CN110412292A - 一种简单有效去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素c测定试剂盒 - Google Patents

一种简单有效去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素c测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素C测定试剂盒。所述胱抑素C测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其中：试剂R1由缓冲液、电解质、防腐剂组成，pH为3.0‑4.0；试剂R2由抗人胱抑素C抗体胶乳颗粒、缓冲液、抑制剂、保护剂、防腐剂组成，pH为7.0‑8.0。本发明的通过控制试剂R1的pH为3.0‑4.0，简单有效去除试剂盒使用过程中样本类风湿因子干扰。

Description

一种简单有效去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素C测定试 剂盒
技术领域
本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素C测定试剂盒。
背景技术
胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。基本原理是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体或者多抗，当与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变反应液透光性能，并且与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度，如图1所示。免疫透射比浊法的精密度大于散射比浊法，抗干扰能力强，稳定性好，检测速度快。特别是第三代双胶乳颗粒连接抗体的技术，不仅提高了试剂灵敏度，还大大提高了测量范围。目前，PETIA检测试剂所采用的胶乳颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。
1983年Anastasi等首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，后被命名为胱抑素C。也被称为γ-微量蛋白或γ-后球蛋白，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。胱抑素C是一种分泌性蛋白,广泛存在于各种体液中，如脑脊液、唾液、尿液、精液等，其中精液和脑脊液中的浓度最高，尿液中最低。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液。胱抑素C对肾功损伤预测的敏感性明显优于肌酐清除率，是评价肾小球滤过率(GFR)的敏感指标，而且其在血液中的浓度不受感染、炎性、肿瘤及肝功能影响，受年龄、饮食、性别等因素的影响也较小，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。
采用胶乳增强免疫比浊法测定胱抑素C的含量已有研究报道，如中国专利(公告号：CN105738617B)公开了一种胱抑素C胶乳增强比浊检测试剂盒，采用大直径聚苯乙烯胶乳颗粒和小直径聚苯乙烯胶乳颗粒的混合物交联抗胱抑素C抗体；以及中国专利(公告号：CN103645323B)公开了一种胱抑素C检测试剂盒，采用羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒结合样本中的胱抑素C。这些试剂盒在使用过程中都不可避免的会受到类风湿因子(RF)等的干扰，影响最终的检测结果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中胱抑素C试剂盒存在的不足，提供一种胱抑素C测定试剂盒，通过控制试剂R1的pH为3.0-4.0，简单有效去除试剂盒使用过程中样本类风湿因子干扰。
本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：一种简单有效去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素C测定试剂盒，所述胱抑素C测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1由缓冲液、电解质、防腐剂组成，pH为3.0-4.0；
试剂R2由抗人胱抑素C抗体胶乳颗粒、缓冲液、抑制剂、保护剂、防腐剂组成，pH为7.0-8.0。
类风湿因子(RF)是一种多株系自身抗体，并不只在类风湿关节炎患者血清中存在，在其他自身免疫性疾病中也有发现，并且在约5％的正常人群中也以低浓度水平存在。RF主要为IgM型，易与人和动物的变性IgG或免疫复合物中的IgG结合，其结合部位主要在IgG的Fc段。如果样本中存在RF，其易与试剂R2中的抗人胱抑素C抗体反应，从而产生假阴性或假阳性，大大降低检测胱抑素C的准确度。
试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液，将试剂R1的pH控制为3-4，利用pH为3-4的缓冲液可以抑制RF与抗人胱抑素C抗体结合，从而避免假阴性或假阳性的产生。
作为优选，所述试剂R1的缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种或多种，缓冲液的浓度为10-80mmol/L。以上缓冲液均为酸性缓冲液，配置pH范围为3.0-4.0。
作为优选，所述试剂R2的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或多种，缓冲液的浓度为10-80mmol/L。
作为优选，所述试剂R1中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或多种，含量为5-50g/L。
作为优选，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、硫酸庆大霉素、proclin300中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.3-1g/L。
作为优选，所述试剂R2中的抑制剂为抑制剂为1-壬烷磺酸钠、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、苯甲基磺酰氟(PMSF)中的一种或多种，抑制剂的浓度为0.5-10mmol/L。采用血清蛋白酶活性抑制剂，有效的抑制血清中其他蛋白酶对抗体的水解活性，能消除血清中胆红素、乳糜等杂质对结果造成的干扰，提高准确度，除此之外，抑制剂还能提高胱抑素C抗体与胱抑素C的结合。
作为优选，所述试剂R2中的保护剂为BSA、明胶、甘氨酸、海藻糖、蔗糖中一种或多种，保护剂的浓度为5-50g/L。保护剂对抗体起到保护作用，提高试剂盒稳定性。
作为优选，所述抗人胱抑素C抗体胶乳颗粒的含量为0.05-0.5g/L，其中胶乳颗粒直径为10-100nm。本发明中，采用的胶乳颗粒为聚苯乙烯乳胶粒子，粒径为10-100nm，该粒径下的胶乳颗粒可以结合适合量的抗体，有利于提高试剂盒精密度。
作为优选，所述试剂盒还包括校准品和质控品，校准品和质控品成分均包括：胱抑素C蛋白、缓冲液、稳定剂和防腐剂。缓冲液、防腐剂同试剂R2中的缓冲液和防腐剂，所述稳定剂为选自甘氨酸、BSA、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸钠等，稳定剂的浓度为5-20g/L。
本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：一种胱抑素C测定试剂盒的检测方法，所述检测方法包括：
在全自动生化分析仪上设置主波长为570nm，副波长为800nm；
将试剂R1和样本按照体积比60-70:1混合，于35-40℃孵育3-6分钟，随即加入试剂R2混合，试剂R2与试剂R1的体积比为1:3-4，于35-40℃孵育40-80s，读取吸光度A1，再孵育5-10分钟后，读取吸光度A2，计算A2与A1的差值，根据校准曲线计算，得出样本中胱抑素C的含量。
本发明通过调控试剂盒中试剂R1的pH值为3.0-4.0，降低样本RF的干扰作用，提高试剂盒的准确性。该去除样本中类风湿因子干扰的方法简单又有效。
附图说明
图1为实施例1-2和对比例1-4试剂盒R1的pH与类风湿因子吸光度的柱形图。
具体实施方式
下面通过具体实施例以及附图对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
本发明试剂盒测定胱抑素C的检测方法为：
在全自动生化分析仪上设置主波长为570nm，副波长为800nm；将试剂R1和样本按照体积比60-70:1混合，于35-40℃孵育3-6分钟，随即加入试剂R2混合，试剂R2与试剂R1的体积比为1:3-4，于35-40℃孵育40-80s，读取吸光度A1，再孵育5-10分钟后，读取吸光度A2，计算A2与A1的差值，根据校准曲线计算，得出样本中胱抑素C的含量。
具体的操作步骤如表1所示，但是表1仅限操作步骤中的一种实例，不限制保护范围。
表1测定胱抑素C的检测步骤
在测定样本前，需要进行校准和质控程序，使用配套的校准品作校准曲线，一般而言校准曲线每7天重新制作一次，当发生如下情形时，需要重新校准：试剂批号更换时，仪器更换零部件或者保养时，质控品或样本结果异常时。质控程序：采用配套的质控品，每个浓度质控品重复测量10次，计算精密度CV，控制在质控品偏差范围内。
根据校准曲线，计算样本胱抑素C含量：
样本胱抑素C含量(mg/L)＝样本的吸光度△A/标准品的吸光度△A×标准品胱抑素C含量。
实施例1
本实施例中，胱抑素C测定试剂盒包含：
试剂R1：50mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，10g/L氯化钠，0.5g/L proclin300，pH3.0；
试剂R2：0.1g/L抗人胱抑素C抗体聚苯乙烯胶乳颗粒(聚苯乙烯胶乳颗粒直径为20nm)，50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，1mmol/L 1-壬烷磺酸钠，0.5g/L proclin300，10g/L BSA，pH 7.5。
实施例2
本实施例中，胱抑素C测定试剂盒包含：
试剂R1：60mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，20g/L氯化钾，0.3g/L叠氮钠，pH 4.0；
试剂R2：0.2g/L抗人胱抑素C抗体聚苯乙烯胶乳颗粒(聚苯乙烯胶乳颗粒直径为30nm)，40mmol/L磷酸盐缓冲液，2mmol/L 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.6g/L proclin 300，20g/L海藻糖，pH 7.2。
对比例1
对比例1的试剂盒与实施例1的区别仅在于，试剂R1的pH为2.2，其它与实施例1相同。
对比例2
对比例2的试剂盒与实施例2的区别仅在于，试剂R1的pH为4.8，其它与实施例2相同。
对比例3
对比例3的试剂盒与实施例1的区别仅在于，试剂R1的缓冲液为磷酸钠缓冲液，pH7.5，其它与实施例1相同。
对比例4
对比例4的试剂盒与实施例1的区别仅在于，试剂R1的缓冲液为碳酸钠缓冲液，pH9.0，其它与实施例1相同。
1、试剂盒测试类风湿因子
采用实施例1-2以及对比例1-4的试剂盒根据表2的步骤测试浓度为500IU/ML的类风湿因子。全自动生化分析仪上设置主波长为570nm，副波长为800nm。
表2测定500IU/ML的RF步骤
测定结果如图1所示，图1为实施例1-2和对比例1-4试剂盒R1的pH与类风湿因子吸光度ABS△A的柱形图，实施例1-2和对比例1-4试剂盒对应的类风湿因子吸光度ABS△A分别为10、12、60、70、150和220，可知，实施例1-2试剂盒的pH可抑制RF与抗人胱抑素C抗体结合，从而产生较小的吸光度变化，而对比例1-4的试剂盒对RF的灵敏度显著大于实施例1-2的，产生较大的吸光度变化。
2、精确度测定
在重复性条件下，用低高值校准品或质控品测试同一批号试剂盒，至少重复测试10次，本次实验中使用的低值校准品为1μg/ml的校准样品，高值校准品为6μg/ml的质控品，分别计算测量值的平均值(x)和标准偏差(s)，按公式CV＝s/x×100％，计算变异系数(CV)，以及相对误差。
表3低高值校准品测试实施例1-2同一批号试剂盒的精密度值
从表3中可以看出，实施例1-2的试剂盒测试结果与实际低高值校准品浓度相差不大，精密度良好。
3、准确度测定
采用回收试验，在1ml人血清样本中添加0.05ml浓度为20μg/ml胱抑素C标准溶液，常规样本在1ml人血清样本中添加0.05ml去离子水，每个重复3次检测取其均值，按公式计算回收率。
回收率＝(C*(V0+V)-C0*(V0+V水)/V*Cs*100％
式中：
V：加入标准溶液的体积；
V0：人血清样本的体积；
V水：加入去离子水体积；
C：人血清样本中加入标准溶液后的检测浓度；
C0：常规样本的检测浓度；
Cs：胱抑素C标准溶液的浓度。
表4实施例1-2和对比例1-4的回收率
通过加样回收率评价实施例和对比例试剂盒的准确性，如表4所示，实施例1-2的加样回收率分别为97.7％和97.0％，准确度高；而对比例1-4的回收率分别为91.5％、89.2％、87.5％和85.4％，显著低于实施例1-2的，准确度大大低于本实施例1-2。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，并不用于限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种简单有效去除样本中类风湿因子干扰的胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述胱抑素C测定试剂盒包含试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1由缓冲液、电解质、防腐剂组成，pH为3.0-4.0；
试剂R2由抗人胱抑素C抗体胶乳颗粒、缓冲液、抑制剂、保护剂、防腐剂组成，pH为7.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种或多种，缓冲液的浓度为10-80mmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或多种，缓冲液的浓度为10-80mmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或多种，含量为5-50g/L。
5.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、硫酸庆大霉素、proclin 300中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.3-1g/L。
6.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的抑制剂为1-壬烷磺酸钠、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、苯甲基磺酰氟中的一种或多种，抑制剂的浓度为0.5-10mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的保护剂为BSA、明胶、甘氨酸、海藻糖、蔗糖中一种或多种，保护剂的浓度为5-50g/L。
8.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述抗人胱抑素C抗体胶乳颗粒的含量为0.05-0.5g/L，其中胶乳颗粒直径为10-100nm。
9.根据权利要求1所述的一种胱抑素C测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品和质控品，校准品和质控品成分均包括：胱抑素C蛋白、缓冲液、稳定剂和防腐剂。
10.一种如权利要求1所述胱抑素C测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
在全自动生化分析仪上设置主波长为570nm，副波长为800nm；
将试剂R1和样本按照体积比60-70:1混合，于35-40℃孵育3-6分钟，随即加入试剂R2混合，试剂R2与试剂R1的体积比为1:3-4，于35-40℃孵育40-80s，读取吸光度A1，再孵育5-10分钟后，读取吸光度A2，计算A2与A1的差值，根据校准曲线计算，得出样本中胱抑素C的含量。
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