CN107447040B

CN107447040B - 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测探针及试剂盒

Info

Publication number: CN107447040B
Application number: CN201710884183.1A
Authority: CN
Inventors: 崔恒宓; 胡序明; 陈世豪
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: CN107447040A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体是涉及一种长链非编码RNA lnc‑ALVE1‑AS1FISH的FISH检测探针及试剂盒。所述探针由序列为SEQ ID NO.1‑48所示的48条序列组成。进一步公开了该探针在制备lnc‑ALVE1‑AS1FISH定位和共定位检测试剂盒中的应用。共定位分析实验显示lnc‑ALVE1‑AS1与Toll样受体3蛋白在细胞质中存在共定位现象。本研究发明不仅提供了lnc‑ALVE1‑AS1FISH检测手段，也为lnc‑ALVE1‑AS1作用机制研究提供了方法基础。

Description

长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测探针及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测探针及试剂盒。

背景技术

内源性反转录病毒(endogenous retroviruses)是基因组成分，源于进化中感染生物体的反转录病毒。作为远古反转录病毒感染在宿主体内的残留，加之过去对它的功能不够了解，曾将其视为垃圾DNA(Junk DNA)。直至最近有研究表明，某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用，还可能与细胞天然免疫有关。

最新研究发现，内源性反转录病毒转录物是长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)的重要来源，具有激活干扰素应答反应的潜能。事实上，lncRNA在细胞生物学调控中的作用越来越受到重视，在抗病毒天然免疫中也具有重要调节作用。内源性反转录病毒衍生的lncRNA在对抗外源性反转录病毒增殖的作用机制将逐渐被阐明，有望成为抵抗外源性病毒的新型疫苗或免疫增强剂。

发明内容

本发明通过高通量测序在鸡基因组中鉴定出一条禽内源性反转录病毒ALVE1衍生的反义长链非编码RNA，命名为lnc-ALVE1-AS1。研究表明，lnc-ALVE1-AS1可以激活细胞抗病毒干扰素应答反应并抑制与其高度同源的外源性J亚群禽白血病病毒增殖。因此，进一步阐明lnc-ALVE1-AS1在抗病毒天然免疫中的作用机制显得尤为重要。

本发明提供了一种长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1荧光原位杂交(Fluorescencein situ hybridization，FISH)检测探针、试剂盒，同时，还提供一种分析lnc-ALVE1-AS1与Toll样受体3蛋白共定位的方法，为研究lnc-ALVE1-AS1的作用机制提供了研究基础。

一种长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测探针，所述探针由序列为SEQ IDNO.1-48所示的48条序列组成。

本发明还公开了所述探针在制备长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测试剂盒中的应用。

一种长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测试剂盒，包括FISH荧光探针、杂交液和染色液；其特征在于，所述探针序列如SEQ ID NO.1-48所示。

本发明提供长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1 FISH检测试剂盒的应用，即分析lnc-ALVE1-AS1与目标蛋白的共定位情况，其特征在于包括如下步骤：

(1)细胞培养

(2)长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1 FISH探针检测。具体包括细胞固定、细胞通透和lnc-ALVE1-AS1探针检测；所述探针序列如SEQ ID NO.1-48所示。

(3)细胞二次固定。加入4％多聚甲醛室温固定20分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(4)细胞二次通透。加入0.5％Triton X-100室温通透15分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(5)封闭。加入2％BSA室温封闭30分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(6)一抗孵育。加入稀释至工作浓度目标蛋白，37℃孵育1小时；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(7)二抗孵育。避光条件下加入稀释至工作浓度Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育40分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(8)DAPI染色。避光条件下加入DAPI染色液染色10分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(9)封片。避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上。

(10)共聚焦显微镜检测。使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。

本发明的实施方案提供上述探针引物在制备lnc-ALVE1-AS1FISH定位和共定位检测试剂盒中的应用。一个实例中目标蛋白采用Toll样受体3蛋白(TLR3)抗体进行说明，但其他蛋白也同样可适用于本发明。

本研究发明不仅提供了lnc-ALVE1-AS1 FISH检测手段，也为lnc-ALVE1-AS1作用机制研究提供了方法基础。

附图说明

图1lnc-ALVE1-AS1的FISH定位结果图。

图2lnc-ALVE1-AS1的FISH共定位结果图。

图3lnc-ALVE1-AS1在鸡1号染色体上的位置示意图。

图4是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒干扰素应答反应图。A：过表达lnc-ALVE1-AS1对病原模式识别受体基因表达的影响；B：过表达lnc-ALVE1-AS1对干扰素刺激基因表达的影响；C：过表达lnc-ALVE1-AS1对TLR3蛋白表达的影响。

图5是lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒增殖图。A：过表达lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达；B：过表达lnc-ALVE1-AS1抑制J亚群禽白血病病毒滴度；C：间接免疫荧光共聚焦实验分析lnc-ALVE1-AS1对J亚群禽白血病病毒增殖的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明使用的鸡Toll样受体3蛋白抗体购自Novus Biologicals公司，货号NBP2-24565。

实施例1 lnc-ALVE1-AS1全长序列的测定

(1)鉴定lnc-ALVE1-AS1的5′和3′末端序列

主要由Takara公司提供的

RACE 5’/3’Kit试剂盒来完成。

首先，用

Reagent提取总RNA，然后用RNase-free DNase I去除基因组。在SMARTScribeReverse Transcriptase(试剂盒提供)的作用下分别将1μg去除基因组的RNA逆转录合成5′-或3′-RACE产物。

然后，按照

RACE 5’/3’Kit试剂盒的操作说明，利用通用引物UPM分别与5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)进行PCR扩增，克隆测序获得lnc-ALVE1-AS1的5′末端和3′末端序列。其中，所用5′-末端或3′-末端基因特异性引物的核苷酸序列如下：

5’GSP：5′-TGACGGGATGGGACACAACGCTAAACAGT-3′(SEQ ID NO.49)

3’GSP：5′-GATTCGCCGCTCCGTTGCTGGTTTCTC-3′(SEQ ID NO.50)。

(2)常规PCR扩增lnc-ALVE1-AS1产物。其中，所用引物lnc-ALVE1-AS1-F和lnc-ALVE1-AS1-R的核苷酸序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-F：5′-ATCTTTATGTTCCATTGTCATCGC-3′(SEQ ID NO.51)

lnc-ALVE1-AS1-R：5′-GCCATTTTACCATCCACCAC-3′(SEQ ID NO.52)

其反应体系包括：100ng鸡胚成纤维细胞cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物lnc-ALVE1-AS1-F与1μL(10μM)lnc-ALVE1-AS1-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。

其反应条件为：95℃3min；95℃15s，58℃90s，72℃1min，35x循环；72℃7min；4℃维持。

(3)TA克隆测序获得lnc-ALVE1-AS1的全长cDNA序列，该序列在鸡1号染色体上的位置示意图见图3。具体cDNA序列如SEQ ID NO.53。

实施例2 lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建

本实施例2中，使用从实施例1中所获得的lnc-ALVE1-AS1全长序列，构建lnc-ALVE1-AS1过表达质粒。

具体包括如下步骤：

(1)从AZA处理96小时的鸡胚成纤维细胞中，使用

Reagent提取总RNA，然后用RNase-free DNase I去除基因组。使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将其逆转录成cDNA产物。

(2)以实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，使用高保真酶扩增lnc-ALVE1-AS1全长序列，其中，所用引物lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F和lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R的核苷酸序列如下：

lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F:

5′-aagcttATCTTTATGTTCCATTGTCATCGCTAAC-3′(SEQ ID NO.54)

lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R:

5′-tctagaGCCATTTTACCATCCACCACATTG-3′(SEQ ID NO.55)

其反应体系包括：100ng实施例2步骤(1)所获得的cDNA产物作为模板，1μL(10μM)上游引物lnc-ALVE1-AS1-HindIII-F与1μL(10μM)lnc-ALVE1-AS1-XbaI-R分别作为扩增引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。

(3)以实施例2步骤(2)中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收产物并连接至T载体进行克隆测序。测序正确的阳性克隆质粒与pcDNA3.1(+)(Invitrogen)过表达质粒载体分别用HindIII和XbaI酶切。最后，酶切回收的lnc-ALVE1-AS1目的片段DNA和pcDNA3.1(+)载体DNA用T4DNA ligase进行连接，连接产物直接转化大肠杆菌。重组子经PCR、酶切和克隆测序鉴定正确后，命名为pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1。

实施例3 lnc-ALVE1-AS1诱导抗病毒天然免疫能力分析

本实施例3中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1过表达质粒，通过荧光定量PCR和Western-blot方法评估了lnc-ALVE1-AS1诱导抗病毒天然免疫能力。

具体包括如下步骤：

(1)将鸡胚成纤维细胞接种至6孔细胞培养板，然后转染pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1过表达质粒。同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。

(2)转染后36小时，收集细胞；

(3)提取总RNA，使用荧光定量PCR方法检测干扰素信号通路相关基因。

(4)提取总蛋白，Western-blot分析TLR3表达水平。将pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1和GFP过表达质粒转染后的细胞裂解液进行SDS-PAGE,然后按照Western-blot操作步骤转移到硝酸纤维素膜，5％脱脂乳封闭后分别加入鸡TLR3抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG进行孵育，观察结果。

通过荧光定量PCR和Western-blot分析，我们观察到lnc-ALVE1-AS1可以显著激活抗病毒天然免疫相关基因表达(图4)。

实施例4 lnc-ALVE1-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力分析

本实施例4中，使用从实施例2中所获得的pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1过表达质粒，通过ELISA、TCID50和共聚焦免疫荧光方法评估了lnc-ALVE1-AS1抗J亚群禽白血病病毒增殖能力。

具体包括如下步骤：

(1)将鸡胚成纤维细胞接种至6孔或24孔细胞培养板，然后感染J亚群禽白血病病毒(毒株JS09GY3，GenBank accession number GU982308)。

(2)病毒感染后24小时，转染lnc-ALVE1-AS1过表达质粒；同时转染GFP过表达质粒作为载体对照。

(3)转染后96小时，收集上清，使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达水平。

(4)转染后96小时，收集细胞和上清，使用TCID50方法测定J亚群禽白血病病毒滴度。

(5)转染后96小时，使用共聚焦免疫荧光测定J亚群禽白血病病毒Env蛋白表达。简要步骤如下：4％多聚甲醛室温固定20分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟；0.5％Triton X-100室温通透15分钟，PBS洗涤三次；2％BSA室温封闭30分钟，PBS洗涤三次；加入稀释至工作浓度的ALVJ囊膜糖蛋白的特异性单抗JE9，37℃孵育1小时，PBS洗涤三次；避光条件下加入稀释至工作浓度Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育40分钟，PBS洗涤三次；避光，DAPI染色液染色10分钟，PBS洗涤三次后封片处理。最后，使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。

通过ELISA、TCID50和共聚焦免疫荧光实验，我们观察到lnc-ALVE1-AS1可以显著激活抑制J亚群禽白血病病毒增殖(图5)。

实施例5 lnc-ALVE1-AS1定位分析

(1)细胞培养。将细胞爬片置于24孔细胞培养板孔底，培养适量细胞(～6X 104/孔)。实验前使细胞融合度达到60％-70％。

注：爬片与底板间不要产生气泡；

(2)细胞固定。

(3)细胞通透。加入0.5％Triton X-100室温通透15分钟，PBS洗涤三次；

(4)探针检测。首先通过

Probe Designer version 4.2软件设计长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1探针，然后由广州锐博生物科技有限公司合成，探针序列如下：

探针1：gtctcgttagcgatgacaat(SEQ ID NO.1)

探针2：taaacagtgcagaaggcggg(SEQ ID NO.2)

探针3：aagtcaggaaacagccgtga(SEQ ID NO.3)

探针4：agggatggacaaactgggtc(SEQ ID NO.4)

探针5：cttagttatggcagtagtca(SEQ ID NO.5)

探针6：cttacggatcaaggcatagc(SEQ ID NO.6)

探针7：ctagacaggcagaagactgc(SEQ ID NO.7)

探针8：accccaggagagataatcaa(SEQ ID NO.8)

探针9：tattcagcagcttatacggg(SEQ ID NO.9)

探针10：tgactgctttaggcagaagt(SEQ ID NO.10)

探针11：taaaggcggttgaagggtca(SEQ ID NO.11)

探针12：ctttgtggattttgccaatc(SEQ ID NO.12)

探针13：aaattacgcagggaccatct(SEQ ID NO.13)

探针14：ggaactggttgctattacgg(SEQ ID NO.14)

探针15：aggctgcattattaagaccg(SEQ ID NO.15)

探针16：ttaaagggtttggcggatgg(SEQ ID NO.16)

探针17：ggggaacggactaacttgga(SEQ ID NO.17)

探针18：actacagacggttatagcgg(SEQ ID NO.18)

探针19：atatgccttatggatggacg(SEQ ID NO.19)

探针20：agagttattttaggacctgc(SEQ ID NO.20)

探针21：cgcatgacgtcacgaatcta(SEQ ID NO.21)

探针22：ctatggcagaagtggaagcg(SEQ ID NO.22)

探针23：ctgatacggtcaggaccaag(SEQ ID NO.23)

探针24：cctctggagccaaaattgat(SEQ ID NO.24)

探针25：tgattaagacagagggaccc(SEQ ID NO.25)

探针26：tatgtggggagtggtttgta(SEQ ID NO.26)

探针27：tatcagtgcggaacagctac(SEQ ID NO.27)

探针28：acctaaaaccgttggcacat(SEQ ID NO.28)

探针29：gaagatggcgccggagaaaa(SEQ ID NO.29)

探针30：agtgggagaaacaactgcgc(SEQ ID NO.30)

探针31：ggcgaatcgacaaaggggag(SEQ ID NO.31)

探针32：gcatcgagaaaccagcaacg(SEQ ID NO.32)

探针33：agttttggttgggattaggg(SEQ ID NO.33)

探针34：ggaacaggttacatctgagc(SEQ ID NO.34)

探针35：aaacctggggattggttttg(SEQ ID NO.35)

探针36：ggtacttgggaaatcgggag(SEQ ID NO.36)

探针37：tctccctcagacttatattc(SEQ ID NO.37)

探针38：catgttgtccctgttacaaa(SEQ ID NO.38)

探针39：cctctccttctaagaaggaa(SEQ ID NO.39)

探针40：gatttcgtccgcgtgtaaaa(SEQ ID NO.40)

探针41：tagcatggaagccgtcataa(SEQ ID NO.41)

探针42：tcgttggaagacgggaagga(SEQ ID NO.42)

探针43：aacctaccgagaactcagag(SEQ ID NO.43)

探针44：ttaggagggcagaagctgag(SEQ ID NO.44)

探针45：taacggagcgaggacgatga(SEQ ID NO.45)

探针46：tcgttagggaatagtggtcg(SEQ ID NO.46)

探针47：cctgaatgaagcagaaggct(SEQ ID NO.47)

探针48：tagatggacagaccgttgag(SEQ ID NO.48)。

探针检测步骤如下：

a)每孔加入200uL预杂交液，37℃封闭30分钟；

b)预杂交同时，将杂交液在37℃中预热；

c)避光条件下，把2.5uL 20uM lnc-ALVE1-AS1FISH Probe Mix储存液加入到杂交液中；

d)弃去每孔细胞中的预杂交液，加入适量含有lnc-ALVE1-AS1探针的探针杂交液，避光，37℃杂交过夜；

e)避光，42℃，洗液I(4X SSC，0.1％Tween-20)清洗每孔细胞3次，每次5分钟，以降低背景信号；

f)避光，42℃，(2X SSC)清洗细胞1次；

g)避光，42℃，(1X SSC)清洗细胞1次；

h)避光，1X PBS清洗细胞，室温5min

(5)DAPI染色。避光条件下，加入DAPI染色液，室温染色10分钟；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(6)封片。避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上。

(7)共聚焦显微镜检测。使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。

结果如图1所示，该检测试剂盒可以分析lnc-ALVE1-AS1在鸡胚成纤维细胞上的定位情况，说明lnc-ALVE1-AS1FISH检测试剂盒可应用于定位分析。

实施例6 lnc-ALVE1-AS1共定位分析

(1)细胞培养。将细胞爬片置于24孔细胞培养板孔底，培养适量鸡胚成纤维细胞，实验前使细胞融合度达到60％-70％。

(2)长链非编码RNAlnc-ALVE1-AS1FISH探针检测。根据实施例1(2)-(4)步骤说明，依次进行细胞固定、细胞通透和lnc-ALVE1-AS1探针检测。

(6)一抗孵育。加入稀释至工作浓度的鸡TLR3抗体，37℃孵育1小时；PBS洗涤三次，每次5分钟。

(10)共聚焦显微镜检测。使用Leica SP8共聚焦显微镜进行观察拍照。结果如图2所示，lnc-ALVE1-AS1与TLR3在细胞质内存在共定位，说明lnc-ALVE1-AS1FISH检测试剂盒可应用于lnc-ALVE1-AS1与蛋白的共定位分析。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测探针及试剂盒

<130>

<160> 55

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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gtctcgttag cgatgacaat 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taaacagtgc agaaggcggg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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aagtcaggaa acagccgtga 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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cttagttatg gcagtagtca 20

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<212> DNA

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cttacggatc aaggcatagc 20

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taaaggcggt tgaagggtca 20

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<212> DNA

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ctttgtggat tttgccaatc 20

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aaattacgca gggaccatct 20

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ttaaagggtt tggcggatgg 20

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agagttattt taggacctgc 20

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<212> DNA

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tgattaagac agagggaccc 20

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tatgtgggga gtggtttgta 20

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<212> DNA

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agtgggagaa acaactgcgc 20

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ggaacaggtt acatctgagc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaacctgggg attggttttg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ggtacttggg aaatcgggag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tctccctcag acttatattc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

catgttgtcc ctgttacaaa 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cctctccttc taagaaggaa 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gatttcgtcc gcgtgtaaaa 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tagcatggaa gccgtcataa 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tcgttggaag acgggaagga 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

aacctaccga gaactcagag 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ttaggagggc agaagctgag 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

taacggagcg aggacgatga 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tcgttaggga atagtggtcg 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cctgaatgaa gcagaaggct 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tagatggaca gaccgttgag 20

<210> 49

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tgacgggatg ggacacaacg ctaaacagt 29

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gattcgccgc tccgttgctg gtttctc 27

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

atctttatgt tccattgtca tcgc 24

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gccattttac catccaccac 20

<210> 53

<211> 2136

<212> DNA

<213> 鸡

<400> 53

atctttatgt tccattgtca tcgctaacga gacggcaggc tgctcagaga cgggccacga 60

ccccgaagag aggcctcttc ctgggcgttg gccctggttg ccatcccgcc ttctgcactg 120

tttagcgttg tgtcccatcc cgtcacacag ctgacatcgc tcacggctgt ttcctgactt 180

tcgttttttc gggcactgcg cctgataatg tcccggggat ccacaagtgt agcagagccc 240

tcgggcacga ccacccgacc cagtttgtcc atccctctct ctattgacta ctgccataac 300

taagggctgg atagcagacg acatggccgc ggctatgcct tgatccgtaa gaggggcagt 360

cttctgcctg tctagcacat atttgattat ctctcctggg gtggtcagcg tggagggtgc 420

tgcccgtata agctgctgaa tatctggctg tgacttctgc ctaaagcagt caatgatcac 480

cggagcccgc gcggaaggtg ggagatctga cccttcaacc gcctttataa gacgattggc 540

aaaatccaca aaggactcag atggtccctg cgtaatttcc gcccacgggt ctgtgggttc 600

cgccaaccga gcgacctctc taaacgcctg gagagccgac gccgtaatag caaccagttc 660

ccccggtctt aataatgcag cctgaccctc tggattgccg gccattccat ccgccaaacc 720

ctttaaacga tccaagttag tccgttcccc ccgcccttga ccgttcgctg ggtgtcgggg 780

gtcgcgagtg gctgccgcta taaccgtctg tagttggact ccccaagcgt ccatccataa 840

ggcatatggg gcaggtccta aaataactct cattagattc gtgacgtcat gcggcagcag 900

cggggaggac atgagcgctt ccacttctgc catagtgatc ggggatcgta agcccttggt 960

cctgaccgta tcagccagtc ttgtgatcaa ttttggctcc agaggggtcc aggcgggtcc 1020

ctctgtctta atcactacag gcatggccac cacgggcgga cctgtactcg caagctcctc 1080

cctgatcctt gcccagtcag tcagggccgg cccaggggcc agacccgcgt gccctggctc 1140

cgcccttggc tgttccgccc cccaaggtgt gtcacccccc tggccctgct gctctcccac 1200

ccccgccagg gaaggataca aaccactccc cacataagga ggaggagggg ccgaggctgt 1260

ggcgcaatta cagccagtag ctgttccgca ctgatagcag gatgtgccaa cggttttagg 1320

tgtggccatt ttctccggcg ccatcttcgc atctcgctgc gcagttgttt ctcccacttc 1380

ctcccctttg tcgattcgcc gctccgttgc tggtttctcg atgcactccg gacctggggg 1440

agagaccctc cctcccccta atcccaacca aaactttgct tgctcagatg taacctgttc 1500

ctctcgagcc gccttcaatg cccccaaaac caatccccag gtttttaact ctcccgattt 1560

cccaagtacc attgcccgct gggagagcgc cgcggtaatg ggatcccagg accccgggga 1620

atataagtct gagggagaca taagcaaccc ttccttttgt aacagggaca acatggcccc 1680

tatttccttc ttagaaggag aggttttccc gcaataggtt ttacacgcgg acgaaatcac 1740

ctttatgacg gcttccatgc tagacccaca gggcgaccgg aatcgtgcct ggggtggact 1800

gctcagtcgt cgggcttcct tcccgtcttc caacgactct ctgagttctc ggtaggttat 1860

cttggccccc ggccgtggag ctccctccga cgtcactcag cttctgccct cctaagccgc 1920

agccccctct actagggtca tcgtcctcgc tccgttaagc gagacggatg agggcaggat 1980

cgccacgccg tctgtggccg accactattc cctaacgatc acgtcggggt caccaaatga 2040

agccttctgc ttcattcagg tgttcgcaat cgttagggac tcaacggtct gtccatctac 2100

ccaggtgcac accaatgtgg tggatggtaa aatggc 2136

<210> 54

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

aagcttatct ttatgttcca ttgtcatcgc taac 34

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tctagagcca ttttaccatc caccacattg 30

Claims

1.cDNA序列如SEQ ID NO.53的长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测探针，其特征在于，所述探针由序列为SEQ ID NO.1-48所示的48条序列组成。

2.权利要求1所述的探针在制备cDNA序列如SEQ ID NO.53的长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测试剂盒中的应用。

3.一种cDNA序列如SEQ ID NO.53的长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的FISH检测试剂盒，包括FISH荧光探针、杂交液和染色液；其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO.1-48所示。