CN101605907A - 血浆凝血酶调节蛋白活性功能测量的方法 - Google Patents

血浆凝血酶调节蛋白活性功能测量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外测量凝血调节蛋白功能活性的方法，其中所述方法包括定量来自生物样品的生物介质中，蛋白C在凝血酶辅助因子即凝血调节蛋白存在下，通过凝血酶向激活的蛋白C(PCa)的激活，所述方法包括向样品血浆中加入蛋白C系统激活所需的试剂、加入纯化的蛋白C并且还加入纤维蛋白聚合抑制剂。本发明还涉及该方法在检测凝集病理中的应用。

Description

血浆凝血酶调节蛋白活性功能测量的方法
发明领域
本发明涉及止血领域，特别涉及凝集失调。
本申请涉及测量生物样品中血浆凝血酶调节蛋白的功能活性的方法。
利用生物样品，特别是从患者采集的血液样品，体内进行本发明的方法。
本发明的方法允许测量血浆介质中凝血酶调节蛋白的功能活性。
特别是，本发明涉及测定血浆介质中凝血酶调节蛋白功能活性的方法，例如利用生色或荧光测定方法进行所述测定。
凝血酶调节蛋白(TM)是凝血酶受体蛋白聚糖，其形成内皮细胞膜的组成部分。它部分负责内皮抗凝血剂的特性，为557个氨基酸的蛋白，由三部分组成：与内吞作用的机制有关的C末端胞质内部分；疏水的膜内部分；以及由长肽链构成的N末端部分。后者含有4个区：Ser/Thr丰富区，紧跟着是6个结构域的区，所述结构域是表皮生长因子的同源物(EGF样)，疏水区以及最后是凝集素样区(图1)。
1981年，Owen W.G.和Esmon C T表征了凝血酶调节蛋白的功能活性(Proceedings of the National Academy of Science USA，1981，vol.78，pages 2249-52 and Journal of Biological Chemistry 1981 vol 256，pages6632-5)，证明血浆蛋白C被凝血酶调节蛋白催化的凝血酶激活为激活的抗凝血剂蛋白C。
Wen D Z等1987(Biochemistry，1987，vol 26，pages 4350-7)在EMBL参考号BC 035602下以及Weiler H.等(J.Thromb.Haemost.2003 July，1(7)：151-24)表征和鉴定了人凝血酶调节蛋白的编码序列。
TM存在于生物体所有血管(动脉、静脉、毛细血管)和淋巴管的表面，在血管化丰富的器官如胎盘和肺中特别丰富。角质细胞、成骨细胞、肾小球膜细胞、血小板和嗜中性粒细胞也表达TM。
TM合成的调节主要依赖循环AMP、TNFα，IL-1和视黄酸。
内皮细胞不分泌TM，且TM不被凝血酶降解。仅在内皮细胞的不同类型攻击(多核弹性蛋白酶；细胞因子、巨噬细胞、脂多糖等)的作用下，内皮TM可被切割成以可溶的形式释放入循环系统随后经肾脏清除的片段。一旦被切割，细胞的TM就成为可溶的即血浆形式的TM，使胞质区和中孔性区被删除(Ishiih et al，1985，J Clin Invest 76，2178)。对可溶的血浆TM(TMp)进行分析，构成了内皮损伤的优良标志物。
TM的主要功能是，通过各种机制对抗凝血酶的促凝血作用。当与TM结合后，凝血酶(Th)经历了构象修饰。它丧失凝血剂特性和对血小板和纤维白蛋原的亲和性。然而，它仍然可以被抗凝血酶III(ATIII)失活。在硫酸软骨素存在的情况下，使TM-Th复合物的形成去偶联。这些相互作用使TM清除在血浆中循环的Th。这种Tm-Th复合物能激活蛋白C，所述蛋白C在S蛋白存在的情况下，抑制因子Va和VIIIa；相互作用和反应的这种连续性，构成了蛋白C系统。TM-Th复合物在与内皮蛋白C受体(EPCR)结合的蛋白C激活以及与纤维蛋白溶解有关的血浆羧肽酶原TAFI(凝血酶可激活的纤维蛋白溶解抑制剂)的激活中起作用。最后，TM在ATIII的存在的情况下具有抗血栓形成活性。TM在炎症和细胞增殖/分化中的作用已经被诱发(图2)。
因此，凝血酶调节蛋白起凝集抑制剂的作用，特别是通过使蛋白C向激活的蛋白C(PCa)的激活加速，所述激活的蛋白C自身在S蛋白辅助因子存在的情况下，使凝集因子Va和VIIIa失活。
凝血酶调节蛋白的体内合成通过各种因子如AMPc、视黄素、甲状腺激素、以及高热而增强(Conway E M et al，1994，J Biol Chem，269，22804)。其他试剂诸如细胞因子IL-1、TNF、LPS和高半胱氨酸以及细胞内微生物(巨细胞病毒、疱疹、立克次氏体(rickettsies))，对其表达和活性具有副作用，因此导致内皮细胞促凝血活性的瞬时增加。
尽管可溶TM(TMs)的水平在新生儿中很高，但无论健康受试者是20岁还是60岁，年龄在他们中无影响，但个体的性别有影响，因为已经观察到男性具有显著高于女性的值。
与内皮攻击有关的TMs水平的升高不但在如DIVC、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和肾功能不全的许多病理中已有描述，也在子痫前期、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)、立克次体病、白塞病(Behcet′s disease)、高胱胺酸尿症(homocystinuria)中有描述。在患有肺动脉高血压(pulmonary arterial hypertension)的患者和处于黑素瘤过程中的患者的研究中，已经观察到水平降低。最后，TM基因的突变已有描述并且与TMs水平的降低有关。
在治疗水平上，已经证明，向动物灌注重组TM有效预防血栓形成的发生。
因为对凝集步骤的直接影响，特别是对蛋白C系统的激活，看起来有兴趣的是能测定凝血酶调节蛋白的功能活性。
现有技术已经提出了测定凝血酶调节蛋白活性的检测，但是它们仅实现细胞系统而未实现血浆系统中凝血酶调节蛋白活性的测定。近来，
Figure A20078004431100091
A K等(Joumal of Thrombosis and Hemostasis，2005，3：976-982)描述了血浆介质分析法。然而，这篇文章未提出TM的直接检测，而必需利用针对血浆凝血酶调节蛋白的单克隆抗体的分离(isolation)和分开(separation)的第一步。实际上，在
Figure A20078004431100092
A K等所述检测的第一步中，将可以稀释的检测血浆在孔内含有抗人凝血酶调节蛋白的单克隆抗体的微孔板(microplate)中孵育。在除去血浆后，洗涤微孔板的孔，以便仅保留已经与抗体结合的凝血酶调节蛋白的片段。在第二步中，向制备好的微孔板中的孔内加入获得激活的蛋白C所需的试剂。孵育后，生色或荧光测定底物可显示激活的蛋白C。
文章的作者得出结论，设计可直接测量血浆中凝血酶调节蛋白的活性而无需凝血酶调节蛋白的分离和分开步骤的检测，在将来是重要的。
因此，当前，分析血浆凝血酶调节蛋白完全属于可溶蛋白的抗原分析，其对应于切割的膜蛋白，所述切割的膜蛋白已经丧失了羧基末端胞质区和跨膜疏水区。TMs仍然保留了与凝血酶结合和激活蛋白C的能力，这些是定位于重复的EGF基元上的功能。
利用抗凝血酶调节蛋白抗体和可溶凝血酶调节蛋白之间的免疫反应的各种检测是可以利用的。例如，Diagnostica Stago提供了ELISA检测，分析凝血酶调节蛋白(
Figure A20078004431100093
Thrombomodulin)。
体外分析凝血酶调节蛋白功能活性的问题在于本发明为将其克服而进行的提议，即提出测量生物介质特别是血浆介质中凝血酶调节蛋白的功能活性的方法，即，允许体外分析包含于含有凝血酶调节蛋白的生物介质中的可溶凝血酶调节蛋白而无需将凝血酶调节蛋白与检测的生物介质特别是血浆的其他组分分开的方法。
换句话说，本发明提出在蛋白C系统激活所需的试剂存在的情况下，用于测量生物介质特别是血浆介质中凝血酶调节蛋白的检测。此外，本发明提出了检测，所述检测在生物介质特别是血浆介质中，在蛋白C激活所需的试剂的作用下，可以克服与样品凝集有关的问题。
本发明的方法以及用于实施该方法的装置限定为用于体外进行的生物医疗研究环境中。
扼要重述地，在由凝血酶调节蛋白和凝血酶(因子IIa)在血管内皮表面形成的复合物的作用下，体内发生蛋白C向PCa的激活。PCa随后与蛋白S复合，从而使其自身结合于血小板或内皮表面上的磷脂。这些PCa-PS-磷脂复合物催化因子Va和VIIIa的失活，由此减缓凝集现象。
因此，本发明涉及体外测量凝血酶调节蛋白功能活性的方法，所述测量在来自从患者采集的样品的生物介质中进行。根据本发明的特定实施方案，可允许测量生物介质中凝血酶调节蛋白活性的样品是血浆样品。根据本发明另一个特定实施方案，允许测量凝血酶调节蛋白活性的样品是全血或脑脊液(CRL)或羊水的样品。
本发明的体外分析方法包括，测量生物样品介质中蛋白C向激活的蛋白C(PCa)的激活，所述激活在凝血酶的作用下、在凝血酶辅助因子即来自样品的凝血酶调节蛋白存在的情况下进行。加入过量的纯化的蛋白C后，进行测量。也将蛋白C系统激活所需的其他试剂以及纤维蛋白聚合抑制剂加入样品中。
特别是，本发明涉及体外测量血浆凝血酶调节蛋白功能活性的方法，所述方法包括分析血浆介质中蛋白C通过凝血酶、在凝血酶辅助因子即所述血浆凝血酶调节蛋白存在的情况下，向激活的蛋白C(PCa)的激活。为了进行这种测量，向检测血浆中加入过量的纯化的蛋白C，称为纯化的外源蛋白C，以及蛋白C系统激活所需的试剂和纤维蛋白聚合抑制剂。
作为加入纯化的蛋白C的替代方法，可以加入TAFI(血浆羧肽酶U，其激活受凝血酶的催化，对于凝血酶调节蛋白是依附的)以便测量其激活的TAFI激活(TAFIa)。
活性的测量术语称为凝血酶调节蛋白功能活性的测量，因为其允许通过向介质特别是检测血浆中加入过量的蛋白C和蛋白C系统激活所需的试剂，测量生物介质特别是血浆介质中凝血酶调节蛋白的活性。将会观察到，在测量过程中，所用的过量蛋白C足以克服与检测介质中内源性蛋白C的存在有关的任何定量或定性不足。换句话说，术语“过量的外源蛋白C”意指，在实施本发明的过程中，以一定量加入外源蛋白C，以致其PCa激活的测量不依赖样品中蛋白C的量。
根据本发明特定实施方案，在血浆介质中进行的分析，是对从患者采集的生物样品中获得的血浆样品进行的。
根据本发明测量的血浆凝血酶调节蛋白是可溶蛋白(可溶凝血酶调节蛋白或TMs，术语也称为血浆凝血酶调节蛋白TMp)，其对应于切割的膜血浆凝血酶调节蛋白并因而与其胞质羧基末端区和跨膜疏水区分开。实际上，可溶凝血酶调节蛋保留了与凝血酶结合和将蛋白C激活为PCa的能力，因为这种激活功能位于蛋白的重复EGF基元上。
相反，当在LCR或羊水样品中测量凝血酶调节蛋白的活性时，凝血酶调节蛋白为完整的(未截短的)形式。
取决于本发明的各种实施模式，加入到检测血浆样品中的蛋白C系统激活所需的试剂主要是凝血酶(特别是纯化的人α凝血酶)和钙离子。
钙离子例如以CaCl2的形式提供。
此外，根据本发明测量血浆凝血酶调节蛋白的活性的方法包括，向检测样品中加入与凝血酶竞争并因而阻断纤维蛋白原向纤维蛋白转化的抑制剂。
根据本发明体外测量血浆凝血酶调节蛋白功能活性的方法包括：
●使凝血酶调节蛋白活性检测血浆样品与纯化的外源蛋白C、凝血酶、钙离子和纤维蛋白聚合抑制剂接触；
●孵育获得的介质，以便允许产生激活的蛋白C；
●激活的蛋白C的功能分析。
在本发明测量方法的特定实施方案中，通过对底物的活性，分析所形成的激活的蛋白C的量。特别是，这种底物是酶促底物，其可以是天然的或合成的；例如，其可以是生色或荧光测定底物。
用于分析PCa活性的适宜底物是蛋白底物，例如肽。
在本发明特定实施方案中，所测量的激活的蛋白C的酶促底物是意味着可以分析PCa酰胺水解活性的底物。特别地，它是生色底物或荧光测定底物。
可以列举的用于本发明环境中的适宜的合成底物是合成的寡肽底物。可以提到的实例是来自Diagnostica Stago的合成底物CBS 42.46(寡肽：THC-Pro-Arg-pNa)。生色底物的另一个实例是底物S-2366(寡肽pyro-Glu-Pro-Arg-pNa)或S-2238(寡肽H-D-Phe-Pip-Arg-pNa)。
在本发明的环境中，可以选择各种纤维蛋白聚合抑制剂。可以列举的实例是合成的肽抑制剂，如寡肽抑制剂H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH.AcOH(GPRP.AcOH)(来自Pentapharm的
Figure A20078004431100121
FG)。
在本发明特定实施方案中，测量血浆凝血酶调节蛋白功能活性的方法包括下列步骤：
a)使血浆样品与试剂1接触，所述试剂1含有包含于可激活蛋白C系统的介质中的凝血酶，特别地包含钙离子，试剂1还含有纤维蛋白聚合抑制剂；
b)将步骤a)中得到的介质与含有纯化的蛋白C的试剂2一起孵育，达足以允许蛋白C通过凝血酶激活为PCa的时段，所述凝血酶与辅助因子即包含于血浆样品中的凝血酶调节蛋白复合；
c)使步骤b)中得到的含有激活的蛋白C的介质与PCa的酶促底物接触；
d)定量PCa底物的转化。
为了实施本发明，所用的蛋白C是纯化的蛋白C，例如，利用
Figure A20078004431100122
AK et al，J Biol Chem，1988，263：19240-8所述方法分离的蛋白C。根据本发明的特定实施方案，所用的蛋白C是纯化的人蛋白C。所用的蛋白C以0.5μM/l至2.5μM/l或甚至0.1-10μM/l的浓度范围提供。
为了表示基本上不含其他蛋白组分和污染物(不依赖有关其制备模式的任何参考)，蛋白C称为“纯化的”。
提供的蛋白C可以是重组蛋白。
用于实施本发明测量的纯化和活性形式的蛋白C也可从DiagnosticaStago，Enzyme Research Laboratories或American Diagnostics获得。
在本发明方法的环境中，使提供的凝血酶与存在于检测血浆样品中的凝血酶调节蛋白接触，导致凝血酶/凝血酶调节蛋白复合物的形成。
提供凝血酶和钙离子的试剂，可由在含有钙离子的缓冲液中稀释的凝血酶构成。也可以将纤维蛋白聚合抑制剂加入到缓冲液中。也可以加入通常包含于这种类型缓冲液中的其他组分。
所用的凝血酶有利地是人来源的。特别地，它是在用于制备反应介质的试剂中，活性范围为以NIH单位表示的5-20NIH、有利地10NIH的凝血酶。
由此构成的试剂允许提供的凝血酶与血浆样品的凝血酶调节蛋白相互作用，并允许蛋白C的激活。
可以列举的所构成试剂的其他组分的实例是肝素抑制剂或另一个抗凝血剂，所述肝素抑制剂或另一个抗凝血剂在检测样品采集自用肝素或者另一种抗凝血剂治疗的患者且检测样品因而具有用肝素或另一种抗凝血剂治疗的患者的特征时使用。
然而，如果样品衍生自用抗维生素K家族的抗凝血剂治疗的患者，则不加入该抗凝血剂的抑制剂，因为目前无可以利用的抑制剂。
作为在Owren Koller缓冲液中稀释样品的替代，根据本领域技术人员已知的通常选择标准，稀释可以在正常血浆中进行，使所述血浆变为凝血酶调节蛋白缺陷的。随后向这种血浆加入外源凝血酶以及纯化的蛋白C和纤维蛋白聚合抑制剂，且如上文所述，当生物样品来自用肝素治疗的患者时，加入肝素抑制剂，或者如果是不同的抗凝血剂，加入另一个抑制剂。凝血酶由血浆提供。
术语“凝血酶调节蛋白缺陷血浆”意指，含有小于1％这种蛋白的血浆。
可以利用本身已知的任何方法，制备凝血酶调节蛋白缺陷血浆。
作为实例，可以利用免疫吸附技术，其采用针对这种蛋白的抗体，例如固定于支持物上的抗体。
用柠檬酸盐处理待处理的血浆。
在允许纯化的蛋白C与凝血酶/凝血酶调节蛋白复合物反应的条件下，提供纯化的蛋白C，从而使蛋白C激活为激活的蛋白C(PCa)形式。蛋白C正是以这种形式即PCa，与钙离子以及磷脂和其辅助因子蛋白S相互作用，能与其底物相互作用，特别是在凝集过程中能与因子Va和VIIIa(FVa，FVIIIa)相互作用。因此，为了测量凝血酶调节蛋白的活性，可以分析因子Va的抑制。
激活的蛋白C的功能活性的测量包括，获得的试剂与激活的蛋白C的酶促底物的反应。
这种底物在上文中已经做了描述；再次回忆一下，它可以是天然的或合成的底物。当它是天然的底物时，可以是血浆凝集蛋白，如FVa或FVIIIa。可选地，所测量的底物，揭示凝血酶调节蛋白的功能活性，可以是激活的TAFI(TAFIa)或激活的TAFI的底物。当PCa的酶促底物本质上是合成的时，它可以是例如肽底物。有利地，所讨论的底物是生色或荧光测定底物。
特别地，它可以是可以分析PCa酰胺水解活性的底物。此类底物例如是Diagnostica Stago的合成的寡肽底物CBS 42.46。其他的底物已通过实例的方式列举。
凝血酶调节蛋白功能活性定量的步骤基于PCa底物转化的定量。
这种定量可通过测量读取窗中反应混合物的光密度进行，其测定为所选底物的函数。
根据本发明特定实施方案，稀释从由患者采集的生物样品中获得的血浆。作为实例，将血浆以小于20倍、例如小于10倍稀释，特别地，将其稀释为1/3或1/4。
可以以底物敏感性的函数，决定进行的稀释，即底物越敏感，稀释可以越大。
在本发明特定实施方案中，纤维蛋白聚合抑制剂是多肽抑制剂。特别的，它可以是多肽H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH.AcOH(GPRP.AcOH)(Penta-pharm的
Figure A20078004431100141
FG)。这种抑制剂可以以血浆样品稀释函数选择1-15g/l的浓度用于分析反应中。作为实例，当血浆稀释1/3时，利用10g/l的这种抑制剂是有利的。
在本发明另一个实施方案中，纤维蛋白聚合抑制剂是上文所述的纤维蛋白原抗体。
根据本发明特定实施方案，凝血酶调节蛋白功能活性的测量包括使用具有下列组成的凝血酶缓冲液：
NaCl(0.15mmol/L[毫摩/升])、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，以及
肝素抑制剂，例如聚凝胺(10g/l)，当血浆样品衍生自用肝素治疗的患者时。
可以使用适宜稀释凝血酶的任何其他缓冲液。
当激活的蛋白C的酶促底物是CBS 42.46或任何其他酶促底物特别是合成的底物时，可在405nm的波长下、在6-500秒的读取窗中读取光密度。
可选地，在405nm的波长下在6-200s的窗中记录光密度。
底物特别是CBS 42.46的浓度在待加入反应介质的试剂中为例如2.5μM/ml。
孵育钙离子存在下与凝血酶接触的血浆和蛋白C的步骤，可进行约1-120分钟、例如约600秒的时段。
因此，在本发明特定实施方案中，测量PCa功能活性的方法在下列条件下进行：
●对于步骤a)，使稀释至1/3的70μl血浆样品与40μl NIH凝血酶接触，所述NIH凝血酶在纤维蛋白聚合抑制剂如GPRP.AcOH(10g/l)存在的情况下经缓冲液稀释，所述缓冲液含有NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，并且当血浆样品衍生自用肝素治疗的患者时，含有肝素抑制剂如聚凝胺(10g/l)。
●对于步骤b)，将30μl纯化的蛋白C与步骤a)中得到的介质一起孵育600s；
●对于步骤c)，110μl激活的蛋白C的酶促底物，如(在试剂中)浓度为2.5μM/ml的CBS 42.46，并通过在405nm的波长下，在6-500s的时间段内读取光密度，测定转化的酶促底物的量。
在本发明特定实施方案中，与测量内对照的相同活性平行的是测量血浆凝血酶调节蛋白的功能活性。这种对照可由以与样品相同的方式处理的标准血浆产生。
为了实施本方法，待提供给反应介质的试剂的量和/或浓度，与血浆、凝血酶、纯化的蛋白C、纤维蛋白聚合抑制剂以及底物的量和/或浓度一样，可以根据本申请给出的附图、特别是以每种试剂或其活性的浓度函数而变化。优选地，反应的各种试剂的各自终浓度在反应介质中基本上是保守的。
术语“终浓度”意指试剂被引入时，所述试剂在发挥其作用的介质中的浓度。
技术人员可以根据所选试剂的功能调整浓度和活性。通过说明，应该指出，试剂的浓度或活性可以以相对于包含在本申请中的说明的正负50％的量变化，例如，正负20％的量或正负10％的量。这种变化可以涉及一种试剂，而独立于其他试剂。
为了定量凝血酶调节蛋白的功能活性，根据本发明特定实施方案，本发明提出将获得的反应的结果、例如记录的光密度值与由校准曲线得到的值进行比较。这种标准曲线例如是通过下列方式由测量凝血酶调节蛋白功能活性获得的：
●在Owren Koller缓冲液中稀释的标准血浆样品，例如，含有常规统计量、术语称为正常量的内源和外源凝集途径中的已知凝集因子的血浆。它可以从正常血浆样品或从混合的正常血浆样品或从单独检测的样品中获得，以便随后测定所获得的凝血酶调节蛋白活性单个值的平均值。凝集因子统计上正常的值位于本领域技术人员所知手册给出的范围。作为实例，认为正常的血浆为这样的血浆，即所述血浆在纤维蛋白原检测中产生正常的结果，激活的脑磷脂时间(CTA)、凝血酶时间(TT)、PC和因子V。在这点上，也可以参考“How to define and determine reference intervals inthe clinical laboratory：Approved Guidelines(如何在临床实验室中定义和测定参考范围：许可的指导方针)-Second Edition(第二版)，NCCLS文件C28-A2(ISBN 1-56238-406-6)NCCLS-USA 2000”中定义的标准；或者
●加入渐增量的纯化的TM的、凝血酶调节蛋白耗尽的血浆。利用本身已知的任何方法，可以将其获得，例如利用抗凝血酶调节蛋白抗体，通过免疫吸附，在加入纯化的TM前进行TM的耗尽。
可以形成稀释范围的来自正常血浆池(pool)的正常血浆或加入渐增量TM的TM缺陷血浆。
加入血浆样品以便建立校准曲线的凝血酶调节蛋白可以是完整的或可溶的。
也可以涉及截短的可溶重组凝血酶调节蛋白分子，如由BerlexBioscien-ces(San Francisco，USA)推向市场的这种分子可以用作产生内对照或产生校准曲线的标准品。
根据可以经历TM活性测量检测的患者的特征，可以调整用于获得对照值的血浆样品的选择。
因此，选择作为对照的血浆样品有利地采集自具有与检测患者的有关年龄、性别、身体质量指数以及适当时，烟草或酒精摄入水平的特征近似的特征的个体。
本发明也涉及测量血浆介质中血浆凝血酶调节蛋白活性的试剂盒，所述试剂盒含有：
●含有在缓冲液中稀释的凝血酶的试剂1，所述缓冲液含有纤维蛋白聚合抑制剂并含有钙离子，且如果需要，含有肝素抑制剂；
●试剂2，含有纯化的蛋白C，或可选地，TAFI(凝血酶可激活的纤维蛋白水解抑制剂)；
●含有激活的蛋白C的酶促底物或TAFI的特异性底物的试剂3。
对TAFI活性的分析由测量TAFIa(激活的TAFI)组成，这已有描述，例如在利用衍生于芳基偶氮甲酸基化合物的TAFIa的生色底物的专利WO-03/004516中。
根据本发明特定实施方案，试剂盒的特征在于，试剂1主要含有下列化合物：NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，以及对于来自用肝素或另一个抗凝血剂治疗的患者的血浆样品，还含有肝素或所述抗凝血剂的抑制剂如凝聚胺(10g/l)，以及纤维蛋白聚合抑制剂。
根据本发明特定实施方案，纤维蛋白聚合抑制剂是以1-15g/l的浓度使用的GPRP.AcOH。以检测血浆的稀释程度的函数确定浓度。作为实例，当血浆稀释三分之一时，使用10g/l的GPRP.AcOH。使用这种抑制剂的特性和条件在上文已有描述。
本发明还涉及上文限定的试剂盒，其中纤维蛋白聚合抑制剂是抗纤维蛋白原抗体。
在特定实施方案中，试剂盒还含有根据本发明的指示所限定的内对照。
根据特定实施方案，试剂盒还可以含有凝血酶调节蛋白功能活性的校准曲线，或用于产生这种曲线的装置。
本发明也涉及体外检测凝集异常的方法，包括如本发明所述测量血浆介质中凝血酶调节蛋白的功能活性。它可以涉及检测凝血酶调节蛋白功能活性水平的增加或该水平的减少。
在成年受试者中，凝血酶调节蛋白水平中的异常变化(增加或减少)是血栓形成或内皮损伤风险的标志物。
根据本方法的特定实施方案，将血浆介质中凝血酶调节蛋白的所测量的功能活性与利用标准血浆测量的这种活性的值进行比较。
根据本发明特定实施方案，获得的值，术语称为标准值或正常值，是在分析凝血酶调节蛋白对标准血浆样品的功能活性后获得的。
根据本发明特定实施方案，所述的标准值是从凝血酶调节蛋白功能活性值建立的，所述值是利用单独分析的正常血浆样品(标样)测量的。
本申请所述的装置、方法和试剂盒可用于检测可能与临床症状有关的凝血酶调节蛋白水平的增加。因此，凝血酶调节蛋白水平的增加可与弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和肾功能不全、子痫前期、血栓性血小板减少性紫癜、立克次氏体病、白塞病、高胱胺酸尿症或流产的症状有关。
根据本发明另一个特定实施方案，装置、方法和试剂盒可用于检测可能与临床症状有关的凝血酶调节蛋白水平的减少。这些症状可以是肺动脉高血压的或黑素瘤的或其他的症状。
在本发明另一个实施方案中，所述的装置、方法和试剂盒用于检测与凝血酶调节蛋白基因突变有关的凝血酶调节蛋白水平的减少。
根据下列实施例和附图，本发明的其他特征和优势将变得明显，所述下列实施例特别说明与病理状态有关的凝血酶调节蛋白水平的变化。
图1：凝血酶调节蛋白组织结构图解：EGF＝表皮生长因子(EGF样)。凝血酶调节蛋白的序列在Weiler H和Isermann B H 2003年的文章(Journal of Thrombosis and Haemostasis，vol 1，pages 1515-1524)中有描述；
图2：凝血酶调节蛋白活性图解：PC：蛋白C；PCa：激活的蛋白C；Th：凝血酶；ATIII-Th：抗凝血酶III-凝血酶复合物；EPCR-PC：内皮蛋白C受体-蛋白C；TAFI：凝血酶可激活的纤维蛋白水解抑制剂；TAFIa：激活的TAFI；TM：凝血酶调节蛋白；V：因子V；Va：激活的因子V；
图3：说明分析特异性的曲线(DefTM：TM缺陷)；
图4：病理血浆和正常血浆的检测；
图5：作为凝血酶调节蛋白浓度的函数的凝血酶调节蛋白活性的测量(DDO)校准曲线；
图6：作为样品中蛋白C量的函数的凝血酶调节蛋白活性敏感性的测量；
图7：样品因子II的敏感性；
图8：样品中TAFI量的敏感性；
图9：稳定性评估；
图10：来自正常妊娠或患有并发症妇女的血浆样品的磷脂浓度和TMa活性的测量；
图11：与心肌梗塞(MI)有关的凝血酶调节蛋白的活性；
图12：已经经历异源移植的患者凝血酶调节蛋白的变化。检测来自状况变为并发症患者的样品和来自状况改善患者的样品的TMa活性。
产生这些结果的条件在实施例中进行了描述。
实施例
1.分析方法
按如下分析70μl稀释1/3的血浆样品的凝血酶调节蛋白功能活性。
A)待提供于反应介质的试剂
●40μl的10 NIH凝血酶，其溶于由下列组成的凝血酶缓冲液(即在介质中最终是1.6NIH)：
0.15mmol/L NaCl
20mmol/L Tris
2.5mmol/L CaCl2
5mg/ml BSA
10g/l GPRP.AcOH(纤维蛋白聚合抑制剂)
2ml/l凝聚胺，10g/l
●30μl纯化的蛋白C，100μg/ml，溶解于1ml蒸馏水中
●110μl PCa的合成底物(来自Diagnostica Stago的CBS 42.46，2.5μM/ml)，溶解于6ml蒸馏水/水蛭素，20ATU)(即介质终浓度1.10μM/ml)。
B)蛋白C的激活和PCa分析
使血浆样品与凝血酶在凝血酶缓冲液中接触，并在37℃下与蛋白C一起孵育约600秒的时段，以便激活蛋白C。
使获得的介质与合成的底物接触。
随后通过在405nm下读取6-500秒的读取窗中的光密度，在37℃下测定PCa的酰胺水解活性。
C)检查测量的特异性
通过将用正常血浆池获得的活性与用加入了纯化的TM(例如来自美国Diagnostica或Haematologic Technologies Inc)的TM缺陷血浆获得的活性进行比较，证实PCa活性的光密度测量的特异性。结果显示于图3中并证实了分析的特异性。
D)检查可重复性
进行可重复性测量，并将结果显示于表1-3中。
E)PCa活性的值
利用本发明的方法，分析43个正常血浆的凝血酶调节蛋白活性。光密度测量和相应的TM活性百分比显示于表4中。可以认为这些测量值是凝血酶调节蛋白功能活性正常值的指标。
表4正常血浆
Figure A20078004431100211
认为100％的TM功能活性是被任意地限定为TM的量，在2.5mmol/LCa2+离子存在的情况下，当凝血酶和PC浓度分别为10NIH和100μg/ml时，所述TM的量导致0.03μmol/l的PCa形成。
此外，利用本发明的方法，分析由生物样品获得的血浆的TM功能活性，所述生物样品采集自患有已鉴定病理的患者。利用上文提到的生色检测和合成的底物，在STA-R分析仪(Diagnostica Stago，France)中进行测量。检测内和检测间Cts值分别＜4％和＜5％。
对检测的响应在0％至200％是线性的。作为TM活性的百分比，结果如下：糖尿病(n＝15)：130％±28；癌症(n＝10)：155±60；败血症(n＝12)：173％±56；多发性创伤(n＝20)：185％±62。
这些结果显示于图4中。
II校准曲线制备的实例
为了产生给出凝血酶调节蛋白功能活性的校准曲线，利用如下：
●稀释正常血浆池，以Owren Koller缓冲液或凝血酶调节蛋白缺陷；
●或对具有纯化的凝血酶调节蛋白的凝血酶调节蛋白缺陷血浆进行过量加样；
●或通过将100％凝血酶调节蛋白活性的水平任意地限定为凝血酶调节蛋白的水平，在2.5mmol/L Ca2+存在的情况下，当凝血酶的浓度为10NIH且PC的浓度为100μg/ml时，所述凝血酶调节蛋白的水平导致0.03μml/l的PCa产生。
检测配制中稀释1/3的每种血浆。
利用上文限定的标准，测定加入血浆池中的对应于凝血酶调节蛋白200％、150％、100％、50％、25％、12.5％以及0％活性的TM浓度。
针对PCa合成的底物即CBS 42.46，测定凝血酶调节蛋白的活性。PCa的酰胺水解活性通过405nm波长下对-硝基苯胺的释放(黄色)测量。
在405nm波长下，在6-500秒的读取窗中，测定对应于凝血酶调节蛋白活性的每个值(作为百分比)的光密度。
校准曲线显示于图5中。
III评估分析对各种血浆凝集蛋白或对干扰凝集的试剂的敏感性
A)对肝素的敏感性
通过在上文所述的分析条件下，向分析的血浆中加入浓度渐增的肝素钙
Figure A20078004431100221
测定敏感性。
肝素钙的影响描述于下文的表6中，且证明对TM的功能活性几乎不具影响。
表6对肝素的敏感性
B)对包含于血浆样品中蛋白C的水平的敏感性
利用上文所述方法，分析含有预定可变浓度的蛋白C的血浆。
如下：
●蛋白C缺陷血浆(栏0)；
●来自各种程度蛋白C缺陷池的血浆(栏12.5-50)；
●来自正常池(GK(Georges King)池)的血浆(栏100)。
结果(表7和图6)表明，样品中PC的水平对TM功能活性的值几乎不具影响。
表7对样品(1)中蛋白C量的敏感性
PC的水平(％) 0 12.5 25 50 100 150 300
  理论水平(％)   110   103   104   106   102   102   102
  测量的水平(％)   110   110   101   107   102   96   96
  一致性   100   107   97   101   100   94   94
0＝Def PC Clinisys
12.5-50＝池/Def Pc
100＝GK池
150-300＝池/纯化的PC
C)对包含于血浆样品中因子II水平的敏感性
利用上文所述方法，分析预定可变浓度的因子II的血浆。
如下：
●因子II缺陷血浆(栏0)；
●来自各种程度因子II缺陷池的血浆(栏25-87.5)；
●来自正常池(GK池)的血浆(栏100)；
结果(表8和图7)表明，样品中FII的水平对TM功能活性的值几乎不具影响。
表8
  FII水平(％)  100   87.5   75   50   25   0
  理论水平(％)  100   95   90   79   69   58
  测量的水平(％)  100   95   88   76   74   58
  一致性  100   100   98   96   107   100
0＝Def II GK
25-87.5＝池/Def II
100＝GK池
D)对包含于血浆样品中TAFI的水平的敏感性
利用上文所述方法，分析含有预定的可变浓度的TAFI的血浆。
如下：
●TAFI缺陷血浆；
●来自各种程度TAFI缺陷池的血浆；
●来自正常池的血浆(GK池)。
结果(表9和图8)表明，样品中TAFI的水平对TM功能活性的值几乎不具影响。
表9对样品(1)中TAFI水平的敏感性
Figure A20078004431100241
E)稳定性评估
为了评估反应的稳定性，间隔一段时间后，重复TM功能活性分析。每隔4小时对相同样品进行的分析表明，值具有正确的稳定性(表10和图9)。
表10
Figure A20078004431100242
PIN 725-17是由Manchester提供的正常血浆，并对应于批次725-17。
F)读取窗
为了在6-500秒、随后在6-200秒的窗口内记录，调整光密度读取窗。获得的各种血浆的结果基本上是相等的(表11)。
IV凝血酶调节蛋白活性的增加和孕妇胎儿早期丧失之间的相关性
早期胎儿丧失是严重的临床问题，其经常不能适当地解释或检测。除了解剖学、染色体和激素原因外，抗磷脂综合症(APS)是目前为止可以诊断的单个常见原因。提出的解释流产的机制之一是由于子宫胎盘血栓形成导致的组织缺氧。凝血酶调节蛋白是血栓形成中重要的标志物。在患有早期流产患者的对照研究中，基于凝血酶调节蛋白通过凝血酶促进蛋白C激活的能力，进行本发明的凝血酶调节蛋白活性检测。将从无血栓形成史且患有早期流产(与APS无关)患者(N＝35)怀孕的最初三个月采集的血液样品中获得的结果，与从正常怀孕的相似年龄组妇女(N＝37)怀孕的最初三个月获得的样品中获得的结果以及未怀孕的正常患者(N＝32)的结果进行比较。流产后立即从患者组采集血液样品。将所有的血液样品(在109MN的柠檬酸盐中1∶10)搅拌2次，并将血浆在-80℃冷冻，直到aPTT和凝血酶调节蛋白活性检测(Diagnostica Stago，France)。相对于正常妊娠的120±10％和流产的158±14％，对照的凝血酶调节蛋白活性检测的平均值为106±12％(p小于0.001)。尽管为了测定这种检测的能力和特异性，需要补充研究，但这种参数的测定可以证明是辅助检测处于流产风险中的妇女的有用的工具。凝血酶调节蛋白活性看起来是妊娠期高血压综合症有利的早期预测标志物，在处于风险的妇女中，其可允许用于预防更严重的临床表现的药物干预。
表11
Figure A20078004431100251
V凝血酶调节蛋白活性和妊娠并发症之间的相关性
妊娠期并发症与NK(天然杀伤)细胞的活性和子宫胎盘血栓形成有关。
促凝血磷酯(PPL)可以在血管破坏的情况下调节NK活性和TMa增加的作用。
利用基于因子Xa(XaCT-Xa凝结时间)的凝集检测测量PPLs的浓度以及测量TMa的活性是有利的，因为这些检测是检测易经历妊娠并发症的妇女的预测标志物。
检测来自在妊娠期经历了并发症(与抗磷脂综合症无关)的无血栓形成史的妇女(35)、正常妊娠的相同年龄组的妇女(37)、无确定的病理且未怀孕的妇女(32)的血液样品。处理样品，以收集在检测前储藏于-80℃的血浆。
在XaCT检测中，测量PPLs。缩短的凝结时间反映了PPL浓度的增加。基于能促进蛋白C激活的能力(如上文所述)，在生色检测中测量TMa活性。
对三种类型的样品获得的结果(图10)的比较表明：1)对于XaCT检测：具并发症妊娠的患者、正常妊娠以及对照的平均值分别为35.2±11.8s、50.6±8.6s和55±9.2s(p＜0.001)；2)对于TMa活性检测：具有并发症妊娠、正常妊娠以及对照的平均值分别为169％±24、119％±16和106％±16(p＜0.05)。
因此，看起来XaCT检测和TMa检测两者作为检测在妊娠期处于并发症风险妇女的预测标志物是有利的。
VI凝血酶调节蛋白活性的增加和心肌梗塞的相关性
测量正常血浆池和从患有心肌梗塞(MI)的存活患者采集的血浆样品和从因MI死亡的患者采集的血液样品中的凝血酶调节蛋白活性。
在上文I所述的条件下，进行测量。
结果表明，在MI的情况下，凝血酶调节蛋白活性实质增加。
Figure A20078004431100261
VII凝血酶调节蛋白活性和骨髓异源移植
测量从经历了骨髓异源移植的患者(小孩)采集的血浆样品的凝血酶调节蛋白活性。
根据移植后样品采集的阶段，移植后TM活性不同。根据移植是发展了并发症或还是相反有利地，观察到TM活性变化的差异。
序列表
<110>斯塔戈诊断公司
<120>血浆凝血酶调节蛋白活性功能测量的方法
<130>B06814A-AD/CAL
<140>PCT/FR 2007/001955
<141>2007-11-28
<150>FR 06/10444
<151>2006-11-29
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<400>1
000
<210>2
<400>2
000
<210>3
<400>3
000
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>寡肽
<400>4
Gly Pro Arg Pro
1

Claims (35)

1.体外测量凝血酶调节蛋白功能活性的方法，所述方法包括分析来自生物样品的生物介质中，蛋白C在凝血酶辅助因子即所述凝血酶调节蛋白存在下，通过凝血酶向激活的蛋白C(PCa)的激活，所述方法包括向所述血浆样品中加入所述蛋白C系统激活所需的试剂、加入纯化的蛋白C以及还加入纤维蛋白聚合抑制剂。
2.如权利要求1所述的体外测量凝血酶调节蛋白功能活性的方法，其中所分析的凝血酶调节蛋白是血浆凝血酶调节蛋白，所述生物样品是血浆样品，所述分析在血浆介质中进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中为了所述激活蛋白C系统，加入凝血酶和钙离子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中利用酶促底物测定所述激活的蛋白C的活性。
5.如权利要求4所述的方法，其中利用PCa的生色或荧光测定底物，分析所述激活的蛋白C的酰胺水解活性。
6.如权利要求5所述的方法，其中分析由合成的底物CBS 42.46释放的对-硝基苯胺。
7.如权利要求4所述方法，其中分析凝集的血浆蛋白，例如因子Va、因子VIIIa或TAFIa，对所述凝集的血浆蛋白的抑制依赖PCa。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，包括下列步骤：
a)使血浆样品与试剂1接触，所述试剂1含有能够激活所述蛋白C系统的介质所含的凝血酶，特别地含有钙离子，所述试剂1还含有纤维蛋白聚合抑制剂；
b)将步骤a)中得到的介质与含有纯化的蛋白C的试剂2孵育足以允许所述蛋白C激活为PCa的时段，所述激活借助与辅助因子、即包含在所述血浆样品中的凝血酶调节蛋白复合的凝血酶；
c)使步骤b)中得到的含有激活的蛋白C的介质与PCa的酶促底物接触；
d)检测所述PCa底物的转化。
9.如权利要求2-8中任一项所述的方法，其中稀释所述血浆样品，例如稀释1/3。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白聚合抑制剂是多肽抑制剂，例如H-GlyProArgPro-OH.AcOH(GPRP.Ac-OH)。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白聚合抑制剂是抗纤维蛋白原抗体。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中凝血酶缓冲液主要含有下列化合物：
NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)；以及当所述血浆样品具有用肝素治疗的患者的特征时，还含有肝素抑制剂，如聚凝胺(10g/l)。
13.如权利要求10或12任一项所述的方法，其中根据对所述血浆样品的稀释，加入浓度为1-15g/l的所述纤维蛋白聚合抑制剂GPRP.AcOH。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中所述激活的蛋白C的所述酶促底物是寡肽THC-Pro-Arg-pNa。
15.如权利要求4-14中任一项所述的方法，其中通过记录光密度，进行所述PCa酶促底物转化的定量测量。
16.如权利要求8-15中任一项所述的方法，其中在下列条件下使用反应中所用的组分：
●对于步骤a)，使70μl稀释1/3的血浆样品与40μl在缓冲液中稀释的10NIH凝血酶接触，所述缓冲液含有NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，并且是在纤维蛋白聚合抑制剂例如GPRP.AcOH(10g/l)存在下，以及当所述血浆样品衍生自用肝素治疗的患者，还含有肝素抑制剂如聚凝胺(10g/l)；
●对于步骤b)，将30μl纯化的蛋白C与步骤a)中得到的介质孵育600秒；
●对于步骤c)，110μl所述激活的蛋白C的酶促底物，通过在405nm波长下读取6-500s时段内的光密度，测定转化的酶促底物的量。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析内对照。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将获得的所述光密度的值与校准曲线进行比较。
19.如权利要求8-18中任一项所述的方法，其中所述试剂是包含于凝血酶调节蛋白缺陷血浆中的凝血酶，已向所述血浆加入纤维蛋白聚合抑制剂，并且当所述检测的血浆具有用抗凝血剂治疗的患者的特征时，还加入所述抗凝血剂的抑制剂。
20.功能性测量生物介质、特别是血浆介质中凝血酶调节蛋白活性的试剂盒，含有：
●试剂1，包含在含有纤维蛋白聚合抑制剂以及含有钙离子的缓冲液中稀释的凝血酶；
●试剂2，含有纯化的蛋白C；
●如果需要，试剂3，含有激活的蛋白C的酶促底物。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂1主要含有下列化合物：NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，以及当所述血浆样品衍生自用肝素治疗的患者时，还含有肝素抑制剂如聚凝胺(10g/l)，以及纤维蛋白聚合抑制剂。
22.如权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述纤维蛋白聚合抑制剂是以1-15g/l的浓度使用的GPRP.AcOH。
23.功能性测量生物介质、特别是血浆介质中凝血酶调节蛋白活性的试剂盒，含有：
●试剂1，含有在含有纤维蛋白聚合抑制剂以及含有钙的缓冲液中稀释的凝血酶；
●试剂2，含有TAFI；以及如果需要
●试剂3，含有TAFI的底物。
24.如权利要求20-24中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还含有内对照。
25.如权利要求19-23中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒含有凝血酶调节蛋白功能活性的校准曲线。
26.体外检测凝集异常的方法，包括测量权利要求2-20中任一项所述的血浆凝血酶调节蛋白功能活性。
27.如权利要求25所述的方法，包括将测量的凝血酶调节蛋白功能活性水平与所述活性的正常值进行比较。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述正常值是在分析正常血浆样品池的凝血酶调节蛋白功能活性后获得的。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述正常值是由对单个分析的正常血浆样品测量的凝血酶调节蛋白功能活性的值建立的。
30.如权利要求1-19或26-29中任一项所述的方法，所述方法用于检测与弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和肾功能不全、子痫前期、血栓性血小板减少性紫癜、立克次氏体病、白塞病、高胱胺酸尿症和流产的症状有关的凝血酶调节蛋白水平的升高。
31.如权利要求1-19或26-29中任一项所述的方法，所述方法用于检测与肺动脉高血压或黑素瘤的症状有关的凝血酶调节蛋白水平的降低。
32.如权利要求1-19或26-29中任一项所述的方法，所述方法用于检测与凝血酶调节蛋白基因突变有关的凝血酶调节蛋白水平的降低。
33.如权利要求20-25中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于检测与弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和肾功能不全、子痫前期、血栓性血小板减少性紫癜、立克次氏体病、白塞病、高胱胺酸尿症和流产的症状有关的凝血酶调节蛋白水平的升高。
34.如权利要求20-25中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于检测与肺动脉高血压或黑素瘤的症状有关的凝血酶调节蛋白水平的降低。
35.如权利要求20-25中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于检测与凝血酶调节蛋白基因突变有关的凝血酶调节蛋白水平的降低。
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