CN107502611B

CN107502611B - 一种抗j亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒rna及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107502611B
Application number: CN201710881948.6A
Authority: CN
Inventors: 崔恒宓; 胡序明; 陈世豪
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: CN107502611A

Abstract

本发明涉及动物病毒学、免疫学、表观遗传学和新型免疫增强剂开发领域，提供了一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA及其制备方法和应用。该RNA来源于鸡1号染色体基因组中内源性反转录病毒ALVE1衍生的反义长链非编码RNA，采用RACE和PCR克隆技术鉴定后，将其命名为lnc‑ALVE1‑AS1，其cDNA具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明通过构建lnc‑ALVE1‑AS1过表达载体质粒，体外实验显示lnc‑ALVE1‑AS1可激活细胞抗病毒干扰素应答反应并抑制J亚群禽白血病病毒增殖。本研究发明不仅提供了抵抗禽白血病病毒的新手段，也为禽白血病病毒的防控提供了新思路。

Description

一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子免疫生物学领域和新型免疫增强剂开发领域，具体涉及一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA及其制备方法和应用。

背景技术

内源性反转录病毒(endogenous retroviruses)是基因组成分，被认为源于进化中感染生物体的反转录病毒。作为远古反转录病毒感染在宿主体内的残留，过去对它的功能不够了解，曾将其视为垃圾DNA(Junk DNA)。直至最近有研究表明，某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用，还可能与细胞天然免疫有关。

目前，在鸡基因组中已鉴定多种类型的内源性反转录病毒，但其基因组结构都与禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)类似。禽白血病病毒属于禽反转录病毒科C型肿瘤病毒，在自然界以内源性(ALVE)和外源性(如ALVA、ALVB、ALVC、ALVD和ALVJ)两种形式存在。禽内源性白血病病毒ALVE是最早发现的内源性反转录病毒，可能与宿主免疫应答和遗传抗性有关。特别是，来源于鸡1号染色体上的内源性反转录病毒ALVE1(长度为7.5kb)与禽白血病病毒高度同源，可能与禽白血病病毒的感染和增殖具有一定关联。

最新研究发现，内源性反转录病毒转录物是长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)的重要来源，具有激活干扰素应答反应的潜能。事实上，lncRNA在细胞生物学调控中的作用越来越受到重视，在抗病毒天然免疫中也具有重要调节作用。内源性反转录病毒衍生的lncRNA在对抗外源性反转录病毒增殖的作用机制将逐渐被阐明，有望成为抵抗外源性病毒的新型疫苗或免疫增强剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种能抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA序列以及作为新型免疫增强剂的应用前景。

本发明提供一种内源性反转录病毒衍生的反义长链非编码RNA(命名为lnc-ALVE1-AS1)，所述lnc-ALVE1-AS1的cDNA序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明提供扩增lnc-ALVE1-AS1全长序列引物，其序列如下：，

lnc-ALVE1-AS1-F：5′-ATCTTTATGTTCCATTGTCATCGC-3′(SEQ ID NO.2)

lnc-ALVE1-AS1-R：5′-GCCATTTTACCATCCACCAC-3′(SEQ ID NO.3)

本发明提供构建lnc-ALVE1-AS1过表达载体质粒引物，其序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F:

5′-aagcttATCTTTATGTTCCATTGTCATCGCTAAC-3′(SEQ ID NO.4)

lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R:

5′-tctagaGCCATTTTACCATCCACCACATTG-3′(SEQ ID NO.5)

本发明还提供了上述lnc-ALVE1-AS1-F、lnc-ALVE1-AS1-R、lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F和lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R引物在制备lnc-ALVE1-AS1试剂盒中的应用。

本发明提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂通过诱导干扰素应答反应来发挥其作用。

本发明还提供了所述RNAlnc-ALVE1-AS1在制备抗禽白血病病毒药物中的应用。特别是在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。所述RNA通过激活抗病毒干扰素应答反应，进而抑制J亚群禽白血病病毒增殖。

附图说明

图1lnc-ALVE1-AS1RACE琼脂糖凝胶电泳图。

图2lnc-ALVE1-AS1在鸡1号染色体上的位置示意图。

图3是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒干扰素应答反应图。A：过表达lnc-ALVE1-AS1对病原模式识别受体基因表达的影响；B：过表达lnc-ALVE1-AS1对干扰素刺激基因表达的影响；C：过表达lnc-ALVE1-AS1对TLR3蛋白表达的影响。

图4是lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖图。A：过表达lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达；B：过表达lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒滴度；C：间接免疫荧光共聚焦实验分析lnc-ALVE1-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 lnc-ALVE1-AS1全长序列的测定

(1)鉴定lnc-ALVE1-AS1的5′和3′末端序列

主要由Takara公司提供的

RACE 5’/3’Kit试剂盒来完成。

首先，用Reagent提取总RNA，然后用RNase-free DNase I去除基因组。在SMARTScribeReverse Transcriptase(试剂盒提供)的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物。

然后，按照

RACE 5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)进行PCR扩增(RACE琼脂糖凝胶电泳图见图1)，克隆测序获得lnc-ALVE1-AS1的5′末端和3′末端序列。其中，所用5′-末端和3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：

5’GSP：5′-TGACGGGATGGGACACAACGCTAAACAGT-3′(SEQ ID NO.6)

3’GSP：5′-GATTCGCCGCTCCGTTGCTGGTTTCTC-3′(SEQ ID NO.7)。

(2)常规PCR扩增lnc-ALVE1-AS1产物。其中，所用引物lnc-ALVE1-AS1-F和lnc-ALVE1-AS1-R的核苷酸序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-F：5′-ATCTTTATGTTCCATTGTCATCGC-3′(SEQ ID NO.2)

lnc-ALVE1-AS1-R：5′-GCCATTTTACCATCCACCAC-3′(SEQ ID NO.3)

其反应体系包括：100ng鸡胚成纤维细胞cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物lnc-ALVE1-AS1-F与1μL(10μM)lnc-ALVE1-AS1-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。

其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。

(3)TA克隆测序获得lnc-ALVE1-AS1的全长cDNA序列，该序列在鸡1号染色体上的位置示意图见图2。具体cDNA序列如SEQ ID NO.1。

实施例2 lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建

本实施例2中，使用从实施例1中所获得的lnc-ALVE1-AS1全长序列，构建lnc-ALVE1-AS1过表达质粒。

具体包括如下步骤：

(1)从AZA处理96小时的鸡胚成纤维细胞中，使用

Reagent提取总RNA，然后用RNase-free DNase I去除基因组。使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将其逆转录成cDNA产物。

(2)以实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，使用高保真酶扩增lnc-ALVE1-AS1全长序列，其中，所用引物lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F和lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R的核苷酸序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F:

5′-aagcttATCTTTATGTTCCATTGTCATCGCTAAC-3′(SEQ ID NO.4)

lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R:

5′-tctagaGCCATTTTACCATCCACCACATTG-3′(SEQ ID NO.5)

其反应体系包括：100ng实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F与1μL(10μM)lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。

(3)以实施例2步骤(2)中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收产物并连接至T载体进行克隆测序。测序正确的阳性克隆质粒与pcDNA3.1(+)(Invitrogen)过表达质粒载体分别用HindIII和XbaI酶切。最后，酶切回收的lnc-ALVE1-AS1目的片段DNA和pcDNA3.1(+)载体DNA用T4DNA ligase进行连接，连接产物直接转化大肠杆菌。重组子经PCR、酶切和克隆测序鉴定正确后，命名为pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1。

实施例3 lnc-ALVE1-AS1诱导抗病毒天然免疫能力分析

本实施例3中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1过表达质粒，通过荧光定量PCR和Western-blot方法评估了lnc-ALVE1-AS1诱导抗病毒天然免疫能力。

具体包括如下步骤：

(1)将鸡胚成纤维细胞接种至6孔细胞培养板，然后转染pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1过表达质粒。同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。

(2)转染后36小时，收集细胞；

(3)提取总RNA，使用荧光定量PCR方法检测干扰素信号通路相关基因。

(4)提取总蛋白，Western-blot分析TLR3表达水平。将pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1和GFP过表达质粒转染后的细胞裂解液进行SDS-PAGE,然后按照Western-blot操作步骤转移到硝酸纤维素膜，5％脱脂乳封闭后分别加入鸡TLR3抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG进行孵育，观察结果。

通过荧光定量PCR和Western-blot分析，我们观察到lnc-ALVE1-AS1可以显著激活抗病毒天然免疫相关基因表达(图3)。

实施例4 lnc-ALVE1-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力分析

本实施例4中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1过表达质粒，通过ELISA、TCID50和共聚焦免疫荧光方法评估了lnc-ALVE1-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力。

具体包括如下步骤：

(1)将鸡胚成纤维细胞接种至6孔或24孔细胞培养板，然后感染J亚群禽白血病病毒(毒株JS09GY3，GenBank accession number GU982308)。

(2)病毒感染后24小时，转染lnc-ALVE1-AS1过表达质粒；同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。

(3)转染后96小时，收集上清，使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达水平。

(4)转染后96小时，收集细胞和上清，使用TCID50方法测定J亚群禽白血病病毒滴度。

(5)转染后96小时，使用共聚焦免疫荧光测定J亚群禽白血病病毒Env蛋白表达。简要步骤如下：4％多聚甲醛室温固定20分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟；0.5％Triton X-100室温通透15分钟，PBS洗涤三次；2％BSA室温封闭30分钟，PBS洗涤三次；加入稀释至工作浓度的ALVJ囊膜糖蛋白的特异性单抗JE9，37℃孵育1小时，PBS洗涤三次；避光条件下加入稀释至工作浓度Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育40分钟，PBS洗涤三次；避光，DAPI染色液染色10分钟，PBS洗涤三次后封片处理。最后，使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。

通过ELISA、TCID50和共聚焦免疫荧光实验，我们观察到lnc-ALVE1-AS1可以显著激活抑制J亚群禽白血病病毒增殖(图4)。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的内源性反转录病毒RNA及其制备方法和应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2136

<212> DNA

<213> 鸡

<400> 1

atctttatgt tccattgtca tcgctaacga gacggcaggc tgctcagaga cgggccacga 60

ccccgaagag aggcctcttc ctgggcgttg gccctggttg ccatcccgcc ttctgcactg 120

tttagcgttg tgtcccatcc cgtcacacag ctgacatcgc tcacggctgt ttcctgactt 180

tcgttttttc gggcactgcg cctgataatg tcccggggat ccacaagtgt agcagagccc 240

tcgggcacga ccacccgacc cagtttgtcc atccctctct ctattgacta ctgccataac 300

taagggctgg atagcagacg acatggccgc ggctatgcct tgatccgtaa gaggggcagt 360

cttctgcctg tctagcacat atttgattat ctctcctggg gtggtcagcg tggagggtgc 420

tgcccgtata agctgctgaa tatctggctg tgacttctgc ctaaagcagt caatgatcac 480

cggagcccgc gcggaaggtg ggagatctga cccttcaacc gcctttataa gacgattggc 540

aaaatccaca aaggactcag atggtccctg cgtaatttcc gcccacgggt ctgtgggttc 600

cgccaaccga gcgacctctc taaacgcctg gagagccgac gccgtaatag caaccagttc 660

ccccggtctt aataatgcag cctgaccctc tggattgccg gccattccat ccgccaaacc 720

ctttaaacga tccaagttag tccgttcccc ccgcccttga ccgttcgctg ggtgtcgggg 780

gtcgcgagtg gctgccgcta taaccgtctg tagttggact ccccaagcgt ccatccataa 840

ggcatatggg gcaggtccta aaataactct cattagattc gtgacgtcat gcggcagcag 900

cggggaggac atgagcgctt ccacttctgc catagtgatc ggggatcgta agcccttggt 960

cctgaccgta tcagccagtc ttgtgatcaa ttttggctcc agaggggtcc aggcgggtcc 1020

ctctgtctta atcactacag gcatggccac cacgggcgga cctgtactcg caagctcctc 1080

cctgatcctt gcccagtcag tcagggccgg cccaggggcc agacccgcgt gccctggctc 1140

cgcccttggc tgttccgccc cccaaggtgt gtcacccccc tggccctgct gctctcccac 1200

ccccgccagg gaaggataca aaccactccc cacataagga ggaggagggg ccgaggctgt 1260

ggcgcaatta cagccagtag ctgttccgca ctgatagcag gatgtgccaa cggttttagg 1320

tgtggccatt ttctccggcg ccatcttcgc atctcgctgc gcagttgttt ctcccacttc 1380

ctcccctttg tcgattcgcc gctccgttgc tggtttctcg atgcactccg gacctggggg 1440

agagaccctc cctcccccta atcccaacca aaactttgct tgctcagatg taacctgttc 1500

ctctcgagcc gccttcaatg cccccaaaac caatccccag gtttttaact ctcccgattt 1560

cccaagtacc attgcccgct gggagagcgc cgcggtaatg ggatcccagg accccgggga 1620

atataagtct gagggagaca taagcaaccc ttccttttgt aacagggaca acatggcccc 1680

tatttccttc ttagaaggag aggttttccc gcaataggtt ttacacgcgg acgaaatcac 1740

ctttatgacg gcttccatgc tagacccaca gggcgaccgg aatcgtgcct ggggtggact 1800

gctcagtcgt cgggcttcct tcccgtcttc caacgactct ctgagttctc ggtaggttat 1860

cttggccccc ggccgtggag ctccctccga cgtcactcag cttctgccct cctaagccgc 1920

agccccctct actagggtca tcgtcctcgc tccgttaagc gagacggatg agggcaggat 1980

cgccacgccg tctgtggccg accactattc cctaacgatc acgtcggggt caccaaatga 2040

agccttctgc ttcattcagg tgttcgcaat cgttagggac tcaacggtct gtccatctac 2100

ccaggtgcac accaatgtgg tggatggtaa aatggc 2136

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atctttatgt tccattgtca tcgc 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccattttac catccaccac 20

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagcttatct ttatgttcca ttgtcatcgc taac 34

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctagagcca ttttaccatc caccacattg 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgacgggatg ggacacaacg ctaaacagt 29

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gattcgccgc tccgttgctg gtttctc 27

Claims

1.一种内源性反转录病毒衍生的反义长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1，其特征在于lnc-ALVE1-AS1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的RNA在制备免疫增强剂中的应用。

3.权利要求1所述的RNA在制备抑制J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。

4.用于扩增权利要求1所述RNA的全长序列的引物，其特征在于序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-F：5′-ATCTTTATGTTCCATTGTCATCGC-3′

lnc-ALVE1-AS1-R：5′-GCCATTTTACCATCCACCAC-3′。

5.权利要求4所述的引物在扩增lnc-ALVE1-AS1全长序列中的应用。

6.用于构建权利要求1所述RNA的过表达载体质粒的引物，其特征在于序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F:

5′-aagcttATCTTTATGTTCCATTGTCATCGCTAAC-3′

lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R:

5′-tctagaGCCATTTTACCATCCACCACATTG-3′。

7.权利要求6所述的引物在构建lnc-ALVE1-AS1过表达载体质粒中的应用。