BR112013022662B1 - Dispositivo de coleta de sangue contendo inibidor de lisofosfolipase e métodos para diagnosticar uma doença metabólica ou monitorar o tratamento de um paciente com uma doença metabólica e para detectar a presença ou quantidade de um pró-fármaco e/ou metabólito ativo do mesmo no sangue ou componente do mesmo - Google Patents

Abstract

dispositivo de coleta de sangue contendo inibidor de lisofosfolipase. dispositivos de coleta para coletar e estabilizar sangue total ou um componente do mesmo, que incluem uma primeira extremidade e uma segunda extremidade e pelo menos uma parede interior que define um reservatório, em que o reservatório contém um agente de estabilização que inclui um inibidor de lisofosfolipase (lysopla) são divulgados. também são divulgados métodos para fabricar e usar os dispositivos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório U.S. No 61/449.337, depositado em 4 de Março de 2011, a divulgação do qual é por meio deste relatório incorporada como referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]Diabetes é uma síndrome de metabolismo desordenado, usualmente devido a uma combinação de causas hereditárias e ambientais, resultando em níveis de açúcar no sangue anormalmente altos (hiperglicemia). Níveis de glicose no sangue são controlados por uma interação complexa de múltiplos produtos químicos e hor-mônios no corpo, incluindo o hormônio insulina feito nas células beta do pâncreas. Diabetes mellitus se refere ao grupo de doenças que leva a altos níveis de glicose no sangue devido aos defeitos na secreção de insulina ou ação de insulina no corpo.

[003]O diabetes se desenvolve devido a uma produção diminuída de insulina (no tipo 1) ou resistência a seus efeitos (no tipo 2 e gestacional). Ambos levam à hi- perglicemia, que amplamente causa os sinais agudos de diabetes, isto é, produção de urina excessiva, resultando em sede compensatória e entrada de fluido aumentada, visão indistinta, perda de peso inexplicada, letargia, e mudanças no metabolismo de energia.

[004]As injeções através de uma seringa, bomba de insulina, ou insulina fornecida por caneta de insulina, que é um tratamento básico de diabetes tipo 1. O diabetes tipo 2 é administrado com uma combinação de tratamento dietético, exercícios, medicações e suplementação de insulina. Todas as formas de diabetes se tornaram tratáveis, visto que a insulina se torna medicinalmente disponível, mas ainda não existe cura.

[005]De acordo com um relato da Organização Mundial de Saúde em 2000, pelo menos 171 milhões de pessoas em todo o mundo estavam sofrendo de diabetes, ou 2,8 % da população. Sua incidência está aumentando rapidamente, entretanto, e estima-se que pelo ano de 2030, este número será quase o dobro. O diabetes mellitus ocorre em todo o mundo, mas é mais comum (especialmente tipo 2) nos países mais desenvolvidos. O maior aumento na prevalência é, entretanto, esperado ocorrer na Ásia e África, onde a maioria dos pacientes provavelmente será encontrada em 2030.

[006]O peptídeo do tipo glucagon (GLP-1), peptídeo inibitório gástrico (GIP), glucagon e grelina foram relatados como biomarcadores de peptídeo de doenças metabólicas, tais como diabetes. A principal fonte de GLP-1 no corpo é encontrada nos intestinos. A concentração sanguínea normal típica de GLP-1 na circulação está em uma faixa de 3 a 85 picomolares. GLP-1 possui várias propriedades fisiológicas que tornam o mesmo um objeto de investigação intensiva como um tratamento potencial de diabetes. Gautier, et al., Diabetes Met. 31:233 - 42 (2005). GLP-1 é conhecido como aquele que aumenta a secreção de insulina a partir do pâncreas, diminui a secreção de glucagon a partir do pâncreas, aumenta a massa celular beta e expressão do gene da insulina, inibe a secreção de ácido e esvaziamento gástrico no estômago, e diminui a entrada de alimentos através do aumento da saciedade. Baggio, et al., J. Gastroenterol. 132:2131 - 57 (2007). Uma vez na circulação, entretanto, GLP-1 foi relatado exibir uma meia-vida biológica curta de cerca de 1,5 a 5 minutos (Hui, et al., Eur. J. Endocrinol. 146:863 - 9 (2002)), devido à degradação proteolítica causada pelas proteases, incluindo dipeptidil peptidase (DPP)-IV.

[007]A forma ativa de GIP é um polipeptídeo de 42 aminoácidos representado pela sequência: YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDKHNITGQ (“GIP(1-42)”). GIP(1-42) é sintetizado por células K que são encontradas na mucosa do duodeno e do jejuno do trato gastrointestinal. Acredita-se que GIP(1-42) induz a secreção de insulina por intermédio de um mecanismo que envolve a interação entre GIP e receptores de GIP(1-42) 7 transmembrana nas células beta pancreáticas. A concentração em jejum normal de GIP(1-42) no plasma é de cerca de 6 a 12 pmols/L, ao passo que a concentração sem jejum normal é de cerca de 80 a 300 pmols/L. GIP(1-42) foi relatado exibir uma meia vida na circulação de cerca de 5 minutos.

[008]Glucagon, um peptídeo de 29 aminoácidos, está envolvido no metabolismo de carboidratos. Produzido pelo pâncreas, ele é liberado quando o nível de glicose no sangue é baixo (hipoglicemia). Ele se liga aos receptores nas células do fígado (hepatócitos), fazendo com que o fígado converta glicogênio armazenado em glicose e depois libere a glicose na corrente sanguínea. Conforme estes armazenamentos se esgotam, glucagon então estimula a síntese de glicose adicional no fígado. A ação do glucagon é, assim, oposta àquela da insulina, que instrui as células no corpo a tomar em glicose a partir do sangue. Glucagon também regula a taxa da pro-dução de glicose através de um processo conhecido como lipólise. A concentração sanguínea normal típica do glucagon na circulação é de 11 a 17 picomolares. Uma vez na circulação, glucagon tem uma meia-vida de cerca de 8 a 18 minutos.

[009]Grelina é um hormônio produzido principalmente por células P/D1 que revestem o fundo do estômago humano e células epsilon do pâncreas que estimulam o apetite. A concentração sanguínea normal típica também está na faixa picomolar. Grelina é um peptídeo de 28 aminoácidos tendo a sequência NH2-GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR-COOH. Uma das formas biologicamente ativas deste peptídeo, conhecido como grelina acilada, contém um grupo n-oc- tanoila em Ser3 (isto é, -CH3(CH2)6COO-). Este peptídeo exerce ações endócrinas, tais como estímulo da liberação do Hormônio do Crescimento (GH) a partir da glândula pituitária, e vários efeitos fisiológicos, tais como indução de adiposidade (aumento no tecido adiposo) e ganho de peso corpóreo, devido aos efeitos estimulantes de apetite e ingestão alimentar aumentada, e estímulo de secreção de ácido gástrico e motilidade. Kojima, et al., Trends Endocrinol. Metab. 12:118 - 122 (2001); Kojima, et al., Physiol. Rev. 85:495 - 532 (2005). Assim, além de diabetes, grelina acilada é um bio- marcador metabólico conhecido para condições relacionadas, tais como perda de peso induzida por dieta e jejum. Uma outra forma de peptídeo grelina é conhecida como des-acil-grelina, que é uma forma metabolicamente inativa tendo suas próprias funções, incluindo a modulação da proliferação celular (Baldanzi, et al., J. Cell Biol. 159:1029 - 37 (2002); Ariyasu, et al., Endocrinol. 2005:355 - 64 (2005)) e adipogênese (Muccioli, et al., Eur. J. Pharmacol. 498:27 - 35 (2004)). A concentração plasmática normal de grelina, incluindo as formas ativas e inativas, varia de cerca de 300 a cerca de 700 pg/ml (ou cerca de 0,08 a cerca de 0,19 nM ou cerca de 0,09 a cerca de 0,19 fmol/μl), e flutua com o tempo. A forma circulante principal de grelina é dec-acil grelina [Hosoda, et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 279:909 - 13 (2000)], e, assim, a maior parte desta quantidade não está na forma do biomarcador metabólico mais exato. Uma vez na circulação, grelina tem uma meia-vida de cerca de 30 minutos.

[0010]Yi, et al., J. Proteome Res. 6(5):1768 - 81 (2007), por exemplo, relatam que a degradação proteolítica de proteínas do soro e plasma causada por proteases intrínsecas ocorre durante os primeiros minutos da coleta e manejo da amostra (o que sugere rápida degradação proteolítica ex vivo). Em uma publicação subsequente, Yi et al., J. Proteome Res. 7(12):5112 - 8 (2008), relatam que, embora a descoberta dos marcadores da doença no fluido sanguíneo continue a acelerar, conforme a tecnologia proteômica se torna mais potente e mais amplamente disponível, houve, notavelmente menos sucesso na transição destas descobertas em utilidade clínico, estimulando um crescente interesse no entendimento das barreiras para esta transição. Com exceção das meias-vidas curtas e, especialmente, as pequenas concentrações de GLP-1, GIP, glucagon e grelina (e, particularmente, as formas biologicamente ativas dos mesmos) no plasma, complicações surgem devido à variabilidade pré-analítica, especialmente durante a coleta de sangue e manejo da amostra precoce. Yi (2008) também relata que no caso de alguns biomarcadores de peptídeo, a degradação proteolítica ocorre em uma questão de segundos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011]Grelina contém uma cadeia principal de peptídeo e uma cadeia lateral contendo um grupo éster de 8 carbonos, que são suscetíveis às proteases e esterases endógenas, respectivamente, que estão presentes no plasma humano. Conforme mostrado nos exemplos de trabalho, os requerentes descobriram que grelina pode ser mais eficazmente estabilizada em amostras de componente de sangue ou fluido coletado (por exemplo, soro ou plasma) através da inclusão de um inibidor de lisofosfoli- pase (LysoPLA), ao contrário de um inibidor de uma protease ou uma esterase. De fato, os dados do requerente mostram que a presença adicional de um inibidor de esterase prejudicou ou diminuiu a estabilidade de grelina in vitro. Com a exceção do fato de que a cadeia lateral de grelina é um grupo “éster”, estas descobertas são surpreendentes e inesperadas, especialmente, tendo em vista os relatos de que a atividade de LysoPLA é detectada no estômago e intestino, mas não no plasma. Assim, a presente invenção fornece, relativamente, estabilidade de armazenagem mais longa de sangue ou um componente do mesmo para propósitos de conduzir teste clínico confiável, tal como medição de biomarcadores, tais como grelina.

[0012]Consequentemente, um primeiro aspecto da presente invenção é dirigido a um dispositivo de coleta para coletar e estabilizar sangue total ou um componente do mesmo, que inclui uma primeira extremidade e uma segunda extremidade e pelo menos uma parede interior que define um reservatório, em que o reservatório contém um agente de estabilização que inclui um inibidor de lisofosfolipase (Lyso- PLA). Em algumas modalidades, o agente de estabilização também inclui pelo menos um inibidor de um outro tipo de enzima que está normalmente presente no sangue e que degrada marcadores diagnósticos de doenças metabólicas. Estas enzimas incluem esterases e proteases. Assim, em outras modalidades, o dispositivo de coleta de sangue também pode incluir um inibidor de uma esterase, tal como um inibidor de butilcolinesterase (BChE) ou acetilcolinesterase (AChE), e/ou um inibidor de uma protease (por exemplo, um inibidor de uma serina protease, um inibidor de uma exopeptidase, um inibidor de uma dipeptidil peptidase, e combinações de dois ou mais entre os mesmos).

[0013]Métodos para preparar e usar os dispositivos para os propósitos de coletar e armazenar sangue total ou componente(s) do mesmo também são fornecidos.

[0014]Um outro aspecto da presente invenção é dirigido a um método para diagnosticar uma doença ou monitorar o tratamento de um indivíduo com uma doença, tal como uma doença metabólica (por exemplo, diabetes), compreendendo medir, com o passar do tempo (ou pelo menos um tempo pré-determinado ou intervalo de tempo), a presença ou quantidade de um ou mais marcadores para a doença, incluindo grelina biologicamente (metabolicamente) ativa, em uma amostra de sangue ou componente do mesmo coletada a partir do paciente usando um dispositivo de coleta de sangue inventivo. Em algumas modalidades, o método também inclui medir pelo menos um marcador de doença metabólica adicional selecionado a partir de glucagon, GIP, gre- lina e GLP-1 (que inclui GLP-1-(7-36)NH2 e GLP-1-(7 - 37)), e combinações de dois ou mais entre os mesmos.

[0015]Ainda um outro aspecto da presente invenção é dirigido a um método para monitorar níveis sanguíneos de um pró-fármaco contendo um grupo lateral éster alifático (por exemplo, grupo acila) em um indivíduo que foi administrado o pró-fár- maco, que inclui coletar uma amostra de sangue a partir do paciente usando o dispositivo de coleta de sangue inventivo, e medir a presença ou quantidade do pró-fármaco e/ou um metabólito ativo do mesmo, na amostra ou um componente da mesma. A presença ou quantidade do pró-fármaco e um metabólito ativo do pró-fármaco pode ser medida. A medição dos níveis sanguíneos do pró-fármaco e/ou metabólito pode ser conduzida mais do que uma vez, tal como em intervalos de tempo pré-determinados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016]A Fig. 1 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de coleta de sangue típico da presente invenção.

[0017]A Fig. 2 é um gráfico que exibe uma comparação da estabilidade de acil-grelina em 30 h em quatro tubos de coleta de sangue diferentes contendo: 1) o inibidor de LysoPLA fluorofosfonato de metil araquidonila (MAFP), EDTA, o inibidor de esterase, tacrina, e os inibidores de protease L-treo-isoleucil tiazolidida, bestatina e leupeptina (um agente de estabilização inventivo “ISA”, designado na figura como ▲); 2) um outro agente de estabilização inventivo que incluiu o EDTA e MAFP anticoagu- lante (designado na figura como x); 3) EDTA e o inibidor de esterase e os inibidores de protease (o agente de estabilização comparativo “CSA” designado na figura como ♦); e 4) EDTA sozinho (designado na figura como ■), seguido por reforço com 1 pg/uL de acil-grelina.

[0018]A Fig. 3 é um gráfico que mostra a estabilidade de grelina em uma amostra de sangue coletado a partir e um ser humano em jejum, com o passar do tempo, e coletada e armazenada em tubos de EDTA reforçados (♦) e não reforçados (■) e tubos de coleta contendo um agente de estabilização representativo (incluindo MAFP como o inibidor de LysoPLA) da presente invenção (reforçado (▲) e não reforçado (x)).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019]Os dispositivos de coleta da presente invenção são usados para coletar e estabilizar sangue total ou um componente do mesmo, tal como concentrados de glóbulos vermelhos, concentrados de plaquetas, concentrados de leucócitos, e componentes de fluido de sangue, incluindo plasma e soro.

[0020]De um modo geral, os dispositivos de coleta de amostra de sangue da presente invenção podem abranger qualquer dispositivo de coleta, incluindo tubos, tais como tubos de teste e tubos de centrífuga; dispositivos de coleta de sangue de sistema fechado, tais como bolsas de coleta; seringas, especialmente seringas pré- enchidas; cateteres; microtitulador e outras placas de múltiplos poços; arranjos; tubulação; vasos de laboratório, tais como frascos, frascos giratórios, garrafas cilíndricas, lâminas para microscópio, montagens de lâminas para microscópio, coberturas de vidro, películas e substratos porosos e montagens; pipetas e pontas de pipeta; recipientes para coleta de tecido e outra amostra biológica; e qualquer outro recipiente adequado para conter uma amostra biológica, assim como recipientes e elementos envolvidos em amostras de transferência. Exemplos e ilustrações de vários entre os tais dispositivos são divulgados na Patente U.S. 7.309.468 concedida a Stevens et al.

[0021]A FIG. 1, que também é ilustrada na Patente U.S. 7.309.468, mostra um dispositivo de coleta de sangue típico 10, útil na presente invenção, que inclui um recipiente 12 que define uma câmara interna ou reservatório 14. Na modalidade ilustrada, o recipiente 12 é um tubo oco que apresenta uma parede lateral 16, uma extremidade de fundo fechado 18 e uma extremidade de parte superior aberta 20. Opcionalmente, um elemento de separação 13 é fornecido dentro da câmara do recipiente 14. O elemento de separação 13 serve para auxiliar na separação dos componentes da amostra de sangue, por exemplo, através de centrifugação. O recipiente 12 é dimensionado para coletar um volume adequado de sangue. Um meio de dispositivo de fechamento 22 para cobrir a extremidade aberta 20 para fechar o recipiente 12 é necessário onde um produto estéril é exigido. Em algumas modalidades, o tubo é configurado para uma tampa de rosca. Em modalidades em que o tubo está com vácuo, entretanto, como no caso onde o reservatório contém um inibidor de BchE, mas não um inibidor de protease, um ajuste de aperto, tampão elastomérico é, em geral, utilizado para conter o vácuo durante os períodos de armazenagem exigidos. Preferivelmente, dispositivo de fechamento 22 forma uma vedação capaz de fechar eficazmente o recipiente 12 e reter uma amostra biológica na câmara 14. O dispositivo de fechamento 22 pode ser um entre uma variedade de formas incluindo, mas não limitadas a, dispositivos de fechamento de borracha, dispositivos de fechamento HEMOGUARD™, vedações metálicas, vedações de borracha combinada com metal e vedações de diferentes polímeros e projetos. Uma blindagem protetora 24 pode se sobrepor ao dispositivo de fechamento 22.

[0022]O recipiente 12 pode ser feito de qualquer material adequado para vasos de laboratório, incluindo, por exemplo plásticos (por exemplo, poliolefinas, polia- midas, poliésteres, silicones, poliuretanos, epóxis, acrílicos, poliacrilatos, poliésteres, polissulfonas, polimetacrilatos, PEEK, poliimida e fluoropolímeros) e produtos de vidro, incluindo vidro de sílica. Preferivelmente, o recipiente 12 é transparente. Exemplos de materiais termoplásticos transparentes adequados para o recipiente 12 incluem policarbonatos, polietileno, polipropileno e tereftalato de polietileno. Materiais plásticos podem ser materiais impermeáveis ao oxigênio ou podem conter uma camada impermeável ao oxigênio ou semipermeável. Alternativamente, o recipiente 12 pode ser feito de um material plástico permeável à água e ao ar.

[0023]A pressão na câmara 14 é selecionada para puxar um volume pré-determinado de amostra biológica na câmara 14. Preferivelmente, o dispositivo de fechamento 22 é feito de um material resiliente que é capaz de manter a pressão interna diferencial entre a pressão atmosférica e uma pressão menor do que a atmosférica. O dispositivo de fechamento 22 é tal que ele pode ser perfurado por uma agulha 26 ou outra cânula para introduzir uma amostra biológica no recipiente 12, conforme conhecido na técnica. Preferivelmente, o dispositivo de fechamento 22 é revedável. Ma-teriais adequados para o dispositivo de fechamento 22 incluem, por exemplo, borracha de silicone, borracha natural, borracha de estireno butadieno, copolímeros de etileno- propileno e policloropreno.

[0024]Exemplos adequados do recipiente 12 incluem tubos de parede única e de múltiplas camadas. Um exemplo mais específico de um recipiente adequado 12 é divulgado na Patente U.S. 5.860.937.

[0025]O recipiente 12 também pode conter um separador, tal como um gel, um separador mecânico ou outro tipo de elemento de separação (por exemplo, filtro de papel ou semelhantes). Os separadores são úteis para a preparação de plasma do sangue, especificamente para separar plasma do sangue total humano ou de animal. O gel é desejavelmente uma formulação de gel polimérica tixotrópica. O gel pode ser um homopolímero ou um copolímero e pode incluir géis com base em silicone, tais como, por exemplo, polissiloxanos, ou géis com base em hidrocarboneto orgânico, tais como, por exemplo, poliacrílicos, poliésteres, poliolefinas, cis polibutadienos oxidados, polibutenos, combinações de óleo de soja epoxidado e hidrocarbonetos clorados, copolímeros de diácidos e propandióis, ciclopentadienos hidrogenados e copolí- meros de alfa-olefinas com dialquilmaleatos. Exemplos de separadores mecânicos que podem ser úteis na presente invenção são descritos nas Patentes U.S. 6.516.953; 6.406.671; 6.409.528; e 6.497.325.

[0026]O recipiente 12 também pode ser adaptado para separar centrifuga- mente linfócitos e monócitos a partir de fases mais pesadas de uma amostra de sangue total. Em tais modalidades, os dispositivos também podem conter um meio de gradiente de densidade líquida e um meio para prevenir a mistura do meio de gradiente de densidade líquida com uma amostra de sangue antes da centrifugação. Um exemplo de um tubo de coleta de linfócitos/monócitos adequado é divulgado na Patente U.S. 5.053.134.

[0027]Com a exceção da modalidade ilustrada na FIG. 1, outros tubos de coleta de sangue comercialmente disponíveis adequados para o uso na presente invenção incluem os seguintes, todos os quais são vendidos pela Becton, Dickinson e Company, Franklin Lakes, N.J., com todos os registros e marcas registradas pertencentes à Becton, Dickinson e Company: tubos de hematologia VACUTAINER® (por exemplo, catálogo nos 367650-1,367661,6405, 6385, 6564, 367653, 367665, 367658, 367669, 6450-8, 6535-37 e 367662); tubos de K2EDTA VACUTAINER® (por exemplo, catálogo nos 367841-2, 367856 e 367861); tubos de PST VACUTAINER® (por exemplo, catálogo nos 367793-4, 6698, 6595 e 6672); tubos de CPT VACUTAINER® (por exemplo, catálogo nos 362753 e 362760-1); tubos de SST VACUTAINER® (por exemplo, catálogo nos 367782-89, 6509-17 e 6590-92); e tubos de ACD VACUTAINER® (por exemplo, catálogo nos 367756, 364012 e 4816), e Tubos sem vácuo BD Microtainer® com Dispositivo de fechamento BD Microgard™ (por exemplo, 365987, 365965, e 365974) ou Tubos convencionais BD Microtainer® (por exemplo, 365956, 365957, 365958, 365959, 365971, e 365973). Muitos tubos de coleta de sangue comerciais têm volumes padrão variando tipicamente de 250 microlitros a e incluindo cerca de 10,0 ml, e, em alguns casos, até 16 ml. Volumes típicos incluem 250, 400, e 500 microlitros, assim como 2,0 ml, 3,5 ml, 4,0 ml, 5,0 ml, 8,0 ml, 8,5 ml, e 10,0 ml.

[0028]Em outras modalidades, o dispositivo pode compreender um reservatório integrado dentro de um cartucho de teste, o reservatório capaz de manter um volume de sangue total na faixa de 2 a 200 microlitros, mais preferivelmente, 50 a 150 microlitros. Tais cartuchos são vendidos, por exemplo, sob o nome comercial i-STAT Point of Care System pela Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois), e são usáveis com um analisador portátil capaz de interfaceamento com o cartucho. Exemplos de tais cartuchos e analisadores portáteis usáveis com a presente invenção incluem o cartucho i-STAT CHEM8+ e analisador portátil i-STAT® 1, respectivamente. Tais dispositivos são mostrados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.096.669, 5.112.455, 5.821.399, 5.628.961, 7.419.821, 6.750.053, e US D337.164.

[0029]Lisofosfolipases (LysoPLA) são enzimas que hidrolisam lisofosfolipí- deos (LysoPL) e, especificamente, nas ligações éster de ácido carboxílico, que são intermediários do tipo detergente no metabolismo de fosfolipídeo e desempenham papéis essenciais em muitos processos fisiológicos e patológicos. Lisofosfatidilcolina (LysoPC), um constituinte normal de membranas celulares e que acredita-se atuar como um mensageiro de lipídeos, transduzindo sinais iniciados a partir dos receptores de membrana, é um substrato endógeno para LysoPLA. Aminoácidos e sequências de ácidos nucleicos correspondentes de LysoPLAs humanos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.858.756; 6.004.792 e 7.294.496. De acordo com uma parte de evidência apresentada na Patente U.S. 7.294.496, o mRNA de Lys- oPLA é amplamente distribuído em muitos tecidos, com coração, placenta e músculo esquelético sendo aqueles mais abundantes, seguido por fígado, pâncreas, rim, cérebro e pulmão, e em uma outra parte de evidência (que continha mensageiros a partir de mais tecidos), padrões similares foram observados, apesar de que a intensidade relativa para alguns tecidos foi modificada em tal placenta e testículo, são as fontes mais abundantes para hLysoPLA, seguido por glândulas adrenais e salivares, fígado, coração, músculo esquelético, e traqueia-cólon. Lisofosfolipases também são relatadas ocorrer em numerosas isoformas.

[0030]Exemplos representativos de inibidores de LysoPLA que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem octilfosfonofluoridato de etila, dodecilfosfonofluoridato de isopropila, n-dodecil-benzodioxafosforina 2-óxido, palmi- toil carnitina, bromoenol lactona, palmitil trifluorometil cetona, e fluorofosfonato de me- til araquidonila (MAFP). Outros inibidores podem ser identificados usando métodos de ensaio conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. 7.294.496.

[0031]O inibidor de LysoPLA está presente no dispositivo de coleta em uma quantidade eficaz para estabilizar várias proteínas endógenas que podem estar presentes na amostra biológica, por exemplo, grelina, e outras proteínas e peptídeos que exigem um grupo éster alifático para atividade biológica. Assim, com a exceção de grelina, que é um marcador de doenças metabólicas, tais como diabetes, os dispositivos de coleta fornecem estabilização de outros neuropeptídeos. Os inibidores de LysoPLA funcionam através da inibição da clivagem do grupo éster alifático. A determinação da quantidade do inibidor de LysoPLA para incluir no dispositivo de coleta de sangue depende de vários fatores, incluindo potência, solubilidade em água, o volume do dispositivo de coleta de sangue, e a natureza e extensão de interações não específicas (por exemplo, devido à presença de outras proteínas no sangue, tais como albumina sérica). Consequentemente, para propósitos da presente invenção, a quan-tidade do inibidor de LysoPLA (e as quantidades de agentes de estabilização adicionais que podem estar presentes) é mais convenientemente expressada em termos de uma faixa de concentração (a partir da qual a quantidade real do inibidor pode ser facilmente calculada). A concentração do inibidor de LysoPLA, em geral, varia de cerca de 0,1 μM a cerca de 10 mM, e, em algumas modalidades, de cerca de 10uM a cerca de 1 mM, e, em algumas modalidades, de cerca de 100 uM a cerca de 1 mM (isto é, 10.000.000 nM). Todas as subfaixas dentro destas faixas também são consideradas. O termo “cerca de”, conforme usado em relação a todos os valores de con-centração divulgados neste relatório, se refere à variabilidade (valor mais/menos) de 50 %.

[0032]Embora sem limitar a invenção a uma teoria, os presentes inventores acreditam que o inibidor de LysoPLA pode fornecer um benefício duplo, em que na proteção do grupo éster alifático a partir da clivagem pela LysoPLA, proteases intrínsecas normalmente encontradas no sangue seriam estericamente impedidas de degradar a cadeia de aminoácidos do peptídeo. Dependendo de tais fatores como a natureza do analito, o formato do ensaio e fluxo de trabalho (isto é, manejo e armazenagem da amostra de sangue coletada antes da análise), os dispositivos de coleta de sangue da presente invenção podem fornecer estabilidade de marcadores bioquímicos, tais como grelina, durante horas ou ainda um ou mais dias do que dispositivos similares que não contêm o inibidor de LysoPLA.

[0033]Em algumas modalidades, o recipiente de coleta de sangue inventivo pode incluir pelo menos um agente de estabilização adicional, tal como um inibidor de uma esterase, por exemplo, carboxiesterases, tais como butilcolinesterase e acetilco- linesterase. Estes agentes de estabilização podem fornecer proteção adicional contra degradação ex vivo de proteínas e peptídeos que exigem um grupo éster alifático para a atividade biológica. Assim, com a exceção de grelina, que é um marcador de doenças metabólicas, tais como diabetes, inibidores de esterase podem fornecer estabilização acentuada de outros neuropeptídeos. Em algumas modalidades, entretanto, o agente de estabilização (e o dispositivo como um todo) não inclui um inibidor de esterase.

[0034]Butilcolinesterase (BChE)(E.C. 3,1,1,8), também conhecida como coli- nesterase do soro ou plasma, acredita-se desempenhar um papel na capacidade do corpo metabolizar cocaína e outros fármacos, tais como succinilcolina e aspirina. Veja, Lockridge, “Genetic Variants of Human Serum Butyrylcolinesterase influence the metabolism of the muscle relaxant succinylcholine.” IN, Kalow (ed.) Pharmacogenetics of Drug Metabolism New York: Pergamon Press, Inc, nas páginas 15-50. BChE está normalmente presente no plasma humano em uma quantidade de cerca de 5 mg/l (ou cerca de 5 U/ml). Os inibidores de BChE úteis na presente invenção têm um valor de Ki de não mais do que cerca de 0,5 μM (500 nM), ou, em algumas modalidades, uma Ki de não maios do que cerca de 0,05 μM (50 nM), ou, ainda em outras modalidades, uma Ki de não mais do que cerca de 0,010 μM (10 nM) (e incluindo todas as subfaixas no mesmo). Kis são variáveis cinéticas (ao contrário de propriedades físicas, tais como peso molecular, fusão e pontos de ebulição etc.) e como tal, podem estar sujeitas à variação relativamente ampla, especialmente, dependendo da metodologia usada para determinar este valor. Assim, o termo “cerca de”, conforme usado neste relatório em relação a valores de Ki, se refere a uma variabilidade (isto é, um valor de mais/me- nos) de 50 %.

[0035]Um inibidor de BChE útil na presente invenção é o composto 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina, também conhecida como tacrina (e derivados da mesma). Veja, Patente U.S. 4.816.456. Tacrina é um inibidor de colinesterase centralmente atuante aprovado pela FDA para o tratamento de doença de Alzheimer. Ela é comercializada pela Sciele Pharma sob o nome comercial COGNEX. Exemplos representativos de derivados de tacrina que podem ser adequados para o uso na presente invenção são mostrados na Patente U.S. 4.754.050, conforme mostrado na fórmula seguinte:

em que n é 1, 2 ou 3; X é hidrogênio, alquila inferior, alcóxi inferior, halogênio, hidróxi, nitro, trifluorometila, NHCOR2 onde R2 é alquila inferior, ou NR3R4 onde R3 e R4 são independentemente hidrogênio ou alquila inferior; R é hidrogênio ou alquila inferior; R1 é hidrogênio, alquila inferior, dialquilamino inferior alquila inferior, arilalquila inferior, diarilalquila inferior, furilalquila inferior, tienilalquila inferior, aril alquila inferior ligado em ponte em oxigênio, diarilalquila inferior ligado em ponte em oxigênio, furilal- quila inferior ligado em ponte em oxigênio ou tienilalquila inferior ligado em ponte em oxigênio; Y é C=0 ou CR5OH onde R5 é hidrogênio ou alquila inferior; Z é CH2 ou C=CR6R7 onde R6 e R7 são independentemente hidrogênio ou alquila inferior; ou Y e Z tomados em conjunto é CR5=CH onde CR5 e CH correspondem a Y e Z respectivamente; um oposto óptico dos mesmos, ou um sal de adição de ácido farmaceutica- mente aceitável dos mesmos.

[0036]Derivados de tacrina específicos abrangidos por esta fórmula incluem os seguintes: 9-Amino-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-metilacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-metoxiacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6- fluoroacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-6-cloro-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-7- cloro-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-trifluorometilacridin-1(2H)- ona; 9-Amino-3,4-dihidro-7-nitroacridin-1(2H)-ona; 7,9-Diamino-3,4-dihidroacridin- 1(2H)-ona; N-[9-Amino-3,4-dihidro-1(2H)-oxoacridin-7-il]acetamida; 3,4-Dihidro-9-me- tilaminoacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-metilamino-7-nitroacridin-1(2H)-ona; 3,4-Di- hidro-9-propilaminoacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[2-(dimetilamino)etil]aminoacri- din-1(2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihi- dro-6-metilacridin-1(2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihidro-6-fluoroacridin-1(2H)-ona; 9- Benzilamino-6-cloro-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-Benzilamino-3,4-dihidro-6-trifluo- rometilacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-metilbenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Di- hidro-9-(3-metilbenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-metilbenzilamino)acri- din-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-metoxibenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9- (3-metoxibenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-metoxibenzilamino)acridin- 1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-fluorobenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-flu- orobenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-fluorobenzilamino)acridin-1(2H)- ona; 6-Cloro-3,4-dihidro-9-(4-fluorobenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 9-(2-Clorobenzila- mino)-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-(3-Clorobenzilamino)-3,4-dihidroacridin-1(2H)- ona; 9-(4-Clorobenzilamino)-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[(2,3,4,5,6- pentafluorobenzil)amino]acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-trifluorometilbenzila-mino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-6-fluoro-9-(2-trifluorometilbenzilamino)acridin- 1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-trifluorometilbenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro- 9-(4-trifluorometilbenzilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-fenetilaminoacridin- 1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4,4-difenilbutil)aminoacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4,4- difenilbutilamino)-6-trifluorometilacridin-1(2H)-ona; 9-[4,4-Bis(3-fluorofenil)butilamino]- 3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-[4,4-bis(4-fluorofenil)butilamino]-3,4-Dihidroacridin- 1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-fenoxipropilamino)acridin-1(2H)-ona; 9-[2-[Bis(4-fluorofe- nil)metóxi]etilamino-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-[4-(Benzilóxi)benzilamino]-3,4- dihidroacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[(2-tienil)metilamino]acridin-1(2H)-ona; 9- Amino-2,3-dihidro-ciclopenta[b]quinolin-1-ona; 9-Amino-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-6-cloro-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-7-cloro-1,2,3,4-tetrahidroacri- din-1-ol; 9-Amino-6-metóxi-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-6-fluoro-1,2,3,4-te- trahidroacridin-1-ol; 9-Amino-1,2,3,4-tetrahidro-6-trifluorometilacridin-1-ol; 9-Metila- mino-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Propilamino-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-[2- (Dimetilamino)etil]amino-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-o; 9-Benzilamino-1,2,3,4-tetrahi- droacridin-1-ol; 9-Benzilamino-6-metil-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Benzilamino-6- fluoro-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Benzilamino-6-cloro-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1- ol; 9-Benzilamino-1,2,3,4-tetrahidro-6-trifluorometilacridin-1-o; 9-(2-Metilbenzilamino)- 1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(3-Metilbenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9- (4-Metilbenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(2-Metoxibenzilamino)-1,2,3,4- tetrahidroacridin-1-ol; 9-(3-Metoxibenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(4-Me- toxibenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(2-Fluorobenzilamino)-1,2,3,4-tetra- hidroacridin-1-ol; 9-(3-Fluorobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(4-Fluoro- benzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 6-Cloro-9-(4-fluorobenzilamino)-1,2,3,4- tetrahidroacridin-1-ol; 9-(2-Clorobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(3-Clo- robenzilamino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(4-Clorobenzilamino)-1,2,3,4-tetrahi- droacridin-1-ol; 1,2,3,4-Tetrahidro-9-(2-trifluorometilbenzil)aminoacridin-1-ol; 6-Flu- oro-1,2,3,4-tetrahidro-9-(2-trifluorometilbenzilamino)acridin-1-ol; 1,2,3,4-Tetrahidro-9- (3-trifluorometilbenzilamino)acridin-1-ol; 1,2,3,4-Tetrahidro-9-(4-trifluorometilbenzila- mino)acridin-1-ol; 9-[(2,3,4,5,6-Pentafluorobenzil)amino]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1- ol; 9-Penetilamino-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(4,4-Difenilbutil)amino-1,2,3,4-te- trahidroacridin-1-ol; 9-[4,4-Bis(3-fluorofenil)butilamino]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-[4,4-Bis(4-fluorofenil)butilamino]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(3-Fenoxipropila- mino)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-[[2-[Bis(4-fluorofenil)metoxi]etil]amino]-1,2,3,4- tetrahidroacridin-1-ol; 9-[4-(Benzilóxi)benzilamino]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-[(2- Tienil)metilamino]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-3,4-dihidroacridina; 9- Amino-1-metil-1,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-3,4-dihidro-2-metilenoacridin- 1(2H)-ona; 9-Amino-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]quinolin-1-ol; 2-(3-Oxoclohexen-1- il)aminobenzonitrila; e 4-Cloro-2-(3-oxociclohexen-1-il)aminobenzonitrila.

[0037]Outros inibidores de butirilcolinesterase que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem dímeros de tacrina, tais como etopropazina (isto é, N,N,N-dietil-α-metil-10H-fenotiazino-10-etanamina; 10-(2-dietilamino-2-metiletil)fe- notiazina; ou fenopropazina), e derivados dos mesmos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 2.607.773 e 4.833.138. Etopropazina, sal de cloridreto, foi aprovada pela FDA para o uso no tratamento de doença de Parkinson.

[0038]Outros inibidores de butirilcolinesterase incluem híbridos de tacrina e (-)-huperzina A (que é um alcaloide licodina enantiomérico isolado do licopódio Hu- perzia serrata da espécie Lycopodium, Huperziaceae). Exemplos de híbridos de Hu- perzina A-tacrina são conhecidos na técnica como Compostos 5a, 5b e 5c, e Huprina X. Seus nomes químicos correspondentes são os seguintes:((9E)-N1-(7-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil)-9-etillideno-4,4,7-tri- metilbiciclo[3,3,1]non-6-eno-1,3-diamina)(5a); ((9E)-N1-(7-(1,2,3,4-tetrahidroacridin- 9-ilamino)heptil)-9-etillideno-47-metilbiciclo[3,3,1]non-6-eno-1,3-diamina)(5b); Éster metílico do ácido ((9E)-N1-(7-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptilamino)-9-etilli- deno-3-metilbiciclo[3,3,1]non-3-eno-1-carboxílico)(5c); e (1S)-7-cloro-15-etil-10-aza- tetraciclo[11,3,1,0A{2,11},0A{4,9}]heptadeca-2(11),3,5,7,9,14-hexaen-3-amina)(Hu- prina X). Métodos de sintetizar estes compostos são divulgados em Gemma, et al., J. Med. Chem. 49(11):3421-25 (2006)(5a, 5b e 5c), e Camps, et al., Mol. Pharmacol. 57:409-17 (2000)(Huprina X).

[0039]A concentração de BchE, em geral, varia de cerca de 5 μM a cerca de 500 mM (isto é, 5 x 108 nM), e, em algumas modalidades, varia de cerca de 0,5 μM a cerca de 50 mM, e, ainda em outras modalidades, de cerca de 0,1 μM a cerca de 10 mM. Todas as subfaixas dentro destas faixas também são consideradas. Como no caso dos valores de Ki, o termo “cerca de”, conforme usado em relação a todos os valores de concentração divulgados neste relatório, se refere à variabilidade (valor de mais/menos) de 50 %.

[0040]O agente de estabilização também pode incluir um inibidor de um outro tipo de esterase no soro, e, especificamente, um inibidor de uma outra B-esterase (da qual BChE é um elemento). Estas esterases incluem acetilcolinesterase (AChE)(EC 3,1,1,7) e carboxilesterase não específicas (EC 3.1.1.1). Inibidores de AChE atuam sob colinesterase e inibem a mesma da quebra da acetilcolina que funciona no corpo como um neurotransmissor. Alguns inibidores de BchE, tais como tacrina e huperazina A também são conhecidos para inibir acetilcolinesterase. Tacrina tem uma Ki relatada para AChE de 6,9 nm (Bencharit, et al., Chem. Biol. 10:341 - 9 (2003)). Huperzina A tem uma Ki relatada para AChE de 47 nm (Gemma, et al., J. Med. Chem. 49:3421 - 5 (2006)). Dado que BChE constitui uma porção significante da atividade de esterase total no soro humano (isto é, cerca de 5 mg/L de BChE comparado a 0,008 mg/L para AChE), a inclusão de inibidores no tubo de coleta de sangue é opcional.

[0041]As Kis dos inibidores de AChE adequadas para o uso na presente invenção são tipicamente de cerca de 500 nm ou menos, e, em outras modalidades, menos do que cerca de 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100, nm, 50 nm ou 10 nm. Conforme divulgado neste relatório, valores de Ki para um inibidor de AChE fornecido podem ser determinados, de acordo com técnicas de ensaio padrão.

[0042]Assim, outros inibidores de AChE que podem ser úteis na presente invenção incluem os seguintes:Huprina X ((1S)-7-cloro-15-etil-10-azatetraciclo[11,3,1,0A{2,11 },0A{4,9}]hepta- deca-2(11),3,5,7,9,14-hexae n-3-amina)(Ki de 0,026 nm); Dímero de Tacrina 4a (me- tilbis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amina)(Ki de 0,06 nm); Dímero de Tacrina 4d (2-{bis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amino}etan-1-ol | N,N- Bis[3-[(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]propil]-N-hidroxietilamina)(Ki de 0,65 nm); derivado de Tacrina 2 (6,8-dicloro-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 1,0 nm); Dí- mero de Tacrina 3b (Análogo de Tacrina Homodimérico 3b | N-[7-(1,2,3,4-tetrahidroa- cridin-9-ilamino)heptil]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina | composto homobivalente de tacrina 3a)(Ki de 1,3 nm); Dímero de Tacrina 4c (N,N-Bis[3-[(1,2,3,4-tetrahidroacridin- 9-il)amino]propil]-N-alilamina | prop-2-en-1-ilbis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ila-mino)propil]amina)(Ki de 1,6 nm); Dímero de Tacrina 3c (Análogo de Tacrina Homo- dimérico 3c | N-[8-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)octil]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- amina)(Ki de 1,9 nm); Dímero de Tacrina 4b (N,N-Bis[3-[(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- il)amino]propil]-N-etilamina | etilbis[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amina) (Ki de 2,8 nm); composto heterobivalente de tacrina 3c (N-{7-[(6,8-dicloro-1,2,3,4-te- trahidroacridin-9-il)amino]heptil}-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 6,0 nm); Híbrido de Huperzina A-Tacrina 5c Éster metílico do ácido ((9E)-7-(7-(1,2,3,4-Tetrahi- droacridin-9-ilamino)heptilamino)-9-etillideno-3-metilbiciclo[3,3,1]non-3-eno-1-carbo- xílico | (1S)-9-etillideno-3-metil-7-{[7-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)hep-til]amino}biciclo[3,3,1]non-3-eno-1-carboxilato de metila)(Ki de 6,4 nm); Dímero de Ta- crina 4j (N-Metil-N-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)-N-[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- ilsulfanil)propil]-1,3-propanodiamina | metil[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)pro- pil][3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)propil]amina)(Ki de 9,1 nm); Híbrido de Hu- perzina A-Tacrina 5b ((9E)-N1-(7-(1,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil)-9-etilli- deno-7-metilbiciclo[3,3,1]non-6-eno-1,3-diamina | N-(7-{[(1S)-1-amino-9-etillideno-7- metilbiciclo[3,3,1]non-6-en-3-il]amino}heptil)-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 15,70 nm); Híbrido de Huperzina A-Tacrina 5a (9E)-N1-(7-(1,2,3,4-Tetrahidroacridin- 9-ilamino)heptil)-9-etillideno-4,4,7-trimetilbiciclo[3,3,1]non-6-eno-1,3-diamina | N-(7- {[(1S)-1-amino-9-etillideno-4,4,7-trimetilbiciclo[3,3,1]non-6-en-3-il]amino}heptil)- 1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 16,50 nm); AP2238 3-(4-{[Benzil(me- til)amino]metil}-fenil)-6,7-dimetóxi-2H-2-cromenona | 3-(4- {[benzil(metil)amino]metil}fenil)-6,7-dimetóxi-2H-cromen-2-ona)(Ki de 21,70 nm); Dí- mero de Tacrina 4i (N-(1,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-il)-N-[8-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- il)oct-1-il]amina | N-[8-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)octil]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- amina)(Ki de 30 nm); composto heterobivalente de tacrina 3g (6,8-dicloro-N-[7- (1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)heptil]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 41 nm); Dímero de Tacrina 4m (N-[3-(1,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]-N-[4- (1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)butil]acetamida)(Ki de 47 nm); 9-Amino-6-Cloro- 2-Metoxiacridina (6-cloro-2-metoxiacridin-9-amina)(Ki de 49 nm); Dímero de Tacrina 4k (N-[3-(1,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]-N-[3-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- ilsulfanil)propil]acetamida)(Ki de 50 nm); composto heterobivalente de tacrina 3i (N-[6- (1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)hexil]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 100 nm); composto homobivalente de tacrina 3b (6,8-dicloro-N-{7-[(6,8-dicloro- 1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]heptil}-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 150 nm); Dímero de Tacrina 3a (N-[5-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)pentil]- 1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 210 nm); Dímero de Tacrina 4g (N-[8-(1,2,3,4- tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)octil]-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 250 nm); composto heterobivalente de tacrina 3f (N-{7-[(6,8-dicloro-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9- il)sulfanil]heptil}-1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina)(Ki de 290 nm); Composto Com base em 1,2-Diona, 8 (1,2-dihidronaftaleno-1,2-diona | 1,2-naftoquinona)(Ki de 320 nM); Dímero de Tacrina 4f (N-[7-(1,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)heptil]-1,2,3,4-te- trahidroacridin-9-amina | composto heterobivalente de tacrina 3e)(Ki de 340 nm); e 6,9-Diamino-2-Etoxiacridina (7-etoxiacridina-3,9-diamina)(Ki de 490 nm). Os valores de Ki divulgados neste relatório para os inibidores de AchE acima mencionados são relatados em Gemma, et al., J. Med. Chem. 49:3421 - 5 (2006); Campiani, et al., J. Med. Chem. 48:1919 - 29 (2005); Wong, et al., J. Am. Chem. Soc. 125:363 - 73 (2003); Savini, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:1779 - 82 (2001); Piazzi, et al., J. Med. Chem. 46:2279 - 82 (2003); Bencharit, supra.; e Hyatt, et al., J. Med. Chem. 50:5727 - 34(2007).

[0043]Ainda outros exemplos de inibidores de AChE que podem ser úteis na presente invenção incluem os seguintes: organofosfatos (por exemplo, Metrifonato, Ecotiofato, fluorofosfatos de diisopropila, Ciclosarina, Dimetoato, Sarina, Soman, Tabun, VX, VE, VG, VM, Diazinon, Malation e Paration); carbamatos (por exemplo, Fi- sostigmina, Neostigmina, Piridostigmina, Ambenônio, Demarcarium, Rivastigmina, Al- dicarbe, Bendiocarbe, Bufencarbe, Carbaril, Carbendazim, Carbetamida, Carbofurano, Clorbufam, Cloroprofam, Etiofencarbe, Formetanato, Metiocarbe, Metomil, Oxamil, Fenmedifam, Pinmicarbe, Pirimicarbe, Propamocarbe , Profam e Propoxur); derivados de Penantreno (por exemplo, galantamina); piperidinas (por exemplo, Do- nepezil (E2020)(Ki de 2,9 nm)); Edrofônio; e compostos naturais (por exemplo, galan- tamina e Onquidal).

[0044]Visto que alguns inibidores de BChE também exibem atividade inibitória de AChE potente, modalidades da presente invenção podem incluir um inibidor de esterase único que possui atividades inibitórias de BChE e AChE.

[0045]A concentração do inibidor de esterase do soro adicional que pode estar presente no dispositivo de coleta de sangue, em geral, varia de cerca de 0,1 μM a cerca de 70 mM, e, em algumas modalidades, de cerca de 1 mM a cerca de 7 mM.

[0046]O agente de estabilização também pode incluir um inibidor de protease. Os inibidores de protease úteis na presente invenção exibem atividade inibitória contra uma ou mais classes de proteases incluindo, por exemplo, serina proteases, exopeptidases e dipeptidil peptidases. Assim, o dispositivo pode conter um coquetel de dois ou mais entre tais inibidores, incluindo, por exemplo, um inibidor de uma serina protease e um inibidor de uma exopeptidase, um inibidor de uma serina protease e um inibidor de uma dipeptidil peptidase, um inibidor de uma exopeptidase e um inibidor de uma dipeptidil peptidase, e um inibidor de uma serina protease, um inibidor de uma exopeptidase e um inibidor de uma dipeptidil peptidase. Veja, por exemplo, Patente U.S. 7.309.468, concedida a Stevens, et al.

[0047]Exemplos representativos de inibidores de serina protease incluem an- tipaína, aprotinina, antitrombina, quimiostatina, DFP, elastatinal, APMSF, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), AEBSF, TLCK, TPCK, leupeptina, tripsina e inibidor de trip- sina de soja. Concentrações de inibidores de serina protease, em geral, variam de cerca de 0,1 μM a cerca de 100 μM.

[0048]Exemplos representativos de inibidores de exopeptidase que podem ser úteis na presente invenção incluem amastatina, bestatina, diprotina A e diprotina B. As concentrações de inibidores de exopeptidase, em geral, variam de cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM.

[0049]A atividade de dipeptidil peptidase (que inclui atividades do tipo DPP-IV e DPP-IV) presente na circulação é altamente específica na liberação de dipeptídeos a partir da extremidade N-terminal dos peptídeos biologicamente ativos com prolina ou alanina na penúltima posição da sequência N-terminal do substrato de peptídeo. Os polipeptídeos insulinotrópicos dependentes de glicose GIP1-42 e GLP-17-36, potencializam a secreção de insulina induzida por glicose a partir do pâncreas (incretinas), são substratos de DPP-IV. A enzima DPP-IV libera os dipeptídeos tirosinil-alanina e histidil-alanina, respectivamente, a partir dos N-terminais destes peptídeos in vitro e in vivo. Mentlein, et al., Eur. J. Biochem. 214, 829 (1993). Exemplos representativos de inibidores de dipeptidil peptidase IV (DPP-IV) que podem ser úteis na presente invenção incluem vildagliptina, sitagliptina, saxagliptina, linagliptina e alogliptina. Outros inibidores de DPP-IV incluem compostos de dipeptídeos formados a partir de um aminoácido, tal como isoleucina, Asn, Asp, Glu, His, Pro, e Val, e um grupo tiazolidina ou pirrolidina, e esterioisômeros, por exemplo, formas de L-treo e L-alo dos mesmos, e sais inorgânicos e orgânicos dos mesmos (por exemplo, fosfato, sulfato, acetato, tartarato, succinato e fumarato). Exemplos específicos dos compostos de dipeptídeo incluem L-treo-isoleucil tiazolidida, L-alo-isoleucil tiazolidida, L-treo-isoleucil pirrolidida, e L-alo-isoleucil pirrolidida. As concentrações do inibidor de dipeptidil peptidase, em geral, variam de cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM.

[0050]O agente de estabilização ainda pode conter inibidores de outras classes de proteases. Assim, em outras modalidades, os dispositivos de coleta de sangue também podem conter um inibidor de uma cisteína protease (por exemplo, IAA (ácido indolacético) e E-64), uma serina/cisteína protease (por exemplo, leupeptina, TPCK, PLCK-HCL, 2-heptanona-HCL, e antipaína-HCl), uma protease aspártica (por exemplo, pepstatina, e VdLPFFVdL), uma metaloprotease (por exemplo, EDTA, bestatina, 1,10-fenantrolina e fosforamodon), uma tiol protease, uma protease aspártica/calpa- ína (por exemplo, pepstatina, N-acetil-leu-leu-norleucinal e N-acetil-leu-leu-metioni- nal), uma caspase, uma endopeptidase (por exemplo, α2-macroglobulina (referida como um inibidor de endopeptidase universal), α1-anti-tripsina e tiorfano), e combinações de dois ou mais dos mesmos. Exemplos adicionais de inibidores de protease incluem inibidor de tripsina de soja ou feijão de lima, inibidor de protease pancreática, ovostatina da clara do ovo e cistatina da clara do ovo. Pessoas habilitadas no campo da proteômica avaliam que um dado inibidor pode exibir atividade inibitório contra uma ou mais proteases na mesma classe de proteases, assim como atividade inibitória contra uma ou mais proteases em diferentes classes de proteases. Bestatina e amas- tatina, por exemplo, exibem atividade inibitória contra metaloproteases, assim como exopeptidases.

[0051]As modalidades da presente invenção que utilizam uma pluralidade de agentes de estabilização, por exemplo, além de um inibidor de LysoPLA, um inibidor de protease, ou um inibidor de BChE e um inibidor de protease), também são referidos neste relatório como um coquetel de agente de estabilização.

[0052]O agente de estabilização pode estar presente em qualquer forma adequada, incluindo líquidos (por exemplo, soluções e suspensões) e sólidos (por exemplo, pelota, tablete, cápsula, material seco por pulverização, material liofilizado, pó, partícula, cristais) e semissólidos (por exemplo, gel). A liofilização pode ser particularmente útil na medida em que fornece estabilidade satisfatória (por exemplo, em termos de maximizar a meia-vida do agente de estabilização) e também permite esterili-zação subsequente. Por exemplo, o agente estabilizante pode ser introduzido no recipiente do dispositivo na forma de uma composição líquida, e depois liofilizado por técnicas padrão. A liofilização, por exemplo, envolve o congelamento da composição líquida e depois aquecimento lento depois do congelamento, simultaneamente aplicando um vácuo, tal que um pó liofilizado permanece no dispositivo de coleta. Vários aditivos, tais como PVP ou trealose, podem ser adicionados à composição líquida antes da liofilização para facilitar a peletização do agente de estabilização e reconstituição dos agentes liofilizados sob contato com sangue. A secagem a vácuo também pode ser usada depois de adicionar a composição líquida. Em outras modalidades, o agente estabilizante é formado em um aerossol líquido ou sólido e pulverizado em uma ou mais superfícies do interior do recipiente. O encapsulamento ou formulação do agente de estabilização na forma de um tablete protege o mesmo da exposição à luz e previne outras interações indesejáveis entre os inibidores e outros elementos no recipiente. Os materiais de encapsulamento e excipientes úteis na preparação de tabletes e cápsulas que dissolvem sob a coleta da amostra são bem conhecidos na técnica.

[0053]Além de estar disposto no reservatório, o agente de estabilização pode estar localizado em qualquer superfície do dispositivo de coleta que entra em contato com o sangue coletado. Por exemplo, o agente de estabilização também pode estar localizado em travas e vedações para fechar o dispositivo, ou na mecânica, ou outros insertos colocados dentro do dispositivo.

[0054]Além do agente de estabilização, o dispositivo da presente invenção também pode conter meio portador (por exemplo, água ou álcool), meio estabilizante ou de reconstituição (por exemplo, polivinilpirolidona, trealose, manitol, etc.) e/ou um ou mais outros aditivos para tratar a amostra biológica. Os aditivos típicos incluem fenol, misturas de fenol/clorofórmio, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos orgânicos, sais de ácidos orgânicos, sais de metais alcalinos de haletos, agentes quelantes orgânicos, corantes fluorescentes, anticorpos, agentes de ligação, anticoagulantes, tais como citrato de sódio, heparina, EDTA e seus sais (por exemplo, EDTA potássico), antioxi- dantes, agentes redutores e agente tamponante. Preferivelmente, o portador e aditi-vos não degradam as proteínas. Onde os inibidores estão na forma de tablete, materiais desintegrantes de tablete farmacêuticos, que são conhecidos àqueles habilitados na técnica, podem ser incluídos, se desejado.

[0055]Um processo de fabricação útil para um dispositivo da presente invenção envolve obter um recipiente de coleta, tal como um tubo; adicionar o agente de estabilização (por exemplo, um inibidor de LysoPLA e um inibidor de protease) ao recipiente; liofilizar os inibidores; evacuar o recipiente; e esterilizar o recipiente. Um elemento de separação pode ser adicionado ao recipiente, se desejado. Um exemplo de um processo de liofilização/evacuação adequado é o seguinte: o recipiente é con-gelado em uma temperatura de cerca de -40 °C em uma pressão de cerca de 760 mm para cerca de 6 a 8 horas; o recipiente é seco conforme a temperatura é aumentada de -40 °C a cerca de 25 °C, em uma pressão de cerca de 0,05 mm, durante cerca de 8 a 10 horas; e o recipiente depois está com vácuo em uma temperatura de cerca de 25 °C e uma pressão de cerca de 120 mm durante cerca de 0,1 hora. Preferivelmente, a técnica de esterilização é com radiação com cobalto 60.

[0056]O sangue total ou componente(s) do mesmo pode(m) ser retirados do paciente diretamente no dispositivo de coleta de sangue sem quaisquer etapas de processo de intervenção. Foi descoberto que a coleta do sangue total diretamente a partir do paciente, e introdução da amostra diretamente no dispositivo contendo o agente de estabilização substancialmente previne a degradação e/ou fragmentação de proteínas que, de outro modo, ocorre quando a amostra é armazenada antes da combinação do mesmo com o agente de estabilização. O método da presente invenção é útil com dispositivos de coleta abertos e com dispositivos de coleta fechados em que a abertura é fechada por um meio de dispositivo de fechamento.

[0057]Em uma modalidade preferida, o dispositivo de coleta é um tubo que é usado para projetar uma amostra de sangue total diretamente a partir de um paciente para estabilizar as proteínas imediatamente no momento da coleta. O tubo de coleta pode ser um sistema com vácuo para coletar sangue. Alternativamente, o tubo pode ser um sistema parcialmente com vácuo ou um sem vácuo para coletar sangue. Um exemplo adequado de um sistema com vácuo é um tubo fechado. Uma remoção com seringa manual é um exemplo adequado de um sistema parcialmente com vácuo e sem vácuo. Os sistemas sem vácuo também podem incluir sistemas de remoção automáticos. Os sistemas com vácuo são particularmente preferidos.

[0058]Os dispositivos de coleta de sangue da presente invenção são particularmente adequados para estabilizar proteínas que contêm cadeias laterais de éster alifático, tais como grelina, e nas modalidades que incluem um inibidor de protease, biomarcadores de proteína adicionais da doença, por exemplo, GLP-1, GIP e gluca-gon, que também são biomarcadores para doenças metabólicas, tais como diabetes. Assim, os dispositivos de coleta podem ser usados para fornecer padrões confiáveis em que para facilitar o projeto de ensaios, tais como ELISA, que levará em consideração a detecção destas proteínas na faixa de 10-9 a 10-11 M, que inclui níveis circu-lantes destas proteínas em indivíduos saudáveis, assim como níveis terapêuticos. Assim, além dos métodos de diagnosticar uma doença, tal como um transtorno metabólico em que níveis elevados do marcador em relação a um controle (tal como critérios médicos estabelecidos e/ou uma faixa de concentração derivada de uma população estatisticamente significante de doadores não patológicos) é indicativo da presença da doença, eles podem levar em consideração métodos para monitorar terapia em um paciente que sofre das doenças, tais como transtornos metabólico, em que a normalização (ou uma tendência para normalização) de quantidades destas proteínas é indicativa de terapia bem sucedida.

[0059]Os dispositivos de coleta de sangue da presente invenção também podem ser usados para os propósitos de coletar e armazenar sangue a partir de pacientes que ingeriram pré-fármacos que são acilados (também referido neste relatório como pró-fármacos que transportam cadeias laterais de éster alifático), para propósi-tos terapêuticos, por exemplo, como parte de um regime de tratamento para uma doença ou condição inflamatória. Um pró-fármaco é, em geral, significa um agente fár- maco ativo que é realmente uma forma precursora de um fármaco que é terapeutica- mente inativo ou significantemente menos ativo do que a porção ativa do agente (que pode ser um metabólito). Após a administração, tal como ingestão oral, muitos pró- fármacos são convertidos no fármaco/metabólito ativo por intermédio de clivagem de uma ligação éster via lisofosfolipases intrínsecas. Por exemplo, enalapril é convertido no metabólito ativo enalaprilato, e o pró-fármaco valaciclovir é convertido no fár- maco/metabólito ativo aciclovir. Heroína é desacetilada no fármaco/metabólito ativo morfina. Em contextos clínicos, e, em particular, experimentos clínicos, é vantajoso monitorar os níveis sanguíneos do pró-fármaco, assim como o metabólito ativo em pacientes durante o curso de tempo, por exemplo, a partir de um ou mais entre os pontos de vista de segurança, eficácia, bioatividade e bioequivalência.

[0060]Por exemplo, em estudos de bioatividade, que mensuram a taxa e extensão a qual o ingrediente ativo ou porção ativa é absorvido a partir de um produto de fármaco e se torna disponível no sítio de ação, é recomendado que a concentração e atividade do fármaco precursor e metabólito seja determinada. Em estudos de bio- equivalência (que estudam a extensão da diferença na taxa e extensão a qual o ingrediente ou porção ativa em equivalentes ou alternativos farmacêuticos se torna disponível no sítio de ação do fármaco quando administrado na mesma dose molar sob condições similares), a medição da forma precursora (pró-fármaco) é, em geral, recomendada (exceto em situações em que os níveis de fármaco precursor são muito baixos para permitir medição analítica confiável no sangue, soro ou plasma para uma duração de tempo adequada, ou quando o metabólito contribui de forma significativa para a segurança e/ou eficácia, casos estes em que, a concentração e atividade do pró-fármaco e do metabólito são medidas).

[0061]A análise qualitativo ou quantitativa do sangue coletado a partir de pacientes que foram em tal terapia (que inclui pacientes que estão correntemente sofrendo tal terapia) usando os dispositivos inventivo coleta de sangue inventivos acentua a precisão de qualquer tal análise em que a degradação catalisada por esterase ex vivo do pró-fármaco no sangue coletado é inibida durante a armazenagem. O processamento das amostras de sangue, por exemplo, extração do plasma a partir do sangue coletado, e separação do pró-fármaco e do metabólito ativo, e subsequente medição destas entidades podem ser conduzidos, de acordo com técnicas padrão. Por exemplo, o pró-fármaco e o metabólito ativo podem ser separados por HPLC de fase reversa. A detecção da presença ou quantidades relativas do pró-fármaco e me- tabólito ativo pode ser conduzida, de acordo com técnicas padrão, tais como espec- trometria de massa, seguido por análise dos resultados, por exemplo, por regressão quadrática ou linear ponderada. Veja, por exemplo, Wiltshire, et al., J. Chromatogr. B745:373 - 88 (2000) (e referências citadas no mesmo). Os controles aos quais os valores medidos podem ser comparados incluem calibragem e amostras de controle de qualidade (referidas em Wiltshire, supra, como curvas de calibragem).

[0062]A presente invenção será agora descrita por referência aos exemplos não limitantes seguintes. A menos que de outro modo estabelecido, todas as partes e porcentagens são fundamentadas em peso.

EXEMPLO 1 - ESTABILIDADE COMPARATIVA DE GRELINA EM AMOSTRAS DE PLASMA

[0063]O sangue foi coletado em 4 tubos separados contendo 1) o inibidor de LysoPLA fluorofosfonato de metil araquidonila (MAFP), EDTA, o inibidor de esterase, tacrina, e os inibidores de protease L-treo-isoleucil tiazolidida, bestatina e leupeptina (um agente de estabilização inventivo “ISA”, designado na figura como ▲), 2) um outro agente de estabilização inventivo que inclui o anticoagulante EDTA e MAFP (designado na figura como x), 3) EDTA e o inibidor de esterase e os inibidores de protease (o agente de estabilização comparativo “CSA” designado na figura como ♦), e 4) EDTA sozinho (designado na figura como ■), seguido por reforço de 1 pg/uL de acil-grelina. Todos os quatro tubos foram retirados indiretamente do mesmo paciente para este experimento e identicamente processados. Os dados ilustrados na Fig. 2 indicam claramente que nos tubos 3 e 4 acil-grelina foi sendo degradada com o passar do tempo. Entretanto, os dois tubos (Nos 1 e 2) contendo MAFP mostraram estabilização nas 30 h do tempo de incubação do plasma. O tubo 2, que continha MAFP e EDTA, superou o tubo 1 que continha o inibidor de esterase e os inibidores de protease.

[0064]Em um experimento separado, sangue foi retirado de um paciente em jejum em EDTA e EDTA + MAFP. A concentração do tubo de MAFP final neste experimento foi de 0,1 mM. O plasma foi separado de cada tubo em dois frascos separados. Um frasco foi reforçado com 1 pg/uL de grelina, enquanto o outro não foi reforçado. O plasma reforçado e não reforçado a partir de EDTA e EDTA + MAFP foram incubados na temperatura ambiente durante 30 horas. A Figura 3 mostra os níveis de grelina medidos em intervalos de tempo específicos. Os dados demonstram claramente maior estabilidade de acil-grelina nos tubos contendo MAFP.

[0065]Todas as publicações de patente e publicações de não patente são indicativas do nível de habilidade daqueles habilitados na técnica a qual esta invenção pertence. Todas estas publicações são neste relatório incorporadas como referência como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada como incorporada como referência.

[0066]Embora a invenção neste relatório tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, deve ser entendido que estas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas às modalidades ilustrativas e que outros arranjos podem ser desenvolvidos sem divergir do espírito e escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (16)

1. Dispositivo de coleta (12) para coletar e estabilizar sangue total ou um componente do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma primeira extremidade (18) e uma segunda extremidade (20) e pelo menos uma parede interior (16) que define um reservatório (14), em que o reservatório compreende um agente de estabilização compreendendo um inibidor de lisofosfolipase (LysoPLA), em que o dispositivo compreende um anticoagulante, e em que o dispositivo é um tubo que está pelo menos parcialmente com vácuo e que compreende ainda um dispositivo de fechamento (22) que pode ser perfurado por uma agulha para fornecer sangue ao re-servatório (14).

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o tubo (12) é estéril.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a parede interior (16) compreende plástico ou vidro.

4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o reservatório compreende um elemento de separação (13).

5. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de LysoPLA é fluorofosfonato de metil araquidonila (MAFP).

6. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de LysoPLA é selecionado dentre o grupo que consiste em bromoenol lactona, octilfosfonofluoridato de etila, dodecilfos- fonofluoridato de isopropila, n-dodecil-benzodioxafosforina 2-óxido, bromoenol lac-tona, palmitil trifluorometil cetona e palmitoil carnitina.

7. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de estabilização consiste em um inibidor de butilcolinesterase (BChE), um inibidor de acetilcolinesterase (AChE), ou uma combinação dos mesmos.

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de BChE é tacrina, ou um derivado do mesmo.

9. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de estabilização compreende um inibidor de protease.

10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de protease é um inibidor de uma serina protease, um inibidor de uma endoprotease, um inibidor de uma exopeptidase, um inibidor de uma dipeptidil peptidase, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

11. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de estabilização é liofilizado.

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticoagulante é ácido etileno diamina tetra-acético (EDTA) ou um sal do mesmo, ou heparina.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticoagulante é revestido ou seco por pulverização em pelo menos uma parte da parede interior.

14. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 8 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de estabilização exclui um inibidor de esterase.

15. Método para diagnosticar uma doença metabólica ou monitorar o tratamento de um paciente com uma doença metabólica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende medir, em pelo menos um tempo pré-determinado, a presença ou quantidade de grelina em uma amostra de sangue ou componente do mesmo, em que o sangue foi coletado do paciente em um dispositivo de coleta (12) de sangue, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que uma quantidade medida maior que um controle é indicativa da presença de uma doença metabólica ou eficácia da terapia.

16. Método para detectar a presença ou quantidade de um pró-fármaco e/ou um metabólito ativo do mesmo no sangue ou componente do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende detectar a presença ou medir a quantidade de um pró-fármaco que transporta um grupo éster alifático em uma amostra de sangue ou componente fluido do mesmo, a partir de um paciente ao qual o pró- fármaco foi administrado, em que o sangue ou componente fluido do mesmo foi coletado em um dispositivo de coleta (12) de sangue, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e comparar a presença detectada ou quantidade medida com um controle.

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