CN111999501A - 一种测定人血清脂蛋白磷脂酶a2试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents
一种测定人血清脂蛋白磷脂酶a2试剂盒及其制备和使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,涉及医学及生物化学技术领域,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,试剂R1包括:Tris缓冲液、Tween20、二价金属盐、Proclin300,溶剂为纯化水;试剂R2包括:MES缓冲液、EDC、乳胶微球、Lp‑PLA2单克隆抗体1、Lp‑PLA2单克隆抗体2、BSA、Proclin300,溶剂为纯化水。本发明还公开了一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的制备方法和使用方法。本发明相比现有技术的优点在于:本发明采用胶乳免疫增强比浊法,同时添加的二价盐又使得与酶法检测结果高度相关,能为临床提供准确,高效,稳定的Lp‑PLA2解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域,尤其涉及一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒及其制备和使用方法。
背景技术
大量流行病学资料及临床研究结果表明,动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是目前危害人类健康的首要致死和致残原因。ASCVD是由血脂异常、高血压、年龄、糖尿病、吸烟等各种危险因素所致的动脉系统慢性炎症性疾病。目前国内外指南均采用传统危险因素(不包括炎症指标)为基础的模型预测ASCVD患者的短期和长期风险,但临床实践中仍存在一些具体问题,如危险因素相同的个体发生心血管病事件的风险存在差异、某些不具备传统危险因素的患者仍然发生心血管病事件、接受足量他汀类药物治疗的患者仍有较高心血管剩留风险等。传统危险因素联合生物标志物有望能更全面地评估ASCVD患者的风险,超敏C反应蛋白(hs-CRP)是经典炎症指标,但无血管特异性。近年研究发现,脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)不仅具有血管特异性,而且是冠心病和缺血性卒中的独立危险因素。
目前测定血清(浆)Lp-PLA2活性及质量两种方式均可反映Lp-PLA2水平,但临床上推荐测定血清Lp-PLA2质量,主要采用的方法有发光免疫测定和酶联免疫吸附试验,前者以上转发光免疫分析为代表,操作简单、重复性好,但结果偏差较大,后者以微孔板酶联免疫吸附测定试验(PLAC)法为代表,操作略显复杂,影响因素多,但作为高通量检测,可满足大样本量检测需求。目前乳胶免疫增强比浊法也被用于测定血清Lp-PLA2质量,操作简单,省时省力,能反应被测物质的含量。专利CN106053808A公开一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒及其制备方法,该技术存在的问题如下:但与酶法检测结果存在一定差异,临床样本符合率较差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种可有效提高该试剂盒与酶法试剂盒的临床样本符合率,相关性较好的测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的,一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
试剂R2:
优选地,所述试剂R1中二价盐为Mg2+。
优选地,所述试剂R1中的表面活性剂为Triton X 100。
优选地,所述试剂R2中乳胶微球为聚丙乙烯乳胶微球。
优选地,所述试剂R2中乳胶微球的粒径为100-250nm。
一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量,将Tris溶于纯化水中,搅拌均匀后,配置成缓冲液;
b.按照试剂R1的组分含量,将Tween 20溶于步骤a制得的缓冲液中,搅拌均匀后,再将Triton X 100溶于制得的缓冲液,搅拌均匀后,再将Proclin300溶于制得的缓冲液,混匀后将二价盐溶于其中,即制得试剂R1液;
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量,将MES溶于纯化水中,搅拌均匀后,配置成缓冲液;
b.按照试剂R2的组分含量,将NHS溶于步骤(1)制得的缓冲液中,搅拌均匀;
c.按照试剂R2的组分含量,将EDC溶于步骤(1)制得的缓冲液中,搅拌均匀;
d.再将乳胶微球溶于步骤(3)制得的缓冲液中,搅拌均匀后,室温放置30min;
e.按照试剂R2的组分含量,将脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体溶于步骤(4)制得的溶液中,搅拌均匀后,37℃放置2-3h;
f.按照试剂R2的组分含量,将BSA溶于步骤(4)制得的溶液中,搅拌均匀后,37℃放置1-2h,即制得试剂R2液。
一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2的试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1)将待测样品与试剂R1混合,37℃孵育5min;
(2)加入试剂R2,混合均匀;
(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1;
(4)300s后,采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2;
(5)根据吸光度变化值计算出样本中的Lp-PLA2的浓度。
进一步地,所述步骤(1)和步骤(2)中,试剂R1和试剂R2按照体积比4:1混合。
进一步地,所述步骤(3)和步骤(4)中,在主波长600nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。
进一步地,所述步骤(5)中,吸光度变化值为ΔA,即ΔA=A2-A1。
其反应原理为:在缓冲体系中,脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体与乳胶微球以共价结合的方式存在,当样本中含有脂蛋白磷脂酶A2时,就会与交联乳胶微球的脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体快速的结合,此时乳胶微球因为结合变会聚集形成浊度,在特定的波长下样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量与其形成的浊度成正比,由此计算出样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量。
式中:ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值;
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值;
CS校准液中Lp-PLA2的浓度。
本发明相比现有技术的优点在于:
(1)本发明采用胶乳免疫增强比浊法,同时添加的二价盐又使得与酶法检测结果高度相关,能为临床提供准确,高效,稳定的Lp-PLA2解决方案。
(2)采用抗脂蛋白Lp-PLA2抗体,与血清中Lp-PLA2特异性结合,使得解离下来的脂蛋白不会对抗原抗体的结合造成影响,避免了市面上速率法中酶在使用解离剂不当情况下所造成的样本间差异。
(3)本发明试剂盒样本无需预处理,节省时间,液体双试剂,稳定性好,使用方便。
附图说明
图1是本发明实施例的本试剂盒检测的校准曲线图;
图2是本发明实施例的本发明试剂盒与对比试剂盒的相关性曲线;
图3是本发明实施例的本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线;
图4是本发明实施例的对比试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线;
图5是本发明实施例的Mg2+的浓度为10g/L时本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线;
图6是本发明实施例的Mg2+的浓度为20g/L时本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线;
图7是本发明实施例的Mg2+的浓度为30g/L时本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线;
图8是本发明实施例的Mg2+的浓度为40g/L时本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线;
图9是本发明实施例的本发明试剂盒的线性范围曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
试剂R2:
优选地,所述乳胶微球为聚丙乙烯微球。
优选地,所述乳胶微球的粒径为250nm。
实施例2
本实施例的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
试剂R2:
优选地,所述乳胶微球为聚丙乙烯乳胶微球。
优选地,所述乳胶微球的粒径为250nm。
实施例3
本实施例的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
试剂R2:
优选地,所述乳胶微球为聚丙乙烯乳胶微球。
优选地,所述乳胶微球的粒径为250nm。
实施例4
制备上述测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的方法,包括以下步骤:
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量,将Tris溶于纯化水中,搅拌均匀后,配置成缓冲液;
b.按照试剂R1的组分含量,将Tween20溶于步骤a制得的缓冲液中,搅拌均匀后,再将Triton X 100溶于制得的缓冲液,搅拌均匀后,再将Proclin300溶于制得的缓冲液,混匀后将二价盐溶于其中,即制得试剂R1液;
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量,将MES溶于纯化水中,搅拌均匀后,配置成缓冲液;
b.按照试剂R2的组分含量,将NHS溶于步骤(1)制得的缓冲液中,搅拌均匀;
c.按照试剂R2的组分含量,将EDC溶于步骤(1)制得的缓冲液中,搅拌均匀;
d.再将乳胶微球溶于步骤(3)制得的缓冲液中,搅拌均匀后,室温放置30min;
e.按照试剂R2的组分含量,将脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体溶于步骤(4)制得的溶液中,搅拌均匀后,37℃放置2-3h;
f.按照试剂R2的组分含量,将BSA溶于步骤(4)制得的溶液中,搅拌均匀后,37℃放置1-2h,即制得试剂R2液。
实施例5
本实施例的一种使用上述实施例1-3中测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的方法:
检测仪器:贝克曼AU680全自动生化分析仪。
待测样本:空腹采集,新鲜不溶血血清,无脂浊,2-8℃可稳定七天。
具体步骤:
(1)设置测定管组和空白管组,其中,测定管组:将8uL待测样品与160uL试剂R1混合,37℃孵育5min;空白管组:将8uL蒸馏水与160uL试剂R1混合,37℃孵育5min;校准曲线如图1所示;
(2)各组中分别加入40uL试剂R2,混合均匀;
(3)采用全自动生化分析仪在主波长600nm处测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1;
(4)300s后,采用全自动生化分析仪在主波长600nm处再测定一次混合液的吸光度A2;
(5)根据吸光度变化值ΔA=A2-A1,再结合计算公式计算出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度。
其反应原理为:在缓冲体系中,脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体与乳胶微球以共价结合的方式存在,当样本中含有脂蛋白磷脂酶A2时,就会与交联乳胶微球的脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体快速的结合,此时乳胶微球因为结合变会聚集形成浊度,在特定的波长下样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量与其形成的浊度成正比,由此计算出样本中脂蛋白磷脂酶A2的含量。
式中:ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值;
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值;
CS校准液中Lp-PLA2的浓度。
参考范围:10-200ng/mL。
实施例6
本实施例用以评价上述实施例中测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒:
1、临床样本相关性的检测
(1)利用本发明实施2配方配制试剂,与专利CN106053808A研发的试剂盒(称对比试剂盒),以及与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒进行对照检测。检测62份临床血清样本,检测结果如表1所示,本发明试剂盒的结果以吸光度OD值进行表示,对比试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的结果以Lp-PLA2的浓度进行表示。获得了本发明试剂盒与对比试剂盒的相关性曲线,检测结果如图2所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=2.4703x+50.049,相关系数R2=0.6516,说明两试剂盒的相关性较小。检测获得了本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线,检测结果如图3所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=4.4508x+189.37,相关系数R2=0.91,说明两试剂盒具有较大的相关性。检测获得了对比试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线,检测结果如图4所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=0.5361x-28.056,相关系数R2=0.668,说明两试剂盒的相关性较小。
表1为本发明试剂盒与对比试剂盒以及杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性比对值
(2)利用实施例3配方配制试剂,通过改变试剂R2中Mg2+的浓度,检测试剂R2中Mg2+的浓度对本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的样本相关性的影响。Mg2+的浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L及40g/L时,分别检测5份临床血清样本,检测结果如表2所示。Mg2+的浓度为10g/L时,获得了本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线,检测结果如图5所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=0.1244x-4.1359,相关系数R2=0.97;Mg2+的浓度为20g/L时,获得了本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线,检测结果如图6所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=0.1747x-4.5314,相关系数R2=0.9811;Mg2 +的浓度为30g/L时,获得了本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线,检测结果如图7所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=0.2328x-5.1736,相关系数R2=0.9844;Mg2+的浓度为40g/L时,获得了本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的相关性曲线,检测结果如图8所示,两试剂盒的线性相关曲线为y=0.302x-4.2775,相关系数R2=0.9805.检测结果反映了,本发明在试剂R1中添加了Mg2+,有效提高了该试剂盒与酶法试剂盒的临床样本符合率,相关性较好。
表2为Mg2+的浓度对本发明试剂盒与杭州昂测乳胶比浊法试剂盒的样本相关性的影响的比对值
2、稳定性验证
将上述试剂R1中分别添加4个不同浓度Mg2+的试剂盒在37℃条件下放置10天后的反应度检测6次,取均值,与质控靶值进行比对,比对结果如表3所示。结果表明,二价盐浓度越低,反应度越高,稳定性越好,添加Mg2+浓度为20g/L时符合试剂反应度要求,测定值与靶值相对偏差均小于10.0%。
表3为4个浓度的Mg2+的试剂盒在37℃条件下放置10天后的反应度值
3、线性范围验证
收集接近线性范围上限和下限的样品,高值标本用蒸馏水倍比稀释成5个不同浓度(Xi)的标本,每个标本重复测定3次,分别计算测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量,以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r,在10ng/mL-900ng/mL范围内相关系数r应≥0.990。结果见图9,线性回归方程为y=0.9991x+0.2489,R2=0.9992,说明线性关系良好,线性范围可达10-900ng/mL。
4、稳定性验证。
(1)热稳定性
将本发明的试剂盒置于37℃条件下,放置15天,分别于第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第10天、第11天和低15天时检测OD值变化率,检测结果如表4所示,OD值变化率最低达到4.12%。
表4为本发明试剂盒的热稳定性验证结果
(2)开瓶稳定性
将本发明试剂盒开瓶放置21天,分别于第4天、第5天、第9天、第21天时检测样本值及其OD值,检测结果如表5所示,OD值变化率变化率小于10%。
表5为本发明试剂盒的开瓶稳定性验证结果
5、检测限验证
用试剂盒测试空白样本,重复测试20次,计算20次测试结果的平均值(x)和标准差(SD),检测标准为x+2SD应不大于空白限值。检测结果如表6所示,本发明的试剂盒的最低被测量浓度为0.23233。
序号 | 结果 | Reaction OD |
1 | -0.78 | 0.0006 |
2 | -0.89 | 0.0005 |
3 | 0.11 | |
4 | -1.90 | -0.0004 |
5 | -0.56 | 0.0008 |
6 | -0.56 | 0.0008 |
7 | -0.89 | 0.0005 |
8 | 0.22 | |
9 | -1.00 | 0.0004 |
10 | -0.33 | 0.0010 |
11 | -0.33 | 0.0010 |
12 | -1.00 | 0.0004 |
13 | -1.45 | 0.0000 |
14 | -1.45 | 0.0000 |
15 | -0.33 | 0.0010 |
16 | -0.89 | 0.0005 |
17 | -1.12 | 0.0003 |
18 | -0.89 | 0.0005 |
19 | -0.78 | 0.0006 |
20 | -0.89 | 0.0005 |
AVE | -0.78550 | |
SD | 0.50891 | |
检测限 | 0.23233 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,其特征在于:所述试剂R1中二价盐为Mg2+。
3.根据权利要求1所述的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,其特征在于:所述试剂R1中的表面活性剂为Triton X 100。
4.根据权利要求1所述的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中乳胶微球为聚丙乙烯乳胶微球。
5.根据权利要求1所述的一种测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中乳胶微球粒径为100-250nm。
6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量,将Tris溶于纯化水中,搅拌均匀后,配置成缓冲液;
b.按照试剂R1的组分含量,将Tween20溶于步骤a制得的缓冲液中,搅拌均匀后,再将Triton X 100溶于制得的缓冲液,搅拌均匀后,再将Proclin300溶于制得的缓冲液,混匀后将二价盐溶于其中,即制得试剂R1液;
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量,将MES溶于纯化水中,搅拌均匀后,配置成缓冲液;
b.按照试剂R2的组分含量,将NHS溶于步骤(1)制得的缓冲液中,搅拌均匀;
c.按照试剂R2的组分含量,将EDC溶于步骤(1)制得的缓冲液中,搅拌均匀;
d.再将乳胶微球溶于步骤(3)制得的缓冲液中,搅拌均匀后,室温放置30min;
e.按照试剂R2的组分含量,将脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体溶于步骤(4)制得的溶液中,搅拌均匀后,37℃放置2-3h;
f.按照试剂R2的组分含量,将BSA溶于步骤(4)制得的溶液中,搅拌均匀后,37℃放置1-2h,即制得试剂R2液。
7.一种使用如权利要求1-5任一项所述的测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将待测样品与试剂R1混合,37℃孵育5min;
(2)加入试剂R2,混合均匀;
(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1;
(4)300s后,采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2;
(5)根据吸光度变化值计算出样本中的Lp-PLA2的浓度。
8.根据权利要求7所述的测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(1)和步骤(2)中,试剂R1和试剂R2按照体积比4:1混合。
9.根据权利要求7所述的测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(3)和步骤(4)中,在主波长600nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。
10.根据权利要求7所述的测定人血清脂蛋白磷脂酶A2试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(5)中,吸光度变化值为ΔA,即ΔA=A2-A1。
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