如为约5.0以下、约4.0以下、约3.0以下、或约1.5以下时，判断为受试者的流早产的发病风险高。
另外，使用纤溶酶原激活物抑制剂浓度作为指标的情况下，纤溶酶原激活物抑制剂浓度低于正常孕妇血浆的情况下，例如为正常孕妇的不足0.75倍、不足0.5倍、不足0.25倍、或不足0.1倍时，判断为受试者的流早产的发病风险高。通过ELISA法测定PAI－1浓度的情况下，PAI－1浓度例如为约4ng/ml以下、约3ng/ml以下、约2ng/ml以下、约1.6ng/ml以下、或约1ng/ml以下时，判断为受试者的流早产的发病风险高。根据AlphaLISA法测定PAI－1浓度的情况下，PAI－1浓度为例如约60ng/ml以下、约40ng/ml以下、约20ng/ml以下、或约10ng/ml以下时，判断为受试者的流早产的发病风险高。
本发明中，可以基于通过一种测定方法得到的PAI－1活性或浓度判定受试者的流早产的发病风险，也可以基于通过多种测定方法得到的PAI－1活性或浓度判定受试者的流早产的发病风险。
3.流早产的发病风险判定用试剂盒
本发明涉及的试剂盒只要是用于实施上述2.栏中说明的判定流早产的发病风险的方法即可，其中含有的具体的构成、材料、设备等没有特别限定。
在本发明的一个方案中，本发明的试剂盒含有包含α－凝血酶、及氯化钙等钙离子的水溶液或高岭土。进而，本发明的试剂盒也可以含有乙酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、及磷酸缓冲液等缓冲液。另外，本发明的试剂盒还可以含有装有柠檬酸钠缓冲液的采血管。
本发明的其他方案中，本发明的试剂盒含有针对抗纤溶酶原激活物抑制剂－1的抗体(一抗)。抗体只要是能够识别纤溶酶原激活物抑制剂－1的抗体即可，可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。另外，根据情况，也可使用抗体片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2等。进而，本发明的试剂盒也可含有固相载体、标准物质及二抗。另外，本发明的试剂盒还可以含有纤溶酶原激活物抑制剂－1的标准品、稀释液、缓冲液以及用于抗原抗体复合体的检测反应的底物及终止溶液。
作为固相载体，可以举出例如玻璃、塑料、天然或修饰纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、磁体、或本领域技术人员公知的其他适合材料形成的载体，作为该固相载体的形状，也可以制成例如板、孔、载玻片、微珠、粒子、管、纤维、膜的形状。另外，作为标准物质，只要是可用于免疫学的方法的物质则可以使用，可举出例如酶、荧光物质、发光物质等。抗体可以固定于固相载体。
就本发明的试剂盒而言，进一步地作为二抗可以含有与针对纤溶酶原激活物抑制剂－1的抗体结合的抗体、或识别与一抗识别的表位不同的表位的针对纤溶酶原激活物抑制剂－1的抗体。二抗可以被酶、放射性同位素、荧光色素、抗生物素、生物素等标记。
4.含有纤溶酶原激活物抑制剂－1的用于预防流早产的药物组合物
本发明的药物组合物中含有纤溶酶原激活物抑制剂－1(PAI－1)作为主成分。另外，本发明的药物组合物也可以以具有与PAI－1为同等以上的活性的突变型纤溶酶原激活物抑制剂－1(突变型PAI－1)作为主成分。此处，所谓“同等的活性”，是指PAI－1所具有的将纤溶酶原激活物失活而抑制纤溶系统的活性的强度实质上相同，所谓“突变型纤溶酶原激活物抑制剂－1”是指，野生型PAI－1的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的取代、缺失、添加或插入的PAI－1。上述所谓“1个或数个”是10以下的整数个，例如1～10个左右，优选1～5个左右。
另外，本发明的药物组合物中，只要不损害预防早产及/或流产这样的效果，则也可进一步含有药学上可接受的载体、或根据剂型不同而在该技术领域中通常使用的添加剂。作为添加剂，可含有例如着色剂、保存剂、风味剂、香味改善剂、提味改善剂、甜味剂、或稳定剂、其他药学上允许的添加剂。
本说明书中明确指出的引用的全部专利及参考文献的全部内容作为参照并入本说明书中。另外，作为本申请具有的优先权主张的基础的申请即日本专利申请2011-249523号(2011年11月15日申请)的说明书及附图中记载的全部内容作为参照并入本说明书中。
以下，通过实施例更详细地说明本发明，这些实施例不限定本发明。
实施例
1.PAI－1缺损症患者的妊娠过程
(1)第一次妊娠
患者为经历多次发作大量出血的47岁女性。最初的妊娠是26岁。妊娠过程顺利，胎儿至16周为止成长正常。妊娠16周结束时，观察到少量的生殖器出血，患者入院。患者的凝血酶原时间、活化部分促凝血酶原激酶时间、及血浆纤维蛋白原浓度在通常的范围内(分别为13.0秒、34.9秒、及165mg/dL)。但是，血浆D－二聚体浓度稍微上升(2.4μg/mL，通常的范围为＜0.5μg/mL)。需要说明的是，D－二聚体是基于纤溶酶的纤维蛋白分解产物，D－二聚体的监测是临床病态中采用的纤溶动态分析法之一。一周给予两次新鲜冷冻血浆(freshfrozenplasma(FFP))，控制生殖器出血，维持了妊娠。血浆D－二聚体浓度在妊娠18周结束时突然上升，在妊娠19周观察到大量的生殖器出血。在胎盘后方及周边未观察到无回声区(echo-freespace)，但发现胎儿的心搏停止，患者的子宫颈部完全打开。血浆D－二聚体浓度减少、生殖器出血在清除胎儿(220g)1周后停止。流产的胎儿为男婴，外貌正常。
(2)第二次妊娠
第二次妊娠是27岁时。患者于妊娠7周确认妊娠后立刻入住本发明人等的医院。于妊娠8周观察到少量的生殖器出血，但该妊娠至11周为止是顺利的。从妊娠11周结束开始，由于观察到持续但少量的生殖器出血，因此开始每周给予2～3次FFP。生殖器出血于妊娠20周停止，但继续给予FFP，妊娠得以稳定。于妊娠28周血浆D－二聚体浓度稍微上升，因此FFP的给予频率从每周2～3次改为隔天给予。但是，血浆D－二聚体浓度持续上升，于妊娠32周达到128μg/mL，通过超声波检查，诊断为发生伴随胎盘剥离的无法控制的子宫收缩。因此，进行紧急剖宫产，患者产下1736g的女婴。手术前后的失血量为4500mL，这通过给予42UFFP而得以控制。
(3)第三次妊娠
第三次妊娠是在29岁时。基于以前妊娠时的成功管理，患者于妊娠8周入院，开始连续给予FFP。FFP至妊娠16周为止为每周给予2次，至妊娠19周为止缓慢增加。在妊娠20周后，每日给予FFP。此次妊娠至妊娠24周为止是稳定的，但血浆D－二聚体浓度从妊娠25周开始持续上升，于妊娠27周达到57.9μg/mL，诊断为发生伴随胎盘剥离的无法控制的子宫收缩。因此，再次进行紧急剖宫产，患者产下978g的女婴。手术前后的失血量为1037mL。这两名女儿健康无症状。
(4)小结
上述结果显示PAI－1发挥对人的妊娠维持来说重要的作用。因此，认为PAI－1为低浓度可作为人自然流产及/或早产的危险因子。
2.PAI活性的测定
A.优球蛋白凝块溶解时间的测定方法
(1)PAI活性的测定法
将通过柠檬酸采血而得到的患者血液在3000g下离心10分钟，采集上清液，将其作为血浆样品。将该血浆用10mM、pH4.5的乙酸缓冲液稀释至20倍，于4℃静置1小时。之后在4℃、1500g下离心10分钟，采集沉淀，将该沉淀用0.1M、pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液混合。将其用作优球蛋白成分。
在α－凝血酶12.5U/ml(最终浓度)中添加优球蛋白成分的样品150μl。测定其沉淀的溶解时间(RegularECLT)。在α－凝血酶2.5.U/ml(最终浓度)、钙离子10mM(最终浓度)的溶液中添加优球蛋白成分的样品150μl。测定其沉淀的溶解时间(添加Ca的ECLT)。需要说明的是，也可以添加高岭土(与钙的浓度相同)来代替钙离子。
(2)PAI活性(优球蛋白溶解时间)
对于因绒毛膜下血肿导致了先兆早产或先兆流产的患者及正常孕妇，按照上述(1)的方法测定PAI活性(添加Ca的ECLT)。结果汇总于表1。上述患者血液均为从妊娠初期(～15周)的患者采集的血液。
[表1]
进而，针对绒毛膜下血肿的患者7名(其中，有早产史及/或流产史的患者为4名)、正常孕妇5名，根据与上述(1)相同的方法测定PAI－1活性(优球蛋白溶解时间)，结果汇总于表2。表2的测定值分别为优球蛋白溶解时间(RegularECLT)、添加了钙的情况下的优球蛋白溶解时间(添加Ca的ECLT)、和ECLT比率(RegularECLT/添加Ca的ECLT)。患者血液均为从妊娠初期(～15周)的患者采集得到的血液。
[表2]
(3)关于测定结果
由以上结果可知，在具有由绒毛膜下血肿导致的流产·早产的历史或标本采集时被诊断为绒毛膜下血肿的病例(病例1～7)中，与正常妊娠过程的病例相比，显示出优球蛋白溶解时间短的倾向。
对于孕妇来说，众所周知通常凝血系统亢进，纤溶系统被抑制，这有助于妊娠维持和分娩时的止血。另外，还已知纤溶系统的抑制倾向随着妊娠周数的增加而增强，认为正常妊娠病例的RegularECLT值非常大(显示＞1200)及随着妊娠周数的增加添加Ca的ECLT变大，反映出了该纤溶抑制。
相对于此，在病例1～7中优球蛋白溶解时间较短，未见到纤溶抑制效果如正常妊娠病例那种程度。由添加Ca的ECLT短，也能够推测PAI－1的活性低纤溶抑制未起作用。
由此认为，优球蛋白溶解时间为500分钟以下的患者的PAI－1活性低，绒毛膜下血肿发病的可能性高，存在早产·流产的发病风险。另外，认为优球蛋白溶解时间为350分钟以下的患者的早产·流产的发病风险高。
另外，对于优球蛋白溶解时间与添加钙时的缩短了的溶解时间的比率(RegularECLT/添加Ca的ECLT)为4.0以下的患者来说，认为PAI－1活性低，绒毛膜下血肿发病的可能性高，存在早产·流产的发病风险。认为上述比率为1.5以下的患者的早产·流产的发病风险高。
B.ELISA法
(1)PAI活性的测定法
将经柠檬酸采血得到的患者血液在3000g下离心10分钟，采集上清液，将其作为血浆样品。使用R&DSystems公司的人SerpinE1/PAI－1DuoSetKit，如下所述地测定PAI－1浓度(抗原值)。
将捕获抗体(来自小鼠的抗人SerpinE1抗体)用磷酸缓冲生理盐水稀释至4μg/mL，用该捕获抗体涂布微孔板的各孔。用含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水(以下称为R.D.)稀释在试剂盒中附带的重组人SerpinE1，稀释至20ng/mL～0.3125ng/mL，作为PAI－1标准溶液。将该标准溶液与患者血浆样品按照每孔100μL滴入到用捕获抗体涂布了的微孔板的各孔中，室温下静置2小时后，用洗涤缓冲液洗涤3次。用R.D.稀释试剂盒中附带的生物素化的来自山羊的抗人SerpinE1抗体，加热处理后添加2％正常山羊血清，配制400ng/mL的检测抗体溶液。将该检测抗体溶液按照每孔各100μL滴入到各孔中，室温下静置2小时后，用洗涤缓冲液洗涤3次。将带有链亲和素(Streptavidin)的HRP溶液按照每孔各100μL滴入到各孔中，避光并于室温下静置20分钟后，用洗涤缓冲液洗涤3次。之后，使板显色20分钟，添加反应终止液。使用酶标仪(microplatereader)在540nm的波长下滤光，在450nm的波长下测定吸光度。根据PAI－1标准溶液的已知浓度和吸光度，制作PAI－1浓度标准曲线，算出血浆样品的PAI－1浓度。
(2)PAI活性(PAI－1浓度)
对于由于绒毛膜下血肿导致了早产或流产的患者及正常孕妇，根据上述(1)的方法测定PAI－1浓度(抗原值)，结果汇总于表3。上述患者血液均是从妊娠初期(～15周)的患者采集得到的血液。需要说明的是，病例1是PAI－1缺损症的患者。
[表3]
(3)关于测定结果
由以上结果可知，在具有由绒毛膜下血肿导致的流产·早产的历史或标本采集时被诊断为绒毛膜下血肿的病例(病例1～7)中，与正常妊娠过程的病例相比，显示出通过ELISA法测定的PAI－1浓度低的倾向。
由此认为，使用ELISA法测定PAI－1浓度(抗原值)的情况下，PAI－1浓度为4ng/ml以下的患者的PAI－1活性低，绒毛膜下血肿发病的可能性高，存在早产·流产的发病风险。另外，对于PAI－1浓度(抗原值)为1.6ng/ml以下的患者，认为早产·流产的发病风险非常高。
C.AlphaLISA法
(1)PAI活性的测定法
AlphaLISA是使用了生物素化抗PAI－1抗体结合了的链亲和素供体微珠和抗PAI－1抗体化学结合了的AlphaLISA受体微珠的浓度测定法。若PAI－1结合于这两种微珠，则两种微珠接近，若照射680nm的激发光则供体微珠中的感光性物质将周围的氧变为单线态激发状态，在接近的受体微珠内引起化学反应，检测到波长615nm的发光。由于发光信号与样品中的PAI－1量成比例，因此通过利用了标准曲线的分析可进行PAI－1浓度的定量。
将经柠檬酸采血得到的患者血液在3000g下离心10分钟，采集上清液，将其作为血浆样品。针对该血浆，使用PerkinElmer公司的AlphaLISA人纤溶酶原激活物抑制剂－1(PAI－1)试剂盒(HumanPlasminogenActivatorInhibitor－1(PAI－1)Kit)，如下所述地测定PAI－1浓度。
用胎牛血清稀释试剂盒附带的AlphaLISA人PAI－1，配制1000ng/mL～0.003ng/mL的PAI－1标准溶液。另外，将患者血浆样品用胎牛血清稀释2倍。在微孔板中滴入5μL的PAI－1标准溶液和稀释过的血浆样品。进而，滴入10μL的AlphaLISA抗PAI－1受体微珠(Anti－PAI－1Acceptorbeads)(最终浓度10μg/mL)，于23℃静置30分钟。之后，滴入10μL的生物素化的抗PAI－1抗体(BiotynylatedAntibodyAnti－PAI－1)(最终浓度1nM)，静置60分钟。最后滴入25μL的涂覆了链亲和素的供体微珠(Streptavicin－coatedDonorbeads)(最终浓度40μg/mL)，避光后于23℃静置30分钟，之后照射680nm的激发光，得到被检测到的615nm的发光信号。基于来自PAI－1标准溶液的发光信号制作PAI－1浓度的标准曲线，算出血浆样品的PAI－1浓度。
(2)PAI活性(PAI－1浓度)
对于由于绒毛膜下血肿导致了早产或流产的患者(2名)及正常孕妇(2名)、非孕妇(2名)，根据上述(1)的方法测定了PAI－1浓度(抗原值)，结果汇总于表4。上述患者血液均是从妊娠初期(～20周)的患者采集得到的血液。需要说明的是，病例1是PAI－1缺损症的患者。
[表4]
(3)关于测定结果
由以上结果可知，与非孕妇相比，孕妇的PAI－1浓度高，在由绒毛膜下血肿导致的流产·早产例中，PAI－1浓度明显低。由此认为，使用AlphaLISA法测定PAI－1浓度(抗原值)的情况下，PAI－1浓度为60ng/mL以下的患者的PAI－1活性低，绒毛膜下血肿发病的可能性高，存在早产·流产的发病风险。另外，认为PAI－1浓度(抗原值)为20ng/mL以下的患者早产·流产的发病风险非常高。
(4)AlphaLISA法的改变
改变AlphaLISA中的PAI－1浓度测定法，使用生物素化uPA代替生物素化抗PAI－1抗体，由此，仅样品中的具有活性的PAI－1与供体微珠·受体微珠这两种微珠结合，结果，可测定PAI－1活性。认为通过使用该方法，可以以更高的灵敏度测定PAI－1活性，与之前记载的其他测定法同样，对于由绒毛膜下血肿引起的流产·早产的早期发现有用。
D.小结
综上可知，测定优球蛋白溶解时间的方法、测定PAI－1抗原值的方法的所有结果均表明PAI活性与由绒毛膜下血肿导致的流早产相关，PAI活性低于正常孕妇的情况下纤溶系统亢进，容易引起由绒毛膜下血肿导致的流早产。
此次的结果中，在ELISA法与AlphaLISA法之间在PAI－1浓度的测定值中确认到误差。认为其原因如下：根据测定法的不同得到良好的灵敏度的范围(测定可能区域)不同；测定时的标准曲线不同；免疫学方法中的使用抗体不相同等。此次，基于ELISA法的测定中利用的R&DSystems公司的人SerpinE1/PAI－1DuoSetKit的PAI－1浓度的测定区域为2ng/ml以上，此次的病例样品的测定结果均不在该区域内。
但是，在所有的测定法中，关于PAI－1活性与由绒毛膜下血肿导致的流早产相关这方面，均未显示出相矛盾的结果，因此认为PAI活性或浓度的测定对于预知由绒毛膜下血肿导致的流早产来说是有用的检查。
实施例中，作为本发明的判定早产或流产的发病风险的方法，例示了下述方法，即基于优球蛋白凝块溶解时间、不添加Ca的情况下和添加了Ca的情况下的优球蛋白凝块溶解时间之比、通过ELISA法测定的PAI－1浓度、及通过AlphaLISA法测定的PAI－1浓度评价PAI－1活性，判定早产或流产的发病风险的方法，但只要是能够测定孕妇的PAI－1活性或浓度的方法即可，不限于上述方法。
另外，判定早产或流产的发病风险的方法可以基于采用上述一种测定方法得到的PAI－1活性进行判定，也可以基于采用多种测定方法得到的PAI－1活性进行判定。
产业上的可利用性
若使用本发明，则可以利用血液学方法诊断一直以来只能通过基于超声波断层法的图像诊断进行诊断的绒毛膜下血肿，因此能够早期诊断及提高诊断的精度。另外，若使用本发明，则即使在发生绒毛膜下血肿的情况下也能够维持妊娠，防止流早产。

Claims (13)

1.测定纤溶酶原激活物抑制剂－1的活性或浓度的试剂在制造用于诊断早产或流产的发病风险的试剂盒中的用途，所述诊断包括下述步骤：
测定从受试者分离的血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂－1的活性或浓度的步骤，
上述活性或上述浓度低于规定值时判断为引起早产或流产的危险性高的步骤，
其中，早产或流产是由绒毛膜下血肿引起的早产或流产。
2.如权利要求1所述的用途，其中，以优球蛋白溶解时间作为指标，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂－1的活性。
3.如权利要求2所述的用途，其中，在优球蛋白溶解时间为500分钟以下时，判断为引起早产或流产的危险性高。
4.如权利要求2所述的用途，其中，在优球蛋白溶解时间为350分钟以下时，判断为引起早产或流产的危险性高。
5.如权利要求2～4中任一项所述的用途，其中，还包括在血浆中添加钙、测定优球蛋白溶解时间的工序及求出不添加钙的情况下的优球蛋白溶解时间与添加了钙的情况下的优球蛋白溶解时间的比率的工序，基于该比率判断为引起早产或流产的危险性高。
6.如权利要求1所述的用途，其中，通过使用了与纤溶酶原激活物抑制剂－1结合的抗体的免疫学测定方法，测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂－1的浓度。
7.如权利要求6所述的用途，其中，通过ELISA法测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂－1的浓度。
8.如权利要求6所述的用途，其中，通过AlphaLISA法测定血浆中的纤溶酶原激活物抑制剂－1的浓度。
9.如权利要求1所述的用途，其中，测定纤溶酶原激活物抑制剂－1的活性或浓度的试剂含有包含α－凝血酶、及钙离子或高岭土的水溶液。
10.如权利要求1所述的用途，其中，测定纤溶酶原激活物抑制剂－1的活性或浓度的试剂含有与纤溶酶原激活物抑制剂－1结合的抗体。
11.如权利要求8所述的用途，其中，使用结合了抗PAI－1抗体的供体微珠及结合了uPA的受体微珠、或结合了uPA的供体微珠及结合了抗PAI－1抗体的受体微珠实施AlphaLISA法。
12.如权利要求11所述的用途，其中，使用结合了uPA的供体微珠及结合了抗PAI－1抗体的受体微珠实施AlphaLISA法。
13.纤溶酶原激活物抑制剂－1在制造用于预防由绒毛膜下血肿引起的早产或流产的药物组合物中的用途。
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