CN1180262C - 一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学科学研究及临床应用领域，具体涉及一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法。本发明的目的是提供一种操作简单，准确迅速的检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法。本发明采取的技术方案是：一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法，其特征在于：①对载有不同个体的同一类型组织标本的芯片进行抗原修复处理；②在芯片上加足量待测血清，4℃保湿过夜或室温下保湿1h-6h也可37℃保湿30m-3h后洗涤；③加经过相应标记方式处理过的抗人Ig抗体，4℃保湿过夜或室温保湿1-6h或37℃保湿30m-3h后洗涤；④以正常人血清涂片作为阳性对照，以正常组织标本的芯片作为阴性对照，进行观察计数。

Description

一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法

技术领域：

本发明涉及生物医学科学研究及临床应用领域，具体涉及一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法。

背景技术：

癌症治疗效果的好坏主要取决于肿瘤负荷的大小和肿瘤所侵及的范围，肿瘤的大小和所浸及的范围又与发现的时间密切相关，发现的愈早，肿瘤负荷及其所浸及的范围就愈小，治疗的效果就愈好；反之，如果发现的愈晚，肿瘤负荷及其所侵及的范围就愈大，治疗的效果就会愈差。研究发现，肿瘤细胞与正常细胞的基因表达存在着较大的差异，这种表达差异进一步表现为肿瘤细胞表面出现了异常表达的蛋白质分子，(或)含量比正常细胞明显增加，这些肿瘤标志物与正常细胞中的分子存在较大差异，因此这种差异可以被机体的免疫系统所识别，继而对其产生特异性抗体或致敏淋巴细胞。目前通过免疫组织化学，酶联免疫分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)等方法均可对肿瘤标志物的含量进行检测，然后用于肿瘤的诊断、鉴别诊断或早期发现。但由于受检测手段的限制，临床上发现的早期肿瘤病例仍然较少，从而使临床治疗面临较大压力。而对特异性抗体的检测经检索国内外十年专利文献尚未发现与本发现相同或类似的文献报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种操作简单，准确迅速的检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法，其特征在于：①对载有不同个体的同一类型组织标本的芯片进行抗原修复处理；②在芯片上加足量待测血清，4℃保湿过夜或室温下保湿1-6h或37℃保湿30m-3h后洗涤；③加经过相应标记方式处理过的抗人Ig抗体，4℃保湿过夜或室温保湿1-6h或37℃保湿30m-3h后洗涤；④以正常人血清涂片作为阳性对照，以正常组织标本的芯片作为阴性对照，进行观察计数。

所述抗原修复是90℃微波、高压水浴或蛋白酶消化等方式。4℃保湿过夜或室温保湿1-6小时或37℃保湿30m-3h后洗涤，以除去未结合的非特异性抗体。

所述抗人Ig抗体标记是采用辣根过氧化物酶或其他酶、生物素、同位素、发光化学物质或各种荧光色素等方式。

具体实施方式：

下面将结合具体实施方式对本发明作详细说明，但本发明并不局限于以下

实施例：

实施例1：用于肺癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将72个不同个体的肺癌组织标本排列在一张玻片上，制成肺癌组织芯片，60个是相同或不同病理类型的不同个体的肺癌组织标本，包括21例鳞状细胞癌，19例腺癌，17例小细胞癌，3例大细胞癌，2例混合型肺癌：还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织标本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。肺癌组织芯片先按常规方法脱蜡和水化之后进行抗原修复，抗原修复使抗原修复用90℃微波5分钟，然后加待测血清200μl，37℃保湿1小时，PBS洗涤以除去未结合的非特异性抗体，加羊抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿1小时后洗涤，再加辣根过氧化物酶标记过的鼠抗羊IgG抗体即第二抗体，37℃保湿1小时后洗涤，加酶的底物二氨基联苯胺(DAB)进行显色，洗涤后进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞着色者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞着色者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞着色者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。主要用于检测待测血清中自身抗肿瘤相关组织多肽抗原的抗体。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞组织多肽抗原的自身抗肿瘤抗体存在。这样同时用多张相同的组织芯片和不同类型的多种抗人Ig抗体就可以检测待测血清中与肺癌相关的自身抗癌胚抗原(CEA)、肿瘤相关糖抗原CA50、变异的P53蛋白、肿瘤相关糖脂抗原、或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗肿瘤细胞抗原的抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

实施例2：用于胃癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将80个不同个体的胃癌组织标本排列在一张玻片上，制成胃癌组织芯片，其中68个是相同或不同病理类型的不同个体的胃癌组织标本，包括26例腺癌，17腺鳞癌，14例鳞状细胞癌，5例未分化癌，4例类癌，还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织标本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。胃癌组织芯片先经常规脱蜡和水化之后进行抗原修复，抗原修复使用90℃微波和高压水浴两种方法结合处理，其方法同传统免疫组化方法。然后加待测人员空腹静脉血清200μl，4℃保湿过夜，PBS洗涤以除去未结合的自身抗肿瘤细胞抗原的抗体，加鼠抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿1小时20分钟后洗涤，再加生物素标记过的抗鼠IgG抗体即第二抗体，37℃保湿1小时后洗涤，加HRP标记的亲和素后洗涤，再加DAB底物进行显色，洗涤后进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞着色者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞着色者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞着色者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。这样同时用多张相同的组织芯片和抗不同类型的多种人Ig抗体就可以检测待测血清中与胃癌相关的自身抗癌胚抗原(CEA)、肿瘤相关糖抗原CA50、CA19-9、CA242、CA72-4、变异的P53蛋白、或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗肿瘤细胞抗原的抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

实施例3：用于肝癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将90个不同个体的肝癌组织标本排列在一张玻片上，制成肝癌组织芯片，其中78个是相同或不同病理类型的不同个体的肝癌组织标本，包括40例肝细胞型，31例胆管细胞型，7例混合细胞型，还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织标本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。肝癌组织芯片先经常规脱蜡和水化处理之后进行抗原修复，抗原修复用蛋白酶消化10分钟，然后加待测血清250μl，4℃保湿过夜，PBS洗涤以除去未结合的非特异性抗体，加鼠抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿50分钟后洗涤，再加荧光色素标记的抗鼠IgG抗体即第二抗体，37℃保湿50分钟后洗涤，用荧光显微镜进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞着色荧光强度大于对照1倍以上者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞着色或荧光强度大于对照2倍以上者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞着色或荧光强度大于对照3倍以上者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。主要月于检测待测血清中自身抗甲胎蛋白(AFP)抗原的抗体。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞AFP抗原的自身抗肿瘤抗体存在。若同时用多张相同的组织芯片和抗不同类型的多种人Ig抗体就可以同时检测待测血清中与肝癌相关的自身抗甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰转移酶同功酶II(γ-GT II)、异常凝血酶原(DCP)、碱性磷酸酶同功酶I(ALP-I)、5’-核苷酸磷酸二酯酶同功酶V，VI(5’-NPDaseV，VI)、胎盘型谷胱甘肽S转移酶(GST-P)或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗肿瘤细胞抗原的抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

实施例4：用于乳腺癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将100个不同个体的乳腺癌组织标本排列在一张玻片上，制成乳腺癌组织芯片，其中88个是相同或不同病理类型的不同个体的乳腺癌组织标本，包括32例浸润性小叶癌，20例浸润性导管癌，12例硬癌，10例髓样癌，8例单纯癌，6例腺癌；还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织样本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。乳腺癌组织芯片先经常规脱蜡和水化，抗原修复使用先用90℃微波5分钟，再用蛋白酶消化5分钟，。然后加待测血清250μl，37℃保湿45分钟，PBS洗涤以除去未结合的非特异性抗体，加羊抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿后洗涤，再加发光化学物质标记过的抗羊IgG抗体即第二抗体，37℃保湿45分钟后洗涤，用光敏显微镜进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞有发光信号或发光强度大于对照1倍以上者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞有发光信号或发光强度大于对照2倍以上者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞有发光信号或发光强度大于对照3倍以上者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。主要用于检测待测血清中自身抗CerbB-2抗体。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞CerbB-2抗原的自身抗肿瘤抗体存在。若同时用多张相同的组织芯片和抗不同类型的多种人Ig抗体就可以检测待测血清中与乳腺癌相关的自身抗肿瘤相关抗原CA15-3、癌胚抗原(CEA)、膜糖蛋白CD44、P53基因突变蛋白、血拴致敏蛋白、癌抗原CA549或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗肿瘤细胞抗原的抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

实施例5：用于结直肠癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将110个不同个体的结直肠癌组织标本排列在一张玻片上，制成结直肠癌组织芯片，其中98个是相同或不同病理类型的不同个体的结直肠癌组织标本，包括41例腺癌，32例印戒细胞癌、13例未分化癌、9例腺鳞癌，3例鳞状细胞癌，还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织样本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。结肠癌组织芯片先经常规脱蜡和水化之后进行抗原修复，抗原修复用高压水浴5分钟，再用蛋白酶消化5分钟，然后加待测血清250μl，4℃保湿过夜或37℃保湿1.5小时，PBS洗涤以除去未结合的非特异性抗体，加鼠抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿1.5小时后洗涤，再加荧光色素标记过的抗鼠IgG抗体即第二抗体，37℃保湿1.5小时后洗涤，洗涤后用荧光显微镜进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞着色或荧光强度大于对照1倍以上者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞着色或荧光强度大于对照2倍以上者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞着色或荧光强度大于对照3倍以上者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。主要用于检测待测血清中自身抗CEA抗体。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞CEA抗原的自身抗肿瘤抗体存在。若同时用多张相同的组织芯片和抗不同类型的多种人Ig抗体就可以检测待测血清中与结直肠癌相关的自身抗癌胚抗原(CEA)、抗癌抗原CA242、CA50、CA19-9或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗肿瘤细胞抗原的抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

实施例6：用于胰腺癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将120个不同个体的胰腺癌组织标本排列在一张玻片上，制成胰腺癌组织芯片，其中108个是相同或不同病理类型的不同个体的胰腺癌组织标本，包括47例胰管癌，41例腺泡细胞癌，11例胰岛细胞癌，9例未分化癌，还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织样本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。胰腺癌组织芯片先经常规脱蜡和水化之后进行抗原修复，抗原修复用90℃微波5分钟，然后加待测血清300μl，4℃保湿过夜或37℃保湿1小时10分钟，PBS洗涤以除去未结合的非特异性抗体，加羊抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿1小时10分钟后洗涤，再加发光化学物质标记过的抗羊IgG抗体即第二抗体，37℃保湿1小时10分钟后洗涤，洗涤后用光敏显微镜进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞发光或光强度或荧光强度大于对照1倍以上者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞发光或光强度或荧光强度大于对照2倍以上者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞发光或光强度大于对照3倍以上者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。主要用于检测待测血清中自身抗CA19-9抗体，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞CA19-9抗原的自身抗肿瘤抗体存在。若同时用多张相同的组织芯片和抗不同类型的多种人Ig抗体就可以检测待测血清中与胰腺癌相关的自身抗癌抗原CA242、CA19-9、CA50、TAG72、CA125、胰腺癌胚胎抗原(POA)、半乳糖苷转移酶同功酶II(Gal TII)或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗肿瘤细胞抗原的抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

实施例7：用于卵巢癌病人体液中特异性抗体含量的检测

将64个不同个体的卵巢癌组织标本排列在一张玻片上，制成卵巢癌组织芯片，其中52个是相同或不同病理类型的不同个体的卵巢癌组织标本，包括17例浆液性癌，13例粘液性癌，9例子宫内膜样癌，7例透明细胞癌，3例混合性上皮癌，3例未分化癌，还有12个是不同个体的不同组织来源的正常对照组织样本。其中包括乳腺、心、脑、肌肉、肾、甲状腺、肾上腺、前列腺、肝、脾、肺、膀胱等。卵巢癌组织芯片先经常规脱蜡和水化之后进行抗原修复，抗原修复用蛋白酶消化10分钟，然后加待测血清150ul，4℃保湿过夜或37℃保湿1小时，PBS洗涤以除去未结合的非特异性抗体，加鼠抗人IgG单(多)克隆抗体，37℃保湿1小时后洗涤，再加荧光色素标记过的抗鼠IgG抗体即第二抗体，37℃保湿1小时后洗涤，洗涤后直接用荧光显微镜进行观察和计数。以正常人血清涂片作为阳性对照，以不加待测血清的同一种组织芯片作为阴性对照，也可用组织芯片上其他正常组织作为阴性对照。结果判定为：1％～5％肿瘤细胞着色或或荧光强度大于对照1倍以上者为弱阳性，以“+”表示；6％～10％肿瘤细胞着色或或荧光强度大于对照2倍以上者为阳性，以“++”表示；11％～15％肿瘤细胞着色或荧光强度大于对照3倍以上者为强阳性，以“+++”表示。正常对照组织应全部阴性。主要用于检测待测血清中自身抗CA125抗体。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞CA125抗原的自身抗肿瘤抗体存在。若同时用多张相同的组织芯片和抗不同类型的多种人Ig抗体就可以检测待测血清中与卵巢癌相关的自身抗癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤相关抗原TA-4、癌抗原CA125、卵巢囊腺癌抗原、卵巢癌抗原(OCA)和NB/70K、病毒性抗原(HSV-2、HPV)或其他抗肿瘤细胞表面抗原的未知自身抗体，包括IgG、IgM或其他类型的自身抗肿瘤细胞抗原的抗体均可用此法进行检测。若出现阳性结果，说明待测血清中具有抗肿瘤细胞某种抗原的自身抗肿瘤抗体的存在及其含量的多少。

本发明的理论基础是不同个体的同一种肿瘤标志物具有相同的基本结构和空间构象，能与同一种单克隆抗体发生特异性结合。最新研究资料显示，恶性肿瘤患者的血清中均不同程度的存在特异性抗体，这些特异性抗体可以是针对一种肿瘤标志物产生的，也可能是针对几种肿瘤标志物产生的。但不管是已知的抗体还是未知的抗体均包含在人体5种类型的抗体之中，所以只要用标记过的抗人不同类型(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的抗体即能对其进行全方位的检测。本发明的临床意义在于自身抗肿瘤抗体的出现是体内肿瘤发生的一个早期信号，故对肿瘤的早期发现和早期诊断具有较大的临床价值，同时对病情进展及疗效监测或预后评估等也有实际的应用价值。

以上实施例中使用过氧化物酶进行标记观察时可使用普通光学显微镜，其灵敏度与荧光检测法相比具有一定差距，故而其他实施例中大多使用的是荧光检测法进行实验。

这种组织芯片技术，将肿瘤组织与正常不同组织置于一张玻片上，这样将正常组织作为对照来进行研究，使所要研究的不同组织标本进行的实验条件基本一致，进一步减小了因实验条件发生微小改变而导致的实验误差，便于实验的对比、研究，使得研究结果更加可靠、准确。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

本发明操作简便，检测数据准确。打破目前肿瘤的诊断、鉴别诊断或早期发现所采用的对肿瘤标志物的含量进行检测的方式，而采用对特异性抗体的含量进行检测的方式，该方法对肿瘤的早期发现和早期诊断具有较大的临床价值，同时对病情进展及疗效监测或预后评估等也有实际的应用价值。

Claims (3)

1、一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法，其特征在于：①对载有不同个体的同一类型组织标本的芯片进行抗原修复处理；②在芯片上加足量待测血清，4℃保湿过夜或室温下保湿1～6h或37℃保湿30分钟～3小时后洗涤；③加经过相应标记方式处理过的抗人Ig抗体，4℃保湿过夜或室温保湿1～6h或37℃保湿30分钟～3小时后洗涤；④以正常人血清涂片作为阳性对照，以正常组织标本的芯片作为阴性对照，进行观察计数。

2、如权利要求1所述的一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法，其特征在于：所述抗原修复是90℃微波、高压水浴或蛋白酶消化方式。

3、如权利要求1所述的一种检测特定部位体液中特异性抗体含量的方法，其特征在于：所述抗人Ig抗体标记是采用辣根过氧化物酶或生物素、同位素、发光化学物质或各种荧光色素标记方式。