KR20130023308A - 폐암 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐암의 조기 진단에 유용한 바이오마커로서 합토글로빈 베타 사슬을 제공한다. 본 발명의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 본 발명의 바이오마커를 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 폐암 진단용 조성물은 다른 질환과의 감별 진단이 가능하며 폐암의 조기 진단에 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

폐암 바이오마커{Biomarker for Lung Cancer}

본 발명은 암, 좀 더 구체적으로는 폐암의 조기진단을 위한 바이오마커에 관한 것이다.

폐암은 세계에서 암 관련 사망의 주된 원인 중 하나이다. 2001년부터 2005년까지의 조사에서 한국의 폐암 환자의 5년 생존율(15.5%)은 다른 암들(위암 56.4%, 결장암 64.8%, 유방암 87.3%, 갑상선암 98.1%)에 비해 현저히 낮았다. 비록 X-선 검사, CT 촬영과 같은 선별 기술이 폐암 진단에 자주 쓰이긴 하지만 비용은 많이 들고 특이성은 떨어지며, 방사능에 노출될 높은 위험이 있어서 영상 진단은 폐암 진단에 있어 아직 많은 문제를 가지고 있다. 폐암의 조기 진단이 되지 않는 것이 높은 사망률과 성공적이지 못한 치료의 주된 원인이다. 모든 비소세포폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)이 IA 단계에서 발견된다면, 5년 생존율이 15%에서 80%로 증가할 수 있다는 보고가 있어 폐암의 시기적절한 진단의 중요성을 알려주고 있다.

폐암은 4개의 주된 조직학적 유형을 가지는데, 그것은 다시 크게 소세포폐암(SCLC) 및 비소세포폐암(NSCLC)의 2가지로 나눌 수 있다. NSCLC은 전체 폐암의 80% 정도에 해당하는데 편평상피암, 선암 및 대세포암을 포함한다. NSCLC의 몇 가지 조직학적 유형 중에서 편평상피암이 폐암의 20-25%를 차지하며, 대세포암은 15-20% 그리고 선암은 30-40%를 차지하여 선암이 폐암 중 가장 많은 조직학적 서브유형이라고 보고되었다.

한편 바이오마커란 정량적인 측정에 의해 정상과 비정상을 구분할 수 있게 하는 물질을 말하며, 생리적, 외형적, 유전자 및 단백질 마커의 여러 형태가 있다. 최근에는 게노믹스 및 프로테오믹스와 같은 “-오믹스”기술을 통해 폐암 치료의 모니터링을 개선하려는 시도가 있었다. 많은 종류의 바이오마커 중에서 단백질 바이오마커가 최근 프로테오믹스 기술의 발전에 따라 활발히 연구되고 있다.

혈액 시료는 좋은 바이오마커의 원천으로 그 안에서 단백질들이 다양한 생리적 작용을 하며, 분비된 단백질들이 생리적 상태를 보여주는 장점이 있다. 그러나 혈액 속에 많은 종류의 단백질들이 존재하기 때문에 혈청에서 암의 바이오마커를 찾는 것은 매우 어려운 작업이다. 그런 어려움에도 불구하고 폐암 바이오마커를 찾아내려는 노력은 계속되고 있으며 사이토케라틴-19 단편(CYFRA 21-1),암배항원(carcinoembryonic antigen: CEA), 암 항원-125(CA-125) 및 뉴런-특이적 에놀라제(neuron-specific enolase: NSE) 등의 폐암 바이오마커 후보물질들이 밝혀진 상태이다. 그러나 임상적으로 쓰이고 있는 것은 많지 않으며 대부분 민감성 및 특이성이 떨어지는 상태이다.

급성기 반응은 감염, 창상, 수술 및 면역 장애에 의해 초래되는 숙주의 항상성장애의 두드러진 전신적 반응이다. 급성기 반응에 의해 간이 급성기 단백질을 분비하는데, 예를 들면 C-반응성 단백질(CRP), 혈청 아밀로이드(serum amyroid A: SAA) 및 TNF-α를 포함하는 양성 단백질과 레티놀 결합 단백질(retinol binding protein: RBP), 트랜스타이레틴(transthyretin: TTR) 및 트랜스페린을 포함하는 음성 급성 단백질을 분비한다. 합토글로빈(Haptoglobin: Hp)은 양성 급성기 단백질 중 하나로 즉각적인 숙주 염증 반응에 의해 주로 간세포에서 유도되는 단백질이다. Hp 분자는 다이설파이드 결합으로 연결된 두 개의 알파 및 베타 사슬 이량체를 가지는 사단량체 단백질이다. 이 두 사슬은 단백질 합성시에 단백질 분해에 의해 잘려져 나오는 공통 전구체 단백질로부터 유래한다. Hp의 주기능은 유리 혈장 헤모글로빈에 결합하여 산화 스트레스로부터 보호하고 헤모글로빈 제거 수용체 CD163에 의한 헤모글로빈 흡수를 도와주는 것이다. 그렇지만 염증 상태에서는 IL-6의 활성에 의해 Hp가 증가된다.

본 발명자들은 상기와 같은 Hp가 암, 특히 폐암 마커로서의 잠재성을 가질 수 있을 것이라고 가정하고 연구를 거듭한 끝에 다른 암이나 호흡기 질환에 비해서 폐암의 경우 Hp의 β사슬이 현저히 증가한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 임상적으로 쓰일 수 있는 민감성 및 특이성이 높은 폐암 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 합토글로빈 베타 사슬을 포함하는 폐암 바이오마커 및 이에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 의해 달성된다.

본 발명에 의해 폐암의 조기진단에 유용하게 쓰일 수 있는 민감성 및 특이성이 뛰어난 폐암 진단용 조성물이 제공된다.

도 1은 합토글로빈의 LC-ESI-MS/MS 분석 도면이다. 총 5명의 건강한 성인(대조군)과 5명의 폐선암 환자의 혈청을 채취한 후에 각 혈청 시료로부터 100㎍의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염색을 했다(A). 각각 다른 강도를 보이는 다른 분자량의 3개의 밴드를 절단하고 인-겔 소화시켰다. 레인 1: 정상 혈청, 레인 2: 암 환자 혈청. 각 밴드에는 20-30개의 단백질들이 동정되었다. 45kDa, 15 kDa, 10 kDa의 밴드에서 폐암 환자(LC)에서는 각각 119, 91, 42개의 Hp 펩타이드가 검출된 반면, 정상인(N)에서는 각각 32, 28, 19개의 Hp 펩타이드가 각각 검출되었다. sub: 암 환자의 펩타이드 수로부터 건강한 사람의 펩타이드 수를 뺀 것.
도 2는 합토글로빈 단편의 MS/MS 스펙트럼이다. (A) 각 밴드의 대표 펩타이드가 Hp의 각 사슬을 나타낸다. 밴드 1의 펩타이드 단편 SCAVAEYGVYVK (m/z=1345.19, 전하=2+)의 MS/MS 스펙트럼은 펩타이드가 20번 검출된 Hp β 사슬을 나타낸다. 밴드 2에서 Hp α2 사슬 단편 LRTEGDGVYTLNDKK (m/z=1707.68, 전하=2+)이 펩타이드 히트 28번으로 발견되었다. 밴드 3에는 펩타이드 히트 6번으로 AVGDKLPECEAVCGKPK (m/z=1857.46, 전하=2+)가 나타나 Hp α1 사슬을 나타내고 있다. (B) 각 밴드의 대표 Hp 펩타이드 서열 및 그것의 검출 횟수를 나타냈다. (C) Hp의 전체 아미노산 서열을 보여준다. 파란 글씨: 신호 서열, 녹색 및 분홍색 글씨: α2 사슬, 녹색 글씨만: α1 사슬, 검은 글씨: Hp β사슬. Hp는 LC-MS/MS 분석을 통해서 검출했다. 동정된 펩타이드는 검은 상자 안에 있고, 예상 단백질 수식 부위는 빨간 글씨로 썼다.
도 3은 Hp의 β사슬이 α2 사슬에 비해 건강한 개체 대비 폐선암 환자의 혈청에서 더 많이 증가함을 보여주는 도면이다. (A) Hp 밴드의 특징을 확인하기 위해 PNGase F로 처리한 혈청 시료를 항-Hp 다클론 항체로 면역블롯하여 분석하였다. PNGase F 처리로 인해 Hp β사슬의 크기가 줄었지만(29kDa) α1 및 α2 사슬은 줄지 않았다. (B, C) 건강한 44명의 지원자 및 78명의 폐선암 환자, 22명의 유방암 환자 및 20명의 간세포암(HCC) 환자의 조혈청으로부터 5㎍씩의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 면역블롯으로 Hp의 발현을 확인했다. 각 암환자 및 건강한 대조군에서 발현된 Hp α2 사슬(B) 및 β 사슬(C)의 대표 블롯을 나타냈다. (D, E) α2 사슬(D) 및 β 사슬(E)에 대한 대표 밴드의 농도계 분석 도면이다. 각 블롯은 동일한 표준시료를 포함하고, 따라서 농도계로 면역블롯한 결과를 분석할 때 분석된 각 밴드의 총 픽셀값(농도×면적)을 각 블롯에 포함된 표준의 총 픽셀로 표준화시켰다. Hp β 사슬의 발현값은 폐암 환자의 혈청과 건강한 개체, 유방암 또는 간세포암 환자의 혈청에서 유의적인 차이를 보였다. adenoCA: 폐선암, breastCA; 유방암, HCC: 간세포암 (* P < 0.05)
도 4는 폐암 환자의 혈청에서 합토글로빈 β가 증가함을 보여주는 ELISA 도면이다. (A) 190명의 건강한 대조군과 190명의 폐선암 환자의 각 혈청으로부터 Hp β 사슬의 농도를 ELISA로 측정하였다. 폐암 환자에서는 Hp β 사슬 평균값이 8.0 ㎍/ml로 대조군의 1.9㎍/ml에 비해 4.2배나 높았다. 다른 조직학적 유형의 폐암인 편평상피암(SQLC) 및 소세포폐암(SCC) 환자의 혈청도 ELISA 분석하였다. SQLC에서의 평균값은 8.2 ㎍/ml이고, SCC에서 평균값은 8.9 ㎍/ml였다. (B) 혈청 시료를 폐암 단계별로 나누자, 혈청 내 Hp 농도가 II 단계를 제외하고는 단계와 비례하는 것으로 보였다(* P < 0.05). II 단계는 시료 수가 적어서 제외했다.
도 5는 다른 유형의 암이나 호흡기 질환 환자의 혈청 및 혈장 시료에서의 합토글로빈 β사슬의 혈중 농도보다 폐선암 환자에서의 농도가 더 높음을 보여주는 도면이다. (A) 20명의 유방암 환자 및 20명의 간세포암 환자에서 Hp β 사슬이 얼마나 발현되는지를 ELISA로 확인했다. 경계값을 5㎍/ml로 하자 오직 하나의 간세포암 환자의 시료만 경계값 이상이었다. (B) 건강한 대조군, 폐선암(adenoCA) 환자, 다른 호흡기 질병인 결핵(TBC) 환자, 특발성 폐섬유화(IPF) 환자 및 기관지천식(BA) 환자의 Hp β 사슬 발현 정도를 ELISA로 확인했다. 건강한 대조군이나 다른 호흡기 질환자에 비해서 폐선암 환자에게서 합토글로빈 β의 농도가 유의적으로 높게 나왔다. *P < 0.05.

본 발명은 합토글로빈 β사슬을 폐암 혈청 마커로 이용하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 폐암 진단용 조성물은 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "폐암"은 폐에 발생하는 악성종양을 의미하며, 조직학적으로는 폐선암, 편평상피암, 대세포폐암 및 소세포폐암을 모두 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단 마커"란 암 환자를 건강한 사람과 구분하여 진단할 수 있는 물질로 건강한 사람에 비하여 암이 발병된 개체에서 증가를 보이는 유기 생체 분자를 말한다. 상기 유기 생체 분자로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질 및 당 등이 포함된다. 본 발명에서는 바람직하게는, 상기 유기 생체 분자는 단백질 또는 폴리펩타이드를 말한다.

한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

본 발명의 바이오마커인 Hp β사슬은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 상기 공지된 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

다클론 항체의 경우 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다. 또한 Hp β 사슬의 다클론 항체는 본 발명의 실시예 3.1에 기술된 바와 같이 상업적으로도 이용가능하다.

단클론 항체도 융합방법, 재조합 DNA 방법 및 파지 항체 라이브러리기술 등과 같이 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있으며 상업적으로 시판되는 항체를 이용할 수도 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법, ELISA, 면역블롯, 파아르 분석법, 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함되며, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는데, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등이 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 다이이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인할 수 있는 방법으로는 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 통상 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어진다.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.

또한 바람직하게는 상기 폐암 진단용 조성물은 상기 마커를 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함한다.

프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산 서열로서 상보적인 템플리트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플리트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포라미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수 개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 공지된 바와 같이 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법, 올리고뉴클레오타이드 연장 분석, 대립형질 특이적 PCR법, RNase 불일치 절단, 단일가닥 입체 다형화, SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE), 변성 고압 액체 크로마토그래피, 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션, 인시츄 하이브리다이제이션 및 마이크로어레이 방법 등이 있다.

상기 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함될 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명의 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등이 있다.

본 발명은 또한 체액 또는 조직 시료를 채취하여 원심분리하고;

상기 원심분리된 상층액으로부터 SDS-PAGE로 단백질을 분리하며;

상기 분리된 단백질 밴드 중 25 내지 50kDa 크기의 밴드를 잘라서 인-겔 트립신 소화에 의해 펩타이드를 수득하고;

상기 수득된 펩타이드를 질량분석기기에서 MRM(multiple reaction monitoring: 다중반응 모니터링) 또는 SRM(selective reaction monitoring; 선택반응 모니터링) 방법으로 분석하여 합토글로빈 베타 사슬 유래 펩타이드의 전구체 이온 또는 이행성 이온의 피크를 찾아내는 것을 포함하는 합토글로빈 베타 폐암 마커를 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 폐암 혈청 마커를 찾아내기 위해 폐선암을 가지거나 가지지 않은 지원자로부터 혈청 시료를 채취했다. 1차원 겔 전기영동을 통해 각 5명씩의 건강한 성인 및 폐선암 환자의 혈청으로부터 100㎍의 단백질을 분리해냈다. 그 다음 겔을 쿠마시 염색하여 정상인과 폐암환자 사이에 강도가 다른 45, 15, 및 10kDa의 분자크기를 갖는 3개의 밴드를 찾아냈다(도 1A). 폐선암 환자에서 증가된 단백질을 동정해내기 위해, 관심 있는 6개의 밴드를 잘라내어 인-겔 소화시키고 트립신 처리된 펩타이드를 LC-ESI-MS/MS 분석하였다. 각 밴드에서 20-30개의 단백질이 동정되었다. 합토글로빈 펩타이드는 45kDa(밴드 1), 15kDa(밴드 2) 및 10kDa(밴드 3)에서 발견되었다(도 1A). 119, 91, 42개의 Hp가 각 밴드의 폐선암 환자 시료로부터 발견된 반면, 32, 28, 19개가 건강한 대조군 시료의 밴드에서 발견되었다(도 1B). 정상인에 대한 폐암환자에서 발견된 Hp 전구체 스펙트럼 수의 비율은 평균 3.1이다(도 1B).

Hp는 α1, α2 및 β 사슬이 서로 다른 조합으로 구성된 폴리펩타이드이다. 본 발명자들은 MS/MS 분석을 통해 각 밴드의 Hp 전구체의 주된 MS/MS 스펙트럼이 Hp의 각 사슬인 α1, α2 및 β 사슬을 각각 나타낸다는 것을 알아냈다. 밴드 1에서는, SCAVAEYGVYVK의 펩타이드 서열이 20의 펩타이드 히트 수로 검출되었고, 그 서열은 Hp β사슬과 일치한다. 밴드 2에서는 LRTEGDGVYTLNDKK 및 AVGDKLPECEAVCGKPK의 펩타이드 단편이 검출되었는데 각각 Hp α1 및 α2 사슬을 나타낸다(도 2). 각 밴드의 Hp 전구체의 특이 서열을 그것의 히트수와 함께 도 2B에 나타냈다. 도 2C는 Hp의 전체 아미노산 서열 및 동정된 펩타이드 단편을 박스로 표시하여 총 38%의 서열을 보여준다. 밴드 내의 Hp 스펙트럼 수를 고려할 때, Hp의 각 사슬이 증가한 밴드 농도의 주성분이라는 것을 알 수 있다.

앞서 말한 바와 같이 Hp는 3개의 사슬로 구성되고 각 사슬은 9, 19 및 29 kDa의 예상 분자크기를 갖는다. 그러나 폴리클로날 항체로 면역블롯을 한 결과 각 밴드의 예상 분자량과 다른 곳에서 검출이 되었다. 본 발명자들은 β 사슬이 N-글리코실화되었고 그래서 45 kDa보다 큰 분자량으로 검출되었을 것이라고 가정했다. 이런 가정을 확인하기 위해서 우선 서열 내에서 가능한 N-글리코실화 모티브(NxS/T)를 찾아 β 사슬 내에 4개의 가능한 위치를 찾아냈고(도 2C) PNGase F를 처리하였다. PNGase F는 아스파라긴-결합(N-결합) 올리고당을 당단백질로부터 잘라내고, 아스파라긴을 아스파르트산으로 탈아민화시키면서 올리고당은 그대로 남겨둔다. PNGase F 처리 후에 45kDa 밴드가 29kDa으로 이동했는데, 45kDa 밴드가 β 사슬의 글리코실화된 형태라는 것을 암시한다(도 3A).

본 발명의 일 실시예에서는 혈청에서의 Hp 발현을 확인하기 위해 44명의 건강한 사람들의 혈청을 대조군으로 하고 78명의 폐암 환자의 혈청을 면역블롯하여 검사하였다. 그 결과, α2 사슬 및 β 사슬 펩타이드가 폐암 환자에서 대조군에 비해 현저히 높게 발현되었다(도 3B, C 참조). 44 명의 건강인 및 78명의 폐선암 환자의 시료를 웨스턴블롯(WB) 하고 α2 사슬 및 β 사슬 밴드의 두께를 측정하였다. 단백질 상대농도는 각 개인에 대해 (시료 밴드의 픽셀 수/표준 밴드의 픽셀 수)*100으로 계산하여 Hp α2 및 β 사슬 밴드의 농도를 분석하였다(도 3D, E). 그 결과 Hp α2 및 β 사슬 모두 폐암 진단을 위한 잠재적 마커의 기질을 보여주지만 β사슬이 폐선암의 확인을 위해 더 나은 마커라는 것을 보여준다. Hp β 사슬은 암환자 및 대조군에서 확실한 발현의 차이를 보였으며(p = 0.042) 유방암 및 간세포암(각각 p = 0.016 및 0.003)과 같은 다른 암과도 확실한 차이를 보였다(도 3E). 하지만 α2 사슬은 건강한 대조군에 비해 폐선암에서 약간 증가했으며(p = 0.002), 폐암과 다른 암(유방암 및 간세포암 각 p = 0.129 및 p = 0.054) 사이에는 유의적 차이가 없었다(도 3D). 폐선암에서의 α2 사슬 농도는 유방암 및 간세포암에서와 유의적 차이가 없었지만 β 사슬 농도는 유의적으로 달랐던 것이다. 이러한 결과는 Hp β 사슬이 α사슬에 비해서 폐선암의 진단을 위해 더 나은 마커라는 것을 보여준다.

혈청에서의 Hp β의 값을 더 잘 정량하기 위해서 본 발명의 일 실시예에서는 β 사슬 특이적 항체를 사용하여 ELISA를 수행했다. 항체의 특이성(specificity)은 폐암 환자의 혈청을 사용하여 웨스턴블롯으로 시험하였다. 그 다음 190명의 폐선암 환자의 혈청과 190명의 건강한 사람의 혈청을 ELISA로 분석했다(도 4A). ELISA 결과 Hp β 사슬의 평균 농도가 폐선암 환자(8.0 ±3.8㎍/ml)와 건강한 사람(1.9±1.2 ㎍/ml) 사이에 상당한 차이가 있었다. 그 다음 폐선암 환자의 ELISA 결과를 암의 단계별로 분석해 보았는데 암 단계가 진행됨에 따라 Hp β 사슬의 농도도 함께 증가함을 확인할 수 있었다(도 4B). Hp β 사슬 농도는 암의 단계에 따라 점차적으로 증가했다. 1단계 평균은 6.2±2.5 ㎍/ml, 3단계 평균은 9.0±4.6 ㎍/ml 그리고 4단계 평균은 11.8±4.9 ㎍/ml였는데, 2단계의 경우 시료수가 너무 적어서 데이터 신뢰성이 떨어져서 제외했다. 이러한 결과는 Hp β 사슬이 폐선암의 발견 및 모니터링을 위한 잠재적인 바이오마커임을 보여준다.

Hp β 사슬 발현이 증가하는 것이 폐선암에 특이적인 것인지 아니면 다른 조직학적 유형의 폐암에도 적용되는 것인지 확인하기 위해서 본 발명의 일 실시예에서는 SQLC 및 SCLC 환자 시료에서의 Hp β 사슬의 발현 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과 평균 농도가 SQLC의 경우 8.2±3.4㎍/ml, SCLC의 경우 8.9±3.6㎍/ml으로 폐선암과 크게 다르지 않았다(도 4A). 즉, Hp β 사슬이 폐선암 뿐만 아니라 편평상피암이나 소세포암과 같은 다른 폐암에서도 바이오마커로 적용될 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 다른 실시예에서는 다른 암과 다른 호흡기 질환자의 혈장에서의 Hp β사슬의 발현 정도를 ELISA 분석하여, Hp β사슬의 감별 진단을 위한 유용성을 확인해보았다. 그 결과 유방암과 간세포암에서 평균 Hp β 사슬 농도는 각각 1.5±0.5 및 1.4±1.0㎍/ml였고(도 5A) 오직 한 사람의 간세포암 환자 시료만 기준치인 5 ㎍/ml를 넘었다. 또한 폐결핵(TBC), 특발성 폐섬유화(IPF) 및 기관지천식(BA) 환자의 Hp β 사슬 농도를 측정하고 건강한 대조군 및 폐선암 환자의 것과 비교하였는데, Hp β 사슬의 혈장 농도는 건강한 대조군(3.2±1.3 ㎍/ml)에 비해 폐선암(11.4±4.3 ㎍/ml)에서 3배 높았고, 다른 호흡기 질병에서도 TBC 4.6±2.0㎍/ml, IPF 5.8±2.6 ㎍/ml 그리고 BA 3.7±1.6㎍/ml로 폐선암에 비해 현저히 낮게 나왔다 (도 5B). 이런 결과는 Hp β 사슬이 다른 암 및 다른 호흡기 질병과 구분되는 폐암에 대한 바이오마커가 될 수 있다는 것을 말해준다.

본 발명자들은 LC-MS/MS 분석을 통해 Hp가 폐암 환자의 혈청에서 건강한 사람에서보다 훨씬 높게 나온다는 것을 알아냈고, 면역블롯과 ELISA를 통해 그 농도가 유의적으로 높다는 것도 밝혀냈다. Hp의 세 개의 사슬 중에서 Hp α2와 β 사슬이 건강한 대조군과 차이를 보였으나 다른 암과는 β 사슬만이 유의적인 발현의 차이를 보였다. Hp β 사슬은 폐선암 뿐만 아니라 다른 조직학적 폐암에서도 발현이 증가했지만, 다른 암이나 다른 호흡기 질환에서와는 유의적인 차이가 있었다.

종래 Hp α 서브유닛이 난소암 및 소세포암(SCLC)의 잠재적인 바이오마커라는 연구가 있었다. Hp가 췌장암 및 난소암의 잠재적인 바이오마커라는 보고가 있었지만 폐암에 대한 연구는 별로 없었으며, 본 발명처럼 Hp β 사슬이 특이적으로 증가했다는 사실은 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀진 것이다. 또한 본 발명자들은 Hp β가 폐암 외의 암에 비해서 폐암에서 유의적으로 증가함을 밝혀내어 Hp β 사슬이 감별진단을 위한 잠재적인 바이오마커임을 제안하고 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

시료 채취

건강한 지원자 및 삼성의료원, 경북대학교 병원 및 순천향대학교 병원의 폐암환자와 다른 암환자, 그리고 호흡기 질환자로부터 동의를 받고 혈청 및 혈장 시료를 채취하였다. 239명의 폐선암 환자와 291명의 건강한 대조군 성인, 그리고 40명씩의 다른 조직학적 폐암(SQLC, SCLC) 환자, 그리고 22명의 유방암 환자 및 20명의 간세포암 환자의 혈청을 분석에 사용하였다. 또한 50명의 건강한 대조군 성인과 30명의 폐선암 환자, 그리고 50명의 호흡기 질환자(TBC, IPF, BA)의 혈장을 분석에 사용하였다. 혈청 및 혈장은 채취 후 4시간 내에 원심분리하여 전혈로부터 분리했고 사용 전 -70℃에 보관하였다. 본 실시예에 사용된 시료에 대한 자세한 사항은 표 1에 정리했다.

시료 유형	개체 유형	성별	나이	합계
혈청	건강한 성인	남	56.2±9.3	118
		여	52.1±10.4	83
	폐선암	남	60.3±10.3	164
		여	62.4±9.6	75
	유방암	여	47.8±6.4	22
	간세포암	남	53.7±6.0	16
		여	61.0±6.7	4
	편평상피암	남	69.1±6.4	36
		여	58.5±12.4	4
	소세포폐암	남	64.4±9.0	39
		여	53.0±0.0	1
혈장	건강한 성인	남	54.4±3.3	50
	폐선암	남	60.4±5.2	30
	TBC	남	55.8±4.2	50
	IPF	남	60.5±12.3	50
	BA	남	54.9±3.0	50

< 실시예 2>

LC - ESI - MS / MS 분석

2.1 SDS-PAGE 분리 및 쿠마시블루 염색

5명씩의 폐선암 환자 및 건강한 성인의 혈청으로부터 SDS-PAGE로 100㎍의 단백질을 분리한 후에 겔을 ddH₂O로 5분간 3번 씻은 후, Bio-Safe 쿠마시블루 염색액(Coomassie G250 Stain: BioRad, Hercules, CA)를 넣고 상온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어주면서 염색했다. 겔에 ddH₂O를 넣고 밤새 배양하여 탈색시켰다.

2.2 인-겔 소화

염색이 끝난 후에 관심 있는 단백질 밴드를 잘라 단편화하고 인-겔 트립신 소화시켰다. 각각 다른 강도를 보이는 암환자와 건강한 성인의 여섯 개의 밴드를 잘라 인-겔 분해했다. 겔을 여섯 개의 밴드로 자르고 75 mM 중탄산암모늄/40% 에탄올(1:1) 용액에서 흔들어주며 배양하여 탈색시켰다. 그 다음 단편들을 다이티오트렐톨(dithiothreltol) 용액에 푹 담그고 흔들면서 배양했다. 단백질을 알킬화하기 위해서 겔 단편을 300 ㎕의 IAA 용액에서 배양한 후에, 700㎕의 100% 아세토니트릴 용액에 넣어 탈수시켰다. 그 다음 겔 단편을 진공에서 말리고 트립신(Roche Applied Science) 처리한 다음 37℃에서 밤새 배양했다. 트립신 처리된 펩타이드를 0.1% 포름산으로 용출시켰다.

2.3 LC-ESI-MS/MS 분석 및 데이터 분석

NSI source(San Jose, CA)가 구비된 Thermo Finningans’s ProteomeX 워크스테이션 LTQ 리니어 IT MS(Thermo Electron, San Jose, CA, USA)를 이용하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 알려진 방법대로 질량분석을 하였다. SEQUEST 알고리즘(Thermo Electron)을 이용하여 MS/MS 결과 데이터를 IPI 인간 단백질 데이터베이스(3.29 버전)에서 검색했다. Scaffold ver.01_07_00을 이용하여 MS/MS 결과에 기초하여 동정된 펩타이드와 단백질을 확증했다.

2.4 펩타이드-N-글리코시다제 F(PNGase F)로 탈글리코실화

1g의 당단백질을 100℃에서 10분간 완충액 속에서 변성시킨 다음 상온으로 식혔다. 완전히 탈당화하기 위해서 단백질을 1㎕ PNGase F(New England BioLabs, UK)가 들어있는 반응 완충액에 넣고 1시간 동안 37℃에서 배양했다. 면역블롯을 통해 단백질이 완전히 탈글리코실화되었음을 확인했다.

< 실시예 3>

혈청 시료 내의 합토글로빈 측정

3.1 웨스턴 블롯 및 농도계 분석

0.5㎍의 조혈청 단백질을 15% SDS-PAGE로 분리한 후에 이동시켰다. 막을 1:3000으로 희석한 Hp 항체(다클론 항-인간 Hp 항체, DaKoCytomation, Denmark)와 함께 상온에서 1시간 배양한 후에 HRP(horseradish peroxidase) 결합 항-토끼 IgG 이차 항체(Stressgen, BC, Canada)를 1:2000로 희석하여 30분간 상온에서 함께 배양했다. ECL Western blot analysisteme(Amersham Biosciences, UK)으로 면역반응한 단백질을 검출했다. Scion Image(Scion, Frederick, MD)를 이용하여 밴드의 농도 분석을 했다.

3.2 ELISA

혈청 및 혈장의 Hp β사슬의 값을 실험실에서 만든 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정했다. 코팅용액, 세척용액, 차단용액 및 색반응 용액은 ELISA 스타터 키트(Koma biotech inc. Korea)를 사용하였다. 세 개의 항체, 즉 항-Hp β 사슬 단클론 항체(Ab frontier, seoul, Korea), 항-Hp 다클론 항체(Ab frontier) 및 항-토끼 2차 항체(Stressgen)를 사용하였다. 항-Hp β 사슬 단클론 항체를 코팅 완충액에 희석하여 1㎍/ml로 만든 다음 각 웰에 100㎕의 코팅용액을 넣었다. 준비된 플레이트를 4℃에서 밤새 배양했다. 200㎕의 차단 용액으로 1시간 동안 상온에서 반응을 종료시킨 다음, 혈청 또는 혈장 시료를 PBS에 200배 희석하고 100㎕씩을 각 웰에 넣은 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 정제된 인간의 Hp 단백질(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 0 ng/ml 내지 600 ng/ml의 농도 범위에서 표준시료로 사용하였다. 100 ㎕의 항-Hp 다클론 항체(1:20,000 Ab frontier)를 96 웰 플레이트에 넣은 후에 1시간 동안 배양했다. 검출을 위해서 플레이트에 100㎕의 염소 항-토끼 항체(1:5,000, Stressgen)와 함께 상온에서 1시간 배양한 다음 PINK-ONE TMB 용액(Koma biotech inc)을 넣었다. Hp β 사슬의 농도를 측정하기 위해서, ELISA 판독기(Simadzu)를 이용하여 450nm에서 판독했다.

< 실시예 4>

페선암 환자와 다른 암 환자의 Hp 의 β사슬 발현 차이 확인

건강한 44명의 지원자 및 78명의 폐선암 환자, 22명의 유방암 환자 및 20명의 간세포암(HCC) 환자의 조혈청으로부터 5㎍씩의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 면역블롯으로 Hp의 발현을 확인했다. 실시예 2.4의 방법에 따라 PNGase F로 처리한 각 시료를 항-Hp 다클론 항체로 면역블롯하여 분석하였다.

각 블롯은 동일한 표준시료를 포함하고, 따라서 농도계로 면역블롯한 결과를 분석할 때 분석된 각 밴드의 총 픽셀값(농도×면적)은 블롯에 포함된 표준의 총 픽셀로 표준화시켰다.

< 실시예 5>

폐선암 및 다른 조직학적 유형의 폐암에서의 Hp β 사슬농도 확인

190명의 건강한 대조군과 190명의 폐선암 환자의 각 혈청으로부터 실시예 3.2의 방법에 따라 ELISA로 Hp β 사슬의 농도를 측정하였다. 다른 조직학적 유형의 폐암인 편평상피암(SQLC) 및 소세포폐암(SCC) 환자의 혈청도 ELISA 분석하였다.

또한 혈청 시료를 폐암 단계별로 나누어 폐암 단계와 Hp β 사슬의 농도와의 관계를 확인하였다.

< 실시예 6>

다른 암 및 다른 호흡기 질환자와의 비교

20명의 유방암 환자 및 20명의 간세포암 환자에서 Hp β 사슬이 얼마나 발현되는지를 실시예 3.2의 방법에 따라 ELISA로 확인했다. 표 1에 기재한 바와 같이, 건강한 대조군, 폐선암(adenoCA) 환자, 다른 호흡기 질병인 결핵(TBC) 환자, 특발성 폐섬유화(IPF) 환자 및 기관지천식(BA) 환자의 Hp β 사슬 발현 정도를 ELISA로 확인했다.

<통계적 분석>

모든 데이터는 평균±표준편차로 나타냈다. 각 군간 농도 및 ELISA 결과의 통계적 차이는 양측 스튜던트 t-검정법(two-tailed student’s t- test)으로 평가했다. 통계적 유의성은 * p<0.05로 나타냈다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (6)

1. 합토글로빈 베타 사슬에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐선암 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 폐암 진단용 조성물.
2. 합토글로빈 베타 사슬에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐선암 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 폐암 진단용 키트.
3. 합토글로빈 베타 사슬에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐선암 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 폐암 진단용 마이크로 어레이.
4. 합토글로빈 베타 사슬을 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐선암 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 폐암 진단용 조성물.
5. 합토글로빈 베타 사슬을 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐선암 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 폐암 진단용 키트.
6. 합토글로빈 베타 사슬을 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐선암 및 소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 폐암 진단용 마이크로 어레이.

Images