CN103487589B - 一种量子点标记的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，具体为一种量子点标记的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法，包括固相载体、固相抗体和检测液，固相载体由玻片、氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层组成；检测液为用经EDC/NHS活化的量子点标记的抗体。固相载体的结构及制备方法可使固相抗体稳定固定于点样孔中并可减少固相抗体的蒸发，提高反应容量，保持活性；每种点样样品重复5次点样，不仅可进一步提高反应容量，还可提高检测结果的准确性；在固相载体的四角处均固定有阴性对照标志物和阳性对照标志物，可提高检测结果的准确性。检测剂的制备方法的量子点标记效率高，标记抗体的稳定性高、活性高，从而可提高检测灵敏度和准确性，并降低试剂盒的生产成本。

Description

一种量子点标记的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种量子点标记的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法。
背景技术
蛋白质芯片技术概念起源于20世纪80年代后期，是生命科学领域热门的新技术之一。蛋白质芯片具有平行性、高通量、灵敏度高、样品用量少、检测速度快等优点。然而，由于蛋白质的化学成分和结构复杂多变，固定在芯片表面的蛋白质容易变性失活。因此，寻找合适的载体和表面修饰方法以保证固定足够量的蛋白质并保持其天然活性成为研制蛋白质微阵列的关键步骤之一。
近年来经过科研人员的尝试和研发，逐步形成了以滤膜、塑料、玻片和金属膜等为主的固相载体。在这几类载体中，玻片具有廉价、表面光滑、荧光背景低、性能稳定、抗体用量低等优点。但是，用玻片固定蛋白往往具有样品易蒸发、不适合多步反应、容量较小和容易发生交叉污染等缺点。
另外，在制作蛋白质芯片的过程中，采用传统的有机染料作为检测标记物，往往带来灵敏度低，稳定性差，检测器材条件要求较高等缺点。量子点作为一种新型的无机荧光标记物，具有激发范围广、发射范围窄、灵敏度高、稳定性好、便于检测等优点。因而，通过改进蛋白质在玻片上的固定方式，以及结合量子点标记物，将充分发挥以玻片作为基片的蛋白质芯片的优势。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种以玻片为载体，且灵敏度高、稳定性高、样品不易蒸发和反应容量大的量子点标记的蛋白质芯片试剂盒及量子点标记的蛋白质芯片试剂盒的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种量子点标记的蛋白质芯片试剂盒，包括设有若干点阵分布的点样孔的固相载体和检测剂，所述固相载体固定有阴性对照标志物、阳性对照标志物和若干种能与炎症因子特异性结合的固相抗体，所述固相载体由玻片，以及玻片上由下至上依次设置的氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层组成；所述阴性对照标志物和阳性对照标志物分别固定于不同的点样孔中，所述每种固相抗体分别固定于不同点样孔中形成若干独立识别位点；所述检测剂由与每种固相抗体相对应的量子点标记抗体组成，所述相对应的固相抗体与量子点标记抗体是能与同种炎症因子特异性结合且具有不同抗原结合位点的抗体。
所述固相载体呈方形，所述固相载体四角的点样孔处均分别固定有阴性对照标志物和阳性对照标志物。
所述阴性对照标志物、阳性对照标志物和每种固相抗体均重复5次点样于不同的点样孔中。
所述炎症因子识别位点、阳性对照点和阴性对照点的体积均为1mm3，所述炎症因子识别区中相邻两个炎症因子识别位点的距离为1.5mm；所述阴性质控区中相邻两个阴性对照点的距离为1.5mm；所述阳性质控区中相邻两个阳性对照点的距离为1.5mm。
所述阴性对照标志物为BSA，所述阳性对照标志物为能与检测剂特异性结合的二抗。
所述固相抗体为CRP抗体Ⅰ、Myoglobin抗体Ⅰ、cTnT抗体Ⅰ、NT-proBNP抗体Ⅰ、CK-MB抗体Ⅰ、H-FABP抗体Ⅰ、GPBB抗体Ⅰ和D-Dimer抗体Ⅰ。
所述检测剂为量子点标记的CRP抗体Ⅱ、Myoglobin抗体Ⅱ、cTnT抗体Ⅱ、NT-proBNP抗体Ⅱ、CK-MB抗体Ⅱ、H-FABP抗体Ⅱ、GPBB抗体Ⅱ和D-Dimer抗体Ⅱ。
以上所述量子点标记的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
a、氨基修饰：将用水清洗后的具有蚀刻孔的玻片浸泡于25-30%的氨水中8-12h，接着用去离子水冲洗玻片并将其浸于丙酮中5-8min；取出玻片并自然晾干至玻片表面无液膜后，将玻片置于含4%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的水含量为10%的丙酮溶液中反应20-30min，反应结束后用丙酮清洗玻片，然后将玻片置于80-100℃下干燥1-2h，形成氨基修饰层；
b、醛基修饰：室温下，将氨基修饰后的玻片置于含5-8%戊二醛的pH=7.2-7.6，浓度为0.01mol/L的PBS中浸泡2-4h；接着用pH=7.2-7.6，浓度为0.01mol/L的PBS清洗玻片上的戊二醛；然后用N2吹干至玻片表面无液膜形成醛基修饰层，干燥保存；
c、琼脂糖修饰：将经醛基修饰的玻片浸入1%的琼脂糖溶液中5-10s，取出后平放至琼脂糖凝固，接着将玻片置于37℃下干燥2-3h，然后在室温下将玻片浸于5%的NaIO4溶液中活化30-60min，取出后用水清洗并用N2吹干至玻片表面无液膜，形成琼脂糖修饰层；玻片、氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层组成固相载体，蚀刻孔处的琼脂糖修饰层形成点样孔；
d、芯片制备：分别将1μL，1mg/mL的阴性对照标志物、阳性对照标志物、各固相抗体溶液固定于点样孔中；将点样后的基片固定于37℃下湿盒中2-4h，接着用PBS清洗，然后在37℃下用1%的BSA封闭1-2h，4℃下真空保存；
e、量子点标记抗体：将EDC、NHS和经pH=7.2-7.5的PBS清洗的羧基水溶性量子点混合均匀并在23-25℃下反应50-70min得活化量子点，然后用pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗活化量子点至EDC、NHS和PBS除去并用pH=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存活化量子点，备用；所述EDC、NHS和量子点的摩尔比为20000-25000：5000:1；将经pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗后的每种抗体分别与活化量子点溶液混合均匀，所述活化量子点与每种抗体的摩尔比分别为1:8-10，在23-25℃下反应5-7h得反应液；反应液经排阻层析得量子点标记抗体。
进行氨基修饰前先对玻片进行蚀刻处理，包括以下步骤：依次用10%的Na2CO3溶液和浓盐酸清洗玻片，接着将玻片浸于水中超声清洗10-20min，并用水淋洗；待玻片表面干燥即其表面无液膜后，将其浸入熔融石蜡中3-5s，取出晾干形成蜡层并在蜡层上设若干穿透蜡层的穿孔；将蚀刻液铺于玻片上5-10min后将蚀刻液吸干，然后将玻片置于100℃的水中浸泡10-20min使蜡层脱落。
所述蚀刻液为含23.5wt%氢氟酸铵、12.4wt%草酸、15.7wt%硫酸铵、6.5wt%甘油和23.5wt%硫酸钡的水溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以量子点标记抗体作为检测剂，检测的灵敏度和准确度高；在设有蚀刻孔的玻片上依次设置氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层，使固相抗体可稳定固定于点样孔中并可减少固相抗体的蒸发，提高反应容量；每种点样样品重复5次点样，不仅可进一步提高反应容量，还可提高检测结果的准确性；在固相载体的四角处均固定有阴性对照标志物和阳性对照标志物，可提高检测结果的准确性。本发明制备芯片的工艺方法可使固相抗体稳定固定于载体上并保持活性，且不易蒸发，检测剂的制备方法的量子点标记效率高，标记抗体的稳定性高、活性高，从而可提高检测的灵敏度和准确性，并降低试剂盒的生产成本。
附图说明
图1为实施例1的心血管疾病因子联合筛查蛋白质芯片的结构示意图；
图2为用毛细管电泳检测实施例中制备CRP抗体Ⅱ-CdTe/ZnS-525的量子点标记效率图。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例
本实施例列举心血管疾病炎症因子作为操作实例详细描述量子点标记的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法。心血管疾病的炎症因子包括CRP（C反应蛋白）、Myoglobin（肌红蛋白）、cTnT（心肌肌钙蛋白T）、NT-proBNP（N末端B型钠尿肽）、CK-MB（肌酸激酶同工酶）、H-FABP（心型脂肪酸结合蛋白）、GPBB（糖原磷酸化酶同工酶BB）和D-Dimer（D－二聚体）共8项生物标志物。实施例中未注明的具体条件和实验步骤，根据现有技术进行。
EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；PBS为磷酸盐缓冲溶液；BSA为牛血清白蛋白；PBST为磷酸盐吐温缓冲液。
（1）固相载体的制备
清洗：将10%的Na2CO3溶液铺于玻片表面5min后吸干，再将玻片放入浓盐酸中清洗5min。接着再将其放入装有蒸馏水的超声波清洗仪中清洗10min，然后取出玻片并用蒸馏水淋洗5次。
过蜡：待玻片干燥至表面无液膜后将其浸于熔融的石蜡中3s，然后取出自然晾干形成蜡层。用点样排针在蜡层上点出80个穿透蜡层的穿孔，每5个穿孔一排，每排中相邻两穿孔的间距为1.5mm。在玻片的四个角处均设有两排平行的穿孔，在玻片的中部设有八排穿孔，玻片上的穿孔呈点阵式分布。
蚀刻：将氢氟酸铵（23.5%）、草酸（12.4%）、硫酸铵（15.7%）、甘油（6.5%）和硫酸钡（23.5%）溶解于50℃的水（18.4wt%）中形成蚀刻液。将蚀刻液铺于玻片上5min，使蚀刻液腐蚀穿孔中的玻片而使玻片上形成凹孔；然后将蚀刻液吸干并将玻片置于100℃的水中浸泡10min使蜡层脱落。
氨基修饰：将蒸馏水铺于玻片表面5min后吸干，再将玻片浸泡于30%的氨水中浸泡10h，接着用去离子水冲洗玻片10min后将玻片浸泡于丙酮中5min；取出玻片并待玻片晾干至表面无液膜后，将玻片置于含有4%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的水含量为10%的丙酮溶液中反应20min；反应结束后取出玻片，将丙酮铺于玻片上5min后吸干，重复3次，然后将玻片置于100℃烘箱中干燥1h，形成氨基修饰层。
醛基修饰：在室温下将经氨基修饰后的玻片置于含5-8%的戊二醛的PBS（0.01mol/L，pH=7.4）中浸泡2h，取出并将PBS（0.01mol/L，pH=7.4）铺于玻片上5min后吸干以洗去戊二醛，重复3遍至戊二醛气味消失，然后用氮气吹干至玻片表面五液膜，形成醛基修饰层；干燥保存。
琼脂糖修饰：将经醛基修饰的玻片浸入1%的琼脂糖溶液中5s，取出后平放至琼脂糖凝固，接着将玻片置于37℃下干燥2h，然后在室温下将玻片浸于5%的NaIO4溶液中活化30min，取出后将蒸馏水铺于玻片上5min后吸干，再用N2吹干至玻片表面无液膜，形成琼脂糖修饰层；玻片、氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层组成固相载体，蚀刻孔处的琼脂糖修饰层形成点样孔，各点样孔的体积为1mm3。
（2）芯片的制备
分别将1μL，1mg/mL的BSA、能与检测剂特异性结合的二抗、CRP抗体Ⅰ、Myoglobin抗体Ⅰ、cTnT抗体Ⅰ、NT-proBNP抗体Ⅰ、CK-MB抗体Ⅰ、H-FABP抗体Ⅰ、GPBB抗体Ⅰ和D-Dimer抗体Ⅰ的溶液点于点样孔中，每种点样样品重复点样五次于同一排且不同的点样孔中；其中，BSA和二抗分别点于固相载体四个角处的点样孔中，使芯片的四个角均形成一对阴性和阳性质控区，其它八种抗体分别点于固相载体中部的点样孔中，每排点样孔点相同的固相抗体。将点样后的基片固定于37℃的湿盒中2h，接着用PBS清洗玻片3次，每次5min；然后在37℃下用1%的BSA封闭1h，完成蛋白质芯片的制备。蛋白质芯片置于铝箔袋中抽真空，4℃保存。
蛋白质芯片的结构如图1所示，在固相载体1上点阵式分布有80个已固定有固相抗体、BAS或二抗的点样孔。其中，在固相载体1的四个角处均设有两排且每排5个的点样孔，将BAS和二抗固定于四角处的点样孔中分别形成阴性质控点3和阳性质控点2，五个阴性质控点3构成一个阴性质控区，五个阳性质控点2构成一个阳性质控区。将固相抗体固定于固相载体1中部的点样孔中形成炎症因子识别位点4。
（3）检测剂的制备
分别取与每种固相抗体对应的检测抗体，所述相对应的固相抗体与检测抗体是能与同种心血管炎症因子特异性结合且具有不同抗原结合位点的抗体；所用检测抗体分别为CRP抗体Ⅱ、Myoglobin抗体Ⅱ、cTnT抗体Ⅱ、NT-proBNP抗体Ⅱ、CK-MB抗体Ⅱ、H-FABP抗体Ⅱ、GPBB抗体Ⅱ和D-Dimer抗体Ⅱ。取发射波长为525nm的CdTe/ZnS羧基水溶性量子点分别标记每种检测抗体，所用量子点记为CdTe/ZnS-525。
取10μL，10μmol/mL的CdTe/ZnS-525于EP（eppendorf）管中，并向EP管中加入2mL，10mmol/L，pH=7.2磷酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在5000r/min，25℃条件下离心6min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，并使最后一次CdTe/ZnS-525溶液的体积不超过50μL。用微量pH计检测量子点溶液的pH并调节pH值至7.2。在湿度不超过30%及0-4℃的冰盒中称取2mmol的EDC和0.5mmol的NHS并迅速加入CdTe/ZnS-525溶液中，用涡旋振荡器震荡均匀后置于摇床上反应60min，反应温度为23℃，得活化CdTe/ZnS-525溶液。向活化CdTe/ZnS-525溶液中加入2mL，50mmol/L，pH=8.5的硼酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在5000r/min，25℃条件下离心6min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，使最后一次活化CdTe/ZnS-525溶液的体积不超过200μL。用微量pH计检测活化CdTe/ZnS-525溶液的pH并调节pH值至8.5。
取0.8μmol的检测抗体于EP管中，加入2mL，50mmol/L，pH=8.5硼酸盐缓冲液，混匀后用50K超滤管在3000r/min，4℃条件下离心10min。重复以上步骤三次，使最后一次检测抗体溶液总体积不超过50μL。用微量pH计测检测抗体溶液的pH并调节pH值至8.5。
将活化CdTe/ZnS-525溶液与检测抗体溶液混合，混匀后置于摇床上反应5h，反应温度23℃，得检测抗体-CdTe/ZnS-525的反应液。用毛细管电泳检测CdTe/ZnS-525与检测抗体的偶联情况，CdTe/ZnS-525与CRP抗体Ⅱ的标记效率如图2所示，量子点（QDs）的峰面积很小，即量子点的标记效率高。CRP抗体Ⅱ-CdTe/ZnS-525简称为CRP-CdTe/ZnS。
通过排阻层析分离反应液得检测抗体-CdTe/Zn-525复合物，并用100K超滤管将检测抗体-CdTe/Zn-525复合物浓缩到200μL以内，测复合物浓度后加入Gly（甘氨酸）浓度为1mg/mL的Gly封闭液，并置于4℃保存。
排阻层析柱的填料为superdex200，流速为1.5mL/min，凝胶长40cm。
量子点标记的蛋白质芯片试剂盒的使用：
将100μL血清样品铺于蛋白质芯片上，并将蛋白质芯片放置于摇床上，室温反应1h。反应结束后用PBST清洗蛋白质芯片3次，每次5min。然后将500μL，0.5mg/mL的检测剂铺于蛋白质芯片上进行二次免疫反应1h。反应结束后用PBST清洗蛋白质芯片并吹干，然后将蛋白质芯片置于紫外成像仪中进行图像扫描，用图像分析软件QuantArray software version3000进行荧光强度分析，并用标准曲线法计算血清样品中CRP、Myoglobin、cTnT、NT-proBNP、CK-MB、H-FABP、GPBB和D-Dimer的浓度。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (3)

1.一种量子点标记的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，所述量子点标记的蛋白质芯片试剂盒包括设有若干点阵分布的点样孔的固相载体和检测剂，所述固相载体固定有阴性对照标志物、阳性对照标志物和若干种能与炎症因子特异性结合的固相抗体，所述固相载体由玻片，以及玻片上由下至上依次设置的氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层组成；所述阴性对照标志物和阳性对照标志物分别固定于不同的点样孔中，所述每种固相抗体分别固定于不同点样孔中形成若干独立识别位点；所述检测剂由与每种固相抗体相对应的量子点标记抗体组成，所述相对应的固相抗体与量子点标记抗体是能与同种炎症因子特异性结合且具有不同抗原结合位点的抗体；其特征在于，包括以下步骤：
a、氨基修饰：将用水清洗后的具有蚀刻孔的玻片浸泡于25-30％的氨水中8-12h，接着用去离子水冲洗玻片并将其浸于丙酮中5-8min；取出玻片并自然晾干至玻片表面无液膜后，将玻片置于含4％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的水含量为10％的丙酮溶液中反应20-30min，反应结束后用丙酮清洗玻片，然后将玻片置于80-100℃下干燥1-2h，形成氨基修饰层；
b、醛基修饰：室温下，将氨基修饰后的玻片置于含5-8％戊二醛的pH＝7.2-7.6，浓度为0.01mol/L的PBS中浸泡2-4h；接着用pH＝7.2-7.6，浓度为0.01mol/L的PBS清洗玻片上的戊二醛；然后用N2吹干至玻片表面无液膜形成醛基修饰层，干燥保存；
c、琼脂糖修饰：将经醛基修饰的玻片浸入1％的琼脂糖溶液中5-10s，取出后平放至琼脂糖凝固，接着将玻片置于37℃下干燥2-3h，然后在室温下将玻片浸于5％的NaIO4溶液中活化30-60min，取出后用水清洗并用N2吹干至玻片表面无液膜，形成琼脂糖修饰层；玻片、氨基修饰层、醛基修饰层和琼脂糖修饰层组成固相载体，蚀刻孔处的琼脂糖修饰层形成点样孔；
d、芯片制备：分别将1μL，1mg/mL的阴性对照标志物、阳性对照标志物、各固相抗体溶液固定于点样孔中；将点样后的基片固定于37℃下湿盒中2-4h，接着用PBS清洗，然后在37℃下用1％的BSA封闭1-2h，4℃下真空保存；
e、量子点标记抗体：将EDC、NHS和经pH＝7.2-7.5的PBS清洗的羧基水溶性量子点混合均匀并在23-25℃下反应50-70min得活化量子点，然后用pH＝8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗活化量子点至EDC、NHS和PBS除去并用pH＝8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存活化量子点，备用；所述EDC、NHS和量子点的摩尔比为20000-25000：5000:1；将经pH＝8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗后的每种抗体分别与活化量子点溶液混合均匀，所述活化量子点与每种抗体的摩尔比分别为1:8-10，在23-25℃下反应5-7h得反应液；反应液经排阻层析得量子点标记抗体。
2.根据权利要求1所述量子点标记的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，其特征在于，进行氨基修饰前先对玻片进行蚀刻处理，包括以下步骤：依次用10％的Na2CO3溶液和浓盐酸清洗玻片，接着将玻片浸于水中超声清洗10-20min，并用水淋洗；待玻片表面干燥即其表面无液膜后，将其浸入熔融石蜡中3-5s，取出晾干形成蜡层并在蜡层上设若干穿透蜡层的穿孔；将蚀刻液铺于玻片上5-10min后将蚀刻液吸干，然后将玻片置于100℃的水中浸泡10-20min使蜡层脱落。
3.根据权利要求2所述量子点标记的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，其特征在于，所述蚀刻液为含23.5wt％氢氟酸铵、12.4wt％草酸、15.7wt％硫酸铵、6.5wt％甘油和23.5wt％硫酸钡的水溶液。
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