CN108373994B - 一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法 - Google Patents

一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法，包括以下步骤：获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。本发明还提供了该平滑肌细胞的鉴定方法。本发明对食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法简单、完善而有效，鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。

Description

一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定 方法
技术领域
本发明关于细胞培养技术领域，尤其涉及一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法。
背景技术
原发性食管运动功能障碍性疾病(PEMD)包括贲门失弛缓症(EAC)、弥漫性食管痉挛(DES)、胡桃钳食管(NE)、食管下括约肌高压症(HLES)等，均发生于食管中下段至食管胃结合部(EGJ)，均以病变段食管高压型蠕动异常、食管对食团的推动力减弱或消失为动力学特点，临床表现均为慢性间歇性胸痛和吞咽困难。由于其临床表现与食管动力有直接关系，因此食管胃结合部平滑肌组织舒缩相关调控机制在PEMD病因学和病理生理学方面的研究非常重要，有必要探索人源性消化道平滑肌细胞在体外培养过程中的生长规律、表型转换特点并开拓相应生理功能的研究以更好的了解消化道平滑肌细胞的生理机制，为消化道运动功能障碍和消化道再造的研究做铺垫。目前有学者对食管平滑肌细胞组织块法原代培养方法进行了相关研究，但实验步骤繁琐，并且缺乏对所涉及的结缔组织细胞的详细鉴定。
发明内容
针对现有技术中实验步骤繁琐、对所涉及的结缔组织细胞缺乏详细鉴定的技术问题，本发明提供了一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法。
以及，一种对上述食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法所得平滑肌细胞的鉴定方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，包括以下步骤：
步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；
步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；
步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。
以及，本发明实施例还提供了一种对上述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法所得平滑肌细胞的鉴定方法，以α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α和PCNA蛋白作为标志物。
相对于现有技术而言，本发明对食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法简单、完善而有效，鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。按本发明所提供的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法为原发性食管运动功能障碍性疾病和食管组织工程学研究奠定了基础，所得平滑肌细胞还可以应用于组织工程、再生医学研究，以便将来制作人体替代组织。
附图说明
图1为EI-T组平滑肌细胞组织块法原代培养过程中细胞生长示图；
图2为T组平滑肌细胞组织块法原代培养过程中细胞生长示图；
图3为TD-T组平滑肌细胞组织块法原代培养过程中细胞生长示图；
图4为3组平滑肌新生细胞爬出时间比较；
图5为3组平滑肌组织块贴壁至初次分瓶中位时间比较；
图6为3组平滑肌已爬出新生细胞的组织块占全部贴壁组织块的中位比例比较；
图7为平滑肌细胞传代培养后各组细胞形态；
图8为平滑肌细胞群体生长形态；
图9为平滑肌细胞结节状隆起；
图10为第3代平滑肌细胞在SMCS及10％-F12两种培养基中增殖情况；
图11为食管胃结合部6种平滑肌组织标志性蛋白免疫组织化学染色示例；
图12为食管胃结合部6种平滑肌组织标志性蛋白mRNA表达的扩增曲线和溶解曲线；
图13为食管胃结合部6种平滑肌组织标志性蛋白mRNA表达量；
图14为平滑肌细胞的荧光鉴定；
图15为平滑肌细胞的标志蛋白表达；
图16为平滑肌细胞的标志蛋白表达荧光数据。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，包括以下步骤：
步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；
步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；
步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。
相对于现有技术而言，本发明对食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法简单、完善而有效，所得平滑肌细胞还可以应用于组织工程、再生医学研究，以便将来制作人体替代组织。
具体的，上述步骤a具体包括以下操作：取手术中切除的食管胃结合部组织，翻转至黏膜面，以碘伏擦洗所述黏膜面，锐性分离黏膜层，剪除表面薄层透明结缔组织，剪取平滑肌组织，制备平滑肌组织肌条，迅速置于盛有培养基与抗生素的容器中，即得。
进一步优选地，所述取手术中切除的食管胃结合部组织，其近端供血血管离断不超过40min，组织离体不超过15min，以确保组织保存生存活性，在后续操作时间内保持细胞活力；所述平滑肌组织肌条的平面尺寸为5～15mm×5～10mm，该尺寸有利于平滑肌条的剪取、保存并保证后续实验的基本组织需求量；所述培养基为DMEM/F-12，作为开发无血清配方的基础，具有F12含有较丰富的成分以及DMEM含有较高浓度营养的综合优点；所述抗生素为青链霉素，属于广谱抗生素，可用于预防细胞培养的细菌污染，特别是革兰氏阳性和阴性细菌的污染；整个操作过程在10min内完成，以避免因离体时间过长而影响平滑肌条的活性。
上述步骤b中所述消化酶包括胰酶/EDTA、胶原酶Ⅰ、胶原酶II、胶原酶Ⅴ、胶原酶Ⅷ、胶原酶Ⅺ、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、中性蛋白酶/分散酶、大豆胰蛋白酶抑制剂，上述消化酶均可用于平滑肌细胞的消化，可以给研究人员在获取平滑肌细胞时提供更多选择。
进一步优选地，所述消化酶为胶原酶II，所述胶原酶II的浓度为125～200CDU/mg，所述胶原酶II在所述消化液中的浓度为0.5～1.0mg/ml，胶原酶Ⅱ对细胞间质有消化作用，可水解结缔组织中胶原蛋白成分，利于细胞从组织块中迁出，使细胞初次分瓶时间明显缩短，所述消化酶还包括0.25％胰蛋白酶/EDTA，是适合本发明中平滑肌细胞培养的试剂，可通过降解细胞间蛋白从而使细胞分开，消化酶浓度太高会损伤平滑肌细胞膜，从而影响平滑肌细胞活性，不利于细胞的贴壁和增殖。
进一步优选地，所述步骤b具体包括以下操作：将步骤a所得平滑肌组织肌条剪成平面尺寸为5～8mm×5mm的组织块，以增加组织块与消化液的接触面积，有利于消化的进行，且组织块更容易贴服于容器底部；以PBS和抗生素混合液，再以PBS漂洗，以去除残余培养基、组织渗出物等；以DMEM/F-12原液溶解消化酶配制成消化液，将所述组织块置于装有所述消化液的容器中，吸取部分所述消化液注入所述组织块内使所述组织块充盈饱满；置于4℃环境中进行消化14～24h，消化时间太短则消化效果较差，消化时间太长则会由于消化酶损伤细胞膜而影响平滑肌细胞活性，不利于其贴壁和增殖；消化终止时加入新生牛血清；以尖端抛光、开口较大的吸管吹打，可使组织块与单个细胞分离；过滤，得到消化后的平滑肌组织块；经过酶消化处理的组织块更易爬出新生细胞，且细胞初次分瓶时间短、组织块利用率高。
进一步优选的，所述抗生素为青链霉素；所述混合液中PBS与抗生素的体积比为5:1；所述以PBS与抗生素混合液漂洗为漂洗2次，每次漂洗时间为3min，经漂洗后，可以去除残余培养基及组织块内渗出物；所述以PBS漂洗为漂洗1次，漂洗时间3min，经漂洗后可以去除残余培养基和抗生素；所述消化液的体积为组织块体积的5～6倍，以确保组织块可全部浸入消化液内；所述消化的过程中间断轻柔震动，有利于消化的充分进行；所述新生牛血清的体积为所述消化液体积的20％～25％。所述吹打时间为5min，将组织块与游离细胞分开；所述过滤的滤网为尼龙网，孔径为200μm，可去除游离细胞，留下组织块。
上述步骤c具体包括以下操作：用PBS漂洗步骤b所得消化后的平滑肌组织块，立即逐一转移至培养容器底部，所述消化后的平滑肌组织块在所述培养容器底部的间距为0.5～1cm，以确保组织块均能接触到培养液，互不干扰，静置4.5～5.5min，使组织块贴于容器底部；将所述培养容器竖起，吸除滑落的所述消化后的平滑肌组织块周围附带液体并将其固定于所述培养容器底部并静置4.5～5.5min，使未能贴于容器底部的组织块得以固定；在不冲洗且不碰触容器底部所述消化后的平滑肌组织块的条件下，垂直向所述培养容器内加入平滑肌培养基；将所述培养容器保持竖立状态静置于通气5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中2～4h，至所述消化后的平滑肌组织块表面稍显干燥、所述消化后的平滑肌组织块与所述培养容器底接触部分边缘的所述平滑肌培养基未干，缓慢正置所述培养容器，使所述平滑肌培养基均匀铺散在所述培养容器底部并浸泡所述消化后的平滑肌组织块与所述培养容器底部的接触部位；将正置的所述培养容器置于培养箱中静置48h不晃动；48h后，吸除所述平滑肌培养基，用PBS轻柔冲洗后加入新的平滑肌培养基，为组织块及爬出的新生细胞补充营养，并防止污染；至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触时进行初次分瓶传代。
进一步优选地，本申请所述食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法中，所述食管胃结合部平滑肌包括食管环行肌、食管纵行肌、套锁纤维、钩状纤维、近套索纤维侧胃环行肌和近钩状纤维侧胃环行肌。
以及，本发明实施例还提供了一种对上述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法所得平滑肌细胞的鉴定方法，以α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α和PCNA蛋白作为标志物。α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α均可用于平滑肌组织和细胞的鉴定，其中α-SMA、SM22α特异性最强；PCNA主要合成并存储于细胞核内并参与DNA的合成，在细胞增殖的G1-S期表达明显增加，是评价细胞增殖状态的重要指标。
相对于现有技术而言，本发明的鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。按本发明所提供的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法为原发性食管运动功能障碍性疾病和食管组织工程学研究奠定了基础。
为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
本发明实施例提供了一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法，具体如下：
1、获取食管胃结合部平滑肌组织肌条
所述平滑肌组织来自于24例高位食管癌患者。在取得伦理委员会批准及患者本人或法定授权人的知情同意的条件下，从患者手术过程中切除的食管胃结合部组织中取材，其近端供血血管离断不超过40min，组织离体不超过15min。将标本翻转至黏膜面，以碘伏擦洗全部黏膜组织后，用无菌组织剪锐性分离黏膜层。根据肌纤维走行判断食管环行肌(esophageal circular muscle，EC)、食管纵行肌(esophageal longitudinal muscle，EL)、套锁纤维(sling fiber，S)、钩状纤维(clasp fiber，C)、近套索纤维侧胃环行肌(即胃大弯侧胃底环形肌，gastric circular muscle-sling，GC-S)和近钩状纤维侧胃环行肌(即胃小弯侧环形肌，gastric circular muscle-clasp，GC-C)。剪除各处平滑肌表面一薄层透明结缔组织后，剪取各组平滑肌组织，制备成约5～15mm×5～10mm的平滑肌条。整个操作过程尽量在10min内完成，以避免因离体时间过长而影响平滑肌条的活性。用于原代细胞培养的平滑肌组织迅速置于盛有DMEM/F12 1ml和青链霉素合剂200μl的1.5ml EP管中。
2、用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块
将平滑肌组织肌条剪成5～8mm×5mm大小，以PBS 1ml和青链霉素合剂200μl混合液漂洗2次，每次3min；后以PBS 1ml漂洗1次，时间3min。以DMEM/F12原液溶解胶原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)配制成胶原酶Ⅱ消化液，胶原酶Ⅱ消化液浓度为0.5mg/ml和1mg/ml(胶原酶Ⅱ≥125CDU/mg)。将平滑肌组织转移至2ml圆底离心管，其内盛有5～6倍于组织块体积的胶原酶Ⅱ消化液，以1ml注射器吸取适量消化液注入组织块内使组织块充盈饱满。将离心管移至4℃冰箱恒温孵育14～24h，孵育过程中可间断轻柔震动。消化终止时加入400～600μl新生牛血清。以尖端抛光、开口较大的吸管对上述加入了新生牛血清的消化液混合物进行柔和吹打约5min，分离出单个平滑肌细胞，用孔径200μm的尼龙网过筛以滤除游离细胞和残余组织，得到消化后的平滑肌组织块，所得到的单个平滑肌细胞可用于其他实验。
3、将消化结束的所述食管胃结合部平滑肌组织块转移至培养容器中进行原代培养
用PBS 1ml漂洗所得消化后的组织块，立即逐一转移至一次性培养瓶底，组织块间距0.5～1cm，静置4.5～5.5min。将培养瓶缓慢竖起，用移液枪吸除滑落组织块周围附带液体并尽量将组织块固定于培养瓶底部并静置4.5～5.5min。竖起培养瓶后无组织块滑落时，垂直向培养瓶内加入平滑肌培养基1ml，不冲洗或触碰瓶底组织块。培养瓶保持竖立状态静置于通气5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中2～4h，以组织块与瓶底接触部分边缘液体未干为标准，缓慢正置培养瓶，使培养基均匀铺散在瓶底部并浸泡组织块与瓶底接触部位。培养瓶静置于培养箱中，48h内不可晃动，48h后，吸除所述平滑肌培养基，用PBS轻柔冲洗后加入新的平滑肌培养基。每48h观察并记录组织块细胞生长情况，至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触时进行初次分瓶传代。
将上述方法设为EI-T组，用另外两种组织块法进行对比：将组织块剪成平面尺寸为2～5mm×2～3mm后不接受酶消化辅助，直接进行培养瓶接种，设为T组；用0.25％胰蛋白酶/EDTA作为消化酶，不注入组织块内，将平滑肌组织剪成平面尺寸为2～5mm×2～3mm后，直接置于消化液中室温消化30min，作为TD-T组。
4、平滑肌细胞的生物学特性检测
(1)三组平滑肌新生细胞爬出情况及形态
实验过程中，EI-T、T、TD-T三组的组织块贴壁时间平均3.5h(2～5.5h)。三种组织块培养法均可见新生细胞爬出并生长、增殖。细胞形态多为不规则的梭形，舒展，伪足明显，如图1～图3所示。T组的组织块紧贴培养瓶底部，一定时间后(中位时间为10.00d)梭形新生细胞由组织块边缘爬出并逐渐向远方扩展，细胞间隙越来越小；TD-T组从组织块中爬出的新生细胞多呈梭型或长梭形，舒展、多有伪足，细胞由组织块爬出中位时间为10.00d，多数细胞两端稍钝，同时可见混有一定数量两端伪足尖长的成纤维细胞，偶见极少量非梭型细胞；EI-T组的组织块爬出的新生细胞较TD-T组胖，细胞多伸展伪足，可见混有一定量两端伪足尖长的成纤维细胞和非梭型细胞，但细胞形态均一性要好于TD-T组，且细胞爬出中位时间为6.00d，生长较快；部分原代爬出的新生细胞在稀疏时并非呈现为梭型，当细胞间隙变小后逐渐呈梭型排列。
如图4～图6所示，在EI-T组中，初次见新生细胞爬出中位时间为组织块贴壁培养后6.00d(0～19d)，组织块贴壁至初次分瓶中位时间为15.50d(0～26d)，组织块贴壁至初次分瓶时已爬出新生细胞的组织块占全部贴壁组织块的中位比例为86.00％(0～100％)；在T组中，初次见新生细胞爬出中位时间为组织块贴壁培养后10.00d(0～19d)，组织块贴壁至初次分瓶中位时间平均为20.00d(0～25d)，组织块贴壁至初次分瓶时已爬出新生细胞的组织块占全部贴壁组织块的中位比例为36.00％(0～67％)；TD-T组中，初次见新生细胞爬出中位时间为组织块贴壁培养后10.00d(0～18d)，组织块贴壁至初次分瓶中位时间为18.00d(0～26d)，组织块贴壁至初次分瓶时已爬出新生细胞的组织块占全部贴壁组织块的中位比例为60.00％(0～100％)。
由图4可见，在初次见新生细胞爬出时间方面，三种组织块培养法有统计学差异(P＝0.000)；进行两两比较发现EI-T组明显优于TD-T组(P＝0.004)和T组(P＝0.019)，而TD-T组与T组无统计学差异(P＝0.785)。由图5可见，在初次分瓶时间方面，三种组织块培养法有统计学差异(P＝0.034)；进行两两比较发现EI-T组明显优于TD-T组(P＝0.05)。由图6可见，在初次分瓶时已爬出新生细胞的组织块占全部组织块的比例方面，三种组织块培养法有统计学差异(P＝0.002)；进行两两比较发现EI-T组明显优于TD-T组(P＝0.02)和T组(P＝0.01)，TD-T组与T组无统计学差异(P＝0.42)。
(2)平滑肌细胞增殖实验
将组织块法获得的细胞传代至第3代，分别以专业平滑肌细胞培养基(SMCS)或含10％新生牛血清的DMEM/F12培养基(10％-F12)进行培养，及时记录细胞生长情况。如图7可见，细胞在经过消化传代后明显较原代胖大。如图8所示，细胞可自行沿一定方向生长，表现为峰谷样图案。平滑肌细胞随着传代次数增多，体积会逐渐增大，突触明显并逐渐丧失梭形结构。如图9所示，当细胞生长密集时，拥挤的细胞逐层环绕，中心可隆起呈结节状。
以每孔2000个细胞为标准将第3代平滑肌细胞接种于96孔板内，每个样本需重复3～4个辅助测量孔。将96孔板静置于细胞培养箱内，6小时后观察细胞贴壁、舒展。
以每100μl培养基加10μl CCK-8试剂的比例配置混悬剂。清除各待测孔培养基后，每孔加入混悬剂100μl。将96孔板静置于培养箱内2h后取出，置于微孔板振荡器上震荡1min，将96孔板转至酶标仪，在450nm波长下读取各孔数据并记录。测量吸光值后的孔不再重复使用。每24h测量一次实验孔吸光值，连续测量9天(216h)。
结果如图10所示，本实施例所获得的平滑肌细胞在SMCS中可表现出典型的细胞增殖S型曲线，但在10％-F12中增殖缓慢甚至近乎停滞。
5、平滑肌细胞鉴定
(1)免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)鉴定
在6种食管胃结合部平滑肌组织石蜡切片中，均可见α-SMA、SM22α、Vimentin、Desmin、CD90和PCNA蛋白的表达，如图11所示，其中α-SMA、Vimentin、Desmin在细胞质呈强阳性或阳性；SM22α和CD90在细胞质呈阳性或弱阳性；PCNA在部分细胞核呈强阳性或阳性。
(2)Realtime RT-PCR实验
依据ABI 7500Real-Time PCR自动绘制相关基因各引物是否存在扩增曲线并绘制出熔解曲线，可明确判断EGJ 6种平滑肌组织的平滑肌细胞中均表达α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α和PCNA的mRNA，如图12所示。
食管胃结合部6种平滑肌组织α-SMA、SM22α、Vimentin、Desmin、CD90和PCNA的mRNA表达量如图13所示。
(3)平滑肌细胞免疫荧光鉴定
组织块法获得的细胞在细胞贴壁后48h即可观察到细胞大多开始舒展，原代细胞传代后(第2代)进行免疫荧光实验，使用共聚焦显微镜(LSM 510，ZEISS，德国)相应受体表达可见α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α和PCNA六种蛋白的表达，如图14所示。
(4)Incellwestern方法鉴定
采用Incellwestern方法可检测到组织块法获得平滑肌细胞(第3代)中α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α和PCNA六种蛋白的表达，如图15、图16所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；
步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；具体包括以下操作：
将步骤a所得平滑肌组织肌条剪成平面尺寸为5～8mm×5mm的组织块；
以PBS和抗生素的混合液漂洗，再以PBS漂洗；
以DMEM/F-12原液溶解消化酶配制成消化液，将所述组织块置于装有所述消化液的容器中，吸取部分所述消化液注入所述组织块内使所述组织块充盈饱满；
置于4℃环境中进行消化14～24h后，加入新生牛血清，以尖端抛光、开口较大的吸管吹打；
用孔径200μm的尼龙网过筛以滤除游离细胞和残余组织，得到消化后的平滑肌组织块；
步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。
2.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述消化酶为胶原酶II，所述胶原酶II的浓度为125～200CDU/mg，所述胶原酶II在所述消化液中的浓度为0.5～1.0mg/ml。
3.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述抗生素为青链霉素；
所述混合液中PBS与抗生素的体积比为5:1；
所述以PBS和抗生素的混合液漂洗为漂洗2次，每次漂洗时间为3min；
所述以PBS漂洗为漂洗1次，漂洗时间3min；
所述装有所述消化液的容器中消化液的体积为组织块体积的5～6倍；
所述消化的过程中间断轻柔震动；
所述新生牛血清的体积为所述消化液体积的20％～25％；
所述吹打时间为5min；
所述过滤的滤网为尼龙网，孔径为200μm。
4.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述步骤c具体包括以下操作：
用PBS漂洗步骤b所得消化后的平滑肌组织块，立即逐一转移至培养容器底部，所述消化后的平滑肌组织块在所述培养容器底部的间距为0.5～1cm，静置4.5～5.5min；
将所述培养容器竖起，吸除滑落的所述消化后的平滑肌组织块周围附带液体并将其固定于所述培养容器底部并静置4.5～5.5min；
在不冲洗且不碰触容器底部所述消化后的平滑肌组织块的条件下，垂直向所述培养容器内加入平滑肌培养基；
将所述培养容器保持竖立状态静置于通气5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中2～4h，至所述消化后的平滑肌组织块表面稍显干燥、所述消化后的平滑肌组织块与所述培养容器底接触部分边缘的所述平滑肌培养基未干，缓慢正置所述培养容器，使所述平滑肌培养基均匀铺散在所述培养容器底部并浸泡所述消化后的平滑肌组织块与所述培养容器底部的接触部位；
将正置的所述培养容器置于培养箱中静置48h不晃动；
48h后，吸除所述平滑肌培养基，用PBS轻柔冲洗后加入新的平滑肌培养基；
至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触时进行初次分瓶传代。
5.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述步骤a具体包括以下操作：
取手术中切除的食管胃结合部组织，翻转至黏膜面，以碘伏擦洗所述黏膜面，锐性分离黏膜层，剪除表面薄层透明结缔组织，剪取平滑肌组织，制备平滑肌组织肌条，迅速置于盛有培养基与抗生素的容器中，即得。
6.根据权利要求5所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述取手术中切除的食管胃结合部组织，其近端供血血管离断不超过40min，组织离体不超过15min；
所述平滑肌组织肌条的平面尺寸为5～15mm×5～10mm；
所述培养基为无牛血清的DMEM/F-12；
所述抗生素为青链霉素；
整个操作过程在10min内完成。
7.根据权利要求1～6任一项所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，所述食管胃结合部平滑肌包括食管环行肌、食管纵行肌、套锁纤维、钩状纤维、近套索纤维侧胃环行肌和近钩状纤维侧胃环行肌。
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