CN103743906A - 用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒、系统及方法 - Google Patents

用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境评测的试剂盒、系统及方法，该试剂盒、系统和方法的应用基于流式细胞仪，所述试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP和CD133-APC。所述系统中设有主控计算机单元和存储有经验数据和图形的存储单元，该硬件的配置是实现测定的重要保证。本发明首次将CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例作为评价造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境品质的指标之一，对于预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生具有指导意义，对于指导制定植入不良患者的临床治疗方案具有重要的参考价值。

Description

用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒、系统及方法
技术领域
本发明涉及一种特殊应用环境中使用的细胞表型专用试剂盒及系统，具体涉及一种用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境评测的试剂盒、测定系统及实现定性定量分析的方法。 
背景技术
异基因造血干细胞移植是治疗血液恶性疾病的有效方式之一，但是移植后植入不良（英文名称Poor Graft Function，缩写PGF）的发生率在5-27%之间，仍然是异基因造血干细胞移植后的主要并发症之一，严重时影响移植患者的长期生存。尽管文献报道，植入不良可能与移植前预处理剂量、免疫排斥、移植物抗宿主病、病毒感染、移植的CD34+细胞数等诸多因素有关，但移植后植入不良的发病机制尚未阐明，骨髓微环境在特定的植入条件下是否在与后期并发症具有重要内在联系尚未明确的研究结果。 
采用骨髓细胞体外长期培养实验和集落形成实验是替代体内研究来评估血液病患者骨髓基质细胞造血支持作用的常用方法。既往研究借助于上述研究方法证实，接受长期化疗的血液病患者骨髓基质细胞受损，接受自体造血干细胞移植的患者在移植前和移植后1年均可检测到骨髓基质细胞受损。我们由此推测骨髓微环境受损也可能参与了造血干细胞移植后植入不良的发生。但是骨髓细胞体外长期培养实验和集落形成实验具有一定的局限性：其目标细胞群包括成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞等一组异质性的骨髓基质细胞组分。特别是在造血干细胞移植后的早期，患者体内重建的骨髓基质细胞数量很少，严重限制了上述研究方法的推广应用。因此，迫切需要建立新的、方便快捷的检测方法对造血干细胞移植后血液病患者的骨髓微环境组分进行有效性评估。这涉及到造血干细胞移植后植入不良能否及时预测以及临床治疗方案的制定是否更加科学、高效与个体化。 
对于血液病患者来讲，骨髓配对找到合适的骨髓捐献者本来就是十分不易之事，如果因为某种因素延误了后期的治疗与恢复，浪费了宝贵的社会资源，则是医学界的悲哀。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境的试剂盒、系统及方法，利用该试剂盒中经过精确标定和定量的专用试剂、配套的设备系统及技术操控方法，可以快速、准确地测定CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中所占比例，从而得出造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境品质的定性和定量结论，从而可以快速、准确地预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生，对临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。 
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案1是： 
提供了一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境评测的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，该试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP和CD133-APC。
采用上述试剂盒与流式细胞仪配合使用，可以准确、定量测定CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例，为骨髓微环境的评测奠定了基础。 
本发明还提供了一种基于上述试剂盒的专用系统，该系统的结构中包括流式细胞仪和配套的数据分析模块，所述系统中还包括主控计算机单元，以及连接在主控计算机单元配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块、配置缓存器模块的监控显示器LCD、存储有经验数据和图形的存储模块、暂存器模块、设置在系统操控台上的操控面板、存储有内外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块、打印机及接口电路，流式细胞仪通过通讯接口电路和主控计算机单元的数据总线连接，且流式细胞仪结构中配套设有用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境评测的专用试剂盒，所述专用试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP和CD133-APC。 
本发明的关键技术在于借助主控计算机系统的完善配备和针对性任务明确的控制方法与配套软、硬件的配套，将关键的采样设备——流式细胞仪改造成为造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境评测报告专用的系统装备。流式细胞仪的用途是测定带有荧光标记的骨髓样本，记录二维散点图。但是，被测定细胞特异性内涵的定性和进一步定量分析，流式细胞仪和配套的分析软件是无能为力的。特定任务的实现，取决于染色标记的选配是否合理，前瞻性研究的定标分界线值的选取是否的具有普遍性以及操作方法是否能为临床的结果所验证。 
本发明的发明关键还在于设计了基于本发明所说的系统，测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境的方法，该方法包括以下步骤： 
A、将待测骨髓样本采用专用试剂盒中的试剂在流式细胞仪专用试管中进行荧光标记，制成测试样本；
B、将装有测试样本的专用试管置入流式细胞仪，启动流式细胞仪8及配套的分析软件，按照存储模块3中特定的数据采集条件采集相关数据，形成散点图，并进行流式设门分析，传输并分类标记存入暂存器模块4；
C、调出在存储模块3中经验数据和图形，显示在高清晰度的监控显示器LCD的上半区，在下半区调出暂存器模块4中的对应图谱，借助光标尺进行对照定量分析；
D、确定CD45-CD34–CD146+在骨髓单个核细胞中表达比例的分界线值的位置；
E、将测定的CD45-CD34–CD146+表达比例≥分界线值定义为骨髓微环境良好；CD45–CD34–CD146+表达比例<分界线值定义为骨髓微环境不良；
F、从存储模块3中调出造血干细胞移植后患者骨髓微环境检测报告表，填入测定数据、相关图表，比对后将“良好”、“不确定”、“不良” 选择填入评测结论栏中，从激光打印机上输出。
借助以上的方法，可以指导编制本系统中的主控程序中的管理软件，形成全自动式的设备，以快速检测、评估造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境。本发明对流式细胞仪的测定结果借助苏木精-伊红（英文名称Hematoxylin-Eosin staining，缩写HE）染色和CD34免疫组化（IHC）染色对患者骨髓活检标本中骨髓微环境中的血管进行原位定量验证，证明了本发明测定方法的科学性、对以后的研究奠定了基础。 
采用本发明的试剂盒、系统和方法测定造血干细胞移植后血液病患者肝素抗凝骨髓单个核细胞中CD45–CD34–CD146+细胞的表达比例，并进一步通HE染色和CD34免疫组化（IHC）染色对患者骨髓活检标本中骨髓微环境中的血管进行原位定量验证。通过临床试验和统计学分析，结果表明：通过流式细胞仪检测到的异基因造血干细胞移植后植入不良患者（n=19）CD45–CD34–CD146+细胞的表达比例明显低于植入良好（英文名称Good Graft Function，缩写GGF）的血液病患者（n=38）和健康供者（n=15）（0.008% vs. 0.16% vs. 0.18%, P<0.0001）；根据操作者工作曲线（ROC曲线）确定CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中表达比例=0.025%为分界值，将CD45–CD34–CD146+细胞的表达比例<0.025%定义为骨髓微环境不良（或异常），将CD45–CD34–CD146+细胞的表达比例≥0.025%定义为骨髓微环境良好（或正常）；通过HE和CD34免疫组化染色进一步在骨髓原位证实移植后 PGF患者（n=19）骨髓血管数量明显低于GGF患者（n=38）和健康供者（n=15）（2 vs. 4 vs. 6 /骨小梁, P<0.05）；多因素预后分析提示CD45–CD34–CD146+细胞的表达比例<0.025%是造血干细胞移植后血液病患者发生植入不良的独立危险因素。虽然本发明所测定CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例不能够直接得出诊断结果或者健康状况，但其作为中间结果可以作为预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生以及指导制定植入不良患者的临床治疗方案的参考信息之一。 
采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明首次将CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例作为评价造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境品质的指标之一，并通过大量实验进行了验证，对于预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生具有指导意义，并且对于指导制定植入不良患者的临床治疗方案具有重要的参考价值；（2）采用本发明的试剂盒、系统以及配套的方法，可以快速测定骨髓单个核细胞中CD45–CD34–CD146+细胞的表达比例，为骨髓微环境的评价提供了一种快速、准确评价的途径，是现有技术的有力补充。 
附图说明
图1中A1、A2、A3别是健康供者、植入良好和植入不良患者的骨髓细胞增生程度典型HE染色图（×10）；如图所示，健康供者的骨髓细胞增生程度依次优于植入良好患者和植入不良患者。 
图2 A-C分别是健康供者、植入良好和植入不良患者骨髓细胞进行CD45–CD34–CD146+测定的典型流式设门分析图。如图所示，健康供者的骨髓CD45–CD34–CD146+细胞比例依次优于植入良好患者和植入不良患者。 
图3A是植入不良患者与植入良好患者之间移植后CD34+细胞数目的差异； 
图3B和图3C分别是健康者、植入不良患者以及植入良好患者之间CD34+细胞和CD45–CD34–CD146+细胞占骨髓单个核细胞比例的相关性结果；
图4 中A1-A3分别是健康供者、植入良好和植入不良患者骨髓血管周围细胞免疫组化的典型CD146染色图（×40）。
图5是本发明系统的结构示意图： 
以，1代表主控计算机单元，2代表存储有主控程序的系统管理模块，LCD代表配置缓存器模块13的监、控显示器，3代表存储有经验数据和图形的存储模块，4代表暂存器模块，5代表设置在系统操控台上的操控面板，6代表存储有内、外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块，7代表打印机及接口电路，8代表流式细胞仪，该仪器通过通讯接口电路12和主控计算机1的数据总线连接，流式细胞仪8结构中配套有对标本进行激光扫描采样的测试窗口9，10是专用标本试管，11代表专用试剂盒。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境评测的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，该试剂盒中配置了下列荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP和CD133-APC，各单克隆抗体的荧光标记及成分等信息参见表1。 
表1 流式单克隆抗体信息
名称 荧光标记 克隆 产品目录号 公司
CD34 FITC 8G12 348053 BD Biosciences
CD146 PE 89106 550315 BD Biosciences
CD45 PerCP 无 347464 BD Biosciences
CD133 APC 293C3 130-090-854 Miltenyi Biotec
所述试剂盒中还配置了红细胞溶解液、pH 为7.2~7.4的10×PBS缓冲液、配套计量的小牛血清。
具体地，所述试剂盒中每种荧光标记的单克隆抗体试剂容量标准单元是：5μL的 CD34-FITC、5μL的CD146-PE、10μL的 CD45- PerCP和 3μL的 CD133-APC，配套设置有不小于3-5mL的流式细胞仪专用试管至少2个。试验时，直接用微量吸枪吸取试剂盒中的每种荧光标记的单克隆抗体试剂即可，采用上述配比的试剂，测试结果重现性好、测试结果准确。 
本实施例还提供了一种用于检测造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境评测的系统，系统结构中包括流式细胞仪及其数据分析软件，还包括主控计算机单元1，以及连接在所述主控计算机单元1配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块2、配置缓存器模块13的监控显示器LCD、经验数据和图形存储模块3、暂存器模块4、设置在系统操控台上的操控面板5、存储有内外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块6、打印机及接口电路7，流式细胞仪8通过通讯接口电路12和主控计算机单元1的数据总线连接，且流式细胞仪8结构中配套设有用于检测造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境的专用试剂盒11，所述专用试剂盒中配置了荧光标记单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP和CD133-APC。 
以上的硬件设置保证了系统的专用性、方便了操作过程的完整性和快速、准确率。特别是经验数据和图形的存储模块的设立和配套管理程序模块的设置，包容了课题组的全部经验和成果，将复杂而繁琐的试验和分析过程转化为，简单的、自动化的数据与图形比对。使得染色、定性、定量实验室课题转化为普通医院的常规化验项目。 
所述经验数据和图形包括按照年龄、性别分别标示的健康人、植入良好和植入不良患者的骨髓样本的骨髓微环境数据库及数据采集条件；所述数据库存储着存储着采用所述专用试剂盒11中的染色单克隆抗体为试剂制成的骨髓试样按照特定的数据采集条件所得的流式设门分析图、流式设门分析所得的CD45–CD34–CD146+细胞表达比例及该骨髓试样相关的临床特征。所述特定的数据采集条件包括采集数据时流式细胞仪所设置的采样条件，包括电压，设门位置、大小及形状，采样数量（比如体积、细胞个数）等信息。 
流式设门分析图的分析方法是：先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为R1区，以排除死细胞和细胞碎片；设CD45/SSC点图，根据各群细胞CD45和SSC的强度，画出CD45–SSClow区，即CD45–区，对CD45-区中的CD34–CD146+细胞进行设门分析，得出CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例。 
监控显示器LCD借助暂存器模块13与主控计算机单元1的数据总线相连、配套设置触摸式电子鼠标。因为大量的图形数据处理和分析，要求该显示器配套中的暂存器模块13和配套设置触摸式电子鼠标以实现图形的快速拖动、进行比较分析。 
本系统的硬件结构和含有经验数据和图形的存储模块的配备，是实现本发明目的的基础条件。控制和引导具体操作的管理软件的汇编方法是实现发明目的又一个关键。 
该方法包括以下步骤： 
A、将待测骨髓样本采用专用试剂盒中的试剂在流式细胞仪专用试管中进行荧光标记，制成测试样本；
B、将装有测试样本的专用试管置入流式细胞仪中，启动流式细胞仪8及配套的分析软件，按照存储模块3中特定的数据采集条件采集相关数据，形成散点图，并进行流式设门分析，传输并分类标记存入暂存器模块4；
C、调出存储模块3中经验数据和图形，显示在高清晰度的监控显示器LCD的上半区，在下半区调出暂存器模块4中的对应图谱，借助光标尺进行对照定量分析；
D、确定CD45–CD34–CD146+在骨髓单个核细胞中表达比例的分界线值的位置；
E、将测定的CD45–CD34–CD146+表达比例≥分界线值定义为骨髓微环境良好；CD45–CD34–CD146+表达比例<分界线值定义为骨髓微环境不良；
F、从经验数据模块3中调出造血干细胞移植后患者骨髓微环境检测报告表，填入测定数据、相关图表，比对后将“良好”、“不确定”、“不良” 选择填入评测结论栏中，从激光打印机上输出。
步骤A中所述测试样本的制备步骤包括： 
A1、取洁净的流式细胞仪的专用试管，在试管中分别加入5μL的 CD34-FITC，5μL的CD146-PE, 10μL的CD45-PerCP和 3μL的 CD133-APC，再加入300μL采集的待测骨髓样本（含有不少于1×106个白细胞），混匀，室温避光放置15分钟孵育，
A2、加入用1×PBS稀释10倍后的红细胞溶解液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟，溶解红细胞，
A3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入2mL含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS，混匀，
A4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入0.3mL1×PBS缓冲液、混匀，制成测试样本。
其中，10×PBS缓冲液的配制方法：称取Na2HPO4·12H2O 26.3g、NaH2PO4·2H2O 3.0g和NaCl 85.0g于容量瓶中，加蒸馏水至1000mL，常温保存。将10×PBS缓冲溶液稀释10倍为1×PBS。 
步骤B中所述建立二维图谱包括： 
B1、先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为R1区，以排除死细胞和细胞碎片；
B2、设CD45/SSC点图，根据各群细胞CD45和SSC的强度，画出CD45–SSClow（CD45–）区；
B3、对CD45–区中的CD34–CD146+细胞进行设门分析，得出CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例。如图2所示，A-C分别是健康供者、植入良好和植入不良患者骨髓细胞进行CD45–CD34–CD146+测定的典型流式设门分析图。
据ROC曲线确定CD45-CD34-CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例=0.025%为分界值，将CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例≥0.025%定义为骨髓微环境良好，将CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例<0.025%定义为骨髓微环境不良。 
下面首先验证采用上述试剂盒、系统和方法对骨髓微环境进行研究的科学性。分别通过实施例2和实施例3中关于造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境组分的HE染色和造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境组分的免疫组化染色对上述结果进行验证。
实施例2、造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境组分的HE染色
1、固定：取骨髓组织切成小块，10%中性福尔马林溶液内固定24小时；1×PBS缓冲液洗5次，每次5分钟；
2、脱水：把固定好的组织标本分别在70% 乙醇1小时，80% 乙醇1小时，95% 乙醇I 1小时，95% 乙醇II 2小时，95% 乙醇III 2小时，100% 乙醇I 1小时和100% 乙醇II 2小时；
3、透明：将脱水后标本依次放入二甲苯I 10分钟，二甲苯II 20 分钟；
4、浸蜡：经透明后的组织放入熔化的石蜡中浸透，反复3次，每次0.5-1小时； 
5、包埋：在包埋器中倒入熔化的新石蜡，在其凝固之前迅速放入组织块，放入前要分清组织的各个面，将所需断面朝下；包埋有腔组织时，把组织平放或立放；
6、切片：在切片机上切下厚度为4μm 的石蜡切片，在37℃水浴中展开，并捞于免疫组化专用玻片上；在60℃烤箱中烘烤4小时；
7、脱蜡：把切片放置于二甲苯I、II 各5分钟；
8、进水：把切片分别放置于100% 、95％、85％、75%、50% 乙醇中各5分钟，放置于自来水5分钟；
9、HE 染色：把切片放于苏木精染液中5分钟，1％盐酸水溶液分化数秒钟（3～4 秒），流水冲洗后放置于0.5％伊红乙醇溶液中1分钟；
10、脱水：将切片放置于85％、95％乙醇各数秒钟，100％乙醇I、II 各1分钟；
11、二甲苯中放置数秒透明，采用中性树胶封片；
12、光学显微镜下观察HE 染色组织切片，如图1和图4所示，研究结果发现健康供者的骨髓造血容量以及每个骨小梁中的血管数量大于植入良好患者大于植入不良患者。
实施例3 造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境组分的免疫组化染色
1、应用抗人CD34 单克隆抗体对骨髓组织切片中的血管进行免疫组化检测，同HE 染色一样先对石蜡切片进行脱蜡和进水；
2、抗原修复: 切片放入已预热的0.01M 柠檬酸缓冲液（pH 6.0）内煮沸20分钟，自然冷却20分钟；
3、用3% 过氧化氢室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；
4、应用蒸馏水冲洗切片，PBS缓冲液中浸泡5分钟；
5、除去PBS缓冲液, 每张切片加1滴或50ul 正常非免疫动物血清, 封闭，室温下孵育10分钟，倾去血清，勿洗，滴加1：100 稀释的抗人CD34 单克隆抗体（美国Abcam公司），4℃湿盒过夜；
6、PBS缓冲液冲洗切片，每次5分钟，共3次；
7、滴加Envision 工作液，室温中放置30分钟
8、PBS缓冲液冲洗切片，每次5分钟，共3次；
9、除去PBS缓冲液, 每张切片加2滴或100ul 新鲜配制的DAB溶液, 显微镜下观察3-10分钟；
10、自来水冲洗, 苏木精染液复染1分钟, 自来水冲洗返蓝；
11、将切片放置于85％、95％乙醇各数秒钟，100％乙醇I、II 各1分钟，二甲苯中放置数秒透明，采用中性树胶封片；
12、光学显微镜下观察各切片中每个骨小梁中CD34 阳性血管的数量；如图4所示，研究结果发现健康供者每个骨小梁中CD34 阳性血管的数量多于植入良好患者多于植入不良患者。
实施例4 
采用实施例1中的试剂盒、系统和方法，对2012年4月1日~2013年4月15日在北京大学人民医院、北京大学血液病研究所收治的异基因造血干细胞移植后植入不良（英文 Poor Graft Function, 缩写 PGF）和植入良好（英文 Good Graft Function, 缩写 GGF）的血液病患者，按照1:2比例进行前瞻性配对研究，对采用实施例2和3中的方法对实施例1的结果进行验证。对于每例PGF患者，均随机选取2例在年龄、移植前化疗疗程、移植时疾病状态以及移植后骨髓微环境的评估时间方面相匹配的GGF患者纳入本研究。GGF入组标准：在造血干细胞移植+28天之后持续保持成功植入（中性粒细胞绝对值[ANC]>0.5×109/L持续3天以上；血小板计数[PLT] >20×109/L持续7天以上；血红蛋白水平 [Hb] >70g/L并脱离红细胞输注）。PGF入组标准：在造血干细胞移植+28天之后出现2-3系血细胞减少持续3天以上（ANC ≤0.5×109/L持续3天以上； PLT ≤20×109/L；或Hb ≤70g/L），不能脱离血制品输注，伴有低增生性骨髓，不伴有严重移植物抗宿主病及血液学复发。
全部患者均在北京大学血液病研究所接受标准化诊断与异基因造血干细胞移植治疗。异基因造血干细胞移植方案按照北京大学血液病研究所的移植常规进行。本研究已经通过北京大学人民医院伦理委员会审批，全部入组患者均签署了知情同意书。 
下面对造血干细胞移植后植入不良和植入良好的两组血液病患者的临床特征以及骨髓血管内皮祖细胞比例进行统计学分析。 
1、临床特点 
本组患者植入不良的中位发生时间是移植后90天（58-264天）。植入不良组和植入良好组患者骨髓检测时间均为移植后90天(P>0.05)。DNA指纹图检测提示所有患者均为完全供者型。GGF和PGF两组患者的临床特征如表2所示。
表2 移植后植入良好和植入不良患者的临床特征
患者特征 植入不良组(n=19) 植入良好组(n=38) P-Valueb
骨髓微环境评估时间 (移植后天数) 90(58-264) 90(30-270) 0.61
骨髓细胞增生程度 (%)(范围) 10(5-15) 45(30-50) <0.0001
骨髓微环境成分      
CD45-CD34+CD146+ (%)(范围) 0.008(0.001-0.03) 0.10(0.02-0.23) <0.0001
CD45-CD34+CD146+  (每个血管)(范围) 1(0-3) 4(2-6) <0.0001
外周血细胞计数      
中位白细胞计数 (×109/L) (范围) 1.73(0.32-5.34) 5(3.10-7.60) <0.0001
中位中性粒细胞计数 (×109/L) (范围) 1.10(0.16-6.50) 3.65(1.55-6.38) <0.0001
中位血红蛋白水平 (g/L) (范围) 76(56-103) 120(78-151) <0.0001
中位 血小板计数 (×109/L) (范围) 17(9-142) 119(61-243) <0.0001
移植时年龄 (岁, 中位值, 范围) 27(16-57) 35.5(16-55) 0.48
性别 (男/女) 9/10 23/15 0.40
疾病诊断      
急性髓细胞白血病 4 9 1.00
急性淋巴细胞白血病 9 17 1.00
慢性粒细胞白血病 2 4 1.00
骨髓增生异常综合征 4 8 1.00
移植时疾病状态     0.11
标危 16 25  
高危 3 13  
确诊到移植的中位时间 (月, 范围) 12(4-20) 10(2-30) 0.32
干细胞来源     1.00
骨髓和外周血 17 34  
外周血 2 4  
移植的单个核细胞数(×108/ 公斤,中位值, 范围) 8.06(5.34-15.34) 7.59(3.50-10.08) 0.12
移植的CD34+细胞数(×106/公斤,中位值, 范围) 2.38(1.23-3.96) 2.26(0.90-3.94) 0.80
供者HLA匹配      
HLA-全合同胞供者 2 10 0.30
HLA-部分相合同胞供者 15 22 0.15
HLA-全合无关供者 2 4 1.00
供受者性别匹配      
女供男 5 6 0.48
女供女 1 2 1.00
男供女 9 11 0.15
男供男 4 15 0.24
供受者ABO 血型不合      
无 13 27 1.00
小不合 2 2 0.59
从表2可以看出，本研究共入组57例接受异基因造血干细胞移植的血液病患者，包括19例植入不良患者和38例植入良好患者，两组患者之间的年龄、性别、疾病诊断、移植前化疗疗程及疾病状态、干细胞来源、供受者之间HLA匹配程度、供受者之间ABO血型匹配程度、供受者之间性别匹配程度、移植的单个核细胞数和CD34+细胞数、确诊到移植的时间、移植后进行骨髓微环境检测的时间、预处理方案、移植物抗宿主病病史、巨细胞病毒感染病史和抗巨细胞治疗疗程等临床特征无显著性差异（P>0.05）。植入不良组患者外周血细胞计数（包括ANC、Hb、PLT）和骨髓增生程度、通过流式细胞术检测的CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中表达比例和免疫组化方法检测的CD45–CD34–CD146+细胞数量明显低于植入良好组患者（P<0.0001）。
如图1所示，健康供者、植入良好和植入不良患者的骨髓细胞增生程度典型HE染色图（×10）也证实：健康供者的骨髓细胞增生程度依次优于植入良好患者和植入不良患者。 
2、植入不良患者和植入良好患者外周血和骨髓的细胞数量分析 
进行骨髓微环境检测时植入不良组患者的外周血细胞计数明显低于植入良好组患者。植入不良组患者的中位白细胞计数 (1.73×109/L vs. 5×109/L, P<0.0001), 中性粒细胞计数 (1.1×109/L vs. 3.65×109/L, P<0.0001), 血红蛋白水平 (76 g/L vs. 120 g/L, P<0.0001) 和血小板计数 (17×109/L vs. 119×109/L, P<0.0001) 均明显低于植入良好组患者。
植入不良患者骨髓病理表现为造血容量减少，脂肪细胞比例增高。植入不良组患者的造血容量明显低于植入良好组患者和健康供者(10% vs. 45% vs. 45%, P<0.0001)。 
3、通过流式细胞术定量检测骨髓CD34+细胞和CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中表达比例 
如图3所示，尽管植入不良组和植入良好组患者所移植的CD34+细胞数量无明显统计学差异，但是植入不良组患者的骨髓CD34+细胞比例明显低于植入良好组患者和健康供者(0.07% vs. 0.26% vs. 0.26%, P<0.0001)。
植入不良组患者骨髓CD45–CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中表达比例明显低于植入良好组患者和健康供者(0.008% vs. 0.10% vs. 0.12%, P<0.0001)。 
4、植入不良的危险因素分析 
如表3所示，应变量为移植后发生植入不良，自变量包括患者的年龄、性别、疾病诊断、移植前化疗疗程及疾病状态、干细胞来源、供受者之间HLA匹配程度、供受者之间ABO血型匹配程度、供受者之间性别匹配程度、移植的单个核细胞数和CD34+细胞数、确诊到移植的时间、移植后进行骨髓微环境检测的时间、预处理方案、移植物抗宿主病病史、巨细胞病毒感染病史和抗巨细胞治疗疗程、骨髓CD45–CD34–CD146+细胞比例等临床特征。单因素预后分析结果显示疾病诊断（骨髓增生异常综合征vs.白血病）、移植物抗宿主病病史和CD146+血管周围细胞（CD45–CD34–VEGFR2+）（<0.025%  vs. ≥0.025%）是影响移植后患者发生植入不良的危险因素。
表3 造血干细胞移植后植入不良的单因素预后分析
危险因素 单因素P-Value
基本特征  
性别，女 vs. 男 0.27
年龄 0.81
疾病特点  
诊断，骨髓增生异常综合症 vs. 白血病 0.04*
状态，高危vs. 低危  
移植前化疗  
化疗疗程 0.70
移植特征  
供受者匹配，同胞全合 vs. 同胞半相合 vs. 无关全合 0.15
HLA不合位点，≥ 2位点 vs. 0-1 位点 0.10
性别不合，女男 vs.女女 vs. 男女vs. 男男 0.12
ABO血型不合，无 vs.小不合 vs. 大不合 0.21
干细胞来源，骨髓+外周血 vs. 外周血 1.00
预处理，改良 BU/CY+ATG vs. 其他 0.15
移植的单个核细胞数，≥7.37×108/ kg vs. < 7.37×108/ kg 0.45
移植的 CD34+细胞数，≥2.3×106/ kg vs. < 2.3×106/ kg 0.42
移植相关并发症  
移植物抗宿主病史，有vs. 无 0.03*
巨细胞病毒感染史，有vs. 无 0.11
骨髓微环境成分  
移植后评估时间 0.33
aCD146+血管周围细胞，<0.025% vs. ≥0.025% <0.0001*
a根据ROC曲线确定的界值将CD45-CD34-CD146+ 细胞分为两组，其敏感性为92%，特异性为95%
* 单因素分析P < 0.1
多因素预后分析显示，疾病诊断（骨髓增生异常综合征vs.白血病）、和CD146+血管周围细胞（<0.025%  vs. ≥0.025%）为影响造血干细胞移植后植入不良发生的独立危险因素。
综上所述，本发明的系统和方法可以定量、定性测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境，从而对移植后患者的后续治疗具有重要的指导意义。 

Claims (10)

1.一种用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，其特征在于该试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP，CD133-APC。
2.根据权利要求1所述的用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还配备了红细胞溶解液、pH为7.2~7.4的10×PBS缓冲液和配套计量的小牛血清。
3.根据权利要求1所述的用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中每种荧光标记的单克隆抗体试剂容量标准单元是：5μL的 CD34-FITC，5μL的CD146-PE, 10μL的 CD45- PerCP和 3μL的 CD133-APC，配套设置有不小于3-5mL的流式细胞仪专用试管至少2个。
4.一种用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的系统，系统结构中包括流式细胞仪和配套的数据分析模块，其特征在于所述系统中还包括主控计算机单元（1），以及连接在主控计算机单元（1）配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块（2）、配置缓存器模块（13）的监控显示器（LCD）、存储有经验数据和图形的存储模块（3）、暂存器模块（4）、设置在系统操控台上的操控面板（5）、存储有内外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块（6）、打印机及接口电路（7），流式细胞仪（8）通过通讯接口电路（12）和主控计算机单元（1）的数据总线连接，且流式细胞仪（8）结构中配套设有用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境评测的专用试剂盒（11），所述专用试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、CD146-PE、CD45-PerCP，CD133-APC。
5.根据权利要求4所述的用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的系统，其特征在于所述经验数据和图形包括按照年龄、性别为标记，分别标示的健康人、植入良好和植入不良患者的骨髓做样本的骨髓微环境流式数据图库及数据采集条件；所述流式数据图库中存储着采用所述专用试剂盒（11）中的染色单克隆抗体为试剂制成的骨髓样本按照特定的数据采集条件所测得的散点图、流式设门分析图和测定的CD45–CD34–CD146+细胞表达比例、及该骨髓样本相关的临床特征。
6.根据权利要求5所述的用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的系统，其特征在于流式设门分析图的分析方法是：先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为R1区；设CD45/SSC点图，根据各群细胞CD45和SSC的强度，画出CD45-区，对CD45-区中的CD34–CD146+细胞进行设门分析，显示骨髓单个核细胞中CD45-CD34–CD146+细胞的表达比例。
7.根据权利要求4所述的用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的系统，其特征在于监控显示器（LCD）借助暂存器模块（13）与主控计算机单元（1）的数据总线相连、配套设置触摸式电子鼠标。
8.根据权利要求4所述的系统实现测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
A、将待测骨髓样本采用专用试剂盒中的试剂在配套的流式细胞仪专用试管中进行荧光标记，制成测试样本；
B、将装有测试样本的专用试管置入流式细胞仪，启动流式细胞仪（8）及配套的分析软件，按照存储模块（3）中特定的数据采集条件采集相关数据，形成散点图，并进行流式设门分析，传输并分类标记存入暂存器模块（4）；
C、调出在存储模块（3）中经验数据和图形的，显示在高清晰度的监控显示器（LCD）的上半区，在下半区调出暂存器模块（4）中的对应图谱，借助光标尺进行对照定量分析；
D、确定CD45-CD34–CD146+细胞在骨髓单个核细胞中表达比例的分界线值的位置；
E、将测定的CD45-CD34–CD146+表达比例≥分界线值定义为骨髓微环境良好；CD45–CD34–CD146+表达比例<分界线值定义为骨髓微环境不良；
F、从存储模块（3）中调出造血干细胞移植后患者骨髓微环境检测报告表，填入测定数据、相关图表，比对后将“良好”、“不确定”、“不良” 选择填入评测结论栏中，从激光打印机上输出。
9.根据权利要求8所述的测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境的方法，其特征在于步骤A中所述测试样本的制备步骤包括：
A1、取试剂盒配套设置的专用试管，在试管中分别加入5μL的 CD34-FITC，5μL的CD146-PE，10μL的CD45-PerCP和 3μL的 CD133-APC，再加入不少于300μL的待测骨髓样本、且保证含有不少于1×106个白细胞，混匀，室温避光放置15分钟孵育；
A2、加入用1×PBS缓冲液稀释10倍后的红细胞溶解液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟；
A3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入2mL含0.5wt.%~2wt.%血清的PBS，混匀；
A4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入0.3mL 1×PBS缓冲液、混匀，制成测试样本。
10.根据权利要求8所述的测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微环境的方法，其特征在于步骤B中所述流式设门分析的步骤包括：
B1、先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为R1区；
B2、设CD45/SSC点图，根据各群细胞CD45和SSC的强度，画出CD45-区；
B3、对CD45-区中的CD34–CD146+细胞进行设门分析，得出CD45-CD34– CD146+细胞在骨髓单个核细胞中的表达比例。
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