KR102266095B1 - 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 단백질 칩, 키트 및 그 제조방법 - Google Patents

혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 단백질 칩, 키트 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈(Abnormal decarboxylase prothrombin)을 검출하기 위한 단백질 칩, 키트 및 그 제조방법에 관한 것으로, 단백질 검출 기술분야에 속한다. 본 발명은 상기 단백질 칩의 기질 슬라이드 글라스에 각각 하나의 혈청 샘플을 검출하기 위한 복수 개의 검출 하부 영역을 설치하고; 상기 각 검출 하부 영역에는 미량의 DCP 특이적 항체를 분무하여 형성된 검출 반점을 가진 검출 반점 영역 및 소 혈청 알부민을 분무하여 형성된 대조 반점을 가지는 대조 반점 영역이 설치되고; 동일한 검출 반점 영역 내의 모든 검출 반점 위의 물질의 농도가 동일하며; 매개 상기 검출 반점을 형성하는 DCP 특이적 항체의 총량은 3-5L이고, 농도는 3-5mg/mL이고, 각 검출 반점은 비접촉식 스폿팅 장치를 통해 6-10회로 나누어 300-500pL를 분무하는 방식으로 형성되며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm; 인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 단백질 칩, 키트는 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 정확하게 검출할 수 있으며, 임상 사용에서 감도가 높고 시간을 절감하고 간편하고 경제적인 점 등 장점을 가진다.

Description

혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 단백질 칩, 키트 및 그 제조방법
본 발명은 단백질 검출 기술에 관한 것으로, 특히 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈(Abnormal decarboxylase prothrombin)을 검출하기 위한 단백질 칩, 키트 및 그 제조방법에 관한 것이다.
데스-r-카르복시 프로트롬빈(Des-r-carboxy-prothrombin, DCP)은 간세포 암종에 의해 생성되는 비정상적인 프로트롬빈으로서, 정상적인 프로트롬빈과 비교하면, DCP의 분자 구조의 특징은 다음과 같다. 즉, 알라닌 도메인(Gla domain)중의 한 개 또는 복수 개 글루타메이트(Glu)잔기가 Gla로 완전히 카르복실화되지 못해 응혈 기능을 상실하게 된다. 정상적인 프로트롬빈은 간세포 마이크로솜내에서 비타민 K에 주로 의존하는 감마-글루타밀-카복시라제 및 코엔자임과 Vitamin K reductase의 참여하에서, Gla도메인 구조의 제6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위의 10개 Glu잔기를 Gla로 카르복실화하여 활성을 가진 프로트롬빈으로 전환시키는데, 만일 상기 한 개 또는 복수 개 부위의 Glu잔기가 완전히 카르복실화되지 못하면, 모두 DCP를 형성할 수 있으며, 프로트롬빈이 응혈기능을 상실하게 한다.
연구 결과에 따르면, 원발성 간암의 혈청에서 DCP가 현저히 증가했다. 루 펑린(Lu Fenglin)등이 발표한 <데스-γ-카르복시 프로트롬빈이 원발성 간세포 암종에 대한 진단 가치>(중국 종양 임상 2009년 07기)에서는, DCP값이 종양의 크기와 양의 상관 관계를 가진다고 개시하였다. 따라서, 혈청 중의 DCP수준을 정확히 판단하는 것은 임상의가 예후를 판단하거나, 치료방안을 선택하거나 또는 치료효과를 관찰하는데 매우 중요한 가치를 가진다. 병원에서는 임상 검사를 위해 매일 대량의 샘플을 검출해야 하기에, 고처리량 칩을 사용해 검출하면 검출 효율을 대폭 향상할 수 있다. 즉, 저렴한 비용으로 신속하고 정확하게 고처리량으로 검출하는 수단이 제일 바람직한 선택이지만, 현재는 아직 고처리량으로 DCP를 검출하는데 관한 보고가 없는 상황이다.
기존의 검출 방법에서 혈청 중의 DCP를 검출하는 방법으로는 전기화학 발광 면역측정법, 액체친화크로마토 면역법, 면역 침전법, western blot 및 ELISA 등이 있다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 임상 혈청이 매우 복잡하여 다른 간암의 다른 마커를 포함할 뿐만 아니라, 혈청 중의 DCP가 매우 낮기 때문에, 검출대기 혈청의 DCP가 다양한 비특이적 물리적 흡착 또는 비특이적 결합의 영향, 예를 들어, 프로트롬빈, 트롬빈 및 셀룰로오스 및 그 유사체의 간섭을 비교적 크게 받는 것을 알 수 있다.
따라서, 검출 결과의 정확도, 감도 및 특이도를 확보하기 위해, 상기 면역원리를 이용한 검출방법은 모두 다음과 같은 공동한 특징을 가진다. 즉, 매번 검출반응에 사용되는 혈청량이 적으면 50-100ul, 많으면 3-5ml이며, 이에 대응하여, 매번 검출 시에 대량의 항체가 필요하다. 예를 들어, CN101377505 A에서 개시한 마이크로 플레이트 화학 발광 면역 측정법의 경우, 매개 웰에 DCP 항체를 함유한 코팅용액을 150ul를 첨가해야 하고, 필요한 혈청 샘플량은 50ul이며, 게다가 해당 문서에서는 최저 검출한계가 4.37mAU/ml에 도달한다고 개시하였지만, 문서에 기재한 실험에서는 실제 임상 혈청을 사용하여 특이도와 정확도를 검증하지 않았고, 그 검출 데이터는 정상 혈청에 표준 물질을 첨가해 취득한 인공 샘플에서 유래되었다. 또한, 이러한 방법에 의하면, 검출시간이 3-4시간 걸리며, 고처리량 칩을 제조할 경우, 각 샘플에 사용되는 검출 반점 또는 포착 반점의 사이즈가 매우 크게 되고 비용도 매우 높으며, 집적 칩을 만드는 가치를 잃게 된다. 즉, 고처리량 및 저비용의 목적을 달성할 수 없고, 외래 진찰에 보급하기에도 현실적이 되지 못한다. DCP의 고처리량 검출을 실현하려면, 더욱 많은 연구가 필요한 상황이다.
본 발명은 단백질 칩 분야에서 혈청의 DCP검출이 백지상태인 상황을 감안하여, 검출의 정확도, 감도 및 특이도를 확보하는 전제하에 항체, 혈청의 사용량을 최대한 절감하고, 임상 사용에 적합하고, 시간을 절약하며, 경제적이고, 정확하고, 간편한 장점을 가지는 혈청 중의 DCP의 검출에 적절한 고처리량 단백질 칩, 키트 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명의 기술적 해결방법은 다음과 같다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
상기 단백질 칩의 기질 슬라이드 글라스에 각각 하나의 혈청 샘플을 검출하기 위한 복수 개의 검출 하부 영역을 설치하고; 상기 각 검출 하부 영역에는 미량의 DCP 특이적 항체를 분무하여 형성된 검출 반점을 가진 검출 반점 영역 및 소 혈청 알부민을 분무하여 형성된 대조 반점을 가지는 대조 반점 영역이 설치되고; 동일한 검출 반점 영역내의 모든 검출 반점 위의 물질의 농도가 동일하며;
매개 상기 검출 반점을 형성하는 DCP 특이적 항체의 총량은 3-5L이고, 농도는 3-5mg/mL이고, 각 검출 반점은 비접촉식 스폿팅 장치를 통해 6-10회로 나누어 300-500pL를 분무하는 방식으로 형성되며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm; 인 것을 특징으로 하는 혈청의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 단백질 칩을 제공한다.
바람직하게는, 매개 상기 검출 반점 영역은 1열로 배열된 4-8개의 서로 분리된 검출 반점을 포함하고, 상기 대조 반점 영역은 1열로 배열된 4-8개 서로 독립적으로 분리된 대조 반점을 포함하며, 상기 검출 반점 및 대조 반점은 평행된 2열로 배열된다.
바람직하게는, 칩의 길이, 넓이, 폭은 각각 76.4mm, 25.2mm 및 1mm이고, 상기 기질 슬라이드 글라스에는 10개의 상기 검출 하부 영역이 설치된다.
바람직하게는, 상기 검출 하부 영역 사이에는 물리적 칸막이로서 돌기가 설치된다.
바람직하게는, 상기 DCP의 특이적인 단일 클론 항체는 마우스 항-인간 DCP이다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
매개 상기 검출 반점을 형성하는 DCP 특이적 항체의 총량은 3nl이고, 농도는 4mg/ml이고, 상기 DCP 특이적 항체를 6-10회로 나누어 매회에 300-500pl를 분무하는 방식으로 상기 검출 반점을 형성하며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm; 인 것을 특징으로 하는 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 단백질 칩의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 제조방법에서, 분무과정에서 사용하는 상기 DCP 특이적 항체의 온도는 4-8℃이다.
바람직하게는, 비접촉식 스폿팅 장치를 사용해 분무하여 스폿팅한다.
본 발명은 상기한 단백질 칩을 기반으로, 상기 임의의 단백질 칩 및 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체, HRP 화학 발광 기질 용액을 포함하며; 상기 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체는 토끼 유래 항체이며, 상기 검출 반점에 고정된 DCP 특이적 항체와 다른 물종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 혈청의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 키트를 더 제공한다.
혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하는 방법에 있어서, 상기한 임의의 단백질 칩을 사용하며,
검출 대기 혈청 샘플을 희석하여 상기 단백질 칩의 검출 하부 영역에 적가하고, 배양 후, PBST로 검출 하부 영역을 세척하여 비특이적 결합물을 제거하며;
PBS로 희석한 HRP 표지된 프로트롬빈 항체를 첨가하며, 배양 후, PBST로 검출 하부 영역을 세척하여 비특이적 결합물을 제거하며;
HRP 발광 기질 용액을 첨가하고, 화학 발광 스캐너를 사용하여 단백질 칩에 대해 스캐닝하여 희석 후의 검출 대기 혈청 샘플 중의 DCP발광 화소값을 각각 얻으며; 상기 배양은 37℃에서 30분간 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하는 방법.
본 발명은 항체 항원-항체 샌드위치 반응 원리 및 화학 발광 원리에 의해 DCP 특이적 항체를 칩의 슬라이드 글라스에 분무하여 검출 반점을 형성하여 혈청 중의 DCP(프로트롬빈의 탈카르복실화 부위)와 결합하며, 또한 대조 반점이 설치된 DCP의 검출을 위한 화학 발광 단백질 칩을 제공한다.
본 발명인은 다음과 같은 사실을 발견했다. 즉, 종래의 면역 원리 검출 방법에 따라, 포획 항체를 칩 기질의 슬라이드 글라스에 매개 검출 반점의 총량 10ul 및 농도 4mg/ml(검출 반점의 직경은 5-10mm)에 따라 분무하며, 혈청에 순차 농도 구배의 표준 물질 용액(표준 물질 혈청 0mAU/ml, 5mAU/ml, 10mAU/ml, 20mAU/ml, 40mAU/ml, 80mAU/ml, 160mAU/ml, 320mAU/ml, 640mAU/ml)을 첨가하여 검출 샘플로 사용하여 표준 곡선을 작성하며, 매개 검출 하부 영역에 50ul의 혈청 표준 물질을 적가 후, PBST를 사용하여 검출 하부 영역을 세척해 비특이적 결합물을 제거하며; PBS로 희석한 HRP 표지된 프로트롬빈 항체를 첨가하여 배양 후, PBST를 사용하여 세척해 비특이적 결합물을 제거하며; HRP 발광기질 용액을 첨가 후, 화학 발광 스캐너로 단백질 칩을 스캐닝하여 화소값을 얻으며; 표준 물질 혈청의 농도를 가로 좌표로, 화소값을 세로 좌표로 표준 곡선을 작성하고 표준 곡선 회귀 방정식을 만들었지만, 그 결과에 의하면, 표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수가 낮고, 여러 번 반복해도 R2값이 모두 0.6-0.7 사이에 있어 칩의 검출 정확도가 불안정하고, 간섭을 많이 받는다는 것을 설명하며; 조제한 다른 농도의 검증 표준 물질 혈청을 사용하여 표준 곡선을 검증한 결과, 검증 표준 물질 혈청 자체의 농도가 현저히 차이가 나며, 그중에 농도가 80mAU/ml 이하인 검증 표준 물질 혈청의 검출값은 여러 번 반복해도 모두 30mAU/ml 이하이며, 거짓 음성(false negative)을 나타낸다.
본 발명인은 우연한 조정을 통해 포획 항체의 스폿팅양 및 스폿팅에 의해 형성된 검출 반점의 크기를 조정하면 표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수의 변동이 큰 것을 발견하였다. 또한, 스폿팅양을 10ul로부터 점차 감소하고 비접촉식 스폿팅 방식을 이용하는 경우, 표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수가 거의 점차적으로 증가하고, 10nl 이하일 때, 회귀 방정식의 상관계수 R2가 0.65-0.75 사이로 증가하며, 검증 표준 물질 혈청을 사용하여 검증한 값도 더욱 정확해지는 것을 발견하였다. 다만, 스폿팅양이 계속 하강하는 시험에서 검출한 상관계수 R2는 오히려 하강하는 추세를 나타냈다.
표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수 R2이 0.65-0.75 사이에 있으면 바람직하지 못하다. 본 발명인은 다양한 시도를 거쳐, 예컨대 3-5nl의 포획 항체를 6-10회로 나누어 검출 반점 위치에 분무하는 항체를 여러 번 스폿팅하여 분무하는 방식을 발견하였다. 이렇게 제조한 칩을 사용하여 작성한 표준 곡선 방정식의 상관계수 R2이 0.95 이상으로 증가되는 것을 발견하였으며, 검증 표준 물질 혈청 및 임상 혈청에 대한 검출을 통해 얻은 정확한 결과에 따르면, 최소 검출선이 4mAU/ml로 낮아지는 것을 발견하였다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 단백질 칩은 Gla Domain구조의 제6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및/또는 32 부위의 10개 Glu잔기가 완전히 카르복실화되지 못해 형성된 활성이 없는 프로트롬빈을 목표로 한다. 상기 임의의 한 개 또는 복수 개 부위의 Glu 잔기가 완전히 카르복실화되지 못하면 모두 혈청 중에 DCP를 포함하는 제6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및/또는 32 부위의 10개 Glu 잔기가 완전히 탈카르복실화되지 않은 프로트롬빈을 형성하며, 본 발명인은 혈청 중 데스-r-카르복시 프로트롬빈(DCP)의 존재 여부를 정확하게 검출 및 확정하는 고처리량 단백질 칩을 제공하기 위해, 칩의 스폿팅 공정, 검출 반점 항체 농도 및 스폿팅양의 선택과 최적화에 착수하여, 칩의 검출 정확도를 확보하였다. 추측에 의하면, 본 발명의 칩을 소량으로 여러 회 스폿팅하는 방식은 항체가 기판에 균일하고 안정하게 접착되게 함으로써, 검출 반점의 속이 빈 현상을 피면하고 검출 반점의 직경을 확보하였으며, 검출 반점 위치에서의 항체의 합리한 밀도를 확보하여 항체가 3차원 구조 및 활성을 유지하기 위한 충분한 공간을 제공하는 동시에, 저농도 샘플의 검출 화소값이 저밀도로 인해 너무 낮아서 거짓 음성을 형성하는 결과를 방지하였다. 검출 반점의 포획 항체의 사용량, 스폿팅 횟수, 검출 반점의 크기 등 3가지 요소가 최종 검출결과에 직접 영향을 미친다.
도1을 참조하면, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 하나의 상기 검출 하부 영역(2)에는 4개의 고정화된 DCP 특이적 항체의 검출 반점(3) 및 4개의 대조 반점(4)이 포함되며; 검출 반점(3) 및 대조 반점(4)은 각각 평행되는 2열로 배열된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 또한 상기 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 단백질 칩 및 종래의 화학 발광용 키트를 포함하는 DCP를 검출하기 위한 화학 발광 키트를 제공한다.
본 발명의 단백질 칩은 다음과 같은 3가지 장점을 가진다.
1. 혈청 중의 DCP를 검출한다.
2. 복수 개 샘플을 동시에 검출할 수 있다. 복수 개 중복되는 샘플 또는 서로 다른 시점에서 채집한 샘플을 동시에 검출하여 동적 값을 취득하거나, 또는 각각의 다른 샘플을 동시에 검출하는 것으로서, 고처리량의 검출을 실현한다. 전반적으로 검출비용을 절감하고, 검출효율을 향상시킨다.
3. 본 발명의 단백질 칩을 사용하면 필요한 혈액 샘플 및 항체량이 모두 대폭 절감된다. 매개 스폿팅 반점에 대해 매회 300-500pl씩 6-10회 분무하여 총 3nl의 항체를 스폿팅한다. 매개 검출 하부 영역에 4개의 검출 반점이 설치되기에 포획 항체가 12nl 필요하며, 스폿팅의 균일성을 확보하는 동시에 속이 빈 현상의 발생을 효과적으로 감소한다. 또한, 본 발명에서는 원시 혈청량 또는 희석 후의 혈청을 10ul만 필요로 하지만, 기존의 다른 면역 원리에 의한 검출방법은 항체의 사용량이 클 뿐만 아니라, 원시 혈청량 또는 희석 후의 혈청이 적어도 50ul 필요하다.
마지막으로, 본 발명은 또한 상기 키트를 사용하여 혈청에 대해 DCP검출을 진행하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 혈청 중의 DCP를 검출하는 방법은, 상기 단백질 칩에서 항체와 항원의 특이적 결합의 특징을 이용하여, 칩 상에 고정화된 DCP 항체와 혈청 또는 혈장 중의 DCP(비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈의 탈카르복실화 부위)를 결합시키는 단계; 그 다음에 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체를 첨가하여, 프로트롬빈 다클론 항체가 DCP(비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈) 탈카르복실화 부위 이외의 에피토프에 결합되는 단계; 마지막에 HRP 발광기질을 첨가하여, 화학 발광 스캐너를 통해 발광신호를 스캐닝하여 양자화하는 단계;를 포함한다.
실험결과에 따르면, 본 발명의 방법은 발광강도를 통해 프로트롬빈 및 DCP에 대해 검출할 수 있다. ELISA방법과 비하면, 감도와 특이도가 모두 ELISA방법보다 우수하고, 시간을 비교하면, ELISA검출은 적어도 3시간이 필요한 반면에 본 발명은 단지 1.5시간만 필요하며; 검출에 필요한 혈청량을 비교하면, 본 발명은 원시 혈청량 또는 희석 후의 혈청이 10ul만 필요하지만, ELISA방법은 검출에 원시 혈청량 또는 희석 후의 혈청이 적어도 50ul 필요하며; 포획 항체의 사용량을 비교하면, 필요한 양이 ELISA방법보다 훨씬 적으며, 본 발명의 칩은 비접촉식 잉크젯 스폿팅 방법을 사용하여 매개 검출 반점에 대해 매회 300-500pl씩 6-10회 분무하여 총 3nl의 항체를 스폿팅하고, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm이다. 매개 검출 사각형은 4개의 검출점을 가지고, 포획 항체가 12nl 필요하며; 분무점의 부피를 정확하게 제어해 여러 회 분무하기에 스폿팅의 균일성을 확보하고, 속이 빈 현상의 발생을 효과적으로 감소하며, 검출 정확도를 대폭 향상하고, 항체의 사용량과 혈청 사용량을 절감하며, 검출원가와 비용을 절감하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 키트 및 검출방법은 감도가 높고, 시간을 절감하고 경제적인 특징을 가지며, 혈액 단백질 검출 비용 및 시간을 대폭 감소시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 비정상적인 탈카르복실화 특이적 항체, 화학 발광 검출 방법 및 단백질 칩 기술의 적용을 결합하여 키트를 사용한 DCP 검출결과의 고감도, 정확도 및 낮은 비용을 확보하였다. 본 발명에 의해 제공되는 검출방법은 실현 가능하고 신뢰성을 가지고 경제적이고 간편하며 시간을 절감할 수 있는 방법이다. 본 발명의 기술적 해결방법은 대규모적으로 고처리량으로 혈청 중의 DCP 검출을 위해 경제적이고 신뢰성이 있는 키트 및 검출방법을 제공한다.
도1은 DCP단백질 칩의 구조도이다.
도2는 DCP항체 샌드위치 법에 의한 단백질 칩의 흐름도이다.
도3은 DCP항체 스폿팅 칩을 사용하여 간암 및 정상 혈청 샘플을 검출한 스캔 도면이다.
이하, 구체적인 실시방식을 결부하여, 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 별도로 명시하지 않은 한, 이하 실시예에서 사용된 절차는 모두 통상적인 방법이고, 사용된 시약은 모두 상업적으로 입수 가능한 것이다.
실시예1. 단백질 칩1 내지 단백질 칩4의 제조 및 검증
주요한 설비 및 기기
화학 발광 스캐너, 미국 GE사.
주요 시약 및 출처
마우스 단일 클론 항체 DCP 항체(일본FUJIREBIO사), 알데히드 칩(상하이바이오사), HRP 표지된 프로트롬빈 토끼 유래 항체(미국Fitzgerald사), HRP 화학발광 기질 용액인 A용액 및 B용액을 1:1의 비례에 따라 혼합하여 새로 배합(미국Millipore사).
비정상적인 프로트롬빈 표준 물질: 일본FUJIREBIO사.
실험에 사용된 시약 및 도구: DCP 항체(일본FUJIREBIO사); HRP 표지된 토끼 유래 항체(미국Fitzgerald사); 화학 발광 스캐너(미국GE사).
PBS배합: 염화나트륨(NaCl) 8g, 염화칼륨(KCl) 0.2g, 인산이수소나트륨(Na2HPO4) 1.44g, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.24g을 배합하여 pH 7.4로 조정하고 용액이 1L되게 한다.
PBST배합: PBS, 1L＋Tween-20, 1ml
기질 슬라이드 글라스(1)는 알데히드 칩(상하이바이오사)이며, 매개 칩은 10개의 검출 사각형(검출 하부 영역)을 포함하며, 매개 사각형은 혈청을 한 개 검출하며, 1회에 10개의 혈청을 검출가능하며, 길이Х폭Х두께는 각각 76.4Х25.2Х1mm이다.
단계 1. 칩1 내지 칩4 제조
매개 검출 하부 영역(2)에서, DCP 항체의 스폿팅 농도 4mg/ml로 마우스 DCP 항체를 칩 상에 순차적으로 스폿팅한다.
매개 검출 하부 영역(2)에는 미량의 DCP 특이적 항체를 분무하여 형성된 검출 반점(3)을 가진 검출 반점 영역과, 농도가 4mg/ml인 소 혈청 알부민을 분무하여 형성된 대조 반점(4)을 가진 대조 반점 영역이 설치된다.
스폿팅 방법은 다음과 같다.
칩1: 매개 검출 사각형에서 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 10ul이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 10ul이며;
칩2: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 5ul이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 5ul이며;
칩3: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 1ul이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 1ul이며;
칩4: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 100nl이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 100nl이며;
통상적인 접촉식 스폿팅 방식을 사용한다.
단계2. 표준 곡선 및 표준 물질을 사용하여 칩을 검증
표준 물질 제조:
정상적인 혈청에 일련의 농도 구배에 따라 비정상적인 프로트롬빈 표준 물질 및 검증용 표준 물질 혈청을 첨가한다.
표준 물질 혈청: 0mAU/ml, 5mAU/ml, 10mAU/ml, 20mAU/ml, 40mAU/ml, 80mAU/ml, 160mAU/ml, 320mAU/ml, 640mAU/ml);
검증용 표준 물질 혈청: 0mAU/ml, 2mAU/ml, 4mAU/ml, 8mAU/ml, 16mAU/ml, 35mAU/ml, 50mAU/ml, 70mAU/ml, 90mAU/ml, 120mAU/ml, 150mAU/ml, 300mAU/ml).
단백질 칩 조작 흐름:
검출 대기 샘플 10ul(2.5ul의 혈청용 PBS를 4배로 희석하여 제조할 수 있음)를 칩의 매개 검출 하부 영역에 적가하여 37℃에서 30분간 배양하며, 항원-항체 결합의 특성을 이용하여 혈청 중의 DCP 및 DCP 항체가 결합하여 항원-항체 복합체를 형성하게 한다.
PBST를 사용해 4회 세척하여 비특이적 결합물을 제거 후, PBS로 희석한 HRP 표지된 토끼 유래 1차 항체를 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한다. 토끼 유래 항체는 항원과 결합되어 DCP 항체-DCP-토끼 유래 HRP 표지된 프로트롬빈 항체 복합체를 형성한다.
PBST를 사용해 4회 세척하여 비특이적 결합물을 제거 후, HRP 발광 기질을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양하고, 그 다음에 화학 발광 스캐너로 스캐닝하여 검출 반점 화소값을 얻는다.
고상 담체상의 화학 발광 화소와 검체의 시험 항원의 량이 양의 상관 관계를 가지며, 칩 포획 스폿팅 항체(마우스 유래 1차 항체) 및 검출용 항체(토끼 유래 1차 항체)는 각각 상이한 종의 동물로부터 채집하며, 프로트롬빈의 상이한 에피토프에 대항한다. 도2는 항체 샌드위치 법에 의한 단백질 칩의 흐름도이다.
표준 물질 혈청의 농도를 가로 좌표로, 화소값을 세로 좌표로 표준 곡선을 작성하여 표준 곡선 회귀 방정식을 만든다.
칩1 내지 칩4에 의해 얻어진 표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수의 제곱값 R2은 0.55-0.6 사이에 있으며, 표준 물질 농도와 화소값 사이의 선형 상관 관계는 바람직하지 못하다.
조제한 다른 농도의 검증 표준 물질 혈청을 사용하여 표준 곡선을 검증한 결과, 검증 표준 물질 혈청 자체의 농도가 현저히 차이가 나며, 그중에 농도가 80mAU/ml이하인 검증 표준 물질 혈청의 검출값은 여러 번 반복해도 모두 30mAU/ml 이하로서, 진단 한계값인 40 mAU/ml보다 작으며, 거짓 음성(false negative)을 나타낸다.
단계3. 알려진 DCP함량의 임상 혈청을 사용하여 이 칩들을 검증하며, 혈청 샘플은 다음과 같다.
간암 혈청 35개: 출처는 수도의과대학교 부속 우안병원 표본 라이브러리이고, 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈 농도가 진단 한계값인 40 mAU/ml(l mAU/ml = 1ng/ml) 이상임을 알고 있음;
정상적인 건강한 사람 혈청 28개: 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈 농도가 진단 한계값보다 작음;
공백 대조군 7개(공백 대조군1ХPBS), 검출 결과의 통계는 하기 표1과 같다.
칩1 내지 칩4의 검출
칩1 칩2 칩3 칩4
DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml		 DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml		 DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml		 DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml
간암혈청(35) 20 15 21 14 24 11 24 11
건강한 혈청(28) 0 28 0 28 0 28 0 28
공백 대조군(7) 0 7 0 7 0 7 0 7
표1의 결과로부터 알 수 있듯이, 공백 대조군 9개에서 DCP가 검출되지 않았고; 건강한 혈청 28개에서 DCP가 검출되지 않았고; 간암 혈청 35개 중에서 단지 20-24개에서만 DCP가 임계값보다 크게 검출되었는데, 다시 말하면, 이러한 칩들의 검출 감도가 (20～24)/35＝57.1%~68.6%로서, 검출 누락 비례가 매우 높다.
실시예2. 칩5 내지 칩7의 제조 및 검증
단계1. 칩 제조
칩5: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 10nl이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 10nl이며;
대조 칩6: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 5nl이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 5nl이며;
대조 칩7: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 2nl이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 2nl이며;
대조 칩5 내지 대조 칩7은 독일 GESIM사의 Nano-Plotter NP2.1모델의 비접촉식 PL급 스폿팅 장치를 사용하였고, 압전 스폿팅 바늘을 사용하였으며, 스폿팅 장치의 챔버 내부 온도를 4-8℃로 제어하였다.
단계2. 단계 및 실험용 시약은 실시예1과 동일하다.
칩5 내지 칩7에서 얻은 표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수의 제곱값 R2이 6.5-7.5 사이로 점차 증가하며, 표준 물질 농도와 화소값 사이의 선형 관계가 현저히 개선된 것을 알수 있다.
조제한 다른 농도의 검증 표준 물질 혈청을 사용하여 표준 곡선을 검증한 결과, 검증 표준 물질 혈청 자체 농도의 차이가 줄어들고 있으며, 최소 검출 한계가 4mAU/ml에 도달할 수 있다.
단계3. 알려진 임상 혈청을 사용하여 칩을 검증
혈청은 실시예1의 단계3의 혈청과 동일하며, 검출결과의 통계는 표2와 같다.
칩5 내지 칩7의 검출결과
칩8 칩9
DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml		 DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml
간암혈청(35) 27 8 30 5
건강한 혈청(28) 0 28 0 28
공백 대조군(7) 0 7 0 7
표2의 결과로부터 알 수 있듯이, 공백 대조군 9개에서 DCP가 검출되지 않았고; 건강한 혈청 28개에서 DCP가 검출되지 않았고; 간암 혈청 35개 중에서 단지 27-30개에서만 DCP가 임계값보다 크게 검출되었는데, 다시 말하면, 이러한 칩들의 검출 감도가 (27～30)/35＝77.1%~85.7%로서, 검출율이 현저히 제고되었지만, 검출 누락 비례가 여전히 비교적 높다. 단계2의 검증 표준 물질 혈청의 검증 상황을 참조하면, 대체적으로 검출 한계가 낮아 검출 누락을 초래한 것으로 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 스폿팅양을 한층 더 줄였지만, 얻은 표준 곡선에서 표준 물질 농도와 화소값 사이의 선형 관계가 개선된 것을 관찰하지 못했다. 검증 표준 물질 혈청 및 임상 혈청에 대한 검증에서도 칩5 내지 칩7에서보다 현저한 개선이 없다.
실시예3. 칩8 내지 칩10의 제조 및 검증
본 발명인은 항체 정제, 시약 배합에서부터 검출 온도와 시간 등에 대한 다양한 시도를 하였지만, 표준 물질 농도와 화소값 사이의 선형 관계가 한층 더 개선되는 것을 발견하지 못했고, 검출율이 90%이상에 도달하기 매우 어려웠다. 다만, 우연한 시험에서, 본 발명인은 항체를 소량으로 여러 회 나누어 스폿팅하는 방법을 시도하였는데, 이런 방법으로 얻은 칩이 실시예2의 기타 조건이 변하지 않는 상황에서 표준 곡선의 상관계수 R2가 이외로 0.9－0.95로 부상되었고, 검출율도 상응하게 92-95%로 제고되었으며, 구체적으로 다음과 같다.
단계1. 칩8 및 칩9의 제조
칩8: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 3nl이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 항체량은 5nl이며; 독일 GESIM사의 Nano-Plotter NP2.1모델의 비접촉식 PL급 스폿팅 장치을 사용하였고, 압전 스폿팅 바늘을 사용하였으며, 스폿팅 장치의 챔버 내부 온도는 4-8℃로 제어하고, 매개 스폿팅 반점에 대해 매회 300-500pl씩 3-5회 분무하여 총 3nl의 항체를 스폿팅하며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm이고, 칩 구조는 도1과 같다.
칩9: 마우스 DCP 단일 클론 항체의 스폿팅 농도는 4mg/ml이고, 매개 검출 반점의 항체량은 5nl이며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하며, 매개 대조 반점의 총량은 5nl이며; 독일 GESIM사의 Nano-Plotter NP2.1모델의 비접촉식 PL급 스폿팅 장치을 사용하였고, 압전 스폿팅 바늘을 사용하였으며, 스폿팅 장치의 챔버 내부 온도는 4-8℃로 제어하고, 매개 스폿팅 반점에 대해 매회 300-500pl씩 6-10회 분무하여 총 3nl의 항체를 스폿팅하며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm이다.
단계2 단계 및 실험용 시약은 실시예1과 동일하다.
칩8 또는 칩9에 의해 얻어진 표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수의 제곱값 R2 이 9.2-9.5 사이로 부상되었고, 표준 물질 농도와 화소값 사이의 선형 관계가 매우 현저하게 개선되었다.
조제한 다른 농도의 검증 표준 물질 혈청을 사용하여 표준 곡선을 검증한 결과, 검증 표준 물질 혈청 자체의 농도가 오차 허용 범위에 속하는 미소한 차이만 존재하며, 그중에 농도가 60mAU/ml인 검증 표준 물질 혈청의 검출값이 한계값 이하이며, 거짓 음성(false negative)을 나타낸다. 여전히 현저한 거짓 음성을 가진다.
단계3. 알려진 임상 혈청을 사용하여 칩을 검증
혈청은 실시예1의 단계3의 혈청과 동일하며, 검출결과의 통계는 표3과 같다.
칩8 및 칩9의 검출 결과
칩8 칩9
DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml		 DCP
≥40mAU/ml		 DCP
<40mAU/ml
간암혈청(35) 33 2 34 1
건강한 혈청 (28) 0 28 0 28
공백 대조군(7) 0 7 0 7
표3의 결과로부터 알 수 있듯이, 공백 대조군 9개에서 DCP가 검출되지 않았고; 건강한 혈청 28개에서 DCP가 검출되지 않았고; 간암 혈청 35개 중 33개에서 DCP가 임계값보다 크게 검출되었는데, 다시말하면, 이러한 칩들의 검출 감도가 (33～34)/35＝94.3%~97.1%로서, 검출율이 거의 100%에 도달한다.
최종 결정한 최적 칩 방안은 다음과 같다.
매개 검출 사각형(검출 하부 영역)내에서, 마우스 DCP 항체를 칩 상에 DCP항체 스폿팅 농도 4mg/ml로 순차적으로 1열에 4개의 검출 반점을 스폿팅하며; 10%의 소 혈청 알부민(BSA)을 음성 대조군으로 하여 마찬가지로 4회 스폿팅하여 대조 반점을 형성하며; 독일 GESIM사의 Nano-Plotter NP2.1모델의 비접촉식 PL급 스폿팅 장치를 사용하였고, 압전 스폿팅 바늘을 사용하였으며, 스폿팅 장치의 챔버 내부 온도는 4-8℃로 제어하고, 매개 스폿팅 반점에 대해 매회 300-500pl씩 6-10회 분무하여 총 3nl의 항체를 스폿팅하며, 매개 검출 하부 영역에 4개의 검출점을 포함하기에 포획 항체가 12nl 필요하며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm이다.
실험예 최적 칩 방안의 적용효과
표준 곡선 회귀 방정식의 상관계수 R2이 0.98이다.
혈청 샘플:
간암 혈청 8개: 출처는 수도의과대학교 부속 우안병원 표본 라이브러리(비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈 농도가 진단 한계값인 40 mAU/ml(l mAU/ml = 1ng/ml)이상임을 알고 있음);
정상적인 건강한 사람의 혈청 1개;
공백 대조군 1개(공백 대조군 1ХPBS).
본 칩의 검출 결과:
공백 대조군 및 건강한 대조군에서 모두 비정상적인 프로트롬빈이 검출되지 않았는 바, 이는 본 실험에서 사용한 칩이 유효하다는 것을 설명한다. 정상 사람의 체내에 비정상적인 프로트롬빈이 존재하지 않으며, 건강한 혈청에서 프로트롬빈이 검출되지 않았다. 이것은, 본 발명의 칩 및 방법에 따라 검출한 거짓 양성(false positive)이 0이며, 검출결과에 따라 간암 혈청과 정상 혈청을 정확하게 구분할 수 있다는 것을 설명한다.
간암 혈청 8개의 검출 반점 스캔 및 컴퓨팅 결과는 양성을 나타냈는 바, 이것은 간암 혈청 8개 중에서 특히 간암 말기 환자의 체내에 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈이 존재한다는 것을 설명하고, 8개 양성 검출 하부 영역의 검출 반점에 서로 다른 정도의 밝기가 표시되는데, 이것은 8개 간암 혈청이 서로 다른 농도의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 포함한다는 것을 설명한다. 도3을 참조하면, 3 및 5는 약한 양성을 나타내고, 검출 반점의 밝기가 약하지만, 1, 2, 4, 6, 7, 8은 모두 강한 양성을 나타낸다. 검출 결과는 본 발명의 단백질 칩이 간암 혈청을 정확하게 검출할 수 있고, 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈의 농도를 반정량적으로 검출할 수 있다는 것을 설명한다. 상기 데이터는 본 발명의 칩 및 방법이 양호한 정확도 및 신뢰성을 가진다는 것을 설명한다.
다른 수십 개의 외래 진료에서 간암으로 확인된 환자의 혈청에 대한 검출에서, 검출 감도 및 특이도가 모두 90%에 도달했다.
본 발명의 키트:
일부 칩의 검출 하부 영역(2) 사이에 물리적 칸막이(5)로서 돌기가 설치된 실시예3의 칩 및 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체, HRP 화학발광 기질 용액을 포함하며, 상기 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체는 토끼 유래 항체이며, 상기 검출 반점에 고정된 DCP 특이적 항체와 다른 물종으로부터 유래된다.
1: 기질 슬라이드 글라스
2: 검출 하부 영역
3: 검출 반점
4: 대조 반점
5: 물리적 칸막이
8: 간암혈청
9: 건강한 대조 혈청
10: 공백 대조군

Claims (10)

  1. 혈청의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 고처리량 단백질 칩에 있어서,
    상기 단백질 칩의 기질 슬라이드 글라스에 각각 하나의 혈청 샘플을 검출하기 위한 복수 개의 검출 하부 영역을 설치하고; 상기 각 검출 하부 영역에는 미량의 DCP 특이적 항체를 분무하여 형성된 검출 반점을 가진 검출 반점 영역 및 소 혈청 알부민을 분무하여 형성된 대조 반점을 가지는 대조 반점 영역이 설치되고; 동일한 검출 반점 영역내의 모든 검출 반점 위의 물질의 농도가 동일하며;
    각각의 검출 반점을 형성하는 DCP 특이적 항체의 총량은 3-5nL이고, 농도는 3-5mg/ml이고, 각 검출 반점은 비접촉식 스폿팅 장치를 통해 6-10회로 나누어 300-500pL를 분무하는 방식으로 형성되며, 검출 반점의 직경은 0.5-1mm; 인 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    매개 상기 검출 반점 영역은 1열로 배열된 4-8개의 서로 분리된 검출 반점을 포함하고, 상기 대조 반점 영역은 1열로 배열된 4-8개 서로 독립적으로 분리된 대조 반점을 포함하며, 상기 검출 반점 및 대조 반점은 평행된 2열로 배열되는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
  3. 제2항에 있어서,
    칩의 길이, 넓이, 폭은 각각 76.4mm, 25.2mm 및 1mm이고, 상기 기질 슬라이드 글라스에는 10개의 상기 검출 하부 영역이 설치되는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 검출 하부 영역 사이에는 물리적 칸막이로서 돌기가 설치되는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 DCP 특이적 항체는 마우스 항-인간 DCP인 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
  6. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 단백질 칩의 제조 방법에 있어서,
    각각의 검출 반점을 형성하는 DCP 특이적 항체의 총량은 3nl이고, 농도는 4mg/ml이고, 상기 DCP 특이적 항체를 6-10회로 나누어 매회에 300-500pl를 분무하는 방식으로 상기 검출 반점을 형성하는 것을 특징으로 하는 단백질 칩의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    분무과정에서 사용하는 상기 DCP 특이적 항체의 온도는 4-8℃인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    비접촉식 스폿팅 장치를 사용해 분무하여 스폿팅하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 혈청의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하기 위한 키트에 있어서,
    제1항 내지 제5항의 어느 한 항의 단백질 칩 및 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체, HRP 화학발광 기질 용액을 포함하며; 상기 HRP 표지된 프로트롬빈 다클론 항체는 토끼 유래 항체이며, 상기 검출 반점에 고정된 DCP 특이적 항체와 다른 물종으로부터 유래되는 것을 특징으로 키트.
  10. 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하는 방법에 있어서,
    제1항 내지 제5항의 어느 한 항의 단백질 칩을 사용하며,
    검출 대기 혈청 샘플을 희석하여 상기 단백질 칩의 검출 하부 영역에 적가하고, 배양 후, PBST로 검출 하부 영역을 세척하여 비특이적 결합물을 제거하며;
    PBS로 희석한 HRP 표지된 프로트롬빈 항체를 첨가하며, 배양 후, PBST로 검출 하부 영역을 세척하여 비특이적 결합물을 제거하며;
    HRP 발광 기질 용액을 첨가하고, 화학발광 스캐너를 사용하여 단백질 칩에 대해 스캐닝하여 희석 후의 검출 대기 혈청 샘플 중의 DCP발광 화소값을 각각 얻으며;
    상기 배양은 37℃에서 30분간 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 중의 비정상적인 디카르복실라제 프로트롬빈을 검출하는 방법.
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