CN111751556A - C3抗体在制备检测试剂盒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域，提供了C3抗体在制备检测外周血清、全血或末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染或者肿瘤的试剂盒中的用途。本发明将C3单克隆抗体或C3单克隆抗体和多克隆抗体包被，胶体金结合多克隆抗体，可提高试剂盒的灵敏度，也可和多克隆抗体联合使用，应用在免疫比浊法（免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、免疫胶乳比浊法）、ELISA法、化学发光法、微流控芯片法、胶体金渗滤法及层析法上。本发明还提供了一种试剂盒，采用C3抗原‑抗体（包含有单克隆抗体和多克隆抗体）结合反应的方法进行检测，可应用于心或脑血栓心或脑梗脑溢血心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染和肿瘤的诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种试剂盒，特别是采用C3在制备检测外周血清、全血或末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染、病毒感染和肿瘤的试剂盒中的用途。
背景技术
C3：分子量185,000道尔顿.骨髓、脾、淋巴结、肝、肺、肠及各种巨噬细胞都有合成C3的功能。由于C3是经典活化途径和旁路活化途径的汇集点，因此C3的测定在临床得到广泛应用。遗传性C3缺陷在慢性肾炎、感染并发肾小球肾炎或心内膜炎、全身性红斑狼疮、急性、慢性肝炎、类风湿关节炎、血清病时血清C3水平下降；在多发性骨髓瘤、前列腺癌、移植排异反应时血清C3水平上升。
C3试剂盒原来是用于诊断外周血C3减少引发的疾病，在筛选上百种抗体中偶然发现在心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞诊断有关联，还与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、病毒感染指标和肿瘤如甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的诊断指标有关联。
发明内容
本发明的目的在于提供C3在制备检测外周血清、全血或末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染或者肿瘤的试剂盒中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中检测心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染和肿瘤如甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的诊断或者病毒感染的手段有限、而且时间长的技术问题。
本发明提供了C3抗体在制备检测外周血清、全血或末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染和肿瘤的试剂盒中的用途。
进一步的，所述的肿瘤为甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌或者膀胱癌。
进一步的，所述的试剂盒包括检测板、兔抗C3抗体、由胶体金标记的羊抗C3抗体结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品，所述的检测板由一个塑料盒底盒组成，所述的塑料盒底盒中设置有一层吸水层，所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上面覆盖一层滤网，所述的滤网上设置有一个塑料盒面盖，所述的塑料盒面盖中央设置有一个检测反应孔，在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加兔抗C3抗体和胶体金标记的羊抗C3抗体结合物，所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液，磷酸盐溶液的pH7.0～7.5之间，牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1.0％，所述的洗涤液是含有Tween-20的Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的pH在7.0～7.5之间，Tween-20在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0.05％，在每毫升胶体金结合物中，羊抗C3抗体的质量为0.25克，所述的阳性参考品为浓度大于1.60g/L的C3抗原。
进一步的，采用胶体金渗滤法及层析法、化学发光法、进行检验。
进一步的，采用ELISA法、免疫比浊法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法或者免疫胶乳增强比浊法进行临床检验常规检测。
进一步的，采用微流控芯片进行检测。
进一步的，所述的兔抗C3抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
本发明提供了一种试剂盒，采用C3抗原-抗体结合反应的方法进行检测。
进一步的，兔抗C3抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体，提高试剂的灵敏度和准确性，(包含有鼠、兔、羊或者马的单克隆抗体或者多克隆抗体)。
本发明的检测原理是：C3抗体和血清中C3抗原的相结合反应。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明可以用于检测人血清样本中C3抗原，作为心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染和肿瘤如甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的诊断。采用本发明的试剂盒1分钟至5分钟内能收到检测报告，检测结果准确而且方便。
具体实施方式
实施例1.试剂盒的制备方法
1.1胶体金结合物制备工艺；
1.1.1制备胶体金；
1.1.1.1 0.05％氯化金溶液300毫升，加热至沸；
1.1.1.2加入5.0％柠檬酸三钠3.6毫升；
1.1.1.3继续加热煮沸15分钟，停止加热，待冷至室温，用蒸馏水恢复至原体积；
1.1.2胶体金标记；
1.1.2.1胶体金100mL；
1.1.2.2加1.0％无水碳酸钠溶液2.4毫升，校pH值6.4～7.2；
1.1.2.3加羊抗C3抗体(1.0mg/mL)2.5毫升，室温静止30分钟；
1.1.2.4搅拌加入10X Tris-HCl 20毫升调控pH 7.2～7.5；
1.1.2.5搅拌加入BSA:2克、PEG20000:1克、ProClin-300:0.2毫升；
1.2检测板制备工艺；
1.2.1装配检测板，取塑料盒底盖,放置吸水层,在吸水层上放置硝酸纤维素膜，盖上塑料盒面盖，压紧；
1.2.2检测点抗体：兔抗C3抗体(1.0mg/mL)1.0毫升加入1.0M NaHCO3:0.1毫升，混匀；
1.2.3取检测点抗体2.0uL，点加在检测板反应孔中心的硝酸纤维素膜上制成检测板；
1.3配制封闭液及洗涤液；
1.3.1配制封闭液，1.0％牛血清白蛋白,0.02M pH7.0～7.5磷酸盐溶液；
1.3.2配制洗涤液，0.05％Tween-20,0.05M pH7.0～7.5Tris-HCl溶液；
1.4正常参考范围确定，以C3抗原测定试剂盒的正常参考范围C3抗原含量0.80g/L—1.60g/L为依据，由于本法为定性检测，样品C3抗原含量在正常参考范围内检测点不显色，故选择以C3抗原含量约1.60g/L的样品做灵敏度检测；
1.4.1实验方法：
1、使用前先将试剂和样品取出，在室温中放置15～30分钟，使其恢复至室温；
2、取出检测板；
3、在检测板反应孔中心加入封闭液2滴，待封闭液完全渗入；
4、用移液器在检测板反应孔中心加入待测样品40微升，待样品完全渗入；
5、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴，待洗涤液完全渗入；
6、在检测板反应孔中心加入胶体金结合物3滴，待胶体金结合物完全渗入；
7、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴，待洗涤液完全渗入，目测结果；
【检验结果判读】
使用者在进行样品检测时，可能会出现如下情况：
a.检测板反应孔中心检测点有红色斑点，为阳性结果；
b.检测板反应孔中心检测点无红色斑点，为阴性结果。
【参考值(参考范围)】
以C3抗原测定试剂盒的正常参考范围C3抗原含量0.80g/L—1.60g/L为依据，样品C3抗原含量在正常参考范围内检测板反应孔中心检测点无红色斑点，
显示阴性结果；
正常参考范围：显示阴性结果(提示C3抗原含量0.80g/L—1.60g/L之间)。
【检验结果的解释】
1、阴性结果，则提示该样本的C3抗原含量0.80g/L—1.60g/L是正常范围；
2、阳性结果，则提示该样本的C3抗原含量＞1.60g/L是不正常范围。
【检验方法的局限性】
1、本方法只能定性测定人血清样本中C3，仅作为辅助诊断使用；
2、反应斑点的稳定性：在30分钟内阳性斑点不会褪色，阴性结果仍无变化。
20例检测结果：(心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞病人)
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
20例健康人(肝功能、肾功能、HBsAg、HIV、丙肝等皆为阴性)以0.80g/L—1.60g/L之间为阴性。
20例心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞4种病人和20例健康人结果对照，完全符合临床诊断。
10种肿瘤病人的60例结果：(甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌)
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
实施例2：免疫胶乳比浊法试剂盒
仪器：7100生化仪
操作方法：将样本采用日立7100生化分析仪进行测定。在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样品加入试剂ⅠR1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入试剂ⅡR2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用日立7100生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤中，将校准品加入试剂ⅠR1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入试剂ⅡR2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；
上述测定的参数为：温度37℃，波长600nm,R1：160uL R2：40uL。样本或校准品3μl，R1：240μl,R2：60μl，反应时间为10分钟。
测20例正常人(肝功能、肾功能、HBsAg、HIV、丙肝等皆为阴性)
| 0.92g/L | 1.27g/L | 1.55g/L | 0.99g/L | 1.41g/L |
| 0.97g/L | 1.22g/L | 1.46g/L | 0.86g/L | 1.57g/L |
| 0.83g/L | 1.45g/L | 1.30g/L | 1.59g/L | 1.53g/L |
| 1.13g/L | 1.53g/L | 1.28g/L | 1.34g/L | 1.43g/L |
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
20例健康人临床诊断结果在0.80g/L—1.60g/L之间，为阴性，符合临床诊断标准。
检测60例肿瘤患者(甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌)
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
60例临床诊断结果在0.80g/L以下或1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
实施例3：20例脑溢血的标本(免疫比浊法)
仪器：7100生化仪
操作方法同实施例2
试剂盒参数：波长600nm,R1：160uL R2：40uL。
20例检测结果：
| 2.30g/L | 1.83g/L | 5.03g/L | 2.67g/L | 4.65g/L |
| 1.78g/L | 1.77g/L | 4.85g/L | 2.82g/L | 5.49g/L |
| 3.25g/L | 2.05g/L | 4.62g/L | 2.71g/L | 6.28g/L |
| 7.26g/L | 2.74g/L | 1.98g/L | 4.33g/L | 5.37g/L |
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
20例脑溢血病人临床诊断结果在1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
实施例4：20例心或脑梗塞的标本(免疫比浊法)
仪器：7100生化仪
操作方法同实施例2
参数：波长340nm,R1：160uL R2：40uL。
20例检测结果
| 3.35g/L | 2.53g/L | 2.75g/L | 4.65g/L | 3.12g/L |
| 3.46g/L | 5.70g/L | 7.92g/L | 6.58g/L | 3.42g/L |
| 4.98g/L | 2.34g/L | 2.65g/L | 2.83g/L | 2.64g/L |
| 1.87g/L | 1.99g/L | 3.75g/L | 2.24g/L | 5.48g/L |
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
20例心或脑梗塞病人临床诊断结果在1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
实施例5：20例心或脑血栓的标本(免疫比浊法)
仪器：7100生化仪
操作方法同实施例2
参数：波长600nm,R1：160uL R2：40uL。
20例检测结果
| 2.15g/L | 4.65g/L | 4.31g/L | 2.45g/L | 7.26g/L |
| 3.47g/L | 5.02g/L | 4.33g/L | 2.36g/L | 4.55g/L |
| 3.26g/L | 5.34g/L | 2.51g/L | 3.41g/L | 6.50g/L |
| 3.45g/L | 5.67g/L | 5.32g/L | 6.98g/L | 2.79g/L |
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
20例心或脑血栓病人临床诊断结果在1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
实施例6：20例心或脑栓塞的标本(免疫比浊法)
仪器：7100生化仪
操作方法同实施例2
参数：波长600nm,R1：160uL R2：40uL。
20例检测结果：
| 5.50g/L | 6.36g/L | 8.46g/L | 5.18g/L | 5.40g/L |
| 6.63g/L | 6.78g/L | 5.39g/L | 6.48g/L | 6.75g/L |
| 6.06g/L | 7.02g/L | 5.50g/L | 6.23g/L | 5.28g/L |
| 8.77g/L | 7.35g/L | 5.45g/L | 5.90g/L | 5.14g/L |
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
20例心或脑栓塞病人临床诊断结果在1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
实施例7：20例化学发光法
本发明化学发光法检测方法，其中包括以下步骤：
1、仪器：MPC-1化学发光测定仪
2、将抗人C3抗体固定在固相表面，加入待测样品和标记的抗人C3抗体，温育，然后用洗涤液洗涤；同时设立C3标准品的对照；
3、加入化学发光底物工作液，放置一段时间；
4、测量发光值，得到待测样本的C3浓度值。
20例检测结果：20例心或脑梗塞病人
| 5.86g/L | 7.50g/L | 6.19g/L | 5.95g/L | 8.55g/L |
| 5.63g/L | 7.74g/L | 6.05g/L | 6.53g/L | 6.46g/L |
| 6.15g/L | 5.84g/L | 7.71g/L | 8.40g/L | 6.73g/L |
| 6.52g/L | 6.16g/L | 6.65g/L | 7.44g/L | 8.46g/L |
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
20例临床诊断结果在1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
实施例8：50例革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒感染的标本(化学发光法)50例检测结果
浓度在0.80g/L—1.60g/L之间是正常。
50例例革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒感染的病人临床诊断结果在1.60g/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.C3抗体在制备检测外周血清、全血或末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染和肿瘤的试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤为甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌或者膀胱癌。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的试剂盒包括检测板、兔抗C3抗体、由胶体金标记的羊抗C3抗体结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品，所述的检测板由一个塑料盒底盒组成，所述的塑料盒底盒中设置有一层吸水层，所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上面覆盖一层滤网，所述的滤网上设置有一个塑料盒面盖，所述的塑料盒面盖中央设置有一个检测反应孔，在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加兔抗C3抗体和胶体金标记的羊抗C3抗体结合物，所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液，磷酸盐溶液的pH7.0～7.5 之间，牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1.0%，所述的洗涤液是含有Tween-20 的Tris-HCl 溶液，Tris-HCl 溶液的pH 在7.0～7.5之间，Tween-20 在Tris-HCl 溶液中的重量百分比为0.05%，在每毫升胶体金结合物中，羊抗C3抗体的质量为0.25 克，所述的阳性参考品为浓度大于1.60 g/L 的C3抗原。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：采用胶体金渗滤法及层析法、化学发光法、进行检验。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：采用ELISA法、免疫比浊法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法或者免疫胶乳增强比浊法进行临床检验常规检测。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：采用微流控芯片进行检测。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的兔抗C3抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
8.一种试剂盒，其特征在于：采用C3抗原-抗体结合反应的方法进行检测。
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|---|---|---|---|
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| CN101718780A (zh) * | 2009-10-29 | 2010-06-02 | 广西师范大学 | 检测人血清补体3的免疫金同步散射光谱试剂盒及使用方法 |
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-
2020
- 2020-07-07 CN CN202010646866.5A patent/CN111751556A/zh active Pending
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